PRZEKAZYWANIE GENÓW OPORNOSCI NA METYCYLINE MIEDZY SZCZEPAMI STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDS I STAPHYLOCOCCUS AUREUS W HODOWLACH MIESZANYCH

Transkrypt

1 MED. DOSW. MIKROBIOL., 1999, 51, Andrzej Mlynarczykl. Grazyna Mlynarczyk1, Janusz Jeljaszewicz2 PRZEKAZYWANIE GENÓW OPORNOSCI NA METYCYLINE MIEDZY SZCZEPAMI STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDS I STAPHYLOCOCCUS AUREUS W HODOWLACH MIESZANYCH Zaklad MikrobiologiiLekarskiej Instytutu Biostruktury AM w Warszawie 1 Kierownik: prof. dr hab. M. Luczak Panstwowy Zaklad Higieny w Warszawie2 Dyrektor Instytutu: prof. dr hab. J. Jeljaszewicz Oceniano czestosc przekazywania genów opornosci na metycyline w mieszanych hodowlach szczepów S. aureus oraz S. epidermidis i S. aureus. Jako biorce stosowano szczep posiadajacy profaga grupy serologicznej A a jako dawców wielolekooporne szczepy szpitalne. U gronkowców wystepuja 4 rózne typy opornosci na antybiotyki j3-laktamowe. Jeden z nich zwiazany jest z integracja do chromosomu gronkowców obcego fragmentu DNA o wielkosci ok. 30 kbp okreslanego jako regulon mec. Region ten zawiera zwykle gen strukturalny meca (kodujacy PBP2a), geny regulatorowe meci i mecrl, gen ugpq (kodujacy pochodna fosfodwuesterazy), niekodujacy region dm o nieznanej funkcji oraz jedna sekwencje insercyjna (IS431mec) (3, 11). Wczesniejsze doniesienia o transpozycyjnym charakterze tego regionu nie potwierdzily sie. Dwudomenowe bialko PBP2A wykazujace niskie powinowactwo do antybiotyków j3-laktamowych przejmuje funkcje innych PBP (inaktywowanych przez antybiotyk). Zapewnia to ciaglosc i prawidlowosc procesów zwiazanych z synteza gronkowcowej sciany komórkowej. Szczepy syntetyzujace PBP2A nazywamy metycyiino-opornymi (np. MRSA, MRSE, MRS-CN). Bialko PBP2A wspóldziala z ok. 15 bialkami enzymatycznymi, które nie sa inaktywowane przez antybiotyki j3-laktamowe. Wykazano, ze mutacje w wielu genach np. abca, fema-femf, hiss, hmrc, hmrd, /lm, pbp2, sigb moga w istotny sposób zmieniac poziom opornosci na metycyiine ujawniajacy sie w standardowych warunkach oznaczania lekowrazliwosci (11). U takich szczepów o heterogennym fenotypie (klasa 1, 2 i 3 opornosci na metycyiine) rzeczywisty poziom opornosci mozemy oznaczyc w warunkach specjalnych, stosujac podloza zawierajace 3-7% NaCI iliub temperature inkubacji 30 C (6). Drugi typ opornosci polega na syntezie j3-laktamaz o waskim spektrum substratowym (penicyliny klasyczne, ampicylina, amoksycyiina, karbenicyiina). Opor- Praca finansowanaz grantu KBN 4 P05F

2 200 A. Mlynarczyk i inni Nr 3-4 nosc ta kodowana jest przez powszechnie wystepujace plazmidy penicylinazowe klasy II oraz transpozony zlokalizowane najczesciej w obrebie plazmidów klasy III. Mechanizm ten wystepuje u wiekszosci szczepów izolowanych z próbek materialu szpitalnego (6, 11). Trzeci typ opornosci reprezentuja szczepy wykazujace nadprodukcje lub zmienione w niewielkim stopniu spektrum syntetyzowanych j3-laktamaz. Wykazuja one zmniejszona wrazliwosc na oksacyline i sa okreslane jako BORSA (borderline oxacillin susceptible Staphylococcus aureus) (1, 6). Czwarty typ opornosci zwiazany jest ze zmianami mutacyjnymi w genach kodujacych bialka PBP (glównie PBP2 i PBP4). Efektem mutacji moze byc zmniejszone powinowactwo PBP2 do antybiotyków j3-laktamowych lub zmieniona proporcja bialek PBP2 i PBP3. Szczepy tego typu nazwano MODSA (modified PBPs S. aureus). Wystepuja one stosunkowo rzadko i wykazuja zmniejszona wrazliwosc na metycyline (3, 5, 6). Celem podjetych przez nas badan bylo wykazanie mozliwosci przekazywania regionu warunkujacego opornosc na metycyline w mieszanych hodowlach dwóch szczepów S. aureus oraz miedzygatunkowy transfer ze szczepu S. aureus do S.epidermidis. MATERIAL I METODY S z c z e p y b a k t e ryj n e. Jako biorców w hodowlach mieszanych stosowano uzyskane we wlasnym zakresie pochodne szczepu NCTC : MMl (NCTC (eMl5)SmRRf) i MM2 (NCTC (eM15)pI258SmRR~). Jako dawców stosowano izolowane z materialów od pacjentów hospitalizowanych szczepy: 1M 645 (S. aureus) i El2 (S. epidermidis). Do charakterystyki plazmidów stosowano pochodne szczepu E12: El21l (PSEl), E1212(PSE2), E1213(PSE3), uzyskane we wlasnym zakresie w wyniku eliminacji plazmidów. Izol acj a pl azmidowego DNA. Stosowano zmodyfikowana metode podana uprzednio (12). Do zawiesiny bakterii o gestosci ok. 5 x 1010CFU/ml w 10 mm EDTA dodawano 2 objetosci acetonu i 2 objetosci 95% etanolu. Tak uzyskana zawiesine trzymano w temp. O C przez 10 min., a nastepnie dodawano 10 objetosci 0,1 M NaCI w 10 mm EDTA o ph 7,0 i wstawiano do temp. O C na dalsze min., delikatnie co pewien czas mieszajac. Nastepnie zawiesine odwirowywano i osad zawieszano w roztworze 0,1 M NaCI w 50 mm EDTA o ph 7,0 tak, aby uzyskac gestosc ok. 2,5 x 1010komórek/mI. Dodawano lizostafine w stezeniu 15 l-lg/ml i inkubowan.o przez 15 min. w 3rc. Po tym czasie dodawano równa objetosc 2% wodnego roztworu sarkozylu, a uzyskany roztwór klarowano przez wirowanie przy x g przez 40 min. Do roztworu dodawano RNA-ze T1 (1 jedn./ml) oraz RNA-ze trzustkowa (50 l-lg/ml) i inkubowano 1 godz. w 45 C. Nastepnie dodawano pronaze (500 l-lg/ml) i inkubowano 30 min. w 45 C. Traktowanie pronaza przeprowadzano dwukrotnie. Dodawano octan sodu do koncowego stezenia 0,3 M i wytracano DNA dwiema objetosciami 95% etanolu. Po 2 godz. przetrzymywania w temp. -20 C próbki wirowano. Osad rozpuszczano w roztworze 0,1 M NaCI w 50 mm EDTA i nastepnie wirowano dwukrotnie w gradiencie CsCI z bromkiem etydyny. Nastepnie bromek etydyny ekstrahowano izopropanolem a DNA dializowano wobec roztworu 10 mm NaCI w 1 mm EDTA o ph 7,0. Uzyskany preparat DNA przechowywano w 4 C i rozdzielano na drodze elektroforezy w 1% agarozie.

3 Nr~ Geny metycylinoopomosci gronkowców 201 E Ii m i n a cj a p I a z m i d ów. 18-godzinna hodowle badanego szczepu rozcienczano x w swiezym podlozu TBY do gestosci poczatkowej ok. 104 komórek/mi, a nastepnie dodawano odpowiedni czynnik chemiczny powodujacy eliminacje DNA plazmidowego z komórek bakteryjnych. Stosowano: bromek etydyny w stezeniu koncowym 6 x 10-6 M, dodecylosiarczan sodowy w stezeniu koncowym 0,002%, akryflawine w stezeniu koncowym 6,5 mgli. Wariantów pozbawionych plazmidu poszukiwano po 24 godz. inkubacji z odpowiednim czynnikiem chemicznym metoda wielokrotnych replik na plytki z odpowiednimi czynnikami selekcyjnymi. H od o w l e m i e s z a n e. 18-godzinne hodowle szczepów biorcy i dawcy w podlozu TBY odwirowywano i doprowadzano do gestosci 5 x 1010j.t.k./ml w swiezym podlozu TBY. Do probówki w której prowadzono hodowle mieszana dodawano 2,5 mi szczepu dawcy i 1,5 mi szczepu biorcy. Mieszanine obydwu szczepów (biorcy i dawcy) w podlozu TB zawierajacym 4 mm CaCh inkubowano w 37'C przez 18 godzin. Po okresie inkubacji, hodowle wirowano, osad zawieszano w 1 mi podloza TB i wytrzasano przez 2 min. W przypadku selekcji opornosci na metycyline prowadzono 2 godz. preinkubacje z wytrzasaniem w podlozu TB z dodatkiem 2% NaCI. Uzyskana zawiesine komórek wysiewano na plytki TBY zawierajace odpowiednie stezenia czynników selekcyjnych. Plytki inkubowano w 37'C przez 48 godz. Do selekcji stosowano streptomycyne- 200 mgli, rifampicyne- 100 mgli, chloramfenikol- 15 mgli, gentamycyne - 5 mgli, erytromycyne - 4 mgli, oksytetracykline - 20 mgli, metycyline mgli oraz Cd(N03)2 x 4 H20 w stezeniu 3 x 100sM. Do selekcji opornosci na metycyline do podloza TBY poza czynnikami selekcyjnymi dodatkowo dodawano 3% NaCI. Klony, u których stwierdzono nabycie determinant opornosci badano pod wzgledem wrazliwosci na inne czynniki w celu sprawdzenia czy nie mialo miejsca jednoczesne pobranie innych mar kerów opornosci. Jako próby kontrolne stosowano hodowle dawcy i biorcy traktowane osobno w identyczny sposób. Czestosc przekazywania cechy liczono wzgledem liczby komórek dawcy obecnych po zakonczeniu inkubacji hodowli mieszanej. WYNIKI W hodowlach mieszanych jako dawców genów opornosci zastosowano izolowane od hospitalizowanych chorych szczepy: S. aureus JM645 i S. epidermidis El2. Wczesniejsze badania wykazaly, ze szczep JM645 posiadal 3 plazmidy: plazmid penicylin azowy p/645 (25,4 kb) warunkujacy synteze 13-laktamazyoraz opornosc na sole kadmu, rteci, bizmutu i olowiu; plazmid pt645 (2,7 kb) warunkujacy opornosc na tetracykliny (typu TetK) oraz plazmid pc645 (2,1 kb) warunkujacy opornosc na chloramfenikol. Szczep JM645 posiadal równiez chromosomalne determinanty warunkujace homogenna opornosc na metycyline oraz opornosci na gentamycyne. Izolacja plazmidalnego DNA ze szczepu S. epidermidis oraz jego pochodnych El2I1, E12/2 i El2/3 uzyskanych w wyniku eliminacji plazmidów wykazaly, ze posiada on równiez 3 plazmidy: psel (38,5 kb) warunkujacy synteze 13-laktamazy oraz opornosc na gentamycyne, czwartorzedowe zasady amoniowe, bromek etidionu oraz sole kadmu i rteci, pse2 (4,0 kb) warunkujacy indukcyjna opornosc na erytromycyne oraz pse3 (3,7 kb) warunkujacy opornosc na chloramfenikol. Szczep El2 posiadal równiez homogenna opornosc na metycyline.

4 202 A. Mlynarczyk i inni Nr 3-4 Szczepy biorców uzyskano w wyniku modyfikacji standardowego szczepu NCTC Szczep zlizogenizowano fagiem ~M-15 (grupa serologiczna A) uzyskujac pochodna szczepu NCTC (~M15). Nastepnie wyizolowano spontaniczne mutanty tego szczepu oporne na wysokie stezenia streptomycyny (200 mg/l) uzyskujac pochodna szczepu NCTC SmR(~M15). Uzyskany szczep zastosowano do selekcji mutanta opornego na wysokie stezenia rifampicyny (100 mg/l) uzyskujac pochodna szczepu NCTC SmRRf(~M15), która nazwano MM1. Pochodna MM1, do której wprowadzono na drodze transdukcji plazmid pi258, nazwano MM2. Przekazywanie opornosci na antybiotyki w hodowlach mieszanych gronkowców badano w nastepujacych ukladach: (1) szczepy MM1 i MM645, (2) szczepy MM2 ijm645, (3) szczepy MM1 i E12, (4) szczepy MM2 i E12. Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli l. Tabela I. Miedzykomórkowe przekazywanie plazmidów i genów chromosomalnych ze szczepów MRS do wariantów szczepu NCTC w hodowlach mieszanych Szczep dawcy Szczep biorcy Przekazywana Czestosc determinanta przekazywania 1M 645 MMl MC O GM 5,5x 10-7 I p/645 4,1 x 10-7 pc645 7,4x 10-7 I pt645 2,2 x 10-7 MC + p/645 1,7 x M 645 MM2 MC 2,5 x 10-8 GM 4,7 x 10-7 pc645 8,3 x 10-8 pt645 2,7 x 10-7 E12 MMl MC O I psel 1,4 x 10-8 pse2 1,9 x 10-8 pse3 3,2 x 10-8 MC + psel 2,1 x 10-9 E12 MM2 MC 3,5 x 10-9 pse2 2,4 x 10-8 pse3 4,0 x 10-8 Stosowane oznaczenia: MC - opornosc na metycyline, GM - opornosc na gentamycyne; p/645, psel - plazmidy penicylinazowe; pc645, pse3 plazmidy chloramfenikolazowe; pt645 - plazmid warunkujacy opornosc na tetracykliny; pse2 - plazmid warunkujacy opornosc na erytromycyne. (1) W hodowli mieszanej MM1 i JM645 uzyskano przekazywanie plazmidu pi645 z czestoscia 4,1 x 10-7,plazm idu pc645 z czestoscia 7,4 x 10-7,plazmidu pt645 z czestoscia 2,2 x 10-7oraz chromosomalnej determinanty opornosci na gentamycyne z czestoscia 5,5 x Uzyskano równiez laczne przekazywanie opornosci na metycyline (Me) i plazmidu penicylinazowego pi645 z czestoscia 1,7 x Nie uzyskano wariantów opornych na metycyline, które nie posiadaly plazmidu penicylinazowego.

5 Nr3-4 Geny metycylinoopornosci gronkowców 203 (2) W hodowli mieszanej MM2 i JM645 uzyskano przekazywanie plazmidu pc645 z czestoscia 8,3 x 10'7, plazmidu pt645 z czestoscia 2,7 x 10'7 oraz chromosomalnych genów warunkujacych opornosc: na gentamycyne z czestoscia 4,7 x 10'7 i metycyline (Mc) z czestoscia 2,5 x (3) W hodowli mieszanej MMl i E12 uzyskano przekazywanie plazmidu psel z czestoscia 1,4 x 10'8,plazmidu pse2 z czestoscia 3,2 x 10-8,plazmidu pse3 z czestoscia 1,9 x 10-8.Uzyskano równiez laczne przekazywanie opornosci na metycyline (Me) i plazmidu penicylinazowego psel z czestoscia 2,1 x Nie uzyskano wariantów opornych na metycyline, które nie posiadaly plazmidu penicylinazowego. (4) W hodowli mieszanej MM2 i E12 uzyskano przekazywanie plazmidu pse2 z czestoscia 2,4 x 10-8i plazmidu pse3 z czestoscia 4,0 x 10-8.Opornosc na metycyline (Mc) przekazywana byla z czestoscia 3,5 x 10'9. DYSKUSJA Przekazywanie genów pomiedzy komórkami róznych szczepów gronkowców w warunkach naturalnych moze byc wynikiem 3 róznych procesów: transdukcji (zwykle w obrebie gatunku lub grupy fagowej), koniugacji warunkowanej przez plazmidy klasy III (w obrebie gatunku, miedzygatunkowe i pomiedzy gronkowcem i enterokokami) (13, 14, 16) i koniugacji warunkowanej przez bakteriofagi (bialka plytki podstawowej i ogonków fagowych) (19,20). Transformacja ze wzgledu na trudny do uzyskania stan kompetencji i silne nukleazy zewnatrzkomórkowe u gronkowców ma znaczenie tylko w warunkach laboratoryjnych. Nazwa "koniugacji warunkowanej przez bakteriofagi" zostala wprowadzona przez Lacey'a w 1980 roku (7). Wykazano, ze przekazywanie genów za posrednictwem tego mechanizmu wymaga obecnosci okreslonego profaga albo u biorcy albo u dawcy, jak równiez odpowiedniej gestosci komórek dawcy i biorcy oraz obecnosci jonów wapnia (7, 9). Zastosowanie szczepów S. aureus zlizogenizowanych mutantem faga ~11, niezdolnym do tworzenia glówki wykazalo, ze w procesie przekazywania nie uczestnicza bialka kapsydu fagowego a jedynie bialka ogonka lub plytki podstawowej (19). Bakteriofag ~11 posiada 8 polipeptydów o ciezarach od do (3 polipeptydy glówki, 1 ogonka i 4 plytki podstawowej) [190]. Fagi grupy serologicznej A posiadaja zwykle 9 polipeptydów o ciezarach od do (8). Mechanizm zjawiska zachodzacego w mieszanych hodowlach gronkowców nie zostal do konca poznany. Wydaje sie prawdopodobne, ze pewne komponenty bakteriofaga (polipeptydy ogonka lub/i plytki podstawowej) syntetyzowane w wyniku ekspresji genów profaga i eksponowane na powierzchni komórki bakteryjnej zmieniaja wlasciwosci powierzchni bakterii, co z kolei umozliwia bliski kontakt komórek i przechodzenie DNA w obydwu kierunkach od dawcy do biorcy i od biorcy do dawcy. Badania Barr'a i wsp. (2) wykazaly, ze przekazywanie plazmidowej opornosci na tetracykliny w hodowlach mieszanych przy wspóludziale bialek fagowych zachodzilo z czestoscia ok. 100 do 1000 razy wieksza w obecnosci subinhibicyjnych stezen antybiotyków J3-laktamowych. Autorzy sugeruja, ze antybiotyki J3-laktamowe zwiekszaja czestosc formowania agregatów komórkowych pomiedzy dawca i biorca. Wykazano równiez, ze przekazywanie materialu genetycznego, warunkowane przez bialka fagowe, jest mozliwe pomiedzy komórkami gronkowca posiadajacymi otoczki. (bakterie takie nie moga byc biorcami

6 204 A. Mlynarczyk i inni Nr 3-4 w procesie transdukcji). Przekazywanie genów za posrednictwem mechanizmu zachodzacego w hodowlach mieszanych nie jest hamowane przez DNA-ze, gammaglobuline, surowice antyfagowa i pronaze (19, 20). Wykazano ponadto, ze na tej drodze moze zachodzic jednoczesne przekazywanie miedzykomórkowe nawet trzech róznych plazmidów (19, 20). Przekazywanie miedzykomórkowe w hodowlach mieszanych moze dotyczyc zarówno plazmidów jak i genów chromosomalnych (10, 15, 18) i moze odbywac sie jednoczesnie w obydwu kierunkach w odróznieniu od koniugacji warunkowanej przez plazmidy i transdukcji (4, 14). Jest równiez prawdopodobne, ze bialka fagowe uczestniczace w koniugacji sa tym samym co opisywany wczesniej czynnik, który nadaje komórkom gronkowcowym kompetencje do transfekcji i transformacji (11). Przypuszczalnie role ta moga spelniac zwiazane z powierzchnia bakterii zagregowane ogonki fagowe widoczne na zdjeciach z mikroskopu elektronowego wykonanych u komórek kompetentnych do pobierania izolowanego DNA. W przeprowadzonych przez nas badaniach wykazano mozliwosc przekazywania chromosomalnego regionu kodujacego opornosc na metycyline lacznie z plazmidem penicylinazowym zarówno pomiedzy szczepami S. aureus jak równiez miedzygatunkowo pomiedzy szczepami S. epidermidis i S. aureus. Koniecznosc obecnosci plazmidu pen i- cylinazowego w przypadku przekazywania opornosci na metycyline nalezy tlumaczyc obecnoscia w regionie zwiazanym z opornoscia na rtec sekwencji insercyjnych homologicznych do IS431mec i mogacych odgrywac duze znaczenie zarówno przy integracji jak i stabilizacji w chromosomie duzego fragmentu DNA jakim jest regulon mec (3, 11). Wykazano równiez, ze obecnosc profaga grupy serologicznej A moze równiez warunkowac miedzykomórkowe przekazywanie plazmidów i determinant chromosomalnych podobnie jak opisywana wczesniej obecnosc profagów grupy serologicznej B (7, 9, 19,20). WNIOSKI 1. Region kodujacy opornosc na metycyline podobnie jak inne determinanty opornosci moze byc przekazywany w hodowlach mieszanych szczepów S. aureus oraz pomiedzy szczepami S. epidermidis i S. aureus. Przy przekazywaniu opornosci na metycyline konieczna jest obecnosc plazmidu penicylinazowego u dawcy lub biorcy. 2. Przekazywanie genów opornosci w hodowlach mieszanych moze byc warunkowane przez bakteriofaga grupy serologicznej A. A. Mlynarczyk, G. Mlynarczyk, J. Jeljaszewicz TRANSMISSlON OF THE METHICILLIN RESISTANCE FROM STAPHYLOCOCCUS EPIDERMID/S TO STAPHYLOCOCCUSAUREUS IN MIXED CULTURES Summ ary In mixed cultures of staphylococci a transfer of the resistance to methicillin and penicillinase plasmids as well as tetracycline and chloramphenicol plasmids was investigated. Il was shown that the resistance to methicillin was transferred in mixed cultures from one strain of S. aureus to another and from S. epidermidis to S. aureus. In both cases transfer of methicillin resistance required, the presence of penicillinase plasmid in recipient or donor strain. In the case of other markers transmission was independent. Moreover it was shown that the transfer of resistance genes in mixed cultures was mediated by bacteriophage of the serologie group A.

7 Nr 3-4 Geny metycylinoopornosci gronkowców 205 PISMIENNICTWO 1. Barg NL, McMurray LU-: Characterization of anovel f3-lactamase plasmid widely distributed amon g borderline oxacillin-susceptible strain of Staphy/ococcus aureus. W: Molecular biology of the staphylococci. Red. R.P. Novick, R. A. Skurray, VCH Publishers, Inc., New York, 1990, Barr V, Barr K, Mil/ar MR, Lacey RU-: Beta-lactam antibiotics increase the frequency of plasmid transfer in Staphy/ococcus aureus. J Antimicrob Chemother 1986; 17: Berger-Biichi B. Resistance not mediated by f3-lactamase (Methicillin resistance). W: The staphylococci in human disease. Red. K.B. Crossley, G.L. Archer, Churchill Livington, New York, 1997, Darini AL. A genetic study of a Staphy/ococus aureus plasmid involving cure and transference. Rev Paul Med 1996; 114: Hackbarth Ci, Kocagoz T, Kocagoz S, Chambers HF. Point mutation in Staphy/ococcus aureus PBP 2 gene affect penicillin binding kinetics and are associated with resistance. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: le/jaszewicz 1, Mlynarczyk G, Mlynarczyk A. Present and future problems of resistance in Gram-positive cocci. Infection 1998; 26: Lacey RW. Evidence for two mechanisms of plasmid transfer in mixed cultures of S. aureus in vitro. J Gen Microbiol 1980; 119: Lee IS, Stewart PRo The virion proteins and ultrastructure of Staphy/ococcus aureus bacteriophages. J Gen Viro11985; 66: Lyon B, Skurray R. Antimicrobial resistance of Staphy/ococcus aureus: genetic basis. Microbiol Rev 1987; 51: Mitra M, Mukherjee M, Gupta MS, i inni. Phage-mediated conjugation in staphylococci as a means of transfer of drug-resistance. Ind J Exp Biol 1995; 33: Mlynarczyk A, Mlynarczyk G, le/jaszewicz l. The genome of Staphy/ococcus aureus: a review. Zbl Bakteriol 1998; 287: Mlynarczyk G, MlynarczykA, Bardowski 1, Osowiecki H. Localization of drug resistance genes in the hospital strains of Staphy/ococcus aureus. Genet Polon 1985, 26: Nob/e WC, Virani Z, Cree RGA. Co-transfer of vancomycin and other resistance genes from Enterococcus faeca/is NCTC to Staphy/ococcus aureus. FEMS Microbiol Lett 1992; 93: Okamoto R, Okubo T, lnoue M. Detection of genes regulating beta-lactamase production in Enterococcusfaeca/is and Staphy/ococcusaureus.Antimicrob Agents Chemother 1996;40: Pereira MS, Barreto ~ Siqueira-Iunior lp. Phage-mediated transfer of tetracycline resistance in Staphy/ococcus aureus isolated from cattle in Brazil. Microbios 1997; 92: Schaberg DR, C/ewel/ DB, G/atzer L. Conjugative transfer of R-plasmid from Streptococcus faeca/is to Staphy/ococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 1982; 22: Udo EE, Grubb WB. Transfer of plasmid-borne resistance from a multiply-resistant Staphy- /ococcus aureus isolate, WBG1022. Curr Microbiol1995; 31: Udo EE. Grubb WB. A phage-mediated transfer of chromosomally integrated tetracycline resistance plasmid in Staphy/ococcus aureus. Curr Microbiol1996; 32: Witte u-: Role <;>fphage in the transfer of plasmids in mixed cultures of Staphy/ococcus aureus. Zbl Bakteriol 1981; 249: Witte u-: Transfer of drug-resistance plasmids in mixed cultures of staphylococci. Zbl Bakteriol 1981; 10 (Suppl): Otrzymano: 31. III. 1999r. Adres Autora: Warszawa,ul. Chalubinskiego5, Zaklad MikrobiologiiLekarskiej Instytutu BiostrukturyAM w Warszawie.