Plazmidy. 4 Podział plazmidów cd.

Transkrypt

1 1 ELEMENTY GENETYKI BAKTERII Genom bakterii Zmienność mutacyjna Zmienność rekombinacyjna: Koniugacja Transformacja Transdukcja 2 Genom bakterii Na genom bakteryjny składają się: nukleoid (genofor, chromosom) plazmidy, profagi (np. Mu) genetyczne elementy translokacyjne (tj. sekwencje insercyjne IS, transpozony Tn oraz integrony) Plazmidy - są pozachromosomalnymi czynnikami genetycznymi - są autonomicznymi replikonami (posiadają własny układ replikacji, niezależny od chromosomu) - niektóre z nich (tzw. episomy, np. czynnik F) mają zdolność rekombinacji z genomem bakteryjnym stając się jego integralną częścią. 3 Plazmidy dzielimy ze względu na wielkość na: - małe (poniżej 25 tys. par zasad) - i duże (powyżej 25 tys. par zasad) ze względu na zdolność do autotransferu na: - koniugacyjne (1-3 kopii w komórce) np. plazmidy: R, F, Col B, Col V - niekoniugacyjne ( kopii w komórce) np. plazmidy Col E 1, Col E 2 są to na ogół małe plazmidy zakażające komórki bakteryjne na drodze mobilizacji, transformacji i/lub transdukcji 4 Podział plazmidów cd. ze względu na warunkowane cechy fenotypowe na: - płciowe (czynnik F) - lekooporności (plazmidy R) - bakteriocynogenii (plazmidy Col) - warunkujące właściwości metaboliczne (plazmid Hys) - warunkujące wirulencję (zjadliwość) bakterii (plazmidy Ent, Hly, CFA I/II) - warunkujące syntezę antybiotyków - kryptyczne (o nieznanej funkcji) 5 Genetyczne elementy translokacyjne: - sekwencje insercyjne (IS) kodują integrazę warunkującą translokację między replikonami - transpozony (Tn) zawierają na obu końcach IS, pomiędzy którymi zlokalizowany jest gen (geny) strukturalne warunkujące oporność na antybiotyki, sole metali ciężkich, czynniki wirulencji, właściwości kataboliczne transpozony mogą integrować się z różnymi replikonami obecnymi w komórce - integrony sekwencje oflankowane IS zawierające tzw. kasetę genową, do której mogą włączać się geny strukturalne np. warunkujące lekooporność 6 Zmienność mutacyjna Mutacje dzielimy na: spontaniczne (np. oporność na streptomycynę zachodzą z niską częstością (10-7 w przeliczeniu na populację bakterii) indukowane czynnikami mutagennymi (promieniowanie UV, kwas azotowy (III), hydroksyloamina HA, 5-bromouracyl BU, 2- aminopuryna AP, etylosiarczan etylu EES), zwiększającymi wielokrotnie częstość występowania mutacji 7 Podział mutacji cd. ze względu na rozmiar mutacje bakteryjne dzielimy na: punktowe (genowe) - tranzycje (pur/pur; pir/pir) - transwersje (pur/pir; pir/pur) - insercje dodanie nukleotydu - delecje wypadnięcie nukleotydu chromosomowe. - inwersje odwrócenie kolejności nukleotydów - duplikacje podwojenie sekwencji nukleotydów - delecje wypadnięcie znacznych fragmentów chromosomu - translokacje przemieszczenie fragmentów DNA w obrębie chromosomu 8 Przykłady mutantów bakteryjnych: - mutanty oporne na antybiotyki, np. Staphylococcus aureus oporny na metycylinę MRSA - mutanty fermentacyjne, np. Lac+ Lac-, Gal+ Gal- - mutanty auksotroficzne (wymagające do wzrostu czynnika wzrostowego): aminokwasu (np. Pro-, Try-), zasady organicznej (np. Ade-) czy witaminy (np. Bio-) - mutanty szorstkie (S R), np. Streptococcus pneumoniae utrata otoczki, Enterobacteriaceae utrata O-swoistych łańcuchów bocznych LPS

2 9 Zmienność rekombinacyjna Bakterie przekazują sobie DNA za pomocą trzech podstawowych mechanizmów: koniugacji transformacji transdukcji 10 zmienność rekombinacyjna cd. Koniugacja Najczęściej obserwowany sposób przekazywania DNA. Czynnik F w koniugacji biorą udział dwa typy komórek: komórki dawców zawierające czynnik F (F+) i komórki biorców bez tegoczynnika (F-) czynnik płciowy F (tzw. czynnik przenoszenia) koduje informację niezbędną do koniugacji niezbędny jest bezpośredni kontakt komórek czynnik F zawiera geny specjalnej fimbrii płciowej, która bierze udział w koniugacji oraz geny innych struktur powierzchniowych zaangażowanych w kontakt z komórkami F- 11 koniugacja cd. czynnik F jest samoprzekazywalny, gdy zostaje on przekazany do komórki F-, komórka staje się wówczas F+ i jest zdolna do przekazywania czynnika płciowego innym komórkom F- W ten sposób bakterie nabierają wielooporności na czynniki antybakteryjne. Komórki HFR Kiedy plazmid zawierający czynnik F zostaje włączony do chromosomu bakterii, określa się ją jako komórkę HFR (czyli komórkę szybko rekombinującą). 12 koniugacja cd. jedna nić kopii chromosomu jest przekazywana do komórki biorcy F-, a druga pozostaje w komóce HFR dawca nie zmienia się genetycznie komórki F- otrzymują fragmenty chromosomu, których rozmiar zależy od czasu koniugacji czynnikiem ograniczającym przekazywanie genów jest stabilność połączenie między fimbrią płciową a receptorem (białko OmpA) zazwyczaj wiązanie to zostaje zerwane przed upływem 2 godzin, potrzebnych do przekazania całego chromosomu bakterie HFR działają jako dawcy w czasie koniugacji chromosomalny DNA jest replikowany 13 zmienność rekombinacyjna cd. Transformacja Bakterie kończące swój żywot uwalniają DNA, który może zostać wychwycony przez inne bakterie. każdy obcy DNA, kiedy dostaje się do komórki, jest trawiony przez endonukleoazy restrykcyjne w pewnych warunków taki DNA może zostać jednak zintegrowany transformujący DNA może być chromosomalny lub plazmidowy i zawierać geny, które zmieniają komórkę biorcy Transformacja może więc prowadzić do rozprzestrzeniania się genów kodujących czynniki zjadliwości pomiędzy populacjami bakterii. 14 transformacja cd. Regulacja transformacji zależy od: kompetencji (zdolności bakterii do wychwytywania DNA i obecności na błonie komórkowej białek, które mają swoiste powinowactwo do DNA cech transformującego DNA (homogenność, podwójna nić i duża masa cząsteczkowa) Etapy procesu transformacji: a) w odwracalnym połączeniu DNA ze ścianą komorową uczestniczą siły jonowe między DNA a ścianą komórkową kompetentnego drobnoustroju Ten typ połączenia odbywa się u bakterii przez cały czas, ale jeśli komórka nie jest kompetentna, połączenie jest nietrwale i DNA uwalnia się i absorbuje gdzie indziej. 15 transformacja cd. b) po przejściu DNA przez ścianę komórkową ustala się nieodwracalne połączenie DNA z wewnętrzną błoną komórkową c) DNA wchodzi do cytoplazmy w formie pojedynczej nici d) integracja z chromosomalnym DNA (wymaga istnienia regionów homologicznych i obejmuje przemieszczenie jednej nici chromosomu, rekombinację wchodzącej nici, eliminację pozostałego fragmentu chromosomu i duplikację wchodzącej nici) 16 zmienność rekombinacyjna cd. Transdukcja W procesie transdukcji przekazanie DNA z jednej komórki do drugiej odbywa się przez wirusy bakteryjne zwane bakteriofagami. Zakażenie umiarkowane (ograniczone, lizogenne, lizogeniczne). charakteryzuje się włączeniem wirusowego DNA do chromosomu bakteryjnego bakterie uzyskują w ten sposób nowy zestaw genów należących do włączonych fagów (profagów) bakteriofagi wywołujące zakażenia lizogenne są również zdolne do zakażenia litycznego, ale wirulentne bakteriofagi mogą powodować tylko zakażenia lityczne (nie mogą powodować lizogennego)

3 17 Przykładem bakterii, których czynniki zjadliwości (zwykle egzotoksyny lub adhezyny) są kodowane przez lizogenne fagi jest Corynebacterium diphtheriae. Bakteria zakażona wirusem lizogenny jest więc zjadliwa, ale nie zakażony szczep jest nieszkodliwy. Rodzaje transdukcji: Transdukcja uogólniona jest wynikiem pomyłki w łączeniu się główek faga napełnianych DNA główki zamiast wokół materiału genetycznego faga gromadzą się wokół fragmentu chromosomu bakterii lub plazmidu po włączeniu dostatecznej ilości DNA do główki faga wirusowa endonukleaza przecina DNA, umożliwiając ostateczne skompletowanie cząstek faga zawierających DNA powstały fag jest określany jako uogólniona cząstka trandukująca 18 rodzaje transdukcji cd. Transdukcja specyficzna (czyli organiczna) zachodzi wtedy, gdy następuje replikacja profaga w bakterii lizogennej w czasie wytwarzania plazmidów F przy pomyłce enzymu tnącego powstaje specyficzny wirus transdukcyjny wówczas DNA znajdujący się w cząsteczkach potomnych zawiera małe fragmenty genomu gospodarza, które są zawsze wysoce swoiste, ponieważ pochodzą z obrzeży genomu wirusa (genom wirusa jest zawsze włączany w kilku swoistych miejscach, gdzie istnieje dostateczna homologia, aby umożliwić rekombinację DNA fagowego i bakteryjnego) 19 ANTYBIOTYKI 20 Klasyfikacje mechanizmów oporności Główne procesy bakteryjne zaburzane przez antybiotyki replikacja i utrzymanie struktury DNA transkrypcja biosynteza białka budowa ściany komórkowej funkcjonowanie błony komórkowej specyficzne dla bakterii szlaki metaboliczne Według zasady działania Według pochodzenia Według sposobu ekspresji Według miejsca kodowania 21 Zasada działania zmiana miejsca docelowego zmniejszenie stężenia leku w komórce - ograniczenie przepuszczalności - aktywne usuwanie inaktywacja cząsteczki leku stworzenie alternatywnego szlaku metabolicznego zmniejszenie wrażliwości enzymu 22 Pochodzenie naturalna oporność oporność nabyta - w drodze mutacji lub rekombinacji - importowana Rodzaje oporności oporność chromosomalna oprność plazmidowa oporność związana z syntezą enzymu 23 Pożądane właściwości antybiotyku selektywne działanie wobec miejsc docelowych drobnoustroju brak lub słabe działanie na komórki ssacze skuteczność wobec określonych drobnoustrojów istotnych klinicznie brak toksyczności długi czas półtrwania leku dobra penetracja tkanek odpowiednie oddziaływanie z białkami osocza łatwość podawania brak interferencji z innymi lekami 24 Podział preparatów o działaniu przeciwbakteryjnym Antybiotyki naturalne półsyntetyczne syntetyczne Chemioterapeutyki syntetyczne

4 25 Antybiotyki naturalne penicylina benzylowa i fenoksymetylowa glikopeptydy aminoglikozydy makrolidy daptomycyna 26 Antybiotyki półsyntetyczne półsyntetyczne penicyliny cefalosporyny aminoglikozydy glicylcykliny dalbawancyna makrolidy ketolidy Antybiotyki syntetyczne aztreonam chloramfenikol 27 Chemioterapeutyki linezolid fluorochinolony sulfonamidy trimetoprim 28 Mechanizm działania antybiotyków i chemioterapeutyków na drobnoustroje blokowanie biosyntezy ściany komórkowej uszkodzenie błony protoplazmatycznej blokowanie biosyntezy białka blokowanie syntezy dna 29 Główne grupy antybiotyków 30 β-laktamy penicyliny cefalosporyny makrolidy linkozamidy glikopeptydy aminoglikozydy tetracykliny fluorochinolony penicyliny cefalosporyny β-laktamy nieklasyczne - monobaktamy - karbapenemy - inhibitory β-laktamaz 31 Chromosomalne cefalosporynazy 32 Plazmidowe β-laktamazy mogą być wytwarzane przez wszystkie bakterie Gram-ujemne z rodziny Enterobacteriaceae ekspresja cefalosporynaz chromosomalnych może być - konstytutywna (np. Escherichia. coli, Acinetobacter), niezależna od obecności antybiotyku w środowisku - Indukcyjna, gdy ilość i aktywnośc wytwarzanego enzymu zależy od obecności w środowisku induktora (antybiotyku) są to penicylinazy i enzymy o szerokim spektrum substratowym β-laktamazy o szerokim spektrum substratowym są wytwarzane przez pałeczki gram-ujemne i w mniejszym stopniu przez bakterie gramdodatnie. dzielą się na β-laktamazy: - typu TEM i SHV - ESBL

5 33 Inhibitory β-laktamaz 34 Oporność gronkowców na metycylinę (MRSA) kwas klawulanowy sulbaktam tazobaktam Antybiotyk skojarzony z inhibitorem wnika do komórki bakteryjnej i swobodnie wiąże się z receptorem (białko wiążące penicyliny PBP), w tym czasie inhibitor wiąże się w sposób nieodwracalny z cząsteczką β- laktamazy. oporne na metycylinę szczepy Staphylococcus aureus wytwarzają białko pbp-2 lub pbp-2a, którego syntezę determinuje gen meca zlokalizowany w chromosomie komórki bakteryjnej szczepy S. aureus oporne na metycylinę wykazują krzyżową oporność ze wszystkimi antybiotykami β-laktamowymi, a często także z aminoglikozydami, fluorochinolami i makrolidami S. aureus są wrażliwe na antybiotyki glikopeptydowe i kotrimoksazol 35 Oporność na aminoglikozydy polega na: 36 Oporność na makrolidy, linkozamidy i streptograminy (MLS) enzymatycznej modyfikacji leku zmianie receptora komórkowego np. Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Enterococcus faecalis zaburzeniach przepuszczalności i transportu antybiotyku do wnętrza komórki Zdolność syntezy enzymów modyfikujących antybiotyk determinowana jest informacją zakodowaną w genomie plazmidu, transpozonu, rzadziej chromosomu. U bakterii Gram-dodatnich modyfikacja miejsca docelowego działania białko 23S RRNA (związana jest z obecnością w komórce genów erm, ten mechanizm oporności oznacza krzyżową oporność na wszystkie makrolidy, linkozamidy i streptograminy) enzymatyczna modyfikacja antybiotyku aktywne usuwanie antybiotyku z komórki 37 Oporność na fluorochinolony 38 Oporność na glikopeptydy geny oporności na fluorochinolony są zlokalizowane na chromosomie bakteryjnym, a podstawowym mechanizmem oporności są mutacje mutacje występują w genie odpowiedzialnym za syntezę gyrazy lub rzadziej topoizomerazy IV gyraza jest głównym miejscem docelowego działania fluorochinolonów u bakterii Gram-ujemnych, zaś topoizomeraza IV u bakterii Gramdodatnich Staphylococcus aureus i Streptococcus pneumoniae geny oporności mogą być zlokalizowane na chromosomie lub transpozonach oporne na glikopeptydy mogą być Enterococcus, Staphylococcus za oporność enterokoków na glikopeptydy odpowiedzialne są zespoły genów vana, vanb, vanc, vand i vane naturalnie oporne na glikopeptydy są Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus 39 Oporność na tetracykliny 40 Antybiotyki zostały wykorzystane w produkcji żywności jako: Mechanizm oporności polega na: utrudnionym dostępie leku do miejsca docelowego działania (rybosomu) aktywnym usuwaniu leku z komórki zmianie miejsca docelowego działania na skutek enzymatycznej modyfikacji środki przyspieszające wzrost środki konserwujące środki do zwalczenia szkodników Geny determinujące oporność na tetracykliny są zlokalizowane na plazmidach lub traspozonach

6 41 W latach zaczęto dodawać antybiotyki do pasz dla zwierząt, głównie w USA i w Wielkiej Brytanii potem w Polsce. 42 Zagrożenia dla zdrowia człowieka wynikające ze stosowania antybiotyków i innych leków w weterynarii: Większość podawanych zwierzętom antybiotyków, była równocześnie wykorzystywana w terapii ludzi. Wkrótce stało się to powodem znacznego przyśpieszenia procesu rozwoju oporności bakterii na antybiotyki. U ludzi i zwierząt następował wzrost zakażeń grzybami patogennymi, wirusami, a także pojawienie się enzymów bakteryjnych inaktywujących antybiotyki. wywołanie alergii powstawanie i narastanie oporności drobnoustrojów chorobotwórczych na antybiotyk toksyczność samych związków Większość antybiotyków działała hamująco na czynności układu immunologicznego, zmniejszając odporność zwierząt i ludzi na infekcje. W 1998 roku wprowadzono w Unii Europejskiej zakaz dodawania do pasz antybiotyków, wykorzystywanych w leczeniu ludzi. 43 Od 1 stycznia 2006 roku we wszystkich krajach Unii Europejskiej, w tym także w Polsce (rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dn. 28 lipca 2006 w sprawie sposobu postępowania z substancjami niedozwolonymi, pozostałościami chemicznymi, biologicznymi, produktami leczniczymi i skażeniami promieniotwórczymi u zwierząt i w produktach pochodzenia zwierzęcego, Dz. U. Nr 147, poz. 1067, z późn. zm.), obowiązuje całkowity zakaz używania antybiotykowych stymulatorów wzrostu (ASW) w paszach dla zwierząt, w produkcji zwierzęcej. 44 Skutki uboczne antybiotyków Antybiotyki są lekami, które hamują rozmnażanie się bakterii lub je zabijają. antybiotyki powinny być stosowane tylko w przypadku infekcji bakteryjnych antybiotyki są bardzo często przepisywane bez potrzeby, co na ogół źle odbija się na zdrowiu człowieka bakterie zwalczane nieodpowiednio dobranymi antybiotykami, stają się na nie oporne 45 Osłabienie odporności organizmu Antybiotyk nie działa jedynie na bakterie, które wywołują infekcje. niszczą też fizjologiczną florę bakteryjną jelit, skóry i błony śluzowej pochwy niszczą naturalne bariery chroniące nas przed drobnoustrojami Skutki: 46 Dlatego podczas kuracji antybiotykiem ważne są: higiena ciała, cieplejsze okrycie unikanie wychłodzenia i przegrzania stosowanie probiotyków np. Trillac, Linex Forte, Lacidofil oraz prebiotyków, zawartych m.in. w czosnku, cebuli, kaszach, bananach, płatkach kukurydzianych i chlebie znacznie obniżenie naszej odporności przedłużeniem infekcji nadkażeniami innymi drobnoustrojami, opornymi na aktualnie stosowany antybiotyk 47 Reakcje uczuleniowe najczęściej spotykamy się z uczuleniem na penicyliny, czyli jedne ze starszych antybiotyków znanych ludzkości. aby zapobiec reakcjom uczuleniowym, zleca się wykonanie prób uczuleniowych na dany lek (eżeli koś jest uczulony na jakikolwiek medykament, musi o tym poinformować każdego lekarza, który będzie udzielał pomocy i innych świadczeń) Podanie uczulającego leku grozi wstrząsem anafilaktycznym, a w najgorszym przypadku zgonem. 48 Biegunki i stany zapalne jelit Z powodu redukcji flory bakteryjnej jelit dochodzi do rozwoju dysbakteriozy jelit. Zazwyczaj ma to miejsce podczas doustnego przyjmowania antybiotyku. Manifestuje się ona głównie objawami ze strony przewodu pokarmowego i obejmuje: zapalenie błon śluzowych biegunki, niestrawność pleśniawki nadkażenia bakteryjne problemy z wchłanianiem składników pokarmowych.

7 49 Postępowanie w przypadku biegunek poantybiotykowych regularne przyjmowanie bakterii probiotycznych nie wolno spożywać jednocześnie probiotyków i antybiotyków zaleca się, by probiotyk przyjąć kilka godzin po antybiotyku i podczas kuracji antybiotykami spożywać fermentowane produkty mleczne np. jogurty, kefiry należy pamiętać o właściwym nawodnieniu organizmu (ok. 2-2,5l płynów) i diecie lekkostrawnej, by nie obciążać już i tak osłabionego układu pokarmowego 50 Infekcje grzybicze pochwy antybiotyki niszczą florę bakteryjną pochwy, którą tworzą m.in. z pałeczki kwasu mlekowego, zapewniające kwaśne ph pochwy (kwaśne środowisko pochwy uniemożliwia rozwój drobnoustrojów chorobotwórczych, głównie grzybów) wiele kobiet właśnie po antybotykoterapii, zmuszona jest szukaać pomocy u ginekologa, z powodu nieprzyjemnych infekcji pochwy, którym towarzyszy świąd okolic intymnych i obfite upławy grzybicy również możemy zapobiegać, przyjmując preparaty z probiotykiem, a także dbając o higienę intymną 51 Inne: uszkodzenia narządów wewnętrznych Działania toksyczne. Pewne antybiotyki mogą działać: ototoksycznie uszkadzać słuch, zwłaszcza u małych dzieci np. gentamycyna, amikacyna, neomecyna, hepatotoksycznie negatywnie wpływajć na wątrobę np. doksycyklina, nowobiocyna, nefrotoksycznie upośledzać funkcjonowanie nerek np. kolistyna, neurotoksycznie uszkadzać układ nerwowy np. kolistyna, toksycznie na szpik kostny np. nowobiocyna, detromycycna. 52 Stosowanie antybiotyków: zawsze musi być zlecone przez lekarza. niekoniecznie podczas zwykłego przeziębienia konieczne jest podanie antybiotyku. antybiotyk to lek zarezerwowany do leczenia zakażeń bakteryjnych, a nie wirusowych, grzybiczych, czy stanów zapalnych związanych ze zwyrodnieniem stawów. leki te przyjmujemy regularnie, o stałych porach i w niezmiennych dawkach. To, że lepiej się poczujemy podczas antybiotykoterapii wcale nas nie obliguje do samowolnego zaprzestania leczenia antybiotyk przyjmujemy wg. zaleceń lekarza więc jeśli trzeba zażywać go przez tydzień, dwa razy dziennie to właśnie tak postępujemy.