KONWERSJA LIZOGENNA JAKO CZYNNIK WPLYWAJACY NA ZJAWISKO TOLERANCJI NA WANKOMYCYNE U STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Transkrypt

1 MED. DOSW. MIKROBIOL., 1997,49, Grazyna Mlynarczyk, Andrzej Mlynarczyk, Dorota Zabicka, Janusz Jeljaszewicz* KONWERSJA LIZOGENNA JAKO CZYNNIK WPLYWAJACY NA ZJAWISKO TOLERANCJI NA WANKOMYCYNE U STAPHYLOCOCCUS AUREUS Zaklad Bakteriologii Klinicznej AM w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. F. Meisel-Mikolajczyk *Panstwowy Zaklad Higieny w Warszawie Wankomycyna dziala glównie jako inhibitor syntezy sciany komórkowej, prawdopodobnie poprzez wiazanie sie z acetylo-d-alanylo-d-alaninowym koncem prekursorów podjednostek peptydoglikanu i sferyczne blokowanie reakcji enzymatycznych zachodzacych w blonie cytoplazmatycznej, koniecznych do powiekszania sie lancuchów peptydoglikanu [10, 13]. Poczatkowo wsród gronkowców nie stwierdzono szczepów opornych na antybiotyki glikopeptydowe. Pierwsze doniesienia dotyczace opornosci na bakteriostatyczne dzialanie tej grupy leków pojawily sie w drugiej polowie lat BO-tych i dotyczyly. gronkowców koagulazoujemnych[15]. Opornosc na antybiotyki z tej grupy czesciej wystepuje i jest lepiej scharakteryzowana u przedstawicieli rodzaju Enterococcus [3, 14]. W przypadku gronkowców zlocistych nie stwierdzono dotychczas naturalnie wystepujacych szczepów opornych na dzialanie bakteriostatyczne wankomycyny. Szczepy S. aureus oporne na dzialamie bakteriostatyczne udalo sie jedynie uzyskac laboratoryjnie w wyniku wielokrotnych pasazy na wzrastajacych stezeniach wankomycyny [1B, 19] oraz w wyniku koniugacyjnego przekazania na filtrach genów opornosci na wankomycyne ze szczepu E. faecalis NCTC12201 do szpitalnego szczepu S. aureus [B]. Sa równiez doniesienia dotyczace naturalnie wystepujacych szczepów S. aureus opornych na dzialanie bakteriobójcze [17]. Szczepy oporne na dzialanie bakteriobójcze antybiotyku, a wrazliwe na dzialanie bakteriostatyczne sa rozpoznawane na podstawie antybiogramu jako wrazliwe. Mechanizm powstawania jak i molekularny charakter opornosci zarówno na bakteriobójcze jak i bakteriostatyczne dzialanie antybiotyków glikopeptydowych u gronkowców nie zostal do tej pory wyjasniony, aczkolwiek sa prowadzone na ten temat intensywne badania [1, 9, 13, 16]. Celem podjetych badan bylo ustalenie, czy modyfikacja genetyczna szczepu S. aureus jaka niewatpliwie jest lizogenizacja bakteriofagiem, moze wplywac na poziom opornosci szczepu na dzialanie bakteriobójcze wankomycyny. MATERIAL I METODY S z c z e p y b a k t e ryj n e i b a k t e ri o f a g i. Stosowano wzorcowy szczep S. aureus NCTC , pozbawiony profagów (nie lizogenny), oraz pochodne tego szczepu zlizogenizowane róznymi bakteriofagami otrzymanymi w naszym laboratorium.

2 14 G. Mlynarczyki inni Nr 1-2 Zastosowane bakteriofagi pochodzily z klinicznych szczepów S. aureus i zostaly przez nas wczesniej scharakteryzowane [6, 7]. Wszystkie mialy zdolnosc do powodowania zjawiska pozytywnej konwersji lizogennej cechy wytwarzania stafylokinazy. Cztery bakteriofagi nalezaly do grupy serologicznej A (lm81k, lm21, lm429, lm421-1), piec do grupy serologicznej B (lm18, lm507, lmps42e, lm6 i lll), a szesc do grupy serologicznej F (lm12, lm658-1, lm209p, lm22, lm7, lm13). Lizogenizacja szczepów S. aureus. Do 4,2 mi podloza TB dodawano: 0,5 mi 18 godzinnej hodowli szczepu gronkowca, 0,2 mi 0,1 M roztworu CaCh oraz 0,2 mi lizatu fagowego. Inkubacje prowadzono przez 24 godz. w temp. 30 C lub 37 C. Stosowano MOI (multiplicity of infection = PFU faga/cfu bakterii) wieksze od 6,4 [11, 12]. Po okresie inkubacji komórki wirowano w podlozu TB zawierajacym 1% cytrynianu sodu. Osad zawieszano w podlozu TB zawierajacym 0,5% cytrynianu sodu i wysiewano na podloza kontrolne. Zlizogenizowane szczepy, w odróznieniu od macierzystego szczepu S. aureus NCTC , wykazywaly opornosc na wprowadzonego bakteriofaga, uwalnialy takiego samego bakteriofaga po indukcji mitomycyna oraz wytwarzaly stafylokinaze. Oznaczanie MI C oraz MB C wankomycyny.micimbcoznaczano metoda makrorozcienczeniowa w oparciu o zalecenia Amerykanskiego Towarzystwa Mikrobiologów [2]. Jako inoculum stosowano 18-godzinna hodowle badanego szczepu w podlozu BHI (Difco). Do roztworu antybiotyku w podlozu Mueller Hintona dodawano inokulum bakteryjne w takiej ilosci aby uzyskac wyjsciowa gestosc komórek w granicach od 8 x los do 5 X 105 na mi. MIC okreslano jako najnizsze stezenie antybiotyku przy którym badany drobnoustrój nie wykazywal widocznego wzrostu po 24 godzinach inkubacji, natomiast jako MBC okreslano takie najnizsze stezenie antybiotyku przy którym po 24 godz. inkubacji przezywalo nie wiecej niz 0,1% bakterii wyjsciowego inokulum. WYNIKI W celu stwierdzenia czy integracja genomu bakteriofaga lagodnego z genomem bakterii moze wplywac na podatnosc komórek S. aureus na dzialanie bakteriobójcze wankomycyny zastosowano jako kontrole bezfagowy wzorcowy szczep S. aureus NCTC Szczep ten nastepnie zlizogenizowano pietnastoma róznymi bakteriofagami nalezacymi do grup serologicznych A, B i F. W wyniku tej lizogenizacji otrzymano pietnascie róznych pochodnych szczepu S. aureus NCTC , z których kazda zawierala innego profaga w genomie. Uzyskanym pochodnym do nazwy NCTC dodano nazwe bakteriofaga, który zostal uzyty do lizogenizacji. Zlizogenizowane szczepy w odróznieniu od macierzystego szczepu S. aureus NCTC , wykazywaly opornosc na wprowadzonego bakteriofaga, uwalnialy takiego samego faga po indukcji mitomycyna C oraz wytwarzaly stafylokinaze. Wszystkim otrzymanym pochodnym oznaczono wartosci MIC oraz MBC, a takze policzono stosunek MBC do MIC w celu wychwycenia ewentualnego wystapienia zjawiska tolerancji. Uzyskane wartosci porównano ze szczepem macierzystym. Wyniki przedstawiono w tabelach I-III.

3 Nr 1-2 Tolerancja na wankomycyne u S. aureus 15 Tabela I. Wartosci MIC i MBC wankomycynydla szczepus. aureus NCTC i jego wariantówzlizogenizowanychbakteriofagami grupy serologiczneja NCTC cI>M8JK 1,0 32,0 32 NCTC cI>M2J 1,0 64,0 64 NCTC cI>429 0,5 16,0 32 NCTC cI>M42J-J 1,0 32,0 32 Tabela II. Wartosci MIC i MBC wankomycynydla szczepus. aureusnctc i jego wariantów zlizogenizowanychbakteriofagamigrupy serologicznejb NCTC cI>MJ8 1,0 32,0 32 NCTC cI>M507 1,0 64,0 64 NCTC cI>MPS42E 1,0 16,0 16 NCTC cI>M6 0,5 0,5 l NCTC cI>11 0,5 4,0 8 Tabela III. Wartosci MIC i MBC wankomycynydla szczepus. aureusnctc i jego wariantów zlizogenizowanychbakteriofagami grupy serologicznejf NCTC cI>M12 1,0 16,0 16 NCTC cI>M658-J 1,0 32,0 32 NCTC cI>M209P 1,0 16,0 16 NCTC cI>13 1,0 32,0 32 NCTC cI>M22 1,0 8,0 8 NCTC cI>M7 0,5 0,5 l Wszystkie badane pochodne szczepu S. aureus NCTC oraz wyjsciowy szczep, wykazaly bardzo male zróznicowanie wartosci MIC od 0,5 do 1,0 llg/mi., co wskazuje, ze lizogenia badanymi bakteriofagami nie wplywa na wrazliwosc szczepu na bakteriostatyczne dzialanie leku. Znacznie bardziej zróznicowane wyniki otrzymano badajac stezenia bakteriobójcze (MBC). Wystepujace tu wahania wynosily od 0,5 do 64,0 Ilg wankomycyny/mi. W osmiu przypadkach stosunek MBC/MIC wynosil 32 lub wiecej, co swiadczylo o wystapieniu zjawiska tolerancji. Tak wysoki przyrost wartosci MBC obserwowano u wszystkich badanych pochodnych zlizogenizowanych bakteriofagami z grupy serologicznej A (4 pochodne na 4 badane), u dwóch pochodnych zlizogenizowanych fagami z grupy serologicznej B (2 pochodne na 5 badanych) oraz u dwóch zlizogenizowanych fagami z grupy serologicznej F (2 pochodne na 6 badanych). Ponadto, w przypadku dwóch pochodnych, jednej lizogennej bakteriofagiem z grupy serologicznej B i jednej lizogennej bakteriofagiem z grupy serologicznej F, zaobserwo-

4 16 G. Mlynarczyk i inni Nr 1-2 wano zmniejszenie wartosci MBC wankomycyny w stosunku do wyjsciowego szczepu NCTC , a tym samym tolerancji na ten antybiotyk. DYSKUSJA Uzyskane przez nas wyniki jednoznacznie sugeruja, ze na wystapienie zjawiska tolerancji S. aureus na wankomycyne moze miedzy innymi wplywac stan lizogenii bakteriofagami. Zaobserwowany wzrost wartosci MBC po wprowadzeniu do genomu bakterii pewnych profagów, a spadek MBC po wprowadzeniu innych wskazuje, ze wplyw tych czynników moze byc róznorodny. Mechanizm tego oddzialywania nie jest jasny i wymaga dalszych badan. Nie stwierdzono korelacji miedzy innymi wlasciwosciami badanych bakteriofagów takimi jak grupa lityczna, wlasciwosci morfologiczne (mikroskopia elektronowa) ani nawet miejscem insercji profaga w genomie bakterii. Wiekszosc badanych bakteriofagów wbudowywalo sie w postaci profaga w genom bakterii w obrebie genu warunkujacego wytwarzanie beta-hemolizyny, co przejawialo sie utrata tej cechy po lizogenizacji, ale niektóre wbudowywaly sie w innym miejscu. Nie korelowalo to jednak z kierunkiem zmian w wartosciach MBC dla wankomycyny. Mozna przypuszczac, ze mutacje w obrebie genomu S. aureus, które spowodowalyby jakakolwiek zmiane w docelowym miejscu dzialania antybiotyku (acetylo-d-alanylo-dalaninie), zredukowalyby jej kompleksowanie z antybiotykiem. Wplywalyby równiez na synteze peptydoglikanu i prawdopodobnie bylyby letalne dla komórki. U S. aureus opornosc moze potencjalnie pojawic sie poprzez zmiane przepuszczalnosci blony cytoplazmatycznej i uniemozliwienie antybiotykowi osiagniecia miejsca uchwytu, ale wymagaloby to duzych zmian w budowie zewnetrznej powierzchni komórki, poniewaz wankomycyna ma znacznie mniejsza wielkosc czasteczki niz jest to limitowane u bakterii Gram-dodatnich.. Opornosc na wankomycyne i teikoplanine u gronkowców koagulazo-ujemnych korelowana jest czesto z wystepowaniem bialka lub bialek blonowych [1, 9]. Jedno z takich bialek o ciezarze 35 kda ulegajace ekspresji wspólnie z PBP2 zostalo opisane u szczepu S. aureus opornego na teikoplanine [16]. Byc moze zjawisko tolerancji równiez wiaze sie z obecnoscia lub brakiem pewnych bialek na powierzchni komórki bakteryjnej, a na obecnosc tych bialek moze z kolei wplywac stan lizogenii fagowej. G. Mlynarczyk, A. Mlynarczyk, D. Zabicka, 1. Jeljaszewicz LYSOGENIC CONVERSION AS A FACTOR INFLUENCING VANCOMYCIN TOLERANCE PHENOMENON IN STAPHYLOCOCCUSAUREUS Summary The standard, non-iysogenic, bacteriophage-free S. aureus NCTC strain was Iysogenized with 15 different, obtained in our laboratory staphylokinase-convertingbacteriophages belonging to serologicalgroups A B and F. MIC and MBC of vancomycin as well as the ratio of MBC to MIC were evaluated for au 15 Iysogenicderivatives. The obtained results were compared with those for matemai strain. In the case of eight strains the ratio MBC/MICshowed the presence of tolerance to vankornycin(mbc/mic 2: 32). Four of the vancomycin-tolerant derivativeswere Iysogenizedwith bacteriophagesbelongingto the serologicalgroup A, two were members of group B and two belonged to group F. PISMIENNICTWO 1. Daum RS., Gupta S., Sabbagh R, Milewski Jv.M: J. Infect. Dis., 1992, 166, Hind1er J.: In Henry D. Isenberg (ed) CIinical Microbiology procedures Handbook, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1992, p Johnson A.P., Utley A.He,

5 Nr 1-2 Tolerancja na wankomycyne u S. aureus 17 Woodford N., George R.C: Clin. Med. Microbiol. Rev., 1990,3, JohnsonA.P., Woodford N: Bacterial antibiotic resistance. Curr. Op. Infect. Dis., 1993, 6, Miele A., Bandera M., Goldstein B.P.: Antimicrob. Agents Chemother., 1995, 39, Mlynarczyk G., Mlynarczyk A., Jeljaszewicz J.: Med. Dosw. Mikrobiol., , Mlynarczyk G., Mlynarczyk A., JeljaszewiczJ.: Med. Dosw. Mikrobiol., 1955, 47, Noble Jv.C, VU'aniZ., CreeR.GA.: FEMS Microbiol. Lett., 1992, 93, O'Hare MD., Reynolds P.E.: J. Antimicrob. Chemother., 1992,30, ReynoldsP.E., SommereA.: Drugs Exp. Clin. Res., 1990, 16, RosypalS., HorakovaD.: Publ. Fac. Sd. Univ. J. E. Purkyne, 1968,496, Rosypal S., RosypalovaA., Novotny M., OseckyP.: Folia Fac. Sd. Nat. Univ. Purk. Brunensis, Biologia 28, 1970, 11, Saha v., Gupta S., Daum R.S.: Infect. Agents Dis., 1992,21, Sahm D.M, Free L., HandwergerS.: Antimicrob. Agents Chemother. 1995, 39, SchwalbeR.S., StapeltonJ.T., GilganP.H.: N. Engl. J. Med., 1987,316, ShlaesD.M, ShlaesJ.H., VincentS., Etter L., FeyP.D., GoeringR.V.: Antimicrob. Agents Chemother., 1993, 37, Voom G.P., KuyvenhovenJ., Goessens WH.F., Schmal-Bauer Jv.C, Broeders P.H.M., ThomsonJ.,MichelM.F.:Antimicrob.Agents Chemother., 1994,38, Watanakunakom c: J. Antimicrob. Chemother., 1988,22, Watanakunakom C: J. Anrtimicrob. Chemother., 1990, 25, WoodfordN, Johnson A.P., MorrisonD., SpellerD.C: Clin. Microbiol. Rev., 1995,8, WoodfordN., MorrisonD., Johnson A.P., Bateman A.C., HastingsJ.G.M, Elliott T.S.J., Cookson B.: Microb. Drug Resistance, 1995, 1,235. Otrzymano:7. III. 1997r. Adres Autora: Warszawa,ul. Chalubinskiego5, Zaklad BakteriologiiKlinicznejAM.