Justyna Krystyna Ciepły Nr albumu Charakterystyka lekoopornych szczepów wirusa HIV 1 izolowanych w Polsce w 2008 roku

Transkrypt

1 Warszawski Uniwersytet Medyczny Wydział Farmaceutyczny Oddział Analityki Medycznej Justyna Krystyna Ciepły Nr albumu Charakterystyka lekoopornych szczepów wirusa HIV 1 izolowanych w Polsce w 2008 roku Praca magisterska wykonana w Zakładzie Mikrobiologii Farmaceutycznej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego pod kierownictwem naukowym prof. dr hab. Stefana Tyskiego Opiekunowie pracy: Dr n. farm. Bohdan Starościak (Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego) Dr n. med. Janusz J. Stańczak (Pracownia Diagnostyki Molekularnej Wojewódzkiego Szpitala Zakaźnego w Warszawie)

2 Wirus HIV 1 Zidentyfikowany w 1983 roku przez L. Montagnier, następnie w 1984 roku przez R. Gallo Rodzina Retroviridae, grupa Len.virus complex Ma kształt kulisty, średnicę 100 nm Genom to dwie cząsteczki jednoniciowego +ssrna Geny gag (białka strukturalne), pol (białka enzymatyczne), env (białka otoczki) oraz tat, rev, nef, vif, vpu, vpr (regulatorowe) Enzymy: 1 cząsteczka proteazy, 1 integrazy i 2 odwrotnej transkryptazy

3 Wirus HIV 1 Do wniknięcia do komórki wymaga cząsteczki CD4+ (receptor) oraz CCR5 lub CXCR4 (koreceptory) Szczepy M tropowe korzystające z CCR5 Szczepy T tropowe korzystające z CXCR4

4 Wirus HIV 1 główne grupy genetyczne M (major) Grupa M to 9 subtypów: A D, F H, J i K O (outlier) N (non M, non O) P ( wyizolowany w 2009 roku od kobiety z Kamerunu mieszkającej we Francji) Występują formy zrekombinowane CRF (Circulajng Recombinant Forms) 48 form np. CRF01_AE, CRF02_AG, CRF05_DF, CRF07_BC

5 Leki antyretrowirusowe Nukleozydowe (NtRTI) i nukleotydowe (NRTI) inhibitory odwrotnej transkryptazy Nienukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy (NNRTI) Inhibitory proteazy (PI) Inhibitory fuzji i wejścia (EI) Inhibitory integrazy (II) Nowe preparaty inhibitory dojrzewania (III faza badań klinicznych)

6 Metody oznaczania lekooporności Fenotypowanie (w tym również fenotypowanie wirtualne) Genotypowanie Hybrydyzacja Sekwencjonowanie

7 Czynniki wpływające na powstanie lekooporności wirusa HIV 1 Wysokie tempo replikacji (dziennie syntetyzowanych jest nowych wirionów) Niedokładność wirusowej odwrotnej transkryptazy 1 5x10 9 wirionów syntetyzowanych w ciągu 24 h zawiera mutacje w regionach kodujących odwrotną transkryptazę i proteazę Niewystarczająca współpraca pacjenta z lekarzem Akumulacja mutantów w czasie zakażenia

8 Oznaczanie lekooporności (zalecenia EACS) Pacjenci nowozdiagnozowani Pacjenci rozpoczynający leczenie o ile nie byli testowani wcześniej. Należy użyć najwcześniej pobraną próbkę krwi przed rozpoczęciem terapii. Pacjenci z niepowodzeniem leczenia (wirusologicznym) Kobiety ciężarne przed rozpoczęciem terapii (dla efektywnej terapii i ochrony dziecka przed zakażeniem) Profilaktyka poekspozycyjna

9 Cel pracy wykrycie mutacji odpowiedzialnych za oporność wirusa HIV 1 na leki ocena częstości występowania w Polsce wariantów genetycznych HIV 1 o obniżonej podatności na leki wykrycie przyczyn niepowodzeń terapeutycznych wśród pacjentów leczonych, umożliwienie prawidłowego doboru następnego schematu leczenia (nowych, aktywnych wobec mutantów leków) ocena występowania subtypów HIV 1 w Polsce ocena właściwości/przydatności metod sekwencjonowania ViroSeq i Trugene

10 Przygotowanie materiału Zbadano 285 próbek w tym 91 od chorych leczonych, 194 od nieleczonych Materiałem wyjściowym do badań było osocze Przed przystąpieniem do sekwencjonowania materiał przygotowywano w następujących etapach: a) Izolacja RNA wirusa HIV 1 b) Odwrotna transkrypcja c) Reakcja PCR d) Oczyszczanie DNA na kolumienkach e) Elektroforeza DNA w żelu agarozowym f) PCR sekwencyjny g) Oczyszczanie DNA

11 Metody sekwencjonowania ViroSeq HIV 1 Genotyping System v2.6 (Abbos, Niemcy) sekwencjonowany jest region kodujący proteazę wirusa (kodony 1 99) oraz 2/3 regionu kodującego odwrotną transkryptazę (kodony 1 335)

12 Metody sekwencjonowania Test Trugene HIV 1 Genotyping Assay (Siemens, Niemcy) określana jest sekwencja regionu proteazy wirusa (kodony 1 99) oraz odwrotnej transkryptazy wirusa (kodony )

13 Przydatność metod stosowanych do oznaczania lekooporności wirusa HIV 1 Metoda ViroSeq Zautomatyzowana Wykrywa 67 mutacji Etapy dodatkowe w przygotowaniu materiału Metoda Trugene Półautomatyczna Wykrywa 72 mutacje Brak etapów dodatkowych w przygotowaniu materiału Konieczna interwencja eksperta, nie wykrywa insercji i delecji Łatwiej poszerzyć oprogramowanie o wykrycie nowych mutacji Trudniej poszerzyć oprogramowanie o wykrycie nowych mutacji

14 Wynik sekwencjonowania Pik zielony adenina (A), czerwony tymina(t), niebieski cytozyna (C), czarny guanina (G)

15 Subtypy HIV 1 zidentyfikowane w Polsce w 2008roku 1,4% 0,4% 3,9% 0,7% 1,8% 91,9% B C D G CRF01_AE CRF02_AG

16 Wyniki Najczęściej wykrywane mutacje Chorzy leczeni NRTI i NtRTI: M184V NNRTI:K103N, Y181C, E138A PI: L10I, L10IL Chorzy nieleczeni PI: L10I, L90M, L76LV NRTI i NtRTI: M41L, T215S i M184V NNRTI: G190A Leki, na które wystąpiła największa oporność NNRTI: newirapina, delawirdyna, efawirenz NRTI i NtRTI: lamiwudyna, emtrycytabina PI: nelfinawir PI: nelfinavir, sakwinawir, indinawir NRTI i NtRTI: azydotymidyna, stawudyna NNRTI: newirapina

17 Wyniki pacjenci leczeni Wśród 91 pacjentów leczonych szczepy lekooporne HIV 1 stwierdzono u 35 (38,5%) 35% Częstość występowania wariantów opornych HIV 1 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% PI NRTI i NtRTI NNRTI Grupy leków

18 Wyniki pacjenci nieleczeni Wśród 194 pacjentów szczepy oporne wirusa HIV 1 stwierdzono u 15 (7,7%) 5,0% Częstość występowania wariantów opornych HIV 1 4,5% 4,0% 3,5% 3,0% 2,5% 2,0% 1,5% 1,0% 0,5% 0,0% PI NRTI i NtRTI NNRTI Grupy leków

19 Częstość występowania wariantów opornych HIV 1 wśród pacjentów nieleczonych w Polsce 30,0% 25,0% 20,0% 15,0% 28,7% 10,0% 14,1% 5,0% 5,8% 3,9% 7,7% 0,0%

20 Częstość występowania wariantów opornych HIV 1 wśród pacjentów leczonych w Polsce 80,0% 70,0% 60,0% 50,0% 40,0% 75,1% 76,7% 30,0% 20,0% 52,6% 43,1% 38,5% 10,0% 0,0%

21 Podsumowanie Chorzy leczeni częstość oporności wirusa HIV 1 na leki 38,5% Chorzy nieleczeni częstość oporności wirusa HIV 1 na leki 7,7% Subtypy HIV 1 w Polsce w 2008 roku: B(91,9%), C, D, G, CRF01_AE, CRF02_AG Metoda Trugene mniej złożona pod względem przygotowania materiału, metoda ViroSeq bardziej złożona

22 Dziękuję za uwagę