Wytwarzanie penicylinazy przez szczepy Neisseria gonorrhoeae izolowane od pacjentów kliniki dermatologii i wenerologii WUM w latach

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: Beata Młynarczyk-Bonikowska, Grażyna Przedpełska, Magdalena Malejczyk, Sławomir Majewski Wytwarzanie penicylinazy przez szczepy Neisseria gonorrhoeae izolowane od pacjentów kliniki dermatologii i wenerologii WUM w latach Katedra i Klinika Dermatologii i Wenerologii WUM Kierownik: prof. dr hab. Sławomir Majewski Badano wytwarzanie penicylinazy przez izolaty dwoinek rzeżączki wyosobnionych od pacjentów zgłaszających się do Poradni Kliniki Dermatologii i Wenerologii w latach Stwierdzono, że powyższy enzym wytwarzało średnio 0,8% badanych szczepów, jest to najniższy odsetek w Europie i jeden z najniższych na świecie. Rzeżączka jest częstą chorobą przenoszoną drogą płciową, rozpowszechnioną na całym świecie. W wielu krajach obserwuje się narastającą oporność czynnika etiologicznego tej choroby (dwoinki rzeżączki) na antybiotyki. Geny oporności mogą być łatwo przenoszone z jednego szczepu dwoinek rzeżączki do drugiego a nawet pobierane od innych bakterii np. niepatogennych dwoinek Neisseria kolonizujących gardło. Pierwsze przypadki oporności N. gonorrhoeae na penicylinę pojawiły się niedługo po zastosowaniu tego antybiotyku w leczeniu rzeżączki. Pierwszym poznanym i w dalszym ciągu istotnym mechanizmem oporności na penicylinę jest wytwarzanie penicylinazy. Zwykle jest to kodowana przez plazmidy (np. psj5.2 o wielkości 5,2 kb) beta-laktamaza TEM-1(1, 9). Niedawno opisano pojedyncze szczepy wytwarzające beta-laktamazę TEM- 135 kodowaną przez inne typy plazmidów (15). Można wyróżnić tzw. PPNG (penicyllinase producing N. gonorrhoeae) oraz PPNG- -TRNG (penicyllinase producing N. gonorrhoeae - tetracycline resistant N. gonorrheae), u których genowi dla penicylinazy towarzyszy gen warunkujący oporność na tetracykliny. Oporność na tetracykliny zlokalizowana w plazmidach wiąże się z aktywną ochroną miejsca docelowego dla antybiotyku poprzez produkcję białka TetM (1,9). Oporność na penicylinę warunkowana przez geny chromosomalne (CMRNG chromosomally mediated resistant N. gonorrhoeae) zwykle wiąże się ze współdziałaniem kilku różnych mechanizmów. Należą do nich :1.modyfikacja miejsca przyłączenia antybiotyku (mutacje i reorganizacje w obrębie genu pena kodującego transpeptydazę PBP-2 oraz w mniejszym stopniu mutacje w genie pona kodującym PBP-1), 2. aktywne usuwanie leku z komórki przez białko- pompę błonową Mtr (multiple transferable resistance) CDE. Przyczyną zwiększonego wytwarzania Mtr CDE są mutacje w genach represora lub promotora pompy mtrr,

2 116 B. Młynarczyk i inni Nr 2 3. zmniejszenie przepuszczalności błony zewnętrznej dla leku (mutacje genach kodujących białka porynowe PIB (gen penb) i PIA). U części szczepów opornych stwierdzono również mutację genu penc kodującego białko sekretyny PilQ (1, 9, 20). W przypadku towarzyszącej obniżonej wrażliwości na cefalosporyny najważniejszą rolę odgrywają mutacje w genie kodującym PBP-2, zwykle wiążące się z większymi zmianami w tym genie, niż gdy występuje tylko oporność na penicylinę. U szczepów N. gonorrhoeae o obniżonej wrażliwości na cefalosporyny opisywano również mozaikową strukturę PBP-2 (20, 4). Chromosomalna oporność na tetracykliny może być wynikiem mutacji w genie rpsj kodującym rybosomalne białko S10 (10). Oporność na inne antybiotyki jest kodowana przez geny chromosomalne. Przyczyną oporności na fluorochinolony mogą być mutacje w genach parc i gyra kodujących podjednostki topoizomerazy IV i topoizomerazy II (gyrazy). Najczęściej są to mutacje powodujące zamianę aminokwasów GyrA-Ser91Phe/GyrA-Asp95Gly/ParC-Ser87Arg (15). Oporność na azytromycynę (makrolidy) może być spowodowana przez syntezę metylaz 23SrRNA w podjednostce 50S rybosomu najczęściej ErmB, a u pojedynczych szczepów ErmA i ErmF, a także mutacje w obrębie V domeny 23SrRNA (6) oraz mutacje powodujące aktywację pompy błonowej MtrCDE (16). Oporność na spektynomycynę wiąże się z mutacjami w genach kodujących 16SrRNA w podjednostce 30S rybosomu (w wewnętrznym regionie genu rrs zawierającego helix 34: transwersja G1064C oraz tranzycja C1192U) (9). Celem pracy było zbadanie wytwarzania penicylinazy przez szczepy rzeżączki izolowane od pacjentów zgłaszających się do Kliniki Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego w latach MATERIAŁ I METODY Materiał pobierano z cewki moczowej, szyjki macicy, gardła lub odbytu od pacjentów zgłaszających się do Kliniki Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego w latach Jako kryterium zapalenia cewki moczowej przyjęto obecność powyżej 4 leukocytów w polu widzenia mikroskopu przy powiększeniu krotnym. W pozostałych przypadkach stan zapalny rozpoznawano na podstawie objawów klinicznych lub materiał pobierano od pacjentów z podejrzeniem zakażenia bezobjawowego. Każdy szczep pochodził od innego pacjenta. Bakterie hodowano na podłożu Roiron (Biomed) w atmosferze wzbogaconej w dwutlenek węgla i identyfikowano przy użyciu testu oksydazowego i testu wykorzystywania węglowodanów (spośród 5 cukrów N. gonorrhoeae fermentuje tylko glukozę). Obecność beta-laktamazy badano w testem jodometrycznym lub testem krążkowym BBL Cefinase discs (BD). Część próbek zbadano równolegle oboma testami uzyskując identyczne wyniki. W teście BD BBL na zwilżone wodą destylowaną krążki zawierające chromogeniczny antybiotyk nitrocefinę nanoszono kilka kolonii N. gonorrhoeae. Wynik odczytywano po co najmniej 1 minucie. W przypadku dodatniego wyniku następowała zmiana koloru krążka z żółtego na czerwony (spowodowana hydrolizą wiązania amidowego przez beta-laktamazę). W teście jodometrycznym rozmazy badanych szczepów (o średnicy 2-3mm) na paskach bibuły skrobiowej nasączonej roztworem penicyliny benzylowej ( jm/0,65ml)

3 Nr 2 Wytwarzanie penicylinazy przez N. gonorrhoeae 117 inkubowano przez 30 min. w temperaturze 37 C a następnie pokrywano rozcieńczonym odczynnikiem Lugola (zabarwienie granatowo-czarne) i odsączano. Wystąpienie odbarwienia wokół miejsca naniesienia bakterii do 5 min świadczyło o wytwarzaniu beta-laktamazy. WYNIKI Dodatnie wyniki posiewów w kierunku N. gonorrhoeae uzyskano u 516 z 1853 przebadanych pacjentów. Tylko w 4 przypadkach na 516, testy na wytwarzanie beta-laktamazy były dodatnie (0,8%) Dwa przypadki wytwarzania beta-laktamazy przez badane w naszym laboratorium szczepy dwoinek rzeżączki miały miejsce w 2006r. (183 badane próbki -1,1%) i po 1 w 2007(111 badanych próbek -0,9%) i 2008(91 badanych próbek 1,1%), a w 2009 r. nie wykryto ani jednego przypadku (na 94 zbadane dodatnie posiewy). Ponad 90% dodatnich posiewów w kierunku rzeżączki i wszystkie beta-laktamazo dodatnie izolaty pochodziły od mężczyzn (Tabela I). Tabela I. Wyniki badań mikrobiologicznych w kierunku N. gonrrhoeae w latach Liczba Wykonanych posiewów Lata K M K M K M K M Wyników dodatnich Izolatów wytwarzających betalaktamazę DYSKUSJA Beta-laktamazę wytwarzało zaledwie 0,8% badanych przez nas szczepów N. gonorrhoeae. Jest to wynik wyraźnie niższy w porównaniu z większością opublikowanych danych na ten temat pochodzących z innych krajów Europy i świata. Wcześniejsze dane pochodzące z raportów wysyłanych przez Katedrę i Klinikę Dermatologii i Wenerologii do Wojewódzkiej Stacji Sanitarno-Epidemiologicznej w Warszawie potwierdzają podobny odsetek szczepów wytwarzających penicylinazę (poniżej 1%) w Polsce w latach Badanie wrażliwości N. gonorrhoeae na antybiotyki jest w wielu rejonach świata objęte specjalnymi programami m.in. GISP(Gonococcal Isolate Surveillence Project) w USA, Australian Gonococcal Surveillance Programme, Euro GASP (European Gonococcal Antimicrobial. Surveillance Programme), RU-GASP (The Russian Gonococcal Antimicrobial Susceptibility Programme). W wielu krajach ze względu na wysoki odsetek szczepów opornych penicylina przestała być zalecana w leczeniu rzeżączki (m.in. wg CDC centers for disease control and prevention, USA oraz wg IUSTI -The International Union against Sexually Transmitted Infections), co spowodowało ponowny spadek oporności. Wytwarzanie penicylinazy przez N. gonorrhoeae w USA spadło z 11% w 1991 do 0,4% w Oporność na penicylinę warunkowana przez geny chromosomalne w 1999 w USA

4 118 B. Młynarczyk i inni Nr 2 wynosiła 5,7% następnie w 2004 spadła do 1% i w 2007 ponownie wzrosła do 2,5%(5). W krajach Ameryki Południowej w latach wytwarzanie penicylinazy przez dwoinki rzeżączki wynosiło zależnie od regionu 17,9 38,8%, a chromosomalna oporność na penicylinę 1,0 11,9% (8). Badania przeprowadzane w 2004 w 12 krajach Europy Zachodniej (Austria, Belgia, Dania, Anglia i Walia, Francja, Grecja, Włochy, Holandia, Portugalia, Szkocja, Hiszpania i Szwecja) wykazały że penicylinazę wytwarza 12,1% (6,7% PPNG i 5,9% PPNG-TRNG) oporność warunkowana chromosomalnie wynosiła 8,7 % (13). Dalsze badania w 17 krajach europejskich uczestniczących w programie badania oporności dwoinek rzeżączki na antybiotyki w latach wykazały wysoki poziom oporności na penicylinę u 12% badanych szczepów (7). W Grecji wytwarzanie penicylinazy przez badane szczepy N. gonorrhoeae zmniejszyło się z 11,6% w 2004 r. do 3,9% w 2008 (19). W Danii w 2007 r. stwierdzono oporność na penicylinę o różnych mechanizmach u 33,9% badanych szczepów dwoinek rzeżączki, a beta-laktamazę wytwarzało 7,75% (12). W Rosji w 2008 beta-laktamazę wytwarzało 2,2% badanych izolatów dwoinek rzeżączki, jednak odsetek oporności lub obniżonej wrażliwości na penicylinę (we wszystkich mechanizmach) wynosił 81,3% (11). W Indiach w latach wyizolowano 16, 5% PPNG, 4,7% PPNG-TRNG, a u 14,9% badanych izolatów N. gonorrhoeae stwierdzono oporność na penicylinę warunkowaną chromosomalnie (3). Jeszcze wyższy odsetek szczepów wytwarzających penicylinazę wykazały badania przeprowadzone w Chinach (Nanjing) i w 1999 wynosił on 8%, ale w 2004 wzrósł do 57,36% a w 2006 spadł do 44% (17).W Japonii w latach penicylinazę wytwarzało około 1,4% badanych szczepów N. gonorrhoeae, jest to wyraźnie niższy odsetek niż w innych krajach azjatyckich (15). W Australii w latach oporność na penicylinę różniła się znacznie zależnie od badanego regionu i na północy kraju wynosiła poniżej 5% (różne mechanizmy). W pozostałych rejonach Australii penicylinazę wytwarzało 6-14% badanych szczepów, ale oporność o różnych mechanizmach stwierdzono u prawie 50% izolatów. W 2008 r. Oporność na penicylinę średnia z różnych rejonów Australii, o różnych mechanizmach wynosiła 44% (18). Wysoki odsetek PPNG stwierdzono w Afryce Środkowej i Południowej; 25,8% szczepów dwoinek rzeżączki w RPA i aż 65% w Mozambiku wytwarzało penicylinazę (2, 10). Wysoka skuteczność kliniczna penicyliny prokainowej stosowanej w poradni Kliniki Dermatologii i Wenereologii w leczeniu rzeżączki potwierdza uzyskane w tej populacji wyniki i wskazuje na również niski odsetek oporności związanej z mechanizmami innymi niż produkcja beta-laktamazy (poniżej 5%). W podsumowaniu można stwierdzić że mimo stosowania penicyliny w leczeniu zakażeń N. gonnorhoeae odsetek szczepów wytwarzających beta-laktamazę w Polsce utrzymuje się na niskim poziomie (średnio 0,8% wszystkich badanych szczepów).

5 Nr 2 Wytwarzanie penicylinazy przez N. gonorrhoeae 119 B. Młynarczyk-Bonikowska, G. Przedpełska, M. Malejczyk, S. Majewski Penicillinase production by Neisseria gonorrhoeae strains isolated from the patients of Dermatology and Wenerology Clinic, Warsaw Medical University in SUMMARY In recent years the resistance of Neisseria gonorrhoeae to antibiotics is increasing in many countries. The aim of the study was to investigate penicillinase production by Neisseria gonorrhoeae strains isolated from the patients of Clinic of Dermatology and Wenerology WUM in a period between We cultured the bacteria on Roiron medium and we used the iodometric test or BBL Cefinase discs to detect penicillinase. The enzyme was produced by 1,1% of 183, 0,9% of 111, 1,1% of 94 and 0% of 91 of investigated strains, respectively in 2006, 2007, 2008 and 2009 year -on average by 0,8%. This is the lowest result in Europe and one of the lowest in the world. PIŚMIENNICTWO 1. Allen VG, Farrell DJ, Rebbapragada A i inni. Molecular analysis of antimicrobial resistance mechanisms in Neisseria gonorrhoeae from Ontario, Canada. Antimicrob Agents Chemother, 2010;55: Apalata T, Zimba TF, Sturm WA, Moodley P. Antimicrobial susceptibility profile of Neisseria gonorrhoeae isolated from patients attending a STD facility in Maputo, Mozambique Sex Transm Dis 2009; 36: Bala M, Jain RK, Ray K. Antimicrobial susceptibility profile of resistance phenotypes of Neisseria gonorrheae in India. Sex Transm Dis 2008; 35: Bala M, Sood S Cephalosporin Resistance in Neisseria gonorrhoeae. J Glob Infect Dis 2010; 2: Centers for Disease Control and Prevention. Sexually Transmitted Disease Surveillance 2007 Suppl., Gonococcal Isolate Surveillance Project (GISP) Annual Report Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, Chisholm SA, Dave J, Ison CA. High-Level Azithromycin Resistance Occurs in Neisseria gonorrhoeae as a Result of a Single Point Mutation in the 23S rrna Genes. Antimicrob Agents Chemother 2010, 54: Cole MJ, Chisholm SA, Hoffmann S i inni. European Surveillance of Sexually Transmitted Infections Network European surveillance of antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae. Sex Transm Infect 2010; 86: Dillon JA, Ruben M, Li H, Borthagaray G i inni. Challenges in the control of gonorrhea in South America and the Caribbean: monitoring the development of resistance to antibiotics. Sex Transm Dis 2006; 33: Dillon JA, Pagotto F. Importance of drug resistance in gonococci: from mechanisms to monitoring. Curr Opin Infect Dis 1999; 12: Fayemiwo SA, Müller EE, Gumede L, Lewis DA. Plasmid-Mediated Penicillin and Tetracycline Resistance Among Neisseria gonorrhoeae Isolates in South Africa: Prevalence, Detection and Typing Using a Novel Molecular Assay. Sex Transm Dis (publikacja w internecie, przed wydrukowaniem, PMID: ) 11. Kubanova A, Frigo N, Kubanov A i inni. The Russian gonococcal antimicrobial susceptibility programme (RU-GASP)-national resistance prevalence in 2007 and 2008, and trends during Euro Surveill 2010; 15:

6 120 B. Młynarczyk i inni Nr Lis-Tønder J, Cybulski Z Antimicrobial susceptibility and biochemical patterns of Neisseria gonorrhoeae strains in Vejle area, Denmark. J Eur Acad Dermatol Venereol 2009; 23: Martin IM, Hoffmann S, Ison CA; ESSTI Network European Surveillance of Sexually Transmitted Infections (ESSTI): the first combined antimicrobial susceptibility data for Neisseria gonorrhoeae in Western Europe. J Antimicrob Chemother 2006; 58: Ohnishi M, Ono E, Shimuta K i inni. Identification of TEM-135 beta-lactamase in penicillinase- -producing Neisseria gonorrhoeae strains in Japan. Antimicrob Agents Chemother 2010; 54: Starnino S, Dal Conte I, Matteelli A i inni. Trend of ciprofloxacin resistance in Neisseria gonorrhoeae strains isolated in Italy and analysis of the molecular determinants. Diagn Microbiol Infect Dis. 2010; 67: Starnino, S. and P. Stefanelli on behalf of the Neisseria gonorrhoeae Italian Study Group. Azithromycin-resistant Neisseria gonorrhoeae strains recently isolated in Italy. J. Antimicrob. Chemother 2009; 63: Su X, Jiang F, Qimuge, Dai X, Sun H, Ye S Surveillance of antimicrobial susceptibilities in Neisseria gonorrhoeae in Nanjing, China, Sex Transm Dis. 2007; 34: Tapsall JW, Limnios EA, Murphy D. Australian Gonococcal Surveillance Programme Analysis of trends in antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae isolated in Australia, J Antimicrob Chemother 2008; 61: Tzelepi E, Avgerinou H, Flemetakis A i inni. Changing figures of antimicrobial susceptibility and serovar distribution in Neisseria gonorrhoeae isolated in Greece. Sex Transm Dis 2010; 37: Zhao, S., M. Duncan, J. Tomberg, C. i inni. Genetics of chromosomally mediated intermediate resistance to ceftriaxone and cefixime in Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob Agents Chemother 2009; 53: Otrzymano: 24 V 2011 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Koszykowa 82a, Katedra i Klinika Dermatologii i Wenerologii WUM