Katedra i Zaklad Mikrobiologii Lekarskiej AM w Warszawie Kierownik Katedry i Zakladu: prof. dr hab. M. Luczak

Transkrypt

1 MED. DSW MIKRBIL., 003, SS, 09- Andrzej Mlynarczyk, Grazyna Mlynarczyk, Miroslaw Luczak WYSTEPWANIE STAPHYLCCCUS AUREUS BNIZNEJ WRAZLIWSCI NA ANTYBITYKI GLIKPEPTYDWE WSRÓD SZCZEPÓW IZLWANYCH Z KLINICZNEG MATERIALU W 00 RKU Katedra i Zaklad Mikrobiologii Lekarskiej AM w Warszawie Kierownik Katedry i Zakladu: prof. dr hab. M. Luczak Badano wystepowanie GISA i h-gvisa wsród MRSA izolowanych w naszym laboratorium. W materiale badanym stwierdzono szczepów, które mozna bylo zaliczyc do h-gisa oraz nie stwierdzono szczepu GISA. Nie stwierdzono wzrostu czestosci wystepowania szczepów h-gisa w stosunku do lat ubieglych. Zaobserwowano znaczny wplyw wyjsciowego inokulum bakteryjnego na ksztalt krzywej w analizie populacyjnej badanych oraz wzorcowych szczepów S. aureus wrazliwych, GISA i h-gisa. pornosc na antybiotyki glikopeptydowe wsród bakterii chorobotwórczych pojawila sie juz czternascie lat temu u enterokoków i od tego czasu w róznych krajach opisywano sporadyczne lub tez epidemiczne (na niektórych oddzialach szpitalnych) wystepowanie tego typu szczepów. becnie zostalo opisanych czternascie róznych genotypów warunkujacych opornosc enterokoków na wankomycyne. Jedenascie: vana, vanb, vanbl, vanb, vanb3, vandl, vand, vand3, vand4, vane i vang warunkuje nabyty typ opornosci (). Najszerzej rozprzestrzeniony jest genotyp vana, warunkujacy opornosc na wysokie stezenia wankomycyny i teikoplaniny (MI C wankomycyny - 04 mg/l, teikoplaniny - mg/l). Mimo, ze niektóre plazmidy czy transpozony ulegaja przekazywaniu w warunkach naturalnych pomiedzy szczepami gronkowców i enterokoków, to dopiero w 00 roku w USA opisano pierwszy naturalnie wystepujacy szczep Staphylococcus aureus oporny na glikopeptydy (MI C wankomycyny wynosilo > mg/l, a teikoplaniny 3 mg/l). Stwierdzono u tego szczepu wystepowanie genu vana. Przypuszczalne nastapilo w tym przypadku przekazanie opornosci ze szczepu enterokoka do szczepu gronkowca (). Jak dotad nie stwierdzono u gronkowców zadnego innego sposród genów van wykrytych u enterokoków. Jednakze w ostatnich latach pojawilo sie wiele doniesien na temat wyhodowania szczepów S. aureus o obnizonej wrazliwosci na antybiotyki glikopeptydowe, tzw. GISA (vancomycin intermediate S. aureus) i h-gisa (hetero-gisa). Szczepy GISA charakteryzuja sie MIC wankomycyny wiekszym lub równym mg/l, natomiast wystepujace znacznie od nich czesciej szczepy h-gisa charakteryzuja sie wartosciami MIC wankomycyny ponizej war-

2 0 A. Mlynarczyk i inni Nr3 tos ci granicznych, ale generuja subpopulacje o obnizonej wrazliwosci, o MIC ~ mg/l (fenotyp heterogenny). Które konkretnie geny sa odpowiedzialne za obnizenie wrazliwosci szczepu gronkowca na glikopeptydy nie zostalo jeszcze wyjasnione, pomimo, ze genom prototypowego szczepu GISA, MuS zostal w calosci zsekwencjonowany (0). Postuluje sie udzial systemu regulacyjnego agr () lub alternatywnego czynnika sigma sigb (). Podstawowa róznica, jaka zaobserwowano miedzy szczepami S. aureus o obnizonej wrazliwosci na glikopeptydy, a ich wrazliwymi pochodnymi jest zwiekszona synteza sciany komórkowej u szczepów mniej wrazliwych. W przypadku japonskich szczepów MuS i Mu3 stwierdzono zwiekszona inkorporacje N-acetyloglukozaminy oraz zwiekszona pule cytoplazmatycznych prekursorów sciany, a zwlaszcza UDP-N-acetylmuramyl- pentapeptydu (3, 4). statnie badania wykazaly, ze rózne szczepy o obnizonej wrazliwosci na glikopeptydy, pochodzace z róznych osrodków charakteryzowaly sie znacznie grubsza sciana komórkowa, a takze wyraznie dluzszym czasem generacji (, ). Poniewaz w przypadku zakazenia szczepem GISA antybiotyki glikopeptydowe sa nieskuteczne, a szczepy h-gisa uwazane sa za potencjalnych prekursorów szczepów GISA, wykrywanie GISA i monitorowanie h-gisa na oddzialach szpitalnych wydaje sie konieczne. statnio opisano wzrost MIC wankomycyny z mg/l do poziomu mg/l (GISA) u szczepów MRSA izolowanych kolejno od tego samego pacjenta w trakcie dlugotrwalego leczenia wankomycyna (). ile wykrywanie szczepów GISA jest w badaniach rutynowych niewatpliwie trudne, ale przy bardzo duzej starannosci wykonalne, o tyle wykrywanie szczepów h-gisa wymaga dzialan przekraczajacych rutynowe oznaczenia i jest niezwykle pracochlonne (S, ). Pomijajac pracochlonnosc oznaczen, uzyskane wyniki nie zawsze sa powtarzalne i wlasciwie nie ma jak dotad opracowanej dobrej metody badan. Metoda referencyjna jest jak dotad metoda analizy populacyjnej wg Hiramatsu (4). Celem podjetych przez nas badan bylo poszukiwanie wsród szczepów S. aureus izolowanych z materialów klinicznych szczepów o obnizonej wrazliwosci na wankomycyne, analiza populacyjna wybranych szczepów wg Hiramatsu oraz porównanie wyników tej analizy uzyskanych dla szczepów oznaczonych przez nas jako GISA lub h-gisa z wynikami dla szczepów wzorcowych MuS i Mu3 otrzymanych z Japonii. Badano wplyw wyjsciowego inokulum bakteryjnego na przebieg krzywej. MATERIAL I METDY s z c z e p y b a k t e ryj n e. Material do prowadzonych przez nas badan stanowily 03 metycylino-oporne szczepy S. aureus (MRSA) izolowane w 00 roku z róznych materialów od róznych pacjentów Szpitala Dzieciatka Jezus w Warszawie. Najwiecej szczepów MRSA pochodzilo z oddzialów: Dermatologii (0 szczepów), rtopedii ( szczepów), Intensywnej pieki Medycznej (3 szczepów), Chirurgii gólnej (3 szczepów) i Transplantologii ( szczepów). Wszystkie szczepy mialy oznaczana wrazliwosc na metycyline oraz inne antybiotyki przy zastosowaniu komercyjnych pasków ATB (biomerieux). Ponadto zastosowano wyizolowany przez nas wczesniej szczep V4 oznaczony jako GISA oraz wzorcowe szczepy MuS (GISA) i Mu3 (h-gisa) od prof. Keiichi Hiramatsu, a takze wrazliwe szczepy wzorcowe NCTC 3 i FDA09P.

3 Nr3 S. aureus o obnizonej wrazliwosci na glikopeptydy w s t e P n a s e l e k c j a h-glsa. Wstepna selekcje szczepów h-gisa wsród klinicznych szczepów S. aureus przeprowadzono nanoszac 0,0 mi nierozcienczonej oraz rozcienczonej l-krotnie godz. hodowli bakteryjnej w plynnym podlozu BHI na sektor podloza 4VBHI (podloze BHI zawierajace 4 mg/l wankomycyny). Szczepy wykazujace wzrost stosowano do dalszych oznaczen. z n a c z a n i e M I C. Wszystkie szczepy, które wykazaly wzrost na podlozach zawierajacych 4 mg/l wankomycyny mialy oznaczone dla tego antybiotyku MIC. Szczepy o podwyzszonym MIC wankomycyny mialy dodatkowo oznaczane MIC dla niektórych innych antybiotyków. Zastosowano dwie metody: makro-rozcienczeniowa, opisywana przez nas wczesniej (3) w oparciu o zalecenia NCCLS oraz metode z zastosowaniem E-testów. W obu przypadkach jako inokulum stosowano -godzinna hodowle badanego szczepu w podlozu BHI (Difco). W przypadku metody E-testów, zgodnie z zaleceniem producenta, stosowano podloze stale BHI oraz wyjsciowa gestosc zawiesiny w skali McFarlanda, natomiast w przypadku metody rozcienczeniowej podloze Mueller-Hintona (biomerieux) oraz gestosc zawiesiny 0, McFarlanda, zgodnie z wytycznymi NCCLS. Analiza populacyjna oraz ocena wplywu zastosowanego w y j s c i o w e g o i n o k u l u m. Zastosowano metode wg Hiramatsu oraz jej modyfikacje (). Do badan zastosowano szczepy oznaczone przez nas jako h-glsa oraz wzorcowe szczepy Mu0 (GlSA) i Mu3 (h-gisa), a takze wrazliwe szczepy wzorcowe NCTC 3 i FDA09P. Wysiewano po 0, mi z hodowli bakteryjnych o gestosci ok. 0cfu/ml oraz z jej dziesieciokrotnych rozcienczen na plytki z podlozem BHI zawierajacych wzrastajace stezenia wankomycyny od do mg/l. Plytki inkub owa no 4 godz. w temp. 3uC i liczono kolonie. Na tej podstawie wykreslono dla badanych szczepów krzywe póllogarytmiczne. WYNIKI Sposród przetestowanych 03 szczepów MRSA wyizolowanych w 00 roku w naszym laboratorium, wzrost na podlozu V4BHI wykazalo. Wszystkie te szczepy zostaly nastepnie przebadane pod katem analizy populacyjnej. Przygotowywano zawiesiny o gestosci 0i jej rozcienczenia. Na plytki z wzrastajacymi stezeniami wankomycyny wysiewano po 0, mi zawiesin. Przebieg krzywych wykreslano wychodzac z róznej poczatkowej liczby bakterii wysianych na plytke: 0i 0,0.Sposród badanych szczepów, piec wykazywalo przebieg krzywej charakterystyczny dla h-glsa. Wsród szczepów izolowanych w ostatnim roku nie znaleziono szczepów Gl- SA. Stwierdzona liczba szczepów h-glsa wsród MRSA izolowanych w 00 roku stanowi 4,% sposród wszystkich szczepów MRSA. W celu kontroli stosowanych metod wykrywania szczepów GlSA i h-glsa wykonano równiez analizy populacyjne dla wzorcowych szczepów Mu0 (GlSA) oraz Mu3 (h-gisa) oraz dla wzorcowych szczepów wrazliwych NCTC 3 i FDA09P. Uzyskane wyniki przedstawiono na rycinach -. Rycina przedstawia przebieg analizy populacyjnej dla wzorcowego szczepu wrazliwego NCTC 3. W przypadku tego szczepu obserwuje sie znaczny wplyw poczatkowego inokulum na uzyskane wyniki. Przy wysiewie na plytke nierozcienczonej hodowli uzyskuje sie pojedyncze kolonie nawet na podlozu zawierajacym mg/l wankomycyny. W przypadku innego wrazliwego szczepu

4 A. Mlynarczyk i inni Nr3 U l 3 4 wankomycyna (mgil) Ryc.l. Zaleznosc przebiegu krzywej populacyjnej od poczatkowego inokulum. Szczep S. aureus NCTC 3. ~ U 4 ~.s 3 l l 3 4 wankomycyna (mgil) Ryc.. Zaleznosc przebiegu krzywej populacyjnej od poczatkowego inokulum. Szczep S. aureus FDA09P.

5 Nr3 S. aureus o obnizonej wrazliwosci na glikopeptydy 3 j:) f;i;.. U 4 = wankomycyna (mgil) Ryc. 3. Zaleznosc przebiegu krzywej populacyjnej od poczatkowego inokulum. Szczep S. aureus MuS(GISA). j:) f;i;. U 4 -= wankomycyna (m gil) RycA. Zaleznosc przebiegu krzywej populacyjnej od poczatkowego inokulum. Szczep S. aureus V4 (GISA).

6 4 A. Mlynarczyk i inni Nr3 U Q wankomycyna (mgil) Ryc.S. Zaleznosc przebiegu krzywej populacyjnej od poczatkowego inokulum. Szczep S. aureus Mu3 (h-gisa). U Q wankomycyna (mgil) Ryc.. Zaleznosc przebiegu krzywej populacyjnej od poczatkowego inokulum. Szczep S. aureus VH (h-gisa).

7 Nr3 S. aureus o obnizonej wrazliwosci na glikopeptydy wzorcowego, FDA09P, nie zaobserwowano wplywu poczatkowego inokulum na koncowy wzrost bakterii na podlozach z wankomycyna (Ryc. ). Na rycinach 3 i 4 przedstawiono przebieg krzywych populacyjnych uzyskanych dla szczepów GISA. Dla szczepu MuS (Ryc. 3) przebieg krzywych jest zblizony i nie zalezy od inokulum. Wyrazne róznice w ksztalcie krzywych wystepuja w przypadku wyizolowanych w naszym laboratorium klinicznych szczepów V4 (GISA) i VH (h-gisa) (Ryc. 4 i ). Równiez inny przebieg ma krzywa otrzymana dla wzorcowego szczepu Mu3 przy inokulum 0niz przy nizszych wartosciach inokulum (Ryc. S). DYSKUSJA W naszych badaniach czestosc wystepowania szczepów h-gisa odnoszona jest do ogólnej liczby szczepów MRSA, poniewaz wsród szczepów wrazliwych na met y- cyline obnizona wrazliwosc na glikopeptydy nalezy do rzadkosci. Czestosc wystepowania szczepów h-gisa wsród MRSA izolowanych w 00 roku wynosila 4,%, co wobec 4,% wsród szczepów izolowanych w 00 stanowi pewien wzrost. Nie stwierdzono natomiast w 00 roku wystepowania szczepów GISA. statnio w literaturze swiatowej pojawia sie, coraz wiecej prac, w których poszukuje sie wsród szczepów S. aureus wyizolowanych w konkretnym okresie i konkretnym laboratorium szczepów wykazujacych tzw. heterogenny typ opornosci, tzw. szczepów h-gi- SA. Uzyskane wyniki sa rózne w zaleznosci od osrodka. Np. w trzech uniwersyteckich szpitalach w Japonii, Hiramatsu (4) wykazal, ze szczepy h-visa stanowily w jednym ze szpitali ponad 0% izolowanych S. aureus (od 0 do %), w drugim ze szpitali 0%, a w trzecim %. Byly jednak szpitale gdzie nie stwierdzono tego typu szczepów. gólem w Japonii Hiramatsu szacuje czestosc wystepowania h-visa na 9,3% w szpitalach klinicznych i na,3% w szpitalach miejskich. Podobne badania wykonywano dla szczepów izolowanych w USA, Europie i innych krajach, uzyskujac bardzo zróznicowane wyniki (,, ). Szczepy o obnizonej wrazliwosci na wankomycyne byly juz opisywane takze w Polsce (9, 3) w tym równiez przez nasz osrodek (3). Znaczne róznice w odsetku szczepów h-gisa uzyskiwane w róznych osrodkach wynikaja z jednej strony ze specyfiki badanego kraju czy szpitala, a z drugiej strony z niedoskonalosci i braku standaryzacji istniejacych metod. Wielu autorów poszukuje lepszej, bardziej miarodajnej metody, nadajacej sie do rutynowego zastosowania (S, ). Jak wiadomo inokulum bakteryjne zawsze odgrywa istotna role w badaniu ilosciowym wrazliwosci bakterii na antybiotyki, ale w przypadku oznaczania wrazliwosci gronkowców na antybiotyki glikopeptydowe ma szczególne znaczenie. Jak wykazaly nasze wczesniejsze wlasne doswiadczenia zastosowanie wysokiego inokulum (00CFU/ml) moze prowadzic do uzyskania wzrostu nawet wrazliwych szczepów na plytkach zawierajacych - mg/l wankomycyny. Natomiast zastosowanie zalecanego przez NCCLS w badaniach inokulum Sx0s CFU/ml moze powodowac przeoczenie szczepów GISA, a zawsze szczepów h-gisa. W naszych badaniach porównalismy wplyw poczatkowego inokulum na analize wrazliwosci na wankomycyne. Zastosowano szczepy wlasne oraz wzorcowe. Biorac pod uwage, ze przy rozcienczaniu zawiesiny bakterii w przypadku szczepów h-gisa zmniejsza sie równiez proporcjonalnie liczba komórek o obnizonej wrazliwosci, po-

8 A. Mlynarczyk i inni Nr3 winnismy otrzymac krzywe o podobnym ksztalcie. Jednak nie zawsze tak jest. Wykazano, ze przy zastosowaniu wysokich wartosci inokulum latwiej jest uzyskac falszywie dodatnie wyniki. Prawdopodobnie wplyw wysokich wartosci inokulum ma znaczenie przy formowaniu sie biofilmu bakteryjnego, a wlasnie zdolnosc szczepu do tworzenia biofilmu moze miec wplyw na wrazliwosc na glikopeptydy. Ponadto, jak wykazaly wczesniejsze badania, sciana komórkowa gronkowców wiaze antybiotyki glikopeptydowe usuwajac je z podloza. Dlatego przy wyzszej gestosci bakterii moze lokalnie dochodzic do obnizenia stezenia antybiotyku w podlozu, co ulatwia wzrost wiekszej liczbie komórek. A. M l Yn a r c z y k, G. M l Yn a r c z y k, M. L u c z a k SEARCHING FR STAPYLCCCUS AUREUS STRAINS WITH REDUCED SUSCEPTIBILITY T GLYCPEPTIDES AMNG CLINICAL ISLATES BTAINED DURING 00 YEAR Summary The methicillin-resistant strains of S. aureus (MRSA) isolated in our laboratory were searched for strains with decreased susceptibility to glycopeptides, GISA (glycopeptide intermediate Staphylococcus aureus) and hetero-gisa strains. 03 strains isolated in 00 were investigated. Five h-visa and none VISA strain were found. There was not observed any increase in the frequency of VISA and h-visa comparing to the former years. In the case of some clinical as well as standard strains (susceptible, GISA and especially h-gisa) the start inoculum significantly influenced a shape of the growth curve obtained as a result of the population analysis. PISMIENNICTW. Chang S, Sievert DM, Hageman JC i inni. Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus investigative team. Infection with vancomycin-resistant Staphylococcus aureus containing the vana resistance gene. N Engl J Med 003; 34: Cui L, Ma X, Sato K i inni. Cell wall thickening is a common feature of vancomycin resistance in Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol003; 4: Hanaki H, Labischinski H, lnaba Y i inni. Increase in glutamine-non-amidated muropeptides in the peptidoglycan of vancomycin-resistant Staphylococcus aureus strain Mu0. J Antimicrob Chemother 99; 4: Hiramatsu K, Aritaka N, Hanaki H i inni. Dissemination in Japanese hospitals of strains of Staphylococcus aureus heterogeneously resistant to vancomycin. Lancet 99; 30: Howe RA, Wootton M, Walsh TR i inni. Expression and detection of hetero-vancomycin resistance in Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother 999; 44: -.. Hubert SK, Mohammed JM, Fridkin SK i inni. Glycopeptide-intermediate Staphylococcus aureus: evaluation of anovel screening method and results of a survey of selected U.S. hospitals. J Clin Microbiol999; 3: Jeljaszewicz J, Mlynarczyk G, Mlynarczyk A. Antibiotic resistance in Gram-positive cocci. Int J Antimicrob Agents 000; : Kim MN, Hwang SH, Pyo YJ, Mun HM, Pai CH. Clonal spread of Staphylococcus aureus heterogeneously resistant to vancomycin in a university hospital in Korea. J Clin Microbiol 00; 40: Krzyszton-Russjan J, Gniadkowski M, Polowniak-Pracka H i inni. The first Staphylo-

9 Nr3 S. aureus o obnizonej wrazliwosci na glikopeptydy coccus aureus isolates with reduced susceptibility to vancomycin in Poland. J Antimicrob Chemother 00; 0: Kuroda M, hta ; Uchiyama I i inni. Whole genom e sequencing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus, the major hospital pathogen. Lancet 00; 3: Marchese A, Balistreri G, Tonoli E i inni. Heterogeneous vancomycin resistance in methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains isolated in a large Italian hospital. J Clin Microbiol 000; 3: -9.. Marlowe EM, Cohen MD, Hindler JF i inni. Practical strategie s for detecting and confirming vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus: a tertiary-care hospitallaboratory's experience. J Clin Microbiol 00; 39: Mlynarczyk G, Mlynarczyk A, Luczak M. VISA i hetero-visa wsród szczepów Staphylococcus aureus izolowanych z przypadków klinicznych. Med Dosw Mikrobiol 00; 4: Peschel A, Vuong C, tto M, Gotz F. The D-alanine residues of Staphylococcus aureus teichoic acids alter the susceptibility to vancomycin and the activity of autolytic enzymes. Antimicrob Agents Chemother 000; 44: 4-.. Sakoulas G, Eliopoulos GM, Moellering RC Jr i inni. Accessory gene regulator (agr) 0- cus in geographically diverse Staphylococcus aureus isolates with reduced susceptibility to vancomycin. Antimicrob Agents Chemother 00; 4: Sieradzki K, Leski ; Dick J i inni. Evolution of a vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strain in vivo: multiple changes in the antibiotic resistance phenotypes of a single lineage of methicillin-resistant S. aureus under the impact of antibiotics administered for chemotherapy. J Clin Microbio003; 4: Sieradzki K, Tomasz A. Gradual alterations in celi wall structure and metabolism in vancomycin-resistant mutants of Staphylococcus aureus. J Bacteriol999; : -0.. Singh VK, Schmidt JL, Jayaswal RK, Wilkinson BJ. Impact of sigb mutation on Staphylococcus aureus oxacillin and vancomycin resistance varies with parental background and method of assessment. Int J Antimicrob Agents 00; : -. trzymano: 3 V 003 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chalubinskiego S, Katedra i Zaklad Mikrobiologii Lekarskiej AM w Warszawie.