WRAZLIWOSC NA WANKOMYCYNE I TEIKOPLANINE KOAGULAZO-UJEMNYCH SZCZEPÓW Z RODZAJU STAPHYLOCOCCUS IZOLOWANYCH Z MATERIALU KLINICZNEGO

Transkrypt

1 -. ; MED. DOSW. MIKROBIOL., 1999,51,17-23 Grazyna Mlynarczyk, 1Andrzej MlynarczykI, Miroslaw Luczae, Janusz Je/jaszewicz2 WRAZLIWOSC NA WANKOMYCYNE I TEIKOPLANINE KOAGULAZO-UJEMNYCH SZCZEPÓW Z RODZAJU STAPHYLOCOCCUS IZOLOWANYCH Z MATERIALU KLINICZNEGO Zaklad MikrobiologiiLekarskiej A.M. w Warszawie1 Kierownik: prof. dr M. Luczak Panstwowy Zaklad Higienl Dyrektor Instytutu prof. dr hab. J. Je/jaszewicz Oceniono czestosc wystepowania szczepów opornych i szczepów o podwyzszonej opornosci na teikoplanine i wankomycyne wsród 686 koagulazoujemnych gatunków Staphylococcus izolowanych w ciagu roku z przypadków klinicznych. Stwierdzono znacznie czestsze wystepowanie podwyzszonej opornosci na teikoplanine niz na wankomycyne. Bzczepom o podwyzszonej opornosci na teikoplanine oznaczono wartosci MIC oraz MBC. Gronkowce koagulazo-ujemne stanowia obecnie najczesciej izolowana grupe mikroorganizmów z materialu klinicznego. Jest to zwiazane z powszechnym wystepowaniem niektórych gatunków na skórze oraz blonach sluzowych u ludzi. Drobnoustroje te charakteryzuja sie wzglednie mala wirulencja dla ludzi zdrowych, jednak w ostatnich latach bakterie te staly sie jednym z glównych czynników zakazen szpitalnych (4). Wiaze sie to z postepem technik medycznych, zarówno diagnostycznych jak i leczniczych. Utrzymywanie przy zyciu i leczenie chorych po coraz bardziej skomplikowanych zabiegach chirurgicznych wiaze sie zarówno z.obnizeniem odpornosci chorych, jak i z koniecznoscia stosowania róznego typu technik medycznych jak zywienie pozajelitowe, dlugotrwale cewnikowanie itp. stanowiacych glówny czynnik ryzyka. Opornosc na antybiotyki gronkowców koagulazo-ujemnych izolowanych od chorych hospitalizowanych jest zwykle wysoka. Coraz czesciej izolowane sa szczepy metycylinooporne i one stanowia powazny problem terapeutyczny. W leczeniu powaznych zakazen spowodowanych przez gronkowce koagulazo-ujemne lekami z wyboru sa antybiotyki glikopeptydowe, takie jak wankomycyna i teikoplanina (3, 8, 9). Do niedawna bakterie te wykazywaly niezmiennie wrazliwosc na te antybiotyki, ale obecnie coraz czesciej pojawiaja sie doniesienia w których opisywane sa szczepy oporne. Zwlaszcza istotne jest ostatnio opisane pojawienie sie szczepów S. aureus opornych na antybiotyki glikopeptydowe (6). Praca czesciowofinansowanaz grantu KBN 4 P05F

2 18 G. Mlynarczyki inni Nr 1-2 o ile mechanizmy na poziomie molekularnym jak równiez uwarunkowanie genetyczne opornosci na antybiotyki glikopeptydowe u enterokoków zostaly stosunkowo dobrze poznane i sa wciaz przedmiotem intensywnych badan (I, 5, 10, 16), to niewiele jest danych na temat opornosci gronkowców na te grupe antybiotyków. Wiadomo jednak, ze mechanizm opornosci u gronkowców jest inny niz u paciorkowców kalowych (7). W przeciwienstwie do paciorkowców, gronkowce sa ogólnie rzecz biorac bardziej wrazliwe na wankomycyne niz na teikoplanine. Szczepy S. haemolyticus oporne na teikoplanine izolowano zanim antybiotyk ten zostal wprowadzony do handlu. Istnieja dowody, ze opornosc wiaze sie ze zmianami w scianie komórkowej, przy czym nie wiadomo, czy zmiany te sa pierwotne c;zywtórne w stosunku do opornosci. Mikroskopia elektronowa transmisyjna wykazala u róznych gatunków gronkowców, ze sciana u bakterii opornych na glikopeptydy jest grubsza, bardziej nieregularna niz u wariantów wrazliwych. Dalsze badania wykazaly, ze szczep oporny na teikoplanine wykazywal zwiekszona ekspresje bialek PBP2-1 i PBP2-2 oraz byl bardziej wrazliwy na lize przy uzyciu lizostafiny niz macierzysty szczep, wrazliwy na teikoplanine (18). Fenotypy opornosci na glikopeptydy u gronkowców sa konstytutywne i charakteryzuja sie obecnoscia dodatkowego lub tez zwiekszona ekspresja istniejacego bialka o masie czasteczkowej która wynosi w zaleznosci od zródla informacji (byc moze od gatunku) od 35 do 39 kda. Milewski i wsp. (11) zidentyfikowali to dodatkowe bialko jako przedstawiciela rodziny dehydrogenaz zaleznych od NAD+. Do tej rodziny nalezy dehydrogenaza D-hydroksykwasów (VanH), zwiazana z opornoscia na wankomycyne u enterokoków. Gen tej dehydrogenazy u gronkowców nazwano ddh. i zostal on ostatnio sklonowany (2). Dane te sugerowalyby ze mechanizm opornosci na glikopeptydy u gronkowców moze byc podobny do mechanizmu u enterokoków. Równiez podobne wnioski wyciageli Billot- Klein i wsp. [1], którzy wykazali ostatnio obecnosc bardzo malych ilosci prekursorów peptydoglikanu zakonczonych D-mleczanem u szczepu S. haemolyticus. Autorzy jednakze nie sa przekonani, czy tak mala ilosc prekursora zakonczonego D-mleczanem (tylko 1,7% wszystkich prekursorów) moze wyjasnic opornosc (MIC wankomycyny dla tego szczepu wynosilo 16 mg!l). Inni autorzy (17) nie stwierdzili u badanego przez siebie mutanta S. aureus, hodowanego w obecnosci 50 mg!l wankomycyny, obecnosci nawet malych ilosci D-mleczanu w prekursorach peptydoglikanu. Nie stwierdzili oni znaczacych róznic w budowie peptydoglikanu u szczepu mutanta i szczepu rodzicielskiego. Jedynie szczep mutanta charakteryzowal sie znacznie obnizona liczba wiazan krzyzowych (mniejsze usieciowanie). Hodowle bakteryjne aktywnie usuwaly antybiotyk z podloza, po czym mógl on byc odzyskany w formie aktywnej. Wankomycyna blokowala in vitro ekstrakty enzymów autolitycznych, lizostafine i mutanolizyne. Antybiotyk powodowal akumulacje materialu sciany na powierzchni komórki oraz hamowanie oddzielania sie komórek siostrzanych. Celem podjetych badan byla ocena poziomu opornosci na wankomycyne (MI C) oraz na teikoplanine (MIC i MBC) szczepów gronkowców koagulazo-ujemnych aktualnie izolowanych z materialu klinicznego.

3 Nr 1-2 Wrazliwosc gronkowców na glikopeptydy 19 MATERIAL I METODY S z c z e p y b a k t e ryj n e. Przeanalizowano szczepy gronkowców izolowanych w 1997 r. z próbek materialu pochodzacego z róznych oddzialów Panstwowego Szpitala Klinicznego Nr 1. Material pochodzil glównie od chorych hospitalizowanych ale w przypadku niektórych oddzialów zabiegowych równiez od chorych leczonych ambulatoryjnie. Material pochodzil z nastepujacych oddzialów: Chirurgia i Transplantologia, OlOM, Ortopedia, Ginekologia, Noworodki, Odzial Internistyczny, Chirurgia szczekowa, Okulistyka. Uwzgledniono wszystkie szczepy gronkowców izolowane w naszym laboratorium od do Gronkowce byly identyfikowane przy pomocy systemu API ID 32 (biomerieux). Wrazliwosc na antybiotyki oznaczano przy uzyciu systemu ATB STAPH (biomerieux). Wrazliwosc na metycyline oznaczano metoda krazkowa stosujac agar Mueller-Hintona nr 2 (biomerieux) z dodatkiem 5 % NaCI oraz krazki z 1 Jlg oksacyliny. Do dalszych badan wybrano 20 szczepów S. epidermidis oraz 20 szczepów S. haemolyticus wykazujacych opornosc na teikoplanine w rutynowych testach. Dla tych szczepów wykonano oznaczenie MIC oraz MBC teikoplaniny. Oznaczanie MI C oraz MB C teikoplaniny iwankomycyny. MIC i MBC oznaczano metoda makro-rozcienczeniowa w oparciu o zalecenia NCCLS (15). Jako inokulum stosowano 18-godzinna hodowle badanego szczepu w podlozu BHI (Difco). Do roztworu antybiotyku w podlozu Mueller-Hintona dodawano inokulum bakteryjne w takiej ilosci, aby uzyskac wyjsciowa gestosc komórek w granicach od 8 x losdo 5 x los/mi. MIC okreslano jako najnizsze stezenie antybiotyku przy którym badany drobnoustrój nie wykazywal widocznego wzrostu po 24 godzinach inkubacji, natomiast jako MBC okreslano takie najnizsze stezenie antybiotyku przy którym po 24 godz. inkubacji przezywalo nie wiecej niz 0,1% wyjsciowego inokulum (15). WYNIKI Najliczniej reprezentowanymi gatunkami wsród badanych szczepów gronkowców byly S. epidermidis (354 szczepy) i S. aureus (325 szczepów). Pozostale najczesciej izolowane gatunki to S. haemolyticus (97 szczepów), S. hominis (35 szczepów) i S. wameri (33 szczepy), S. capitis (40 szczepów). Stosunkowo niewiele wyhodowano szczepów nalezacych do S. saprophyticus, prawdopodobnie dlatego, ze w naszym laboratorium mocz jest stosunkowo rzadko badanym materialem. Wyhodowane szczepy pochodzily glównie z wymazów, najczesciej byly to wymazy z ran, rurek i cewników, oraz wyhodowania z krwi. Wyniki badania opornosci na wankomycyne, teikoplanine oraz metycyline przedstawiono w tabeli I. Glównym przedmiotem naszego zainteresowania byly gronkowce koagulazo-ujemne, ale dla porównania podano równiez wyniki dotyczace wyhodowanych w tym samym czasie szczepów S. aureus. Przy uzyciu systemu ATB STAPH najwiecej szczepów opornych na glikopeptydy zidentyfikowano w obrebie S. haemolyticus. Przy czym opornosc ta dotyczyla glównie teikoplaniny, prawie 27% izolowanych szczepów tego gatunku zaklasyfikowano jako oporne. Tylko 1 szczep zaklasyfikowano jako oporny na wankomycyne. Znaczny odsetek szczepów opornych stwierdzono równiez w obrebie gatunku S. epidermidis. Sposród nich 6,8% zaklasyfikowano jako oporne na teikoplanine i 1,4% szczepów jako oporne

4 20 G. Mlynarczyki inni Nr 1-2 Tabela I. Opornosc na antybiotyki glikopeptydowe oraz metycyline róznych gatunków Staphylococcus izolowanych w 1997 r od chorych z PSK nr. 1 Liczba Liczba szczepówopornych na Gatunek szczepów Metycyline Wankomycyne Teikoplanine badanych (%) (%) (%) S. epidermidis (62,4) 5 (1,4) 24 (6,8) S. aureus (37,9) O 9 (2,8) S. haemolyticus (64,9) 1 (1,0) 26 (6,8) S. capitis (32,5) O O S. hominis 35 9 (25,7) O O S. warneri 33 9 (27,3) O O S. xylosus 17 6 (35,3) O 1 (5,9) S. lentus (80,0) O O S. simu/ans 15 5 (33,3) O O S. saprophyticus 10 1 (10,0) O O S. sciuri 10 5 (50,0) O O S. cohni 9 4 (44,0) O 1 (11,1) S. lugdunensis 6 1 (16,7) O O S. intermedius 5 4 (80,0) O 1 (20) Inne CNS (47,5) O 3 (7,5) Razem (48,6) O 65 (6,4) Inne CNS: gronkowcekoagulazoujemne. Tabela II. Wartosci MIC teikoplaniny dla koagulazo-ujemnych szczepów gronkowców zidentyfikowanych jako oporne w tescie ATB.ST APH Gatunek Liczba szczepów Liczba szczepów (%) badanych MIC J,1g/ml MIC 4-8 J,1g/ml MI C 16 J,1g/ml S. epidermidis 19 1 (5,3%) 17 (89,4%) 1 (5,3%) S. haemolyticus 24 O (O,O%) 16 (79,2%) 5 (20,8%) Razem 43 1 (2,3%) 33 (76,7%) 6 (13,9%) Tabela III. Wartosci MBC teikoplaniny dla koagulazo-ujemnych szczepów gronkowców zidentyfikowanych jako oporne w tescie ATB.ST APH Gatunek Liczba szczepów Liczba szczepów(%) badanych MBC 8 J,1g/ml MBC 16 Jlg/ml MBC > 32 J,1g/ml S. epidermidis 19 3 (15,8%) 11 (57,9%) 5 (26,3%) S. haemolyticus 24 1 (4,2%) 15 (62,5%) 8 (33,3%) Razem 43 4 (9,3%) 26 (60,5%) 13 (30,2%) na wankomycyne. Wsród innych gatunków odnotowano jedynie pojedyncze szczepy oporne na teikoplanine: po jednym szczepie S. xylosus, S. cohni oraz S. intermedius. Poza wymienionymidwoma gatunkami, S. epidermidis(5 szczepów) i S. haemolyticus

5 Nr 1-2 Wrazliwosc gronkowców na glikopeptydy 21 (1 szczep), zaden szczep nalezacy do innego gatunku nie zostal oznaczony jako oporny na wankomycyne. Do dalszych oznaczen wybrano 19 szczepów S. epidermidis oraz 24 szczepy S. haemolyticus, zakwalifikowane jako oporne na teikoplanine. Dla tych szczepów oznaczono najpierw najmniejsze stezenie bakteriostatyczne teikoplaniny (MIC), a nastepnie naj mniejsze stezenie bakteriobójcze (MBC). Wyniki przedstawiono w tabelach II i III. Wykazano, ze wiekszosc szczepów oznaczonych jako oporne na teikoplanine wykazywalo MIC pomiedzy 4 a 8 mg/l. Stwierdzono, ze 6 szczepów wykazywalo MIC teikoplaniny wyzsze niz 16 mg/l. Wartosci MBC byly dla badanych szczepów odpowiednio wyzsze. Nie przekraczaly jednak wartosci 64 mg/l. Wiekszosc szczepów wykazywala MBC w przedziale od mg/l (tabela III). DYSKUSJA Obserwacja, ze opornosc na antybiotyki glikopeptydowe wystepuje czesciej u gronkowców koagulazo-ujemnych niz u S. aureus jest zgodna z danymi pismiennictwa. Gatunkami u których szczególnie czesto obserwuje sie te opornosc sa S. haemolyticus oraz S.epidermidis. W niektórych osrodkach izolowano szczepy oporne na teikoplanine nalezace do gatunków S. hominis, S. warneri i S. xylosus. Wsród szczepów izolowanych w naszym osrodku stwierdzono 1 szczep S. xylosus oporny na teikoplanine natomiast nie stwierdzono wystepowania opornych szczepów S. hominis ani S. warneri. Nie dla wszystkich szczepów oznaczonych w tescie ATB jako oporne udalo sie zweryfikowac wyniki metoda oznaczania MIC. Dla wiekszosci tych szczepów uzyskane wyniki wykazuja tzw. podwyzszona opornosc, jako ze tak najczesciej interpretowane sa wartosci MIC w granicach 4-16 mg/l. Podwyzszona opornosc moze byc przyczyna nieskutecznosci leczenia tym antybiotykiem. Stezenie zarówno wankomycyny jak i teikoplaniny jakie powinno byc przyjmowane jako graniczne w oznaczaniu wrazliwosci szczepów jest ciagle przedmiotem dyskusji, a rózne metody oznaczania wrazliwosci sa krytykowane ze wzgledu na mozliwosc znacznych bledów. Zwlaszcza krytykowana jest metoda dyfuzyjno-krazkowa, poniewaz czesto prowadzi do falszywych oznaczen (19, 20). W dalszej czesci pracy oznaczano wartosci MBC dla szczepów o podwyzszonej opornosci na teikoplanine. Stwierdzono, ze niektóre z tych szczepów charakteryzowaly sie znacznymi wartosciami MBC, przekraczajacymi 32 mg/l. Mechanizm prowadzacy do podwyzszenia opornosci na bakteriobójcze stezenie antybiotyków, przy zachowanej wrazliwosci na dzialanie bakteriostatyczne nie jest obecnie wyjasniony. Wysokie MBC prowadzi do tolerancji, która jak wykazaly nasze poprzednie badania moze byc zwiazane z lizogenizacja komórek przez niektóre bakteriofagi (12, 13, 14). Badane przez nas szczepy pochodzily z materialów klinicznych i prawdopodobnie, zawieraly w swoim genomie profagi. WNIOSKI Podwyzszona opornosc na antybiotyki glikopeptydowe wystepuje czesciej u niektórych gatunków gronkowców koagulazo-ujemnych niz u S. aureus, a zwlaszcza u S. haemolyticus i S. epidermidis. Podwyzszona opornosc gronkowców dotyczy czesciej teikoplaniny niz wankomycyny. Wysoki odsetek tych szczepów (32%) wykazuje znaczna opornosc na bakteriobójcze dzialanie teikoplaniny (tolerancje).

6 22 G. Mlynarczyki inni Nr 1-2 Grazyna Mlynarczyk, Andrzej Mlynarczyk, Miroslaw Luczak, Janusz J elj aszewicz THE SENSITIVITY OF COAGULASE-NEGATIVESTAPHYLOCOCCI ISOLATED FROM CLINICAL SPECIMENSTO VANCOMYCIN AND TEICOPLANIN Summary The Crequency oc resistance and elevated resistance to teicoplanin and vancomycin among 689 strains occoagulase-negative staphylococci isolated in one year Crom c1inical specimens was determined. Using ATB.ST APH test, a resistance was shown mainly among strains oc S. epidennidis and S. haemolyticus. The elevated resistance to teicoplanin was much more Crequent1y observed than to vancomycin. About 27% oc isolated strains ocs. haemolyticus and 6.8% ocs. epidennidis were c1assifjed as resistant. Among other species only single strains were recognised as resistant: one strain oc S. xylosus, one oc S. co/mi and one oc S. in/enl1edills. 94.7% oc S.epidennidis and 100% ocs. haemolyticus strains c1assiciedas resistant lo teicoplanin in ATB showed MIC values 14 mgli. Moreover it was shown that 26.3% octhese strains ocs. epidennidis and 33.3% ocs. haemolyticus had MBC oc teicoplanin values equal to or higher than 32 mgli. PISMIENNICfWO 1. Bil/ot-Klein D, Shlaes D, Bryant D i inni. Presence oc UDP-N-acetylmuramyl-hexapeptides and heptapeptides in enterococci and staphylococci acter treatment with ramopianin, tunicamycin or vancomycin. J Bacteriol1997; 179: Boyle-Vavra S, De Jonge BLM, EbeT1CC, Daum RS. Cloning oc the Staphylococcus aureus ddh gene encoding NAD+ -dependent D-lactate dehydrogenase and insertional inactivation in a glycopeptide-resistant isolate. J Bacteriol 1997; 179: Caval/o J.D., A. Talannin, R.Fabre i inni. Susceptibility ocnosocomial Gram-positive cocci to teicoplanin and other antibiotics. Eur J Clin MicrobiollnCect Dis 1996; 14: Cercenado E, Garcia-Leoni ME, Diaz MD i inni. Emergence oc teicoplanin-resislant coagulase-negative staphylococci. J Clin Microbiol 1996; 34: Clark NC, Teixeira LM, Facklilm RR, Tenover Fe. --Detection and differentiation ocvanc-i, vanc-2 and vanc-3 glycopeptide resistance genes in enterococci. J Clin Microbiol 1998; 36: Hiramatsu K, Hanaki H, Ini T i inni. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus c1inicalstrain with reduced vancomycin susceptibility. J Antimicrob Chemother 1997; 40: Jeljaszewicz J. Epidemiology, biochemistry and therapeutic possibilities Corvancomycin-resistant Staphy/ococcus aureus Antibiot Chemother 1998, 2: Jeljaszewicz 1, Mlynarczyk G, Mlynarczyk A. Present and Cuture problems oc resistance in Gram-positive cocci. InCection 1998; 26: Mai11ardiJL, Shliles DM, Goering RV i inni. Decreased teicoplanin susceptibility oc methicillin resistant strains ocstaphy/ococcus aureus. J InCect Dis 1995; 171: Marsha/ CG, Lessard AD, Park IS, Wright GD. Glycopeptide antibiotic resislance genes in glycopeptide-producing organisms. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42: Milewski WM, Boy/e-Vavra S, Moreira B i inni. Overproduction oc a 37-kilodalton cytoplasmatic protein homologous to NAD+ -linked D-lactate dehydrogenase associated with vancomycine resistance in Staphy/ococcus aureus. Antimicrob Agenls Chemolher 1996; 40: Mlynarczyk G, Mlynarczyk A, Zabicka D, Je/jaszewicz J. Lysogenic conversion as a Cactor influencing the vancomycin tolerance phenomenon in Staphy/ococcus aureus. J Antimicrob Chemother 1997; 39:

7 Nr 1-2 Wrazliwosc gronkowców na glikopeptydy Mlynarczyk G, Mlynarczyk A, Jeljaszewicz J. Bakteriofagi grupy serologicznej F konwertujace synteze fibrynolizyny i toksyny beta u S. aureus. Med Dosw Mikrobiol 1995; 47: Mlynarczyk G, Mlynarczyk A, Jeljaszewicz J. Bakteriofagi grupy serologicznej B konwertujace synteze fibrynolizyny u S. aureus. Med Dosw Mikrobiol1995; 47: NationaI Committee for Clinical Laboratory Standards. Penormance Standards for antimicrobiai susceptibility testing. 16. Pate/ R, Uh/ JR, Kohner P i inni. DNA sequence variation within vana, vanb, vanc-l, and vanc-2/3 genes of c1inicai Enterococcus 202--{)5. isolates. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42: 17. Sieradzki K, Tomasz K Inhibition of cell wall turnover and autolysis by vancomycin in a highly vancomycin-resistant mutant of Staphy/occoccus aureus. J Bacteriol 1997; 179: Sieradzki K, Vi/lari P, Tomasz A. Decreased susceptibilities to teicoplanin and vancomycin among coagulase-negative methicillin-resistant c1inical isolates of staphylococci. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42: Tenover FC, Lancaster MY, Hill BC i inni. Characterization of staphylococci with reduced susceptibilities to vancomycin and other glycopeptides. J Clin Microbiol1998; 36: Verbrugh HA. Comparison of eight methods to detect vancomycin resistance in enterococci. J Clin Microbiol 1998; 36: Otrzymano: 2.III.1999r. Adres Autora: 02--{)04Warszawa,Chalubinskiego5, Zaklad MikrobiologiiLekarskiej Instytutu BiostrukturyAM.