LOKALIZACJA GENÓW OPORNOSCI NA WYBRANE GRUPY ANTYBIOTYKÓW U METYCYLINOOPORNYCH SZCZEPÓW STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Transkrypt

1 MED. DOSW. MIKROBIOL, 1999, 51, 9-16 Andrzej MlynarczykI, Grazyna MlynarczykI, Janusz Jeljaszewicz2 LOKALIZACJA GENÓW OPORNOSCI NA WYBRANE GRUPY ANTYBIOTYKÓW U METYCYLINOOPORNYCH SZCZEPÓW STAPHYLOCOCCUS AUREUS Zaklad MikrobiologiiLekarskiej Ins~utu Biostruktury AM w Warszawie 1 Kierownik Zakladu: Prof. dr hab. M. Luczak Panstwowy Zaklad Higieny w Warszawie2 Dyrektor Instytutu: Prof. dr hab. J. Jeljaszewicz Badano obecnosc, lokalizacje, typ i rodzaj regulacji genów opornosci na MLS (makrolidy-linkozamidy-streptograminy B), tetracykliny, chloramfenikol i aminoglikozydy u szczepów MRSA (methicillin resistant Staphylococcus aureus) izolowanych z materialu szpitalnego. Uzyskane wyniki skorelowano z uzyskanymi wczesniej wzorami trawienia genomu endonukleaza Smal i ich rozdzialu w wyniku elektroforezy pulsacyjnej (PFGE). Szczepy MRSA stanowia ciagle narastajacy problem terapeutyczny. Obecnosc regulonu mec sprzyja reorganizacji genomów bakterii i w duzej mierze przyspiesza ewolucje regionów genomu odpowiedzialnych za opornosc na antybiotyki i srodki dezynfekcyjne (8, 9). S. aureus a zwlaszcza szczepy MRSA posiadaja duza róznorodnosc genów opornosci zlokalizowanych zarówno w chromosomie jak i plazmidach i transpozonach (13). Opornosc na MLS zwiazana jest z wystepowaniem genów erma, ermb lub ermc kodujacych N-6 metylotransferaze. Enzym ten powoduje metylacje pojedynczej adeniny w 23S rrna który jest miejscem docelowym dzialania antybiotyku. Gen erma jest indukcyjny i wystepuje zwykle w chromosomie bakterii w obrebie transpozonów typu Tn554 najczesciej lacznie z genem opornosci na spektynomycyne (16, 17). Ten typ opornosci byl dominujacy wsród szczepów wystepujacych w wielu krajach europejskich w latach (20). Gen ermb jest konstytutywny i wystepuje zwykle w transpozonach typu Tn551 wbudowanych w plazmidy (np. p/258) (13). Gen ermc moze byc indukcyjny lub konstytutywny i wystepuje w malych plazmidach (np. pe194, prj5, ptu512, pses30) (5, 13). Pozytywna regulacja ekspresji genów erm zachodzi na poziomie translacji (10). Opornosc na MS (makrolidy, streptograminy B) zwiazana jest z obecnoscia plazmidów (np. pep2104, pul5050, pms97) zawierajacych geny msra, msrb Praca finansowanaz grantu KBN 4 P05F

2 10 A. Mlynarczyk i inni Nr 1-2 lub msrsa. Geny te koduja zalezne od ATP bialka blonowe odpowiedzialne za aktywny wyplyw antybiotyku z komórki (mechanizm pompy blonowej) (11, 12). Pojedyncza opornosc na linkozamidy moze byc zwiazana z obecnoscia wystepujacego w plazmidach (np. pip855, pip1l56) genu lina kodujacego O-nukleotydylotransferaze linkozamidowa (2). Opornosc na tetracykliny zwiazana jest z wystepowaniem genów tetk lub tmn (tetm). Gen tetk wystepuje zwykle w malych plazmidach (np. ptl8l, pt127, pnsl) i moze ulegac integracji do chromosomu najczesciej u szczepów MRSA. Koduje bialko blonowe odpowiedzialne za aktywny wyplyw wszystkich tetracyklin z wyjatkiem minocykliny. Gen tmn (tetm) wystepuje w chromosomie i koduje bialko TetM odpowiedzialne za uniemozliwianie przylaczania i aktywne odlaczanie wszystkich tetracyklin od miejsca docelowegona rybosomie (10, 13). ' Opornosc na chloramfenikol zwiazana jest z wystepowaniem genów cmp zlokalizowanych w malych plazmidach klasy I (np.pc223,pc22l,pcl94,pub1l2,psk2,pcw7) kodujacych 4 typy serologiczne acetylotransferazy chloramfenikolazowej (13, 19). Opornosc na aminoglikozydy zwiazana jest z wystepowaniem wielu genów o róznej lokalizacji kodujacych transferazy aminoglikozydowe modyfikujace czasteczki antybiotyku. Najczesciej wystepujacym i odgrywajacym najistotniejsza role jest gen aaca-aphd kodujacy dwufunkcyjna transferaze: acetylotransferaze AAC(6')/fosfotransferaze (APH2"). Warunkuje on jako jedyny opornosc na aminoglikozydy lacznie z gentamycyna, a w praktyce klinicznej wyklucza stosowanie wszystkich bez wyjatku aminoglikozydów. Gen aaca-aphd wystepuje w transpozonach typu Tn400l lub Tn385l (S. aureus), Tn403l (CNS), Tn528l, Tn5384 (E. faecalis) (1, 13). Wystepowanie tego typu transpozonów bylo opisywane u S. aureus zarówno w chromosomie bakteryjnym, jak i duzej liczbie plazmidów rodziny pskl klasy II (np. pskl, psk4, psk14) i koniugacyjnych plazmidów klasy III (np. pgol, psk4l, pjel) (1, 7, 18). Ponadto opornosc na aminoglikozydy i aminocyklitole (spektynomycyna) zwiazana jest z wystepowaniem genów: aada, aadd, aade, apm, apm-3, aphc i spc (3, 4, 6, 13, 17). Gen aada wystepuje w plazmidach (np. pwal) i koduje nukleotydylotransferaze AAD(3")(9) modyfikujaca streptomycyne i spektynomycyne (4). Gen aadd wystepuje w wielu plazmidach róznej wielkosci (np. publlo - klasa I; psk4l, psh8, pcrgl600 - klasa III) i koduje nukleotydylotransferaze AAD( 4')( 4") modyfikujaca tobramycyne, amikacyne kanamycyne i neomycyne (3, 13). Gen aade wystepuje w transpozonach (np. Tn3854, Tn5404, Tn zlokalizowane w plazmidach np. pipl066) i koduje nukleotydylotransferaze AAD( 6') modyfikujaca streptomycyne (6). Gen apm wystepuje w plazmidach (np. pwal, ptu053) i koduje fosfotransferaze APH(3')IIla modyfikujaca kanamycyne i neomycyne (10, 13). Gen apm-3 wystepuje w transpozonach (np. Tn3854, Tn5404, Tn5405 zlokalizowane w plazmidach np. p1p1066) i koduje fosfotransferaze APH(3')III modyfikujaca kanamycyne i neomycyne (6). Gen aphc wystepuje w plazmidach i koduje fosfotransferaze APH(3") modyfikujaca streptomycyne (10, 13). Gen spc wystepuje w transpozonach (np. Tn554, Tn zwykle w chromosomie bakterii) i koduje nukleotydylotransferaze AAC(9) modyfikujaca spektynomycyne (17). Celem podjetych badan bylo ustalenie u badanej grupu szczepów MRSA lokalizacji genów opornosci na tetracykliny, MLS, aminoglikozydy i chloramfenikol oraz korelacja uzyskanych wyników z uzyskanymi wczesniej wzorami trawienia genomu tych szczepów

3 Nr 1-2 Geny opornosci MRSA 11 endonukleaza Smal i rozdzialu uzyskanych fragmentów przy uzyciu elektroforezy pulsacyjnej (PFGE). MATERIAL I METODY S z c z e p y b a k t e ryj n e. Material do badan stanowilo 80 szczepów MRSA izolowanych w ostatnich latach z próbek materialów pochodzacych od pacjentów PSK Nr 1 w Warszawie. Szczepy NCTC i RN981 stosowane w transdukcji w charakterze biorców otrzymano od dr R.P. Novick'a z Public Healths Research Institute w Nowym Jorku. B a k t e ri o fa g i. Do transdukcji stosowano fagi 52B, 53, 81, 83A i 84 z miedzynarodowej serii do typowania S. aureus, oraz fagi M15, M410, M429B i M621 uzyskane we wlasnym zakresie w wyniku indukcji mitomycyna C ze szczepów S. aureus pochodzacych z materialu klinicznego. Fagi 52B, 53, 81, 83A i 84 pochodzily z Narodowego Centrum Referencyjnego Typowania Gronkowców Bakteriofagami w Gdansku. p o d l o z a. Do namnazania bakteriofagów stosowano podloze plynne TB wg (15), a do miareczkowania bakteriofagów podloza TBA 0,8% i TB 1,2% wg (15). Szczepy namnazano na podlozu plynnym TBY wg (15). Do selekcji transduktantów i okreslania fenotypu plazmidów stosowano podloze stale TBYA wg (15) zawierajace odpowifdnio: chloramfenikol (Egid) - 15 mgli, oksytetracykline (Polfa) - 30 mgli, minocykline (Ratiopharm) - 30 mgli, erytromycyne -15 mgli, linkómycyne (Upjohn Co) - 4 mg/mi, spektynomycyne (Sigma) - 10 mgli, gentamycyne (Polfa) - 10 mgli, neomycyne (Calbiochem) - 30 mgli, kanamycyne (Sigma) - 30 mgli, streptomycyne (Polfa) - 15 mgli, trimetoprim (Sigma) mgli, akryflawine (BDH Chemical Ltd) mgli, bromek etidionu (Calbiochem)- 100 mgli, cetrymid (Serva)- 200 mgli. T r a n s d u kc ja. Stosowano procedure opisana wczesniej (15). Transdukcje prowadzono do biorców NCTC i RN981 stosujac lizaty nienaswietlane i naswietlane przez 15 min. Do naswietlania lizatów fagowych stosowano lampe Westinghouse C 30T8 (energia 11,5 x 10,7J/mm2/s) z odleglosci 75 cm. E I i m i n a c j a p I a z m i d ów. Stosowano metode z zastosowaniem hodowli w temperaturze 43 C wg (15). WYNIKI BADAN I ICH OMÓWIENIE L o k a li z a c j a g e n ó wop o r n o s c i n a M L S. Geny opornosci na MLS transdukowano z 50 szczepów MRSA do biorców NCTC (Rec+) i RN981 (Rec') selekcjonujac warianty oporne na podlozu z erytromycyna. Ze wszystkich szczepów uzyskano przekazywanie cechy zarówno do biorcy Rec+ i Rec'. Od 13 dawców opornosc na erytromycyne i spektynomycyne przekazywala sie lacznie a naswietlanie lizatów fagowych promieniowaniem UV nie obnizalo czestosci transdukcji. Transdukcja do szczepu Rec' i kotransdukcja spektynomycyny oraz brak obnizenia czestosci transdukcji promieniowaniem UV wskazuja, ze indukcyjna opornosc na MLS lacznie z opornoscia na spektynomycyne moga byc czescia elementu transpozycyjnego. Z 37 pozostalych szczepów MRSA nie uzyskano kotransdukcji erytromycyny ze spektynomycyna. W 21 przypadkach stwierdzono kotransdukcje opornosci na erytromycyne z opornoscia na linkomycyne i klindamycyneco wskazuje na konstytutywny typ ekspresji genu warunkujacego opornosc na MLS. W 37 ukladach transdukcyjnych stwierdzono ok.

4 12 A. Mlynarczyk i inni Nr krotny spadek czestosci transdukcji po zastosowaniu lizatu naswietlanego UV. U uzyskanych transduktantów potwierdzono zdolnosc do eliminacji przetransdukowanej cechy. Transdukcja do szczepu Rec", eliminacja cechy u transduktantów oraz obnizenie czestosci transdukcji po naswietlaniu lizatu UV wskazuja, ze opornosc na MLS u 37 szczepów jest zlokalizowana w plazmidach. L o k a li z a c j a g e n ó wop o r n o s ci n a t e t r a c y k li n y. Geny opornosci na tetracykliny transdukowano z 71 MRSA do biorców NCTC i RN981. Z 32 szczepów uzyskano przekazywanie cechy zarówno do biorcy Rec+ i Rec'. We wszystkich 32 ukladach transdukcyjnych stwierdzono ok krotny spadek czestosci transdukcji do biorcy Rec' po 15 min. naswietlaniu lizatu fagowego. Transdukcja do szczepu Rec' oraz spadek czestosci transdukcji z naswietlanym UV lizatem fagowym wskazuja, ze opornosc na tetracykliny typu TetK (opornosc na wszystkie tetracykliny z wyjatkiem minocykliny) u badanych 32 szczepów jest zlokalizowana w plazmidach. W przypadku jednego szczepu który wykazywal opornosc na minocykline dodatkowo wykonano transdukcje do biorcy Rec+ stosujac lizat naswietlany 15 min. promieniowaniem UV oraz przeprowadzono analize fenotypowa transduktantów. Otrzymano transduktanty o dwóch róznych fenotypach: TetK oraz wykazujace opornosc'na wszystkie tetracykliny. Drugi fenotyp nie wystepowal wsród transduktantów uzyskanych do biorcy Rec". Wskazuje to, ze szczep posiada dwie niezalezne determinanty opornosci na tetracykliny: plazmidalna (typu TetK) i chromosomalna warunkujaca opornosc na wszystkie tetracykliny lacznie z minocyklina (typu TetM). W 39 ukladach transdukcyjnych uzyskano przekazanie opornosci na tetracykline tylko do szczepu Rec +. Czestosc transdukcji uzyskana od tych dawców byla znacznie nizsza niz w przypadku plazmidów warunkujacych opornosc typu TetK i wynosila od 10-6do 10-8.Analiza uzyskanych transduktantów wykazala, ze u 23 szczepów jest obecna, zlokalizowana chromosomalnie pojedyncza determinanta typu TetK. U 11 szczepów wykazano obecnosc zlokalizowanej chromosomalnie pojedynczej determinanty typu TetM. U 5 szczepów wykazano obecnosc w chromosomie 2 determinant opornosci na tetracykliny: jednej typu TetK i jednej typu TetM. L o k a li z a cj a g e n ó wop o r n o s ci n a c h lor a m f e n i k o l. Geny opornosci na chloramfenikol transdukowano z 30 szczepów MRSA do biorców NCTC i RN981. Ze wszystkich szczepów uzyskano przekazywanie cechy zarówno do biorcy Rec+ i Rec'. We wszystkich przypadkach obserwowano ok krotny spadek czestosci transdukcji do biorcy Rec' po naswietlaniu lizatu fagowego promieniami UV. Transdukcja do szczepu Rec", oraz obnizenie czestosci transdukcji (Iizat naswietlany UV) wskazuja, ze geny warunkujace opornosc na chloramfenikol u 30 szczepów sa zlokalizowane w plazmidach. Lokalizacj a genów opornosci na gen tamycyne. Geny opornosci na gentamycyne, transdukowano z 33 szczepów MRSA do biorców Rec+ i Rec". Ze wszystkich szczepów uzyskano przekazywanie cechy do obu biorców. Z 31 dawców opornosc na gentamycyne ulegala kotransdukcji tylko z opornoscia na kanamycyne i tobramycyne. W przypadku tych 31 szczepów wykazano, ze naswietlanie zawiesiny fagowej promi.eniowaniem UV przez 15 min. nie obnizalo czestosci transdukcji gentamycyny. Transdukcja do szczepu Rec' oraz brak obnizenia czestosci transdukcji promieniowaniem UV wskazuja, ze gen warunkujacy laczna opornosc na gentamycyne i

5 Nr 1-2 Geny opornosci MRSA 13 inne aminoglikozydy jest prawdopodobnie czescia elementu transpozycyjnego. Z pozostalych dwóch opornych na gentamycyne szczepów uzyskano kotransdukcje opornosci na gentamycyne, kanamycyne i tobramycyne z opornoscia na neomycyne, czwartorzedowe sole amoniowe i bromek etidionu oraz trimetoprim (w przypadku jednego szczepu). W obydwu ukladach transdukcyjnych stwierdzono ok. 50-krotny spadek czestosci transdukcji po 15 min. naswietlaniu lizatu fagowego. U -uzyskanych transduktantów potwierdzono zdolnosc do eliminacji nabytych cech opornosci. W wyniku hodowli obydwu typów transduktantów w temp. 43 C obserwowano utrate plazmidu z czestoscia ok %. Stwierdzono koeliminacje opornosci na neomycyne, CZ'fartorzedowe sole amoniowe i bromek etidionu oraz na trimetoprirn (w przypadku Jednego szczepu). Kotransdukcja kilku cech opornosci do szczepu Rec', koeliminacja cech opornosci u transduktantów oraz obnizenie czestosci transdukcji (lizat naswietlany promieniowaniem UV) wskazuja, ze opornosc na gentamycyne u tych dwóch szczepów jest zlokalizowana plazmidalnie. L o k a li z a cj a g e n ó wop o r n o s c i n a n e o m y c y n e. Geny opornosci na neomycyne transdukowano z 34 szczepów MRSA do biorców Rec+ i Rec'. Ze wszystkich badanych szczepów uzyskano przekazywanie cechy do obydwu biorców. Wykazano kotransdukcje opornosci na neomycyne z opornoscia na kanamycyne (K) we wszystkich ukladach transdukcyjnych. Ponadto wykazano kotransdukcje opornosci na neomycyne z opornoscia na trimetoprim (Tp), gentamycyne (G), tobramycyne (T) niska opornoscia na streptomycyne (S), czwartorzedowe zasady amoniowe (Q) i bromek etidionu (B). Uzyskano wzory kotransdukcji: NKS (4 szczepy), NKQ (4 szczepy), NKQB (4 szczepy), NKSQB (10 szczepów), NKSQBTp (3 szczepy), NKB (6 szczepów), NKGTSQB (1 szczep), NKGTSQBTp (1 szczep), NKSB (1 szczep). Zastosowanie do transdukcji naswietlanej zawiesiny faga powodowalo ok krotnyspadek czestosci transdukcji do biorcy Rec'. U uzyskanych transduktantów potwierdzono zdolnosc do eliminacji przetransdukowanych cech opornosci w wyniku hodowli w temp. 43 C. Obserwowano utrate plazmidu z czestoscia od 2 do 20% oraz koeliminacje opornosci na neomycyne ze wszystkimi markerami ulegajacymi kotransdukcji. Transdukcja do szczepu Rec', mozliwosc eliminacji cechy u transduktantów oraz obnizenie czestosci transdukcji w wyniku naswietlania zawiesiny faga promieniowaniem UV wskazuja, ze geny warunkujace opornosc na neomycyne u 34 szczepów sa zlokalizowane w plazmidach. Porównano lokalizacje genów opornosci na antybiotyki i srodki dezynfekcyjne z wykonana wczesniej charakterystyka tej grupy szczepów MRSA przy uzyciu trawienia genomu endonukleaza Smal i elektroforezy pulsacyjnej (PFGE). W obrebie badanej grupy szczepów wystepowaly 4 duze grupy o identycznym wzorze trawienia Smal (14). Grupa 1 obejmowala 9 szczepów. U wszystkich wystepowaly chromosomalne geny opornosci na tetracykline (prawdopodobnie gen tetk), zlokalizowany w chromosomie transpozon warunkujacy opornosc na gentamycyne i inne aminoglikozydy (prawdopodobnie typu Tn4001 z genem aaca-aphd) oraz plazmid warunkujacy konstytutywny typ opornosci na MLS (prawdopodobnie z genem ermcr). 4 szczepy tej grupy mialy dodatkowy plazmid. Okreslono 3 fenotypy tego plazmidu: pnk (2 szczepy), pnkqab (1 szczep) ipb (1 szczep).

6 14 A. Mlynarczyk i inni Nr 1-2 Grupa 2 obejmowala 11 szczepów. U wszystkich wystepowal w chromosomie transpozon warunkujacy indukcyjna opornosc na MLS i opornosc na spektynomycyne (prawdopodobnie typu Tn554 zawierajacy genyenn.a i spc). U wszystkich wystepowal w chromosomie gen opornosci na tetracykliny (prawdopodobnie u 8 szczepów tetm, a u 3 szczepów tetk). U 10 szczepów wystepowal plazmid warunkujacy opornosc na chloramfenikol. U wszystkich szczepów wystepowal plazmid warunkujacy opornosc na neomycyne. Okreslono 5 róznych fenotypów tego plazmidu wystepujacych w tej grupie szczepów: pnks (1 szczep), pnksb (3 szczepy), pnksqab (4 szczepy), pnksqabtp (2 szczepy) i pgnksqabtp (1 szczep). Grupa 3 obejmowala 13 szczepów. Nie stwierdzono u tych szczepów genów opornosci na badane substancje, zlokalizowanych w chromosomie. Dziewiec szczepów z tej grupy mialo po 2 plazmidy w róznych kombinacjach. Wszystkie te szczepy mialy plazmid pt a dodatkowo 6 szczepów mialo plazmid pqab, 2 szczepy plazmid psqab a jeden szcep per. z pozostalych 4 szczepów dwa mialy pojedynczy plazmid pt a dwa inne pojedynczy plazmid pqab. Grupa 4 obejmowala 6 szczepów. Wszystkie te szczepy mialy chromosomalne geny opornosci na tetracykliny (prawdopodobnie gen tetk), a u dwóch szczepów wystepowal prawdopodobnie drugi chromosomalny gen tetm. Wszystkie mialy równiez zlokalizowany w chromosomie transpozon warunkujacy opornosc na gentamycyne i inne aminoglikozydy (prawdopodobnie typu Tn4001 z genem aaca-aphd). Ponadto wszystkie mialy plazmid warunkujacy opornosc na MLS (5 szczepów prawdopodobnie z genem ermci a jeden szczep z genem ermcr). U 4 szczepów wystepowal plazmid warunkujacy opornosc na chloramfenikol. Ponadto wszystkie szczepy posiadaly jeszcze jeden plazmid. Wykazano 4 rózne fenotypy tego plazmidu: pnks (2 szczepy), pqab (2 szczepy), pnkqab (1 szczep) i psb (1 szczep) (oznaczenia jak wyzej). WNIOSKI l. W odniesieniu do szczepówmrsa chromosomalna lokalizacja genów na niw antybiotyki wystepowala z czestoscia: 93,9% (gentamycyna), 24% (MLS) i 54,9% (tetracykliny) a plazmidalna z czestoscia: 6,1% (gentamycyna), 100% (neomycyna), 100% (chloramfenikol),45,1% (tetracykliny)i 74% (MLS). 2. Lokalizacjawielu genów opornosci byla w duzymstopniu skorelowana z wzorami PFGE. A. Mlynarczyk, G. Mlynarczyk, J. Jeljaszewicz THE LOCALIZATION OF GENES CONFERRING RESISTANCES TO THE SELECTED GROUPS OF ANTIBIOTICS IN METHICILLIN-RESISTANTSTRAINS OF STAPHYLOCOCCUSAUREUS Summary Localizationof genes conferring resistanceto MLS, tetracyclines,chloramphenicol,gentamycin and neomycin in 80 MRSA strains isolated from hospital specimens was determined. The obtained results were compared to DNA pattems of the examined strains after digestion with Smal and separation in f-ulsed field electrophoresis (PFGE). It was shown that genes of resistance to MLS (ErmI ) in the case of 13 strains were located on chromosome and in the case of 37 strains on plasmids (16 strains had ErmI+ and 21 strains had Ermr). Genes

7 Nr 1-2 Geny opornosci MRSA 15 determining resistance to tetracyclineswere localised on chromosome in the case of 39 (23 strains possessed TetK, 11 strains had TetM and 5 strains possessed both TetK and TetM determinants) and in the case of 32 strains on plasmids.chloramphenicolresistance genes were localisedon plasmidsin all 30 resistant strains. Genes conferring resistance to gentamycinwere present in 31 of the investigated strains on chromosome and in two strains on plasmids. Neomycin resistancegenes were plasmid in 34 strains. It was shown that the localizationof the resistance genes and the PFGE patterns of the investigatedstrains were highlycorrelated. PISMIENNICTWO 1. Berg T, Pirth N, Apisiridej S i inni. Complete nucleotide sequence of psk41: evolution of staphylococcal conjugative multiresistance plasmids. J Bacteriol1998; 180: Brisson-Noel A, Delrieu P, Samain D, Courvalin P. Inactivation of lincosaminide antibiotics in Staphylococcus: identification of lincosaminide O-nucleotidyl-transferases and comparison of the corresponding resistance genes. J Biol Chem 1988; 263: Byrne ME, Gillespie MT, Skurray RA. 4'4"adenyltransferase activity on conjugative plasmids isolated from Staphylococcus aureus is encoded on an integrated copy of pub110. Plasmid 1991; 25: Byme ME, Littlejohn TG, Skurray RA. Transposons and insertion sequences in the evolution of multiresistant Staphylococcus aureus. W: Molecular biology of the staphylococci. Red. R. P. Novick, R. A. Skurray, VCH Publishers, Inc., New York 1990, Catchpole l, Dyke KGH. A Staphylococcus aureus plasmid that specifies constitutive macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance contains anovel deletion in the ermc attenuator. FEMS Microbiol Lett 1990; 69: Derbise A, Dyke KGH, El Solh N. Characterization of a Staphylococcus aureus transposon, Tn5405. Located within Tn5404 and carrying the aminoglycoside resistance genes, apha-3 and aade. Plasmid 1996; 35: Pirth N, Skurray RA. Mobile elements in the evolution and spread of multiple-drug resistance in staphylococci. Drug Resistance Updates 1998; 1: JeIjaszewicz 1, Mlynarczyk G, Mlynarczyk A. Present and future problems of resistance in Gram-positive cocci. Infection 1998; 26: JeIjaszewicz 1, Mlynarczyk G, Mlynarczyk A. Aktualne zagrozenia dotyczace opornosci na antybiotyki u bakterii. Blok Operacyjny 1998; 3-4: Lyon B, Skurray R Antimicrobial resistance of Staphylococcus aureus: genetic basis. Microbiol Rev 1987;51: MatsuokaM, Endou E, KobayashiH i inni. A dyadic plasmid that shows MLS and PMS resistance in Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett 1997; 148: Matsuoka M, Endou K, Kobayashi H i inni. A plasmid that encodes three genes for resistance to macrolide antibiotics in Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett 1998; 167: Mlynarczyk A, Mlynarczyk G, JeIjaszewiczJ. The genome of Staphylococcus aureus: a review. Zbl Bakt 1998; 287: Mlynarczyk G, Rosdahl VT, Skov R, Mlynarczyk A. Epidemiology of methicillin resistant Staphylococcus aureus in a Warsaw hospital. J Hosp Infect 1996; 34: Mlynarczyk G, Mlynarczyk A, Osowiecki H, JeIjaszewicz 1 Naturrlily occuring drug-resistance plasmids in hospital strains of Staphylococcus aureus. Acta Microbiol Polon 1983; 32: Murphy E. Nucleotide sequence of enna a macrolide-lincosamide-streptogramin B determinant in Staphylococcus aureus. J Bacteriol 1985; 162: Murphy E. Nucleotide sequence of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Staphylococcus aureus and its relationships to AAD(3")(9) Mol Gen Genet 1985; 200:

8 16 A. Mlynarczyk i inni Nr PaulsenIT, Firth N, SkurrayRA. Resistance to antimicrobial agents other than b-lactams. W: The Staphylococciin human disease. Red. K.B. Crossley, G. L. Archer, Churchill Livington,New York 1997, WangPZ, Projanl, HenriquezV, Novick RP. A region ot 20 amino acid residues in the C-terminal portion ot the pc221 replication initiator protein contains the recognition determinant ot origin specificity.w: Molecular biology ot the staphylococci.red. R. P. Novick,R. A. Skurray, VCH Publishers, Inc., New York 1990, WesthH, HougaardDM, Vuustl, Rosdahl vr. Prevalenceot erm gene ciassesin erythromycin-resistant Staphylococcusaureus strains isolated between 1959 and Antimicrob Agents Chemother 1995;39: Otrzymano: 2.III.1999r. Adres Autora: Warszawa,Chalubinskiego5, Zaklad MikrobiologiiLekarskiej AM.