METODY OZNACZANIA AKTYWNOŚCI ANTYBIOTYKÓW. Podstawowe pojęcia:

Transkrypt

1 METODY OZNACZANIA AKTYWNOŚCI ANTYBIOTYKÓW Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM Podstawowe pojęcia: Antybiotyk substancja o aktywności przeciwdrobnoustrojowej, wytwarzana przez mikroorganizmy, uzyskana na drodze półsyntetycznej lub syntetycznej lecz mająca naturalny wzorzec. Chemioterapeutyk substancja o aktywności przeciwdrobnoustrojowej, uzyskana na drodze syntetycznej, nie posiadająca naturalnego wzorca. Oporność: mikrobiologiczna oznacza, że dany szczep posiada mechanizm oporności farmakologiczna zdolność przeżycia w obecności antybiotyku w stężeniu wyższym niż jest możliwe do osiągnięcia w warunkach in vivo kliniczna pomimo osiągnięcia maksymalnych dawek leku zabicie drobnoustrojów nie jest możliwe. krzyżowa niewrażliwość na wszystkie bądź niektóre antybiotyki należące do tej samej grupy chemicznej lub grupy niespokrewnionej, gdy miejsca uchwytu dla antybiotyków znajdują się blisko siebie (np. oporność na linkozamidy i makrolidy) skojarzona mechanizmy oporności wynikające z braku przepuszczalności błony komórkowej lub aktywnego wypompowania leku z komórki, powodujące oporność na więcej niż jedną grupę chemiczną. Oporność nabyta - nowa cecha szczepu, która wynika ze zmian w jego materiale genetycznym. Oporność naturalna jest cechą danego gatunku czy szczepu mikroorganizmów. Może wynikać z: a) braku w komórce celu (np. receptora) dla danego antybiotyku lub niskiego powinowactwa do niego, np. oporność Mycoplasma pneumoniae czy Chlamydia pneumoniae na antybiotyki β-laktamowe b) wytworzenia alternatywnego szlaku metabolicznego (mechanizm by-pass), np. oporność na sulfonamidy c) braku lub utrudnionego transportu antybiotyku przez ścianę komórkową, np. oporność na makrolidy u Enterobacteriaceae d) aktywnego usuwania antybiotyku z komórki przez białka transbłonowe do przestrzeni periplazmatycznej 1

2 e) wytwarzania enzymów unieczynniających antybiotyk w wyniku jego hydrolizy, np. β-laktamazy rozszczepiające pierścień β-laktamowy f) wytwarzania enzymów wprowadzających do cząsteczki antybiotyku podstawniki, które zmieniają swoistość jego działania, np. O-fosforylacja, N-acetylacja, O-adenylacja odpowiednich pozycji w cząsteczce anminoglikozydów przez enzymy (kodowane w plazmidowym DNA) powoduje inaktywację antybiotyku, uniemożliwiając jego oddziaływanie z rybosomami MIC (ang. minimal inhibitory concentration) wartość określająca najmniejsze stężenie leku, (wyrażone w mg/l), które w warunkach in vitro hamuje wzrost bakterii przy określonej gęstości inokulum i w określonym czasie. MBC (ang. minima bactericidial concentration) wartość określająca najmniejsze stężenie leku, (wyrażone w mg/l), które w warunkach in vitro powoduje zabicie 99,9% komórek bakteryjnych, przy określonej gęstości inokulum i w określonym czasie. Antybiogram wynik oceny wrażliwości danego gatunku drobnoustroju na działanie określonych antybiotyków, przeprowadzonej w laboratorium (na szalce Petriego). Metody określania wrażliwości: 1. Metoda rozcieńczeń (probówkowa) antybiotyk rozcieńcza się w dowolnym stosunku z podłożem bulionowym o odpowiednim składzie (przygotowuje się serię rozcieńczeń antybiotyku), które następnie zaszczepia się badanym szczepem. Zmętnienie lub osad w pożywce świadczy o wzroście bakterii. Największe rozcieńczenie antybiotyku (czyli najmniejsze stężenie), w którym nie wystąpił wzrost przyjmuje się jako MIC. Im mniejsze są różnice pomiędzy wartościami stężeń antybiotyku w szeregu rozcieńczeń, tym uzyskana wartość MIC jest bardziej zbliżona do rzeczywistej. Oznaczenie wykonuje się w probówkach (objętość podłoża wynosi min. 2 ml) lub w płytkach titracyjnych (100 µl). 2. Metoda rozcieńczeń (płytkowa) antybiotyk rozcieńcza się w upłynnionym podłożu agarowym, które po zestaleniu zaszczepia się badanymi drobnoustrojami (jedna płytka = jedno rozcieńczenie antybiotyku). Z użyciem tej samej serii płytek możliwe jest oznaczenie wrażliwości kilkunastu szczepów jednocześnie. 3. Metoda dyfuzyjna (krążkowa) dyfuzja antybiotyku z bibułowego krążka do podłoża agarowego i jego działanie na posiane drobnoustroje. Na płytce ze stałym podłożem metodą murawkową posiewa się badany szczep, a następnie umieszcza się kilka krążków zawierających 2

3 antybiotyk. Po inkubacji odczytuje się średnicę stref zahamowania wzrostu wokół krążka, będącą miarą wrażliwości szczepów na badaną substancję. Możliwe reakcje oraz typy stref powstających wokół krążka przedstawia poniższa ilustracja: Oporność brak sfery zahamowania: bakterie rosną przy samym krążku. Oporność pośrednia wąska strefa braku wzrostu wokół krążka. Wrażliwość szeroka strefa wokół krążka wolna od wzrostu. Inaktywacja enzymatyczna wąska strefa braku wzrostu wokół krążka. W przeciwieństwie do strefy pośredniej, brzeg strefy jest ostro zarysowany i składa się na niego nieco silniejszy wzrost w postaci pewnych kolonii normalnej wielkości lub większych niż pozostałe. Działanie selektywne taki wynik otrzymuje się, gdy inokulum zawiera dwa szczepy różniące się podatnością na dany antybiotyk. W pobliżu krążka stężenie antybiotyku jest na tyle duże, że hamuje wzrost obydwu szczepów (wąska strefa wolna od wzrostu). W dalszej odległości od krążka (mniejsze stężenie antybiotyku) wzrost jednego ze szczepów zostaje zahamowany, podczas gdy drugi rośnie. Porównanie z kontrolą półstrefa otrzymana ze szczepem kontrolnym (po jednej stronie krążka) jest naprzeciwko półstrefy dla szczepu badanego (po przeciwnej stronie krążka). By to uzyskać, szczepy badany i kontrolny wysiewa się na odrębne połówki szalki, a krążek kładzie się między nimi. Mutanty oporne inokulum zawierało niewielki procent komórek zmutowanych zdolnych do tworzenia kolonii w warunkach hamujących wzrost komórek dzikich. Mutanty zwykle charakteryzują się opornością na antybiotyk. Istnieje jednak pewien typ mutantów rosnących jedynie w obecności danego antybiotyku i mutanty te będą również tworzyć kolonie w strefie wolnej od wzrostu innych komórek bakteryjnych. Przykładem są mutanty zależne od streptomycyny, które mają takie zmiany w rybosomach, że dopiero w obecności streptomycyny następują przemiany konformacyjne pozwalające na ich prawidłowe funkcjonowanie. Zakażenia inokulum składa się z mieszaniny organizmów, z których przynajmniej jeden jest oporny na badany antybiotyk. 3

4 Synergizm dwa krążki zawierają różne antybiotyki. Strefa zahamowania wzrostu jest większa niż suma efektów każdego z antybiotyków z osobna. Inaczej mówiąc, działanie tych antybiotyków jest synergiczne. Antagonizm dwa krążki zawierają różne antybiotyki. W tym przypadku jeden z antybiotyków hamuje aktywność drugiego. 4. Metoda dyfuzyjna (cylinderkowa) metalowe, szklane lub porcelanowe cylinderki (bez dna) o znormalizowanych wymiarach (10 mm wysokości, 8 mm średnicy) umieszcza się na pożywce agarowej z powierzchniowo posianym szczepem wzorcowym i napełnia roztworami antybiotyku o znanych odpowiednich stężeniach. W czasie inkubacji antybiotyk, dyfundując do pożywki, powoduje zahamowanie wzrostu drobnoustroju. Wielkość stref zahamowania wzrostu jest proporcjonalna do stężenia antybiotyku umieszczonego w cylinderku. Czas i temperatura inkubacji płytek z cylinderkami zależne są od właściwości drobnoustrojów i antybiotyku. Jeżeli mamy do czynienia z antybiotykiem szybko dyfundującym, płytki umieszcza się w cieplarce tuż po napełnieniu cylinderków. W warunkach powolnej dyfuzji związku, przygotowane płytki z wypełnionymi cylinderkami powinny pozostać przez określony czas w niskiej temperaturze. 5. E-testy (ang. Epsilometer tests) antybiotyk dyfunduje z plastikowego paska, w którym stopniowo (gradientowo) zmienia się stężenie antybiotyku do pożywki agarowej, gdzie powierzchniowo posiany został wzorcowy szczep drobnoustroju. 4

5 6. Genotypowanie kontrola obecności/nabycia genu warunkującego oporność na dany antybiotyk (PCR), analiza mutacji w obrębie genu oporności (PCR, SSCP, sekwencjonowanie, hybrydyzacja). Literatura: 1. Hryniewicz W., Sulikowska A., Szczypa K., Krzysztoń-Russjan J., Gniadkowski M.: Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki. Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów. Centralne Laboratorium Surowic i Szczepionek w Warszawie. 2. Markiewicz Z., Kwiatkowski Z.A.: Bakterie antybiotyki lekooporność. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa Kędzia W.: Materiały do ćwiczeń z mikrobiologii farmaceutycznej. PZWL, Warszawa