IZOLACJA I WSTĘPNA CHARAKTERYSTYKA BAKTERII REDUKUJĄCYCH METALE ZIEM RZADKICH WYIZOLOWANYCH Z HAŁDY FOSFOGIPSU W WIŚLINCE

Transkrypt

1 Michał RYTEL, Stefan RUSSEL* pierwiastki ziem rzadkich, redukcja, mikroorganizmy, fosfogipsy IZOLACJA I WSTĘPNA CHARAKTERYSTYKA BAKTERII REDUKUJĄCYCH METALE ZIEM RZADKICH WYIZOLOWANYCH Z HAŁDY FOSFOGIPSU W WIŚLINCE Praca przedstawia wyniki izolacji bakterii z hałdy fosfogipsu w Wiślince, posiadających zdolność do redukcji metali ziem rzadkich. Wyizolowano jeden szczep bakterii: Chryseobacterium jejuense. W pracy wykazano, że ilość bakterii posiadających zdolność do redukcji związków pierwiastków ziem rzadkich jest niewielka. Okazało się również, że wyizolowany szczep wykazuje zdolności do wzrostu w szerokim zakresie temperatur. Wyizolowany szczep bakterii słabo toleruje środowisko o obniżonym ph. WSTĘP Rozdział pierwiastków ziem rzadkich (REE) z roztworów zawierających różne rodzaje tych pierwiastków jest bardzo trudny ze względu na ich bardzo podobne właściwości chemiczne [1]. Metody ekstrakcji REE za pomocą rozpuszczalników organicznych stwarzają duże obciążenia dla środowiska, w związku z czym prowadzone są badania nad wykorzystaniem do tego celu mikroorganizmów takich jak bakterie [2,3], promieniowce [1,11], grzyby [3, 10, 13, 15] i drożdże [14,15]. Badano adsorpcję kilku aktynowców (tor, uran) i lantanowców (lantan, europ, iterb) przez Mycobacterium smegmati. Ilość lantanowców zaadsorbowanych w komórce okazała się niewielka[1]. Ostatnio stwierdzono, że gram-ujemne bakterie (takie jak Variovorax paradoxus), lepiej adsorbują lekkie REE (Y, La, Ce, Nd). Okazało się, że roztwór zawierający jeden rodzaj pierwiastka grupy REE jest lepszym medium dla bakterii oddziałujących z REE niż roztwór z mieszaniną tych pierwiastków. W wyniku przeprowadzonych badań nad oddziaływaniem mikroorganizmów z pierwiastkami ziem rzadkich, okazało * Instytut Technologiczno-Przyrodniczy w Falentach, Al. Hrabska 3, Raszyn, m.rytel@itep.edu.pl

2 570 M. RYTEL, S RUSSEL się, że największe ilości REE magazynowane są w komórkach bakterii gram dodatnich, natomiast akumulacja REE w komórkach bakterii gram ujemnych, grzybów, oraz drożdży była zdecydowanie niższa [6]. W wyniku badań okazało się, że tlenowa bakteria gram dodatnia z rzędu promieniowców Streptomyces najefektywniej absorbuje iterb z pośród wszystkich pierwiastków ziem rzadkich [7]. Fosfogipsy, jako odpady powstałe podczas rozkładu surowców fosforowych, zawierają liczne zanieczyszczenia w postaci REE, metali ciężkich lub nawet uranu. Stanowią wobec tego, swoisty rezerwuar cennych pierwiastków [8]. METODYKA Próbki do badań pobrano z hałdy fosfogipsu w Wiślince. W celu pobrania próbek usunięto 10 cm wierzchniej warstwy, a następnie pobrano próbki fosfogipsu. Próbki fosfogipsu umieszczane były w sterylnych 50 ml pojemnikach wypełnionych solą fizjologiczną (8,5 g NaCl) w 1/3 objętości. Próbki umieszczono w temperaturze 4 C i transportowano do laboratorium. Bakterie izolowano na podłożu stałym o składzie: La 2 O 3 2 g; pepton 2 g; ekstrakt drożdżowy 1 g; CaCl 2 0,1 g; KH 2 PO 4 0,05 g; MgSO 4 x7h 2 O 0,02 g; NaCl 0,2 g; (NH 4 ) 2 SO 4 0,1 g (A). Hodowle inkubowano w temperaturze 20 C. Po 24 godzinach inkubacji próbki pasażowano. Pasażowanie powtarzano do momentu uzyskania czystych kolonii. W celu wstępnego określenia zdolności bakterii do redukcji związków pierwiastków ziem rzadkich wykorzystano metodę arsenazo III: 50 mg odczynnika arsenazo III rozpuszczono w 100 ml wody destylowanej. Przygotowano roztwór wzorcowy lantanu 1 mg La/ml: rozpuszczono 0,117 g La 2 O 3, odwodnionego przez wyprażenie, w 5 ml gorącego kwasu solnego. Rozcieńczono roztwór wodą destylowaną do 100 ml. Do roztworu badanego (ph~1), zawierającego mniej niż 80 µg metali ziem rzadkich, dodano 2 ml 1% roztworu kwasu askorbinowego. Po paru minutach 1 ml buforu mrówczanowego (ph 3,5) i 4 ml roztworu arsenazo III i dopełniono do 40 ml wodą destylowaną. Roztwór doprowadzono do ph~2,6 i dopełniono wodą destylowaną do 50 ml. Absorbancję mierzono przy długości fali λ= 650 nm. Krzywą wzrostu bakterii ustalano na płynnym podłożu pełnym o ph 7. Do doświadczenia wykorzystano bakterie po 12 godzinnej inkubacji. Hodowle prowadzone były na wytrząsarce w temperaturze 20 C. Dodatkowo zmierzono możliwości wzrostu szczepu w temperaturach 10 C, 30 C i 40 C oraz przy różnych wartościach ph podłoża: 5, 9 i 11. Absorbancja mierzona była co 8 godzin przez 8 dni, przy długości fali λ= 600 nm. W celu amplifikacji genów 16S rrna prowadzono reakcję PCR-u kolonijnego (Gathogo i wsp., 2003). Próbki zsekwencjonowano w Pracowni Sekwencjonowania

3 Izolacja i wstępna charakterystyka bakterii redukujących metale ziem rzadkich z hałdy w DNA i Syntezy Oligonukleotydów w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN. W procesie sekwencjonowania użyto następujących starterów: 1) 27F 5 AGAGTTTGATCATGGCTCAG 3 2) 1492R 5 GGTTACCTTGTTACGACTT 3 Otrzymane sekwencje zostały porównane z bazą danych, wykorzystując program BLAST znajdującego się na stronie internetowej: WYNIKI W celu izolacji bakterii zdolnych do redukcji pierwiastków ziem rzadkich zastosowano podłoże A. Bakterie hodowano na szalkach Petriego z podłożem A zestalonym agarem do momentu pojawienia się pojedynczych kolonii (do 5 dni). Z puli wyrosłych kolonii do dalszej analizy wybrano 8 morfologicznie różnych kolonii. W celu potwierdzenia czy wszystkie wybrane szczepy są zdolne do redukcji pierwiastków ziem rzadkich (lantanu), przeprowadzono test metodą arsenazo III. Spośród 8 szczepów tylko 1 izolat dał pozytywny wynik w przeprowadzonym teście. Po odwirowaniu hodowli zmierzona absorbancja była przybliżona do wartości próby roztworu wzorcowego (~0,4), natomiast różniła się od roztworu bez dodatku pierwiastków ziem rzadkich (absorbancja roztworu ~0,006). W ten sposób, spośród 8 szczepów bakterii wyizolowanych z hałdy fosfogipsu wyróżniono 1 szczep zdolny do redukcji pierwiastków ziem rzadkich. Analiza uzyskanej sekwencji 16 rdna wykazała, że wyizolowany szczep należy do gatunku Chryseobacterium jejuense (zgodność 99%). Wykres 1 przedstawia krzywą wzrostu bakterii w podłożu płynnym o różnym ph. Z wykresu wynika, że wyizolowany szczep do wzrostu preferuje ph zbliżone do neutralnego lub lekko zasadowego (najszybszy wzrost przy ph 7 po 18 godzinach i przy ph 9 po 32 godzinach). Szczep, po nieco ponad 5 dniach adaptacji, wykazał się gwałtownym wzrostem także przy ph 11. W pożywce o kwaśnym odczynie, izolat wykazywał powolny wzrost. Wykres 2 Przedstawia krzywą wzrostu wyizolowanego szczepu w hodowlach prowadzonych w różnych temperaturach. Najintensywniejszy wzrost bakterii można zauważyć w temperaturach 20 C oraz 30 C. W obydwu przypadkach wzrost bakterii następuje już po 18 godzinie hodowli. Temperatury 10 C i 40 C wymagają około 3 dniowej adaptacji szczepu. Po 3 dniach wyizolowany szczep bakterii również wykazuje możliwość do wzrostu w tych temperaturach.

4 absorbancja (600nm) absorbancja (600nm) 572 M. RYTEL, S RUSSEL wzrost w zależności od ph 3 2,5 2 1, k 0,5 0 t0 t16 t32 t48 t64 t80 t96 t112 t128 t144 t160 t176 t192 czas [h] Wykres 1. Wzrost wyizolowanego szczepu w zależności od ph podłoża wzrost w zależności od temp 3 2,5 2 1, k 0,5 0 t0 t16 t32 t48 t64 t80 t96 t112 t128 t144 t160 t176 t192 czas [h] Wykres.2 Wzrost wyizolowanego szczepu w zależności od temperatury hodowli

5 Izolacja i wstępna charakterystyka bakterii redukujących metale ziem rzadkich z hałdy w DYSKUSJA Fosfogips powstający w następstwie produkcji nawozów fosforowych zawiera pierwiastki ziem rzadkich [9]. Należało więc przypuszczać, że żyją w środowisku hałdy mikroorganizmy zdolne do redukcji związków pierwiastków ziem rzadkich. Udało się wyizolować szczep Chryseobacterium jejuense. Jest to rodzaj bakterii tlenowych, gram ujemnych. Jak wykazały wcześniejsze badania interakcji mikroorganizmów z pierwiastkami ziem rzadkich, to bakterie gram dodatnie znacznie lepiej akumulowały pierwiastki z grupy lantanowców [12]. Gram ujemna bakteria, wyizolowana z hałdy fosfogipsu jest natomiast w stanie redukować nierozpuszczalne związki pierwiastków ziem rzadkich (La 2 O 3 ), o czym świadczyły wyniki mierzonej absorbancji. Analiza jakościowa nie daje jednak odpowiedzi, czy bakteria ta również bierze udział w akumulacji pierwiastków ziem rzadkich. Wzrost bakterii w szerokim zakresie temperatur, jak również ph powoduje, że szczep Chryseobacterium jejuense posiada potencjał do ługowania pierwiastków ziem rzadkich związanych w minerałach lub stanowiących zanieczyszczenia w fosfogipsach. Istnieją metody wykrywania pierwiastków ziem rzadkich akumulowanych przez bakterie za pomocą promieni rentgena. Metoda została wykorzystana do analizy akumulacji itru przez szczep Variovorax paradoxus [5]. Variovorax paradoxus to również gram ujemna bakteria wykazująca możliwości wzrostu w szerokim zakresie temperatur oraz ph [4]. Z wynikających podobieństw między wyizolowanym szczepem a Variovorax paradoxus, można podejrzewać, że szczep Chryseobacterium jejuense nie tylko posiada potencjalne możliwości ługowania pierwiastków ziem rzadkich, ale także może posiadać zdolności ich magazynowania wewnątrz komórki. LITERATURA [1] ANDRES Y., MACCORDICK H. J., HUBERT J.-C., Appl. Microbiol. Biotechnol, 1993, 39, [2] BYERLEY J. J., SCHARER M., CHARLES A. M., Chem. Eng. J, 1987, 36, B49, [3] GOLAB B. Z., ORLOWWSKA R. W. SMITH, Water Air SoilPollut, 1991, 60, [4] DAVIS, D. H.,. DOUDOROFF M, STANIER R. Y., MANDEL M., Int. J. Syst. Bacteriol. 1969, 19: [5] KAMIJO M., SUZUKI T., KAWAI K., MURASE H., Journal of Fermentation and Bioengineering, 1998, Vol. 86, No. 6, [6] KAMIJO M., SUZUKI T., KAWAI K., MURASE H., FERMENT J., Bioeng, 1998, 86, [7] KAMIJO M., SUZUKI T., KAWAI K., FUJII T., MURASE H., Biosci. Bioeng, 1999, 87, [8] KOWALCZYK J., MAZANEK C., Fizykochemiczne problemy mineralurgii, 1987, 19, p [9] KOWALCZYK J., Fizykochemiczne problemy mineralurgii, 1994, 28, p

6 574 M. RYTEL, S RUSSEL [10] MIYAWAKI R., NAKAI I., Handbook of the physics and chemistry of rare earths, Elsevier, 1993, 16, [11] TSURUTA T., BIOSCI J., Bioeng., 2002, 94, [12] TSURUTA T., Jurnal of Nuclear and Radiochemical Sciences, 2005, Vol. 6, No.1, pp [13] SAKAGUCHI T., TSURUTA T., NAKAJIMA A., Engineering Foundation Conference, eds. B. S. Richardson and B. J. Schneiner, 1996, p [14] SHUMATE II S. E., STRANDBERG G. W., PARROTT J. R.., Biotechnol. Bioeng. Symp., 1978, 8, [15] STRANDBERG G. W.,. SHUMATE II S. E, PARROTT J. R.., Appl. Env. Microbiol., 1981, 41, ISOLATION AND PRELIMINARY CHARACTERISTIC OF RARE EARTH ELEMENTS REDUCING BACTERIA ISOLATED FROM PHPSPHOGYPSUM DUMPS IN WISLINKA The article presents results of isolation of bacteria from phosphogypsum dumps in Wislinka with the ability to reduce rare earth elements. There were isolated one strain of bacteria have this ability. Chryseobacterium jejuense. It was show that the Mount of bacteria having the ability to reduce REE compounds is small. It was also found tha the isolated strain has the ability to grow over a wide temperature range. The isolated bacterial strain hardly tolerates environment of low ph.