WPŁYW I CHARAKTERYSTYKA MIKROORGANIZMÓW WYIZOLOWANYCH ZE ŚRODOWISKA KOPALNI ZŁOTA W ZŁOTYM STOKU NA UTLENIANIE ZWIĄZKÓW MANGANU

Transkrypt

1 mangan, utlenianie, mikroorganizmy Michał RYTEL, Stefan RUSSEL * WPŁYW I CHARAKTERYSTYKA MIKROORGANIZMÓW WYIZOLOWANYCH ZE ŚRODOWISKA KOPALNI ZŁOTA W ZŁOTYM STOKU NA UTLENIANIE ZWIĄZKÓW MANGANU Praca przedstawia wyniki izolacji bakterii z kopalni złota w Złotym Stoku, posiadających zdolność do utleniania manganu. Ze środowiska kopalni wyizolowano dwa szczepy bakterii posiadających taką zdolność: Serratia protulomoleculans oraz Achromobacter sp. W pracy wykazano, że wyizolowane szczepy potrafią wykorzystywać związki manganu jako jedynego źródła energii. Okazało się również, że wyizolowane mikroorganizmy są zdolne do wykorzystywania związków manganu uwięzionych w skałach, co wpływa na uwalnianie manganu do środowiska. 1. WSTĘP W obiegu manganu w przyrodzie decydującą rolę odgrywają mikroorganizmy. Bakterie zdolne do utleniania Mn(II) należą do różnych domen: Firmicutes, Proteobacteria i Actinobacteria, należy przy tym zaznaczyć, że stale poznajemy nowe bakterie zdolne do przeprowadzania tego procesu. Niektóre z nich zostały stosunkowo dobrze poznane i uznane jako organizmy modelowe: Bacillus sp., Pseudomonas putida i Leptothrix discophora. Okazało się, że mikroorganizmy utleniające mangan, głównie bakterie i grzyby znacznie szybciej przyczyniają się do biomineralizacji manganu niż jakiekolwiek inne czynniki abiotyczne. Sztolnie kopalni złota w Złotym Stoku tworzą specyficzne środowisko życia. Brak dostępu światła uniemożliwia rozwój roślin i organizmów fototropicznych. Takie warunki tworzą mikroklimat promujący organizmy chemoautotroficzne, czerpiące * Instytut Technologiczno-Przyrodniczy w Falentach, Zakład Biologii Środowiska i Higienizacji Wsi, al. Hrabska 3, Falenty.

2 444 M. RYTEL, S. RUSSEL energię z utleniania związków chemicznych. Poza nimi występują również saprofity oraz drapieżniki. Panuje stała temperatura 10 C, wilgotność jest niemal 100%. Martwa materia organiczna dostarczana jest z zewnątrz wraz z przesiąkającą wodą, natomiast cząstki organiczne mogą być transportowane wraz z powietrzem. Jednak głównym rezerwuarem materii organicznej jest rozkradające się drewno, które stanowiło wsporniki dla stropu lub służyło jako podkład pod tory. Celem niniejszej pracy była charakterystyka utleniania związków manganu przez mikroorganizmy wyizolowanych z biofilmów naskalnych oraz mat wodnych ze środowiska kopalni złota w Złotym Stoku. 2. METODYKA Próbki do badań pobrano ze sztolni Gertruda w kopalni złota w Złotym Stoku. Pobrano 16 próbek z 8 punktów sztolni. Biofilmy naskalne pobrano w 6 punktach, pozostałe 2 punkty to maty wodne. Brązowa barwa biofilmów sugerowała obecność manganu w podłożu, co determinowało pobranie takiej próbki. Fragmenty biofilmów oraz mat wodnych umieszczane były w sterylnych 50 ml pojemnikach wypełnionych podłożem wg Dubinina, w 1/3 objętości. Próbki umieszczono w temperaturze 4 C i transportowano do laboratorium. Bakterie izolowano na podłożu stałym wg Dubinina, a następnie przeszczepiano hodowle na podłoże wg Moy, Neilan. Inkubacja trwała 2 dni w 24 C. W celu uzyskania czystych szczepów wielokrotnie pasażowano wyhodowane kolonie na podłożu minimalnym z dodatkiem 1mM MnSO 4 x 5H 2 O. W celu wstępnego określenia zdolności do utleniania Mn(II) przez wyizolowane bakterie zastosowano test z odczynnikiem benzydynowym. Odczynnik w obecności Mn(IV) powoduje reakcję barwną (podłoże zmienia kolor na niebieski) Krzywą wzrostu bakterii ustalano na płynnym podłożu pełnym. Do doświadczenia wykorzystano bakterie po 12 godzinnej inkubacji. Hodowle prowadzone były w na wytrząsarce w temperaturze pokojowej. Absorbancja mierzona była, co godzinę przez 17 godzin, przy λ= 600nm. Eksperyment na utlenianie Mn prowadzono na podłożu minimalnym z dodatkiem uwodnionego siarczanu manganu(ii), którego stężenie w podłożu wynosiło 1mM. Doświadczenie trwało 11 dni, hodowla była wytrząsana w temperaturze pokojowej a pomiary wykonywane były, co 24 godziny.ogólną liczbę bakterii ustalano przy użyciu komory Thoma. W celu amplifikacji genów 16S rrna prowadzono reakcję PCRu kolonijnego. Eksperyment wykazujący oporność wyizolowanych szczepów na wybrane metale przeprowadzono na podłożu minimalnym z dodatkiem 1mM manganu (II) oraz wy-

3 Wpływ i charakterystyka mikroorganizmów wyizolowanych ze środowiska kopalni złota 445 branego związku metalu (Tab.1). Podłoża zawierały sole metali ciężkich w minimalnych stężeniach hamujących wzrost wybranych mikroorganizmów. Tabela 1. Związki wykorzystane w eksperymencie Analizowany metal Związek chemiczny Badane stężenie [mm] Cr (III) Cr 2 (SO 4 ) 3 x 18 H 2 O 1-10 Zn (II) ZnSO 4 x 7 H 2 O 1-5 Cu (II) CuSO 4 x 5 H 2 O 1-4 Co (II) CoSO 4 x 7 H 2 O 1-3 Fe FeCl V (V) NaVO Cd (II) CdSO 4 x 8H 2 O WYNIKI W celu izolacji bakterii zdolnych do utleniania Mn zastosowano podłoże wg Dubinina; Bakterie hodowano na szalkach Petriego z podłożem minimalnym z dodatkiem 1mM MnSO 4 x 5H 2 O do momentu pojawienia się pojedynczych kolonii (do 5 dni). Z puli wyrosłych kolonii do dalszej analizy wybrano 30 morfologicznie różnych kolonii. W celu potwierdzenia czy wszystkie wybrane szczepy są zdolne do utleniania manganu przeprowadzono test z odczynnikiem benzydynowym. Spośród 30 szczepów tylko 8 izolatów dało pozytywny wynik w przeprowadzonym teście. Kolonie potraktowane odczynnikiem benzydynowym przebarwiły się na ciemny niebieski kolor, co świadczy, że w podłożu znajduje się Mn(IV). W ten sposób spośród wszystkich szczepów bakterii wyizolowanych z kopalni wyróżniono 8 szczepów zdolnych do utleniania manganu. Na wyróżnionych szczepach przeprowadzona analizę enzymem restrykcyjnym (EcoR1) w celu pozbycia się powtarzających szczepów. Rysunek 1 przedstawia analizę restrykcyjną wyizolowanych szczepów. Na zdjęciu są widoczne dwa rodzaje układu prążków, świadczące o występowaniu jedynie dwóch różnych mikroorganizmów (ścieżka nr. 5 jest charakterystyczna dla jednego szczepu, reszta ścieżek, na których układ prążków jest identyczny świadczą o wystąpieniu tego samego rodzaju bakterii). Do dalszych analiz wybrano szczep ze ścieżki nr 5 oraz losowo wybrany szczep z pozostałych ścieżek. Wybrane próbki zsekwencjonowano w Pracowni Sekwencjonowania DNA i Syntezy Oligonukleotydów w Instytucie Bio-

4 Stężenie Mn(II) ppm 446 M. RYTEL, S. RUSSEL chemii i Biofizyki PAN. Celem eksperymentu było sprawdzenie możliwości wykorzystania Mn(II), jako jedynego źródła energii. W tym celu prowadzono hodowle na podłożu minimalnym, w którym jedynym źródłem energii był MnSO 4 x 5H 2 O. 500pz M pz Rys. 1. Analiza elektroforetyczna DNA. Ścieżki przedstawiają: M-wzorzec wielkości DNA, 1-8 preparaty 16S rdna szczepów MR1-MR8 trawione enzymem EcoRI Dynamika utleniania manganu Dni Achromobacter sp. S. protulomoleculans K Rys. 2. Mikrobiologiczne utlenianie manganu Rysunek 2 przedstawia zmianę stężenia Mn(II) na podłożu płynnym na skutek działalności mikroorganizmów. Celem eksperymentu było udowodnienie, że wyizolowane szczepy bakterii potrafią wykorzystywać związki Mn(II) jako jedyne źródło energii. Spadek stężenia manganu(ii) w roztworze oraz pojawienie się ciemnego osadu jedynie w próbkach zaszczepionych bakteriami świadczy o jego biologicznym utlenianiu.

5 Wpływ i charakterystyka mikroorganizmów wyizolowanych ze środowiska kopalni złota 447 Tabela 2. Wyniki eksperymentu na oporność izolatów na wybrane metale Metal Stężenie mm Cu Cr Zn Cd Fe Co V Achromobacter sp. szczep S. protulomoleculans Tabela 2 przedstawia minimalne stężenia wybranych pierwiastków pływających inhibująco na wzrost bakterii. Kadm i cynk okazały się najbardziej toksycznymi pierwiastkami, ich minimalne stężenie hamujące wzrost obydwu szczepów to 1mM. Pierwiastki takie jak wanad i kobalt, również okazały się skutecznymi inhibitorami wzrostu. Szczepy nie wykazują wzrostu w stężeniach wyższych niż odpowiednio 1 i 2 mm.

6 448 M. RYTEL, S. RUSSEL 4. DYSKUSJA Mimo tak ogromnej ilości mikroorganizmów żyjących w środowisku kopalni, udało się wyizolować jedynie dwa szczepy, które potrafią utleniać mangan. Przyczyną tak skąpej ilości wyizolowanych szczepów bakterii zdolnych do utleniania manganu prawdopodobnie jest trudność w dobraniu odpowiednich warunków hodowli. Poza tym, procent szczepów, które można hodować w warunkach laboratoryjnych jest znikomy. Można, więc podejrzewać, że mikroorganizmów zdolnych do przeprowadzania procesu utleniania manganu jest znacznie więcej niż jedynie dwa. Obecność w podłożu związku Mn(II) (MnSO 4 x 5H 2 O) wymagało obniżenia ph podłoża do 6, w celu zatrzymania chemicznego utleniania się manganu. Przeprowadzony eksperyment dotyczący kinetyki utleniania Mn(II) (rysunek 2) przedstawia, że zarówno Achromobacter sp. jak również Serratia protulomoleculans są w stanie utleniać mangan. Spadek stężenia Mn(II) o ok 20 ppm wiąże się ze wzrostem stężenia Mn(IV), co zaobserwować można było w postaci ciemnego osadu. Z przeprowadzanych wcześniej badań [4] wynika, że najefektywniejsze biologiczne utlenianie Mn(II) zachodzi przy jego stężeniu równym 70ppm. Zespół ten wyizolował ze środowisk morskich 5 szczepów zdolnych do przeprowadzenia procesu utleniania manganu. Dwa spośród badanych szczepów wykazały się wysoką efektywnością gdyż po 160 godzinach prowadzenia hodowli zanotowano spadek stężenia Mn(II) o 50 ppm, podczas gdy po 160 godzinach hodowli szczepów wyizolowanych z kopalni zanotowano spadek stężenia o 20 ppm. Niższa efektywność szczepów kopalnianych może być wynikiem obecności wielu związków nieorganicznych w skałach kopalni, a mangan nie jest ich podstawowym źródłem energii. Stwierdza się [8], że większość organizmów posiadających zdolność utleniania manganu posiada enzym oksydazę multimiedziową (MCO), która w przypadku braku manganu w środowisku może być wykorzystywana do wiązania żelaza. Istnieje możliwość, że wyizolowane z zamkniętego środowiska szczepy posiadają jedynie oksydazę cytochromową, która zaadoptowała się odwrotnie niż MCO i w przypadku braku żelaza może być wykorzystana do wiązania Mn(II). Wcześniejsze badania nad szczepami morskimi [4], wykazały, że ph rośnie wraz ze wzrostem stężenia Mn(IV) w podłożu (od ph 6,4 do ph ~7,4). W hodowlach zaszczepionych bakteriami wyizolowanymi z kopalni, odnotowano nieznaczny spadek ph, może wynikać z tego, że zarówno szczep Achromobacter sp. jak również Serratia protulomoleculans wykorzystują proces utleniania manganu nie tylko jako źródło energii, ale również jako pewnego rodzaju ochrony przed środowiskiem zewnętrznym, ponieważ okazało się, że niektóre mikroorganizmy potrafią tworzyć otoczki wykorzystując Mn(IV) [8]. Utlenianie związków manganu przez mikroorganizmy często wiąże się z uwalnianiem do środowiska innych toksycznych pierwiastków [8], postanowiono sprawdzić tolerancję szczepów na wybrane pierwiastki. Można zauważyć (tabela 2), że szczep Achromobacter sp. wykazuje tolerancję na wyższe stężenia toksycznych pierwiastków

7 Wpływ i charakterystyka mikroorganizmów wyizolowanych ze środowiska kopalni złota 449 niż szczep Serratia protulomoleculans. Wyniki analizy oporności na metale ciężkie, potwierdziły hipotezę, że mikroorganizmy żyjące w środowisku wodnym wykazują większą tolerancję na działanie metali ciężkich. LITERATURA [1] EDWARDS, K.J. i in., Geomicrobiology of the ocean crust: a role for chemoautotrophic Febacteria, Biol. Bull., 2003, Vol. 204, [2] FRIEDL, G. i in., Solid phases in the cycling of manganese in eutrophic lakes: new insights from EXAFS spectroscopy, Geochim. Cosmochim., 1997, Vol. 61, [3] JOHNSON, D. i in., Micro- organisms and manganese cycling in a seasonally stratified freshwater dam, Wat. Res., 1995, Vol. 29. No. 12, [4] MOY Y.P. i in., Screening, identification and kinetic characterization of a bacterium for Mn(II) uptake and oxidation, Biotechnology letters, 2003, Vol. 25, [5] PARIKH, S.J., CHOROVER, J., FTIR spectroscopic study of biogenic Mn-oxide formation by Pseudomonas putida GB-1, Geomicrobiol., 2005, Vol. 22, [6] TEBO, B.M. i in., Bacterially mediated mineral formation: insights manganese(ii) oxidation from molecular genetic and biochemical studies. [w:] Geomicrobiology: Interactions Between Microbes and Minerals (Reviews In Mineralogy) (Banfield, J.F. and Nealson, K.H., eds), Mineralogical Society of America, Washington, D.C, 1997, Vol. 35, [7] TEBO, B.M. i in., Biogenic manganese oxides: properties andmechanisms of formation, Annu. Rev. Earth Planet. Sci., 2004, Vol. 32, [8] TEBO,B. M., i in., Geomicrobiology of manganese(ii) Oxidation, TRENDS in Microbiology, 2005, Vol. 13, No. 9. [9] WEBB, S.M. i in., Evidence for the presence of Mn(III) intermediates in the bacterial oxidation of Mn(II), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. INFLUENCE AND CHARACTERISATION OF MANGANESE OXIDATION BYMICROORGANISMS ISOLATED FROM GOLD MINE IN ZLOTY STOK The article presents results of isolation of bacteria from a gold mine in Zloty Stok, having the ability to oxidize manganese. There were isolated two strains of bacteria have this ability. Serratia protulomoleculans and Achromobacter sp. The study showed that microorganisms are capable of using manganese compounds as the energy source. It also appeared that the isolated microorganisms are able to use manganese compounds trapped in the rocks, which affects the release of manganese into the environment.