Kontrola pożywek mikrobiologicznych. Sekcja Badań Epidemiologicznych

Transkrypt

1 Kontrola pożywek mikrobiologicznych Sekcja Badań Epidemiologicznych

2 Zgodnie z ISO oraz ISO jednym z czynników istotnie wpływających na jakość wyników badań w przypadku badań mikrobiologicznych, szczególnym znaczeniu dla powtarzalności i wiarygodności wyników badań są pożywki mikrobiologiczne. Jakość pożywek determinuje bowiem, zarówno możliwość wykrycia drobnoustrojów w badanej próbce, jak też ich poprawnej identyfikacji i prawidłowej oceny lekowrażliwości. W procesie badawczym, nawet najlepiej dobrane do określonego kierunku badania pożywki, ale niewłaściwej jakości, mogą spowodować uzyskanie niewiarygodnego wyniku. Jest to powód, dla którego pożywki mikrobiologiczne muszą odpowiadać określonym kryteriom jakościowym, a laboratorium powinno zapewniać odpowiednią jakość pożywek oraz sprawdzać i potwierdzać spełnienie kryteriów jakości pożywek.

3 W zależności od możliwości organizacyjnych, laboratoria mikrobiologiczne wykorzystują podłoża komercyjne lub przygotowują pożywki we własnym zakresie. Pożywki komercyjne są dostarczane do laboratorium w postaci gotowej do użycia lub jako częściowo przygotowane pożywki w postaci odwodnionych granulatów ewentualnie proszków, z których należy przygotować pożywkę. Każda seria pożywki dostarczana jest do laboratorium wraz z certyfikatem jakości, w którym wytwórca potwierdza jej jakość.

4 Certyfikat ten dla każdej serii pożywek, powinien zawierać następujące dane: 1. nazwę wytwórcy, 2. nazwę produktu, numer serii i datę ważności, 3. ogólną charakterystykę właściwości fizykochemicznych pożywki: kolor, ph, 4. charakterystykę mikrobiologiczną tj. wykaz szczepów kontrolnych użytych do przeprowadzenia kontroli danej serii 5. pożywki wraz z opisem prawidłowej morfologii kolonii wyrosłych na pożywce.

5 Zgodnie ze specyfikacja techniczną ISO/TS zaleca się, aby pożywki chronić przed dostępem światła, odwodnieniem i przechowywać je w temperaturze 5±3

6 Pożywki mikrobiologiczne definicja Pożywka hodowlana wg PN-EN 1659: Zestaw substancji w płynnej, półpłynnej lub stałej postaci, zawierający naturalne lub/i syntetyczne składniki służące do namnożenia lub utrzymania przy życiu drobnoustrojów Pożywka mikrobiologiczna stanowi środowisko wzrostu drobnoustrojów, dlatego musi spełniać wszystkie wymagania bakterii, dla których jest przeznaczona, zarówno pod względem zabezpieczenia w odpowiednie substancje odżywcze, jak również odpowiednie warunki dla wzrostu tak, aby mogło dojść do ich namnożenia, przechowywania, transportu czy identyfikacji.

7 W zależności od kryterium, pożywki mikrobiologiczne można klasyfikować ze względu na: skład: podłoża syntetyczne o ściśle określonym składzie chemicznym i podłoża o nie w pełni zdefiniowanym składzie chemicznym ze względu na obecność składników pochodzenia naturalnego, konsystencję: pożywki stałe, półpłynne i płynne, zastosowanie: podłoża namnażające, różnicujące, wybiórcze, wybiórczo-różnicujące, transportowe, postać pożywki: pożywki gotowe do użycia, pożywki suche i niekompletne.

8 Jednak bez względu na postać, skład, stan czy przeznaczenie, pożywki mikrobiologiczne powinny posiadać odpowiednią jakość. Podstawowymi parametrami jakości pożywek są odpowiednie właściwości fizyczne i chemiczne, a także właściwości mikrobiologiczne takie jak jałowość oraz, zależne od składu chemicznego - żyzność, selektywność, specyficzność i zdolność do badania wrażliwości drobnoustrojów na leki.

9 Kontrola ogólna właściwości fizycznych i chemicznych pożywki Właściwości fizyczne i chemiczne oceniane są głównie poprzez wizualną, makroskopową ocenę wyglądu pożywki. Kontrola ta jest łatwa do przeprowadzenia i bardzo przydatna, gdyż przed rozpoczęciem szczegółowych badań kontrolnych, może wskazywać na zmiany jakości pożywki. Przykładowo, inne niż oczekiwane zabarwienie pożywki może świadczyć o nieprawidłowym jej składzie chemicznym. Właściwości fizyczne i chemiczne należy kontrolować dla każdej partii pożywek, zarówno tych przygotowanych w laboratorium, jak i komercyjnych

10 Wśród właściwości fizycznych jakimi powinna charakteryzować się pożywka o odpowiedniej jakości, można wymienić takie jak np. właściwa grubość warstwy i jednorodność podłoża, prawidłowa wartość ph. Każda z tych cech jest na tyle istotna, że może warunkować użycie pożywki w procesie wykonania badania Inną, ważną właściwością jest jałowość pożywki, która zapewnia ograniczenie możliwości uzyskania wyniku fałszywie dodatniego hodowli drobnoustrojów, będącego wynikiem zanieczyszczenia mikrobiologicznego pożywki przed

11 Jałowość pożywki uzależniona jest od właściwego przeprowadzenia procesu sterylizacji. Sterylizację najczęściej wykonuje się za pomocą przegrzanej pary wodnej (autoklaw) lub metodą filtracji. Jakość pożywki w dużej mierze zależy także od warunków jej przechowywania

12 Ocenę jałowości przeprowadza się inkubując pożywki w temperaturze odpowiedniej dla stosowanej metody badania pod względem jałowości należy badać, np. jedną płytkę/butelkę lub 1% płytek/butelek z początku i końca partii produkcyjnej, inkubując pożywki co najmniej 18 godzin w temperaturze 37 C lub temperaturze w jakiej pożywka jest stosowana w procedurze badawczej

13 Do oceny właściwości mikrobiologicznych pożywek wpływających na wzrost, tj. żyzności i selektywności drobnoustrojów, należy wykorzystywać metody ilościowe i półilościowe, zaś do oceny specyficzności - metody jakościowe. Niezbędnym warunkiem przeprowadzenia tej kontroli jest zastosowanie odpowiednich szczepów kontrolnych.

14 Kontrola ilościowa pożywek Żyzność to taka cecha, która świadczy o właściwościach odżywczych pożywki wpływających na możliwość wzrostu drobnoustrojów. Pożywka charakteryzująca się odpowiednią żyznością to pożywka umożliwiająca szybki i intensywny wzrost drobnoustrojów.

15 dla poprawnego wykonania badania żyzności należy zastosować tzw. pożywkę referencyjną, pełniącą rolę pożywki odniesienia, do której porównujemy pożywkę badaną. Najczęściej, pożywką referencyjną jest pożywka nieselektywna, zapewniająca optymalny wzrost wszystkich szczepów kontrolnych, dodatnich i ujemnych.

16 na pożywkę badaną oraz referencyjną należy posiać po 0,1 ml zawiesiny szczepu kontrolnego o tak dobranym stężeniu drobnoustrojów, aby po inkubacji uzyskać policzalną liczbę kolonii. Zawiesinę bakteryjną dokładnie rozprowadzić na pożywkach za pomocą głaszczki. Po zakończeniu inkubacji, policzyć kolonie wyrosłe na pożywkach i obliczyć współczynnik żyzności (PR)

17 PR = Ns / No Gdzie: PR współczynnik żyzności (Productivity Ratio) Ns całkowita liczba kolonii na pożywce badanej No całkowita liczba kolonii na pożywce referencyjnej

18 Inną metodą oceny żyzności pożywek stałych jest półilościowa ekonometryczna metoda posiewu rysowego. W metodzie tej, oceny żyzności dokonuje się poprzez wyznaczenie indeksu wzrostu (GI). Ezą o pojemności 1 μl nachyloną pod kątem w stosunku do podłoża, należy wykonać posiew rysowy dokładnie według schematu:

19 Schemat posiewu rysowego w metodzie ekonometrycznej wg Schematu posiewu rysowego w metodzie ekonometrycznej wg ISO

20 Indeks wzrostu wylicza się poprzez zsumowanie punktów przyznawanych każdej posianej linii według następującej skali: - 1 punkt - uzyskuje linia, na której stwierdzamy wzrost na całej długości - 0,5 punktu - uzyskuje linia, na której stwierdzamy wzrost na połowie długości 0 punktów uzyskuje linia, na której nie stwierdzono wzrostu lub wzrost jest mniejszy niż połowa długości posianej linii.

21 Ocena żyzności pożywek agarowych półilościową metodą ekonometryczną. Przykład wzrostu Salmonella Enteritidis na pożywce XLD.

22 Inną cechą użytkową pożywki jest selektywność (wybiórczość), świadcząca o zdolności pożywki do wybiórczego hamowania wzrostu określonych grup drobnoustrojów. Cecha ta związana jest z obecnością w pożywce takich składników (suplementów), które wybiórczo hamują wzrost jednych drobnoustrojów, ale nie wpływają na możliwość jednoczesnego wzrostu innych drobnoustrojów. Dzięki tej właściwości pożywki, możemy hodować określone, wybrane grupy drobnoustrojów.

23 Specyficzność pożywki to cecha zapewniająca właściwe różnicowanie drobnoustrojów wyhodowanych na danym podłożu. Rozróżnienie drobnoustrojów poprzez makroskopową ocenę stopnia nasilenia reakcji biochemicznych i/lub fizjologicznych (np. wielkość i kolor kolonii, obecność hemolizy) możliwe jest dzięki obecności w pożywce odpowiednich składników różnicujących.

24 Kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych Kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych służy do sprawdzania i/lub potwierdzania jakości, a tym samym, przydatności pożywek do wykonywania rutynowych badań mikrobiologicznych. Kontroli należy poddać pożywki wykonywane w laboratorium oraz pożywki pochodzenia komercyjnego

25 Kontrolę tę wykonuje się dla każdej serii pożywki stopniowo, etapami o różnym poziomie szczegółowości. Pierwszym etapem kontroli jest ocena ogólna, obejmująca określenie właściwości fizykochemicznych pożywki. Drugi etap, to ocena szczegółowa obejmująca mikrobiologiczne kryteria jakości pożywek charakteryzujące właściwości użytkowe pożywek, tj. jałowość, żyzność, selektywność i specyficzność. Zgodnie z EN 12322, daną partię pożywki można zaakceptować jako przydatną do stosowania w procesie diagnostycznym, tzn. uznać jej jakość za właściwą, jeśli jednocześnie spełnione są ogólne i mikrobiologiczne kryteria jakości

26 Prawidłowe przeprowadzenie kontroli żyzności, selektywności i specyficzności, wymaga aby dla każdej kontrolowanej pożywki skomponować odpowiednio dobrany zestaw szczepów kontrolnych przygotowanych na bazie szczepów referencyjnych.

27 Kontrola szczegółowa właściwości mikrobiologicznych pożywek Kontrola właściwości mikrobiologicznych pożywek ma na celu sprawdzenie obecności zanieczyszczeń mikrobiologicznych w pożywce, intensywności wzrostu drobnoustrojów na danej pożywce, zahamowania wzrostu mikroflory towarzyszącej, potwierdzenie, że wyhodowane drobnoustroje (szczep kontrolny) wykazują charakterystyczne dla swojego gatunku cechy biochemiczne i fizjologiczne oraz sprawdzenie przydatności do badania lekowrażliwości. Dlatego też, kontrola ta obejmuje tzw. mikrobiologiczne kryteria jakości

28 Prawidłowo skomponowany zestaw szczepów kontrolnych, powinien zawierać: 1. szczep stanowiący kontrolę dodatnią (tzw. szczep docelowy) posiadający typowe cechy, silnie rosnący na danej pożywce, wykazujący dodatni wynik testu, 2.szczep stanowiący kontrolę słabo dodatnią słabo rosnący na badanej pożywce, wykazujący z opóźnieniem wynik testu, 3.szczep stanowiący kontrolę ujemną wykazujący częściowe lub całkowite zahamowanie wzrostu na badanej pożywce, wykazujący ujemny wynik testu.

29 Instrukcja IT-27-LB Sporządzanie i kontrola pożywek mikrobiologicznych Załącznik nr 1 Załącznik nr 2 F5 do IT-27-EB F6 do IT-27-EB F7 do IT-27-EB F9 do IT-27-EB

30 Legionella pneumophila na podłożu GVPN

31 Kontrola jakościowa pożywki płynnej Fraser

32 Wzrost Salmonella Typhimurium na podłożu Rapid Salmonella agar i Hektoen agar

33 Podłoże płynne z malonianem sodu Klebsiella pneumoniae i Escherichia coli

34 Podłoże Colorex Listeria. Listeria inocua i Listeria monocytogenes

35 Listeria inocua

36

37

38

39