Charakterystyka izoenzymów aminotransferazy asparaginianowej z siewek pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum L.)

Transkrypt

1 Charakterystyka izoenzymów aminotransferazy asparaginianowej z siewek pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum L.) Marcin Maciąga & Andrzej Paszkowski Katedra Biochemii, Wydział Rolnictwa i Biologii, SGGW

2 Wstęp 2/16 Aminotransferaza asparaginianowa (EC ; AAT) katalizuje reakcję przeniesienia grupy aminowej (-NH 2 ) z L-asparaginianu na 2-oksoglutaran z utworzeniem szczawiooctanu i L-glutaminianu. Reakcja jest odwracalna i przebiega z udziałem kofaktora 5`-fosforanu pirydoksalu zgodnie z mechanizmem zwanym Ping Pong Bi Bi. Enzym jest aktywny katalitycznie wyłącznie jako dimer o masie cząsteczkowej około 90 kda. + H 3 N COO - CH CH 2 COO - O COO - C CH 2 CH 2 COO - AAT COO - C CH 2 COO O + H 3 N COO - CH CH 2 CH 2 COO - L-asparaginian 2-oksoglutaran szczawiooctan L-glutaminian Charakterystyka aminotransferazy asparaginianowej

3 Wstęp 3/16 Bierze udział w asymilacji azotu dostarczając 2-oksoglutaranu do cyklu GS/GOGAT; Dostarcza L-asparaginianu, który jest prekursorem w biosyntezie metioniny, tryptofanu i lizyny oraz asparaginy i ureidów; Uczestniczy w wewnątrzkomórkowym systemie wahadłowym jabłczanowo-asparaginianowym przenoszącym równoważniki redukcyjne w poprzek błon: mitochondrialnej, chloroplastowej i peroksysomalnej; Bierze udział w międzykomórkowym transporcie metabolitów między mezofilem a komórkami pochwy okołowiązkowej u roślin typu C 4. Funkcje metaboliczne aminotransferazy asparaginianowej u roślin

4 Wstęp 4/16 Gatunek Cytoplazma Mitochondria Chloroplasty Peroksysomy Glioksysomy Liczba genów Proso (Panicum miliaceum) 3 Ryż (Oryza sativa) 4 Szpinak (Spinacia oleracea) 4 Rzodkiewnik (Arabidopsis thaliana) 5 Kukurydza (Zea mays) 5 Soja (Glycine max) 5 Lokalizacja wewnątrzkomórkowa izoenzymów AAT u wybranych roślin

5 Wstęp 5/16 Dt3AS M3A M3B Dt3AL Dt3BS NT3B-3A AAT-3c (αα) AAT-3b (αβ; βδ) AAT-3a (ββ; βδ; δδ) Ekstrakt Mt Chl Cyt - AAT-3c AAT-3b AAT-3a Pasmo cytoplazmatyczne (AAT-3) AAT-2c AAT-2b AAT-2a Pasmo chloroplastowe (AAT-2) Foto: Maciąga i Paszkowski AAT-1c AAT-1b AAT-1a Pasmo mitochondrialne (AAT-1) Izoenzymy aminotransferazy asparaginianowej u heksaploidalnej pszenicy

6 Cel pracy 6/16 Celem mojej pracy było porównanie właściwości biochemicznych izoenzymów aminotransferazy asparaginianowej z pasma chloroplastowego (AAT-2) i cytoplazmatycznego (AAT-3) z pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum), a następnie ustalenie ich sekwencji aminokwasowych i porównanie z dostępnymi sekwencjami dla tego enzymu u innych roślin.

7 Wyniki 7/16 Etap Aktywność całkowita U Zawartość białka mg Aktywność właściwa U mg -1 Odzysk % Stopień oczyszczenia -x Homogenat Siarczan amonu (40-80%) Sephadex G Rys. Materiał roślinny. 72 kda Rys. Kolumna z żelu Sephadex G-150. Przebieg oczyszczania izoenzymów z pasma chloroplastowego (AAT-2) i cytoplazmatycznego (AAT-3)

8 Wyniki 8/16 Etap Aktywność całkowita U Zawartość białka mg Aktywność właściwa U mg -1 Odzysk % Stopień oczyszczenia -x DEAE-celuloza AAT AAT Gradient od 20 do 250 mm pasmo AAT -2 0,5 Aktywność enzymu (U) pasmo AAT-3 0,4 0,3 0,2 0,1 Zawartość białka (A280) Rys. Kolumna z DEAE-celulozy podłączona do zestawu Bio-Rad. - + Przebieg oczyszczania izoenzymów z pasma chloroplastowego (AAT-2) i cytoplazmatycznego (AAT-3) 0 Pasmo cytoplazmatyczne (AAT-3) Pasmo chloroplastowe (AAT-2)

9 Wyniki 9/16 Etap Aktywność całkowita U Zawartość białka mg Aktywność właściwa U mg-1 Odzysk % Stopień oczyszczenia -x L-ornityna-Sepharose 4B AAT Protein-Pak Q 8HR AAT-2a AAT-2b AAT-2c Protein-Pak Q 8HR (Re) AAT-2a AAT-2b AAT-2c Gradient od 120 do 200 mm KCl AAT -2b 1 M KCl Gradient od 135 do 170 mm KCl 1 M KCl Aktywność enzymu (U). 4 AAT-2a 145 mm KCl 175 mm KCl. AAT-2c Zawartość białka (A280) Aktywność enzymu (U) mm KCl AAT -2c 155 mm KCl Zawartość białka (A280). Rys. Kolumna Protein-Pak Q 8HR podłączona do zestawu do HPLC Numer frakcji Przebieg oczyszczania izoenzymów z pasma chloroplastowego (AAT-2) Numer frakcji

10 Wyniki 10/16 AAT -2c -2b -2a -3c -3b -3a - Pasmo cytoplazmatyczne (AAT-3) Alloenzym L-asparaginian mm + 2-oksoglutaran mm L-glutaminian mm Pasmo chloroplastowe (AAT-2) Szczawiooctan mm k cat s -1 k cat /K m s -1 mm -1 AAT-2a AAT-2b AAT-2c AAT-3a NB NB AAT-3b NB NB AAT-3c NB NB Porównanie stałych K m i k cat /K m dla alloenzymów z pasma chloroplastowego i cytoplazmatycznego

11 Wyniki 11/16 Markery mas cząsteczkowych AAT-2c AAT-2b AAT-2a 97.4 kda 66.2 kda 45.0 kda Prążki poddane spektrometrii mas 31.0 kda 21.5 kda 14.4 kda SDS/PAGE alloenzymów z pasma chloroplastowego (AAT-2)

12 Wyniki 12/16

13 Wyniki 13/16 Porównanie sekwencji aminokwasowych izoenzymów aminotransferazy asparaginianowej

14 Wyniki 14/16 Izoenzymy mitochondrialne Izoenzymy chloroplastowe Izoenzymy cytoplazmatyczne Drzewko filogenetyczne roślinnych izoenzymów aminotransferazy asparaginianowej

15 Wnioski 15/16 Masa cząsteczkowa aminotransferazy asparaginianowej z pszenicy wyznaczona w warunkach natywnych (sączenie molekularne Sephadex G-150) wynosi około 72 kda, natomiast w warunkach denaturujących (SDS/PAGE) dla alloenzymów z pasma chloroplastowego około 44 kda. Między alloenzymami z pasma chloroplastowego i cytoplazmatycznego nie stwierdzono większych różnic we właściwościach kinetycznych (K m, k cat /K m ). Ustalono 5 pełnych spośród 9 sekwencji kodujących izoenzymy aminotransferazy asparaginianowej u pszenicy. Izoenzymy aminotransferazy asparaginianowej występują u roślin tylko w cytoplazmie, mitochondriach i chloroplastach.

16 Dziękuję za uwagę