(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 13/ EP B1 (13) (1) T3 Int.Cl. C07K 16/24 (06.01) A61K 39/00 (06.01) C07K 14/4 (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Antagoniści IL-21 () Pierwszeństwo: US 714 P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 08/36 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 13/ (73) Uprawniony z patentu: Zymogenetics, Inc., Seattle, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 PALLAVUR V. SIVAKUMAR, Frederiksberg, DK STEPHEN R. JASPERS, Brewster, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska PATPOL KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis [0001] Układ odpornościowy stanowi podstawową obronę organizmu przed chorobami wywoływanymi przez patogeny, takie jak bakterie, wirusy, grzyby itp., jak również chorobami spowodowanymi przez nieprawidłowy rozwój własnych komórek i tkanek organizmu (tj. guzy nowotworowe). Normalnie, układ odpornościowy jest zdolny rozróżniać prawidłowe komórki organizmu lub własne od komórek obcych patogenów lub nieprawidłowych lub nie będących własnymi. Proces dzięki któremu układ odpornościowy powstrzymuje się przed reagowaniem wobec własnego organizmu nazywany jest tolerancją. Czasami, układ odpornościowy traci zdolność rozpoznawania własnych jako prawidłowych i następująca odpowiedź, skierowana wobec tkanki lub komórek, prowadzi do utraty tolerancji - reakcji autoimmunologicznej. Patologie wynikające z reakcji autoimmunologicznej mają często poważne konsekwencje kliniczne i są jednym z głównych problemów zdrowia na świecie, w szczególności w krajach rozwiniętych. [0002] Cytokiny zazwyczaj pobudzają proliferację lub różnicowanie komórek linii krwiotwórczej lub biorą udział w mechanizmach odpowiedzi odpornościowej lub zapalnej organizmu. Interleukiny są rodziną cytokin, które pośredniczą w odpowiedziach odpornościowych. Receptory wiążące cytokiny zazwyczaj składają się z jednej lub większej liczby białek zintegrowanych z błonami, które wiążą cytokinę z wysokim powinowactwem i przekazują informację o zajściu wiązania do komórki za pośrednictwem cytoplazmatycznych części podjednostek konkretnego receptora. Receptory cytokin zostały podzielone na kilka klas, na podstawie podobieństwa ich zewnątrzkomórkowych domen wiążących ligand. Przykładowo, łańcuchy receptorowe odpowiedzialne za wiązanie i/lub przekazywanie sygnału działania interferonów są przedstawicielami klasy II rodziny receptorów cytokin, na podstawie charakterystycznej domeny zewnątrzkomórkowej złożonej z 0 reszt. [0003] Niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciał monoklonalnych anty-il-21 i ich zastosowania w leczeniu choroby autoimmunologicznej, jak określono w zastrzeżeniach. [0004] WO 99/61617 opisuje IL-21 i IL-22. [000] WO 03/0313 opisuje antagonistów IL-21. [0006] WO 04/ opisuje przeciwciała skierowane wobec receptora ludzkiej IL-21 i ich zastosowania. [0007] Ueda Maki i wsp., British Journal of Haematology, styczeń 0, tom. 128(2), str , opisuje wyrażanie funkcjonalnego receptora IL-21 na dorosłych komórkach białaczki z limfocytów T. [0008] Niniejsza specyfikacja opisuje przeciwciało monoklonalne anty-il-21, które wiąże się z regionem antygenowym ludzkiej IL-21. Przeciwciało monoklonalne może wiązać się z regionem antygenowym IL-21 przedstawionym w SEKW. NR ID.: 6, od reszty aminokwasowej 97 do 122. Przeciwciało monoklonalne może wiązać się z regionem antygenowym przedstawionym w SEKW. NR ID.: 6, od reszty aminokwasowej 14 do 148. Przeciwciało monoklonalne może wiązać się z regionem antygenowym przedstawionym w SEKW. NR ID.: 6 od reszty aminokwasowej 14 do 162. Przeciwciało monoklonalne może wiązać się z regionem antygenowym przedstawionym w SEKW. NR ID.: 6 od reszty aminokwasowej do 0. Specyfikacja opisuje przeciwciało monoklonalne wiążące się z regionem antygenowym przedstawionym w SEKW. NR ID.: 6 od reszty aminokwasowej do 0. Przeciwciała monoklonalne według wynalazku, jak tu opisano, można przedstawić jako neutralizujące aktywność białka ludzkiej IL-21. Przeciwciała monoklonalne według wynalazku jak tu opisano, można przedstawić jako wiążące się z białko Fc - ludzka IL-21, wiążące się z białkiem Fc ludzkiej muteiny, przy czym mutacje znajdują się w Gln14 i/lub Ile148 z SEKW. NR ID.: 6, lub wiążące się z mysią fuzją białkową Fc mysiej IL-21. Ogólnie, opisane tu przeciwciała monoklonalne wiążą się z dwoma lub większą liczbą białek IL-21. [0009] W innych aspektach wynalazku, przeciwciało monoklonalne (jak określono w zastrzeżeniach) swoiście wiąże się z epitopem, z którym wiąże się przeciwciało monoklonalne (nr dostępu ATCC PTA-39). Specyfikacja opisuje także przeciwciało monoklonalne, które swoiście wiąże się z 1

3 epitopem, z którym wiąże się przeciwciało monoklonalne (nr dostępu ATCC PTA- 394). Przeciwciała monoklonalne według wynalazku mogą być także wyznakowane wykrywalnym markerem i wykrywalny marker może być wybrany spośród, lecz nie ogranicz się do, izotopów radioaktywnych, enzymów barwników i biotyn. [00] Niniejszy wynalazek opisuje bin (lub grupę przeciwciał), który jest zdolny do współzawodniczenia z przeciwciałem monoklonalnym (nr dostępu ATCC PTA-39) o wiązanie z antygenem ludzkiej IL-21. [0011] Specyfikacja opisuje bin, który jest zdolny do współzawodniczenia z przeciwciałem monoklonalnym (nr dostępu ATCC PTA-394) o wiązanie z antygenem ludzkiej IL-21. [0012] W niniejszym wynalazku zawarte są także hybrydoma wytwarzające zastrzegane przeciwciała monoklonalne, jak określono w zastrzeżeniach. [0013] Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania przeciwciał monoklonalnych obejmującego: (a) dostarczenie hybrydoma zdolnej do wytwarzania przeciwciała monoklonalnego; i (b) hodowanie hybrydoma w warunkach, które umożliwiają wytwarzanie przeciwciała monoklonalnego przez hybrydoma, jak określono w zastrzeżeniach. [0014] W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza przeciwciało, jak określono w zastrzeżeniach, do zastosowania w leczeniu choroby autoimmunologicznej. W pewnych wykonaniach, choroba immunologiczna jest wybrana z grupy składającej się z zapalenia trzustki, cukrzycy typu I (IDDM), choroby Gravesa- Basedowa, nieswoistego zapalenia jelit (IBD, ang. inflammatory bowel disease), choroby Crohna, wrzodziejącego zapalenia okrężnicy, zespołu nadwrażliwości jelita, stwardnienia rozsianego, reumatoidalnego zapalenia stawów, uchyłkowatości jelit, tocznia rumieniowatego układowego, łuszczycy, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, twardziny skóry, twardziny układowej, artropatii łuszczycowej, choroby zwyrodnieniowej stawów, zapalenia atopowego skóry, bielactwa nabytego, choroby przeszczep przeciw gospodarzowi (GVHD, ang. graft vs. host disease), chłoniaka skórnego z limfocytów T (CTCL, ang. cutaneous T cell lymphoma), zespołu Sjogrena, kłębuszkowego zapalenia nerek, nefropatii IgA, choroby przeszczep przeciw gospodarzowi, odrzucenia przeszczepu, atopowego zapalenia skóry, zespołu antyfosfolipidowego, astmy, oraz innych chorób autoimmunologicznych. [001] Niniejsza specyfikacja opisuje sposób hamowania lub redukcji zaburzenia, w którym pośredniczy IL-21, obejmujący podawanie przeciwciała monoklonalnego anty-il-21 w ilości wystarczającej do zahamowania lub zredukowania u osobnika aktywności biologicznej, w której pośredniczy IL-21. [0016] Następujące definicje zostały dostarczone w celu ułatwienia zrozumienia opisanych tu wynalazków. [0017] Termin przeciwciało lub peptyd(y) przeciwciała odnosi się do całego przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego, który współzawodniczy z całym przeciwciałem o swoiste wiązanie i obejmuje przeciwciała chimeryczne, humanizowane, w pełni ludzkie i bispecyficzne. Fragmenty wiążące mogą być wytworzone za pomocą technik rekombinacji DNA. Fragmenty wiążące mogą być wytworzone za pomocą cięcia enzymatycznego lub chemicznego całego przeciwciała. Fragmenty wiążące obejmują, lecz nie ograniczają się do, Fab, Fab', F(ab') 2, Fv i przeciwciała jednołańcuchowe. [0018] Termin wyizolowane przeciwciało odnosi się do przeciwciała, które zostało zidentyfikowane i wydzielone i/lub odzyskane ze składnika z jego naturalnego środowiska. Składnikami zanieczyszczającymi z jego naturalnego środowiska są materiały, które przeszkadzałyby w zastosowaniach diagnostycznych lub terapeutycznych przeciwciała, i mogą one obejmować enzymy, hormony i inne rozpuszczone substancje białkowe lub niebiałkowe. Przeciwciało może być oczyszczone (1) do ponad 9% wagowo przeciwciała określonego metodą wg Lowryego, a korzystniej ponad 99% wagowo, (2) do stopnia wystarczającego do uzyskania co najmniej 1 reszt z końca N lub wewnętrznej sekwencji aminokwasowej określonej przy użyciu sekwenatora typu spinning cup, lub (3) do homogenności za pomocą metody SDS-PAGE w warunkach 2

4 1 2 3 redukujących lub nieredukujących stosując barwienie przy użyciu błękitu Coomassiego lub korzystnie, srebra. Wyizolowane przeciwciało obejmuje przeciwciało in situ w zrekombinowanych komórkach, jeżeli co najmniej jeden składnik naturalnego środowiska przeciwciała nie będzie obecny. Zazwyczaj, jednakże, wyizolowane przeciwciało będzie wytworzone przez co najmniej jeden etap oczyszczania. [0019] Wariant przeciwciała anty-il-21 odnosi się tu do cząsteczki, która różni się sekwencją aminokwasową od sekwencji aminokwasowej rodzicielskiego przeciwciała anty-il-21 dzięki addycji, delecji, i/lub substytucji jednej lub większej liczby reszt aminokwasowych w sekwencji przeciwciała rodzicielskiego. Wariant może obejmować jedną lub większą liczbę substytucji aminokwasowych, w jednym lub większej liczbie regionów hiperzmiennych przeciwciała rodzicielskiego. Przykładowo, wariant może obejmować co najmniej jeden, np. od około jednego do około dziesięciu, a korzystnie od około dwóch do około pięciu, substytucji w jednym lub większej liczbie regionów hiperzmiennych przeciwciała rodzicielskiego. Zazwyczaj, wariant będzie posiadać sekwencję aminokwasową o co najmniej 7% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencjami domeny zmiennej łańcucha ciężkiego lub lekkiego przeciwciała rodzicielskiego, korzystniej o co najmniej 80%, korzystniej o co najmniej 8%, korzystniej o co najmniej 90%, a najkorzystniej o co najmniej 9%. Identyczność lub homologia w odniesieniu do tej sekwencji jest tu zdefiniowana jako procent reszt aminokwasowych w wytypowanej sekwencji, który jest identyczny z resztami przeciwciała rodzicielskiego, po przyrównaniu ze sobą tych sekwencji i wprowadzeniu przerw, jeśli to konieczne, w celu uzyskania maksymalnego odsetka identyczności sekwencji. Żadne z wydłużeń, delecji lub insercji, na końcu N, końcu C i wewnątrz sekwencji przeciwciała nie powinno być interpretowane jako zaburzające identyczność lub homologię. Wariant zachowuje zdolność do wiązania ludzkiej IL-21 i korzystnie posiada lepsze właściwości niż przeciwciało rodzicielskie. Przykładowo, wariant może posiadać silniejsze powinowactwo wiązania, wzmocnioną zdolność hamowania indukowanego przez IL-21 pobudzania komórek układu odpornościowego. W celu analizy takich właściwości, powinno się porównać postać Fab wariantu z postacią Fab przeciwciała rodzicielskiego lub postać o pełnej długości wariantu z postacią o pełnej długości z przeciwciała rodzicielskiego, przykładowo, ponieważ ujawniono, że forma przeciwciała anty-il-21 ma wpływ na jego aktywność w ujawnianych tu testach aktywności biologicznej. Wariantem przeciwciała, który stanowi tu szczególny przedmiot zainteresowania jest ten, który wykazuje co najmniej około. krotne, korzystnie co najmniej około. krotne, a najkorzystniej co najmniej około 0. krotne, wzmocnienie aktywności biologicznej, w porównaniu z przeciwciałem rodzicielskim. [00] Termin przeciwciało rodzicielskie w użytym tu znaczeniu odnosi się do przeciwciała, które posiada dowolną sekwencję aminokwasową stosowaną do wytworzenia wariantu. Korzystnie, przeciwciało rodzicielskie posiada ludzki region zrębowy i, jeśli obecny, posiada region(y) stały przeciwciała ludzkiego. Przykładowo, przeciwciało rodzicielskie może być przeciwciałem ludzkim lub humanizowanym. [0021] Termin agonista odnosi się do dowolnego związku obejmującego białko, polipeptyd, peptyd, przeciwciało, fragment przeciwciała, dużą cząsteczkę lub małą cząsteczkę (poniżej kd), która zwiększa aktywność, aktywację lub funkcję innej cząsteczki. Agoniści IL-21 powodują, przykładowo: pobudzenie komórek NK, podzbiorów limfocytów T i podzbiorów limfocytów B oraz komórek dendrytycznych. [0022] Termin antagonista" odnosi się do dowolnego związku obejmującego białko, polipeptyd, peptyd, przeciwciało, fragment przeciwciała, dużą cząsteczkę lub małą cząsteczkę (poniżej kd), która zmniejsza aktywność, aktywację lub funkcję innej cząsteczki. Antagoniści IL-21 powodują: obniżenie funkcji immunologicznej komórek NK podzbiorów limfocytów T i podzbiorów limfocytów B oraz komórek dendrytycznych; wiązanie IL-21, tak że oddziaływanie białka IL-21 jest zblokowane, zahamowane, zredukowane, antagonizowane lub neutralizowane. 3

5 [0023] Za przeciwciało dwuwartościowe inne niż przeciwciało wieloswoiste lub wielofunkcyjne, w pewnych wykonaniach, uważane jest takie, które obejmuje miejsca wiązania posiadające identyczną swoistość antygenową. [0024] Przeciwciało bispecyficzne lub bifunkcjonalne jest przeciwciałem hybrydowym posiadającym dwie różne pary łańcucha ciężkiego/lekkiego i dwa różne miejsca wiązania. Przeciwciała bispecyficzne można wytwarzać różnymi metodami, włączając między innymi, fuzję hybrydoma lub łączenie fragmentów Fab'. Patrz, np., Songsivilai i Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: (1990); Kostelny i wsp., J. Immunol. 148: (1992). [002] Określenie przeciwciało chimeryczne lub przeciwciała chimeryczne odnosi się do przeciwciał, których geny łańcucha lekkiego i ciężkiego zostały skonstruowane, zazwyczaj za pomocą technik inżynierii genetycznej, z genów regionu zmiennego i stałego immunoglobulin należących do różnych gatunków. Przykładowo, zmienne segmenty z genów przeciwciała monoklonalnego myszy można połączyć z ludzkimi segmentami stałymi, takimi jak gamma 1 i gamma 3. Typowe chimeryczne przeciwciało terapeutyczne jest zatem białkiem hybrydowym składającym się z domeny zmiennej lub wiążącej antygen z przeciwciała myszy i domeny stałej z ludzkiego przeciwciała, chociaż można stosować inne gatunki ssaków. [0026] Termin miano skutecznie neutralizujące w użytym tu znaczeniu odnosi się do ilości przeciwciała, która odpowiada ilości obecnej w surowicy zwierzęcia (człowieka lub szczura bawełnianego), dla której wykazano, że jest klinicznie skuteczna (u ludzi) lub redukuje wirusa do 99%, przykładowo, u szczura bawełnianego. Redukcja 99% jest określana przez swoiste zakażanie np., 3 pfu, 4 pfu, pfu, 6 pfu, 7 pfu, 8 pfu lub 9 pfu) wirusem RSV. [0027] Termin epitop obejmuje dowolną determinantę białkową zdolną do swoistego wiązania immunoglobuliny lub receptora limfocytów T. Determinanty epitopowe zazwyczaj składają się z chemicznie aktywnych powierzchniowych grup cząsteczek, takich jak aminokwasowe lub cukrowe łańcuchy boczne i zazwyczaj posiadają specyficzną trójwymiarową charakterystykę strukturalną, jak również specyficzną charakterystyką ładunku. Konkretniej, termin epitop IL-21 w użytym tu znaczeniu odnosi się do części polipeptydu IL-21 posiadającego aktywność antygenową lub immunogenną w zwierzęciu, korzystnie ssaku i najkorzystniej u myszy lub człowieka. Epitop posiadający aktywność immunogenną jest częścią polipeptydu IL-21, która wywołuje odpowiedź przeciwciała u zwierzęcia. Epitop posiadający aktywność antygenową jest częścią polipeptydu IL-21, z którą immunoswoiście wiąże się przeciwciało, jak określono za pomocą metody dobrze znanej w dziedzinie, przykładowo, testami immunologicznymi. Epitopy antygenowe nie muszą koniecznie być immunogenne. [0028] Użyty tu termin wyznakowany epitopem odnosi się do przeciwciała anty-il-21 będącego w fuzji ze znacznikiem epitopowym. Polipeptyd ze znacznikiem epitopowym posiada wystarczającą liczbę reszt dostarczających epitop wobec którego może być wytworzone przeciwciało, jednak jest wystarczająco krótki, że nie zaburza aktywności przeciwciała dla IL-21. Znacznik epitopowy korzystnie jest wystarczająco unikatowy, tak że przeciwciało zasadniczo nie oddziałuje krzyżowo z innymi epitopami. Odpowiednie polipeptydy znacznikowe zasadniczo posiadają co najmniej 6 reszt aminokwasowych i zazwyczaj pomiędzy około 8-0 reszt aminokwasowych (korzystnie pomiędzy około 9- reszt). Przykłady obejmują polipeptyd znacznikowy flu HA i jego przeciwciało 12CA (Field i wsp. Mol. Cell. Biol. 8: (1988)); znacznik c- myc i jego przeciwciała 8F9, 3C7, 6E, G4, B7 oraz 9E (Evan i wsp., Mol. Cell. Biol. (12): (198)); oraz znacznik z glikoproteiny wirusa opryszczki (gd) i jego przeciwciało (Paborsky i wsp., Protein Engineering 3(6):47-3(1990)). W pewnych wykonaniach, znacznik epitopowy jest epitopem wiążącym receptor ratunkowy. W użytym tu znaczeniu termin epitop wiążący receptor ratunkowy odnosi się do epitopu regionu Fc cząsteczki IgG (np., IgG 1, IgG 2, IgG 3 lub IgG 4 ), który jest odpowiedzialny za wydłużenie okresu półtrwania in vivo cząsteczki IgG w surowicy. 4

6 [0029] Termin fragment w użytym tu znaczeniu odnosi się do peptydu lub polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasową składającą się z co najmniej sąsiadujących reszt aminokwasowych, co najmniej sąsiadujących reszt aminokwasowych, co najmniej 1 sąsiadujących reszt aminokwasowych, co najmniej sąsiadujących reszt aminokwasowych, co najmniej 2 sąsiadujących reszt aminokwasowych, co najmniej sąsiadujących reszt aminokwasowych, co najmniej 0 sąsiadujących reszt aminokwasowych, co najmniej 60 sąsiadujących reszt aminokwasowych, co najmniej 70 sąsiadujących reszt aminokwasowych, co najmniej sąsiadujących 80 reszt aminokwasowych, co najmniej sąsiadujących 90 reszt aminokwasowych, co najmniej sąsiadujących 0 reszt aminokwasowych, co najmniej sąsiadujących 12 reszt aminokwasowych, co najmniej sąsiadujących reszt aminokwasowych z sekwencji aminokwasowej polipeptydu IL-21 lub przeciwciała, które immunoswoiście wiąże się z polipeptydem IL-21. [00] W użytym tu znaczeniu, termin immunoglobulina odnosi się do białka składającego się z jednego lub większej liczby polipeptydów zasadniczo kodowanych przez geny immunoglobulinowe. Jedna forma immunoglobuliny stanowi podstawową jednostkę strukturalną przeciwciała. Forma ta jest tetramerem i składa się z dwóch identycznych par łańcuchów immunoglobulinowych; każda para posiada jeden łańcuch lekki i jeden ciężki. W każdej parze, regiony zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego są razem odpowiedzialne za wiązanie antygenu, a regiony stałe są odpowiedzialne za funkcje efektorowe przeciwciała. [0031] Łańcuchy lekkie immunoglobuliny o pełnej długości (około 2 Kd lub 214 aminokwasów) są kodowane przez gen regionu zmiennego na końcu NH 2 (około 1 aminokwasów) i gen regionu stałego kappa lub lambda na końcu COOH. Łańcuchy ciężkie immunoglobuliny o pełnej długości (około 0 Kd lub 446 aminokwasów), są podobnie kodowane przez gen regionu zmiennego (około 116 aminokwasów) i jeden z innych wymienionych powyżej genów regionu stałego (około 3 aminokwasów). Łańcuchy ciężkie są klasyfikowane jako gamma, mu, alfa, delta lub epsilon i określają izotyp przeciwciała odpowiednio jako IgG, IgM, IgA, IgD i IgE. Regiony zmienny i stały w obrębie łańcuchów lekkiego i ciężkiego są połączone regionem J o około 12 lub większej liczbie aminokwasów, z łańcuchem ciężkim obejmującym również region D o około lub większej liczbie aminokwasów. (Patrz ogólnie, Fundamental Immunology (Paul, W., wyd. 2., Raven Press, N.Y., 1989), Rozdz. 7. [0032] Region zmienny łańcucha lekkiego i ciężkiego immunoglobuliny składa się z regionu zrębowego przerwanego trzema regionami hiperzmiennymi. Zatem, termin region hiperzmienny odnosi się do reszt aminokwasowych przeciwciała, które są odpowiedzialne za wiązanie antygenu. Region hiperzmienny obejmuje reszty aminokwasowe z regionu determinującego dopasowanie lub CDR (tj., reszty (L1), 0-6 (L2) i89-97 (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego oraz 31-3 (H1), 0-6 (H2) i 9-2 (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego (Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd.. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) i/lub te reszty z pętli hiperzmiennej (tj., reszty (L1), 0-2 (L2) i (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego oraz (H1), 3- (H2) i 96-1 (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego; Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196: , 1987). Resztami regionu zrębowego lub FR są reszty domeny zmiennej inne niż reszty regionu hiperzmiennego jak tu zdefiniowano. Sekwencje regionów zrębowych różnych łańcuchów lekkich i ciężkich są zasadniczo konserwowane w obrębie gatunku. Zatem, ludzki region zmienny jest regionem zrębowym, zasadniczo identycznym (około 8% lub więcej, zazwyczaj 90-9% lub więcej) z regionem zrębowym naturalnie występującej ludzkiej immunoglobuliny. Region zrębowy przeciwciała, które jest kombinacją regionów składowych łańcuchów lekkiego i ciężkiego, służy do pozycjonowania i przyrównania regionów CDR. Regiony CDR są przede wszystkim odpowiedzialne za wiązanie antygenowego epitopu. [0033] Zgodnie z tym, termin humanizowana immunoglobulina odnosi się do immunoglobuliny obejmującej ludzki region zrębowy i jedną lub większą liczbę regionów CDR z immunoglobuliny innej niż ludzka (zazwyczaj myszy lub szczura). Immunoglobulina inna niż ludzka dostarczająca regiony CDR nazywana jest

7 donorem a immunoglobulina ludzka dostarczająca region zrębowy nazywana jest akceptorem. Regiony stałe nie muszą być obecne, lecz jeśli są, muszą być zasadniczo identyczne z regionami stałymi ludzkiej immunoglobuliny, tj., co najmniej około 8-90%, korzystnie około 9% lub bardziej identyczne. Zatem, wszystkie części humanizowanej immunoglobuliny, z wyjątkiem możliwych regionów CDR, są zasadniczo identyczne z odpowiadającymi częściami sekwencji naturalnej ludzkiej immunoglobuliny. Przeciwciało humanizowane" jest przeciwciałem obejmującym humanizowany łańcuch lekki i humanizowany łańcuch ciężki immunoglobuliny. Przykładowo, humanizowane przeciwciało nie będzie obejmowało typowego przeciwciała chimerycznego, jak określono powyżej np., ponieważ cały region zmienny przeciwciała chimerycznego nie jest ludzki. [0034] W użytym tu znaczeniu termin przeciwciało ludzkie obejmuje przeciwciało, które posiada sekwencję aminokwasową immunoglobuliny ludzkiej i obejmuje przeciwciała wyizolowane z bibliotek immunoglobulin ludzkich lub z transgenicznych zwierząt dla jednej lub większej liczny immunoglobulin ludzkich i które nie wyrażają immunoglobulin endogennych, jak opisane, przykładowo, przez Kucherlapati i wsp. w patencie USA nr [003] Termin genetycznie zmienione przeciwciała oznacza przeciwciała, w których sekwencja aminokwasowa różni się od tej dla przeciwciała natywnego. Ze względu na stosowanie technik rekombinacji DNA przy wytwarzaniu przeciwciał, nie ma konieczności ograniczania sekwencji aminokwasowych do tych znalezionych w naturalnych przeciwciałach; przeciwciała można projektować tak, aby uzyskać pożądane cechy charakterystyczne. Istnieje wiele możliwych zmian i mieszczą się one w zakresie od zmiany tylko jednego lub kilku aminokwasów do całkowitego przeprojektowania, przykładowo, regionu zmiennego lub stałego. Zmiany w regionie stałym będą zasadniczo wykonane w celu polepszenia lub zmiany cech charakterystycznych, takich jak, wiązanie dopełniacza, oddziaływanie z błonami i inne funkcje efektorowe. Zmiany w regionie zmiennym będą wykonane w celu polepszenia charakterystyki wiązania antygenu. [0036] Dodatkowo do przeciwciała, immunoglobuliny mogą występować w szeregu innych form, w tym jako, przykładowo, jednołańcuchowe lub Fv, Fab i (Fab') 2, jak również jako diaciałą, przeciwciała liniowe, wielowartościowe lub wieloswoiste przeciwciała hybrydowe (jak opisano powyżej oraz szczegółowo w: Lanzavecchia i wsp., Eur. J. Immunol. 17, (1987)) i w pojedynczych łańcuchach (np., Huston i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1988) i Bird i wsp., Science, 242: (1988). (Patrz, ogólnie, Hood i wsp., Immunology, Benjamin, N.Y., 2. wyd. (1984) oraz Hunkapiller i Hood, Nature, 323:1-16 (1986. [0037] W użytym tu znaczeniu terminy jednołańcuchowy Fv, przeciwciała jednołańcuchowe, Fv lub scfv odnoszą się do fragmentów przeciwciał, które obejmują regiony zmienne, z obu łańcuchów, ciężkiego i lekkiego w jednym pojedynczym łańcuchu polipeptydowym, lecz nie posiadają regionów stałych. Zasadniczo, przeciwciało jednołańcuchowe obejmuje dalej łącznik polipeptydowy pomiędzy domenami VH i VL, który umożliwia tworzenie pożądanej struktury, pozwalającej na wiązanie antygenu. Przeciwciała jednołańcuchowe omówione są szczegółowo przez Pluckthun w The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, tom. 113, red. Rosenburg i Moore. Springer-Verlag, New York, str (1994); patrz także, publikacja międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 88/01649 i patent USA nr i Przeciwciała jednołańcuchowe mogą być także bispecyficzne i/lub humanizowane. [0038] Fragment Fab składa się z jednego łańcucha lekkiego oraz C H1 i regionów zmiennych jednego łańcucha ciężkiego. Łańcuch ciężki z cząsteczki Fab nie tworzy wiązania dwusiarczkowego z inną cząsteczką łańcucha ciężkiego. [0039] Fragment Fab zawiera jeden łańcuch lekki i jeden łańcuch ciężki, który zawiera większość regionu stałego, pomiędzy domenami C H1 i C H2, tak, że może powstawać międzyłańcuchowe wiązanie dwusiarczkowe pomiędzy dwoma łańcuchami ciężkimi tworząc cząsteczkę F(ab') 2. 6

8 [00] Fragment F(ab') 2 zawiera dwa łańcuchy lekkie i dwa łańcuchy ciężkie, zawierające część regionu stałego pomiędzy domenami C H1 i C H2, tak, że tworzone jest międzyłańcuchowe wiązanie dwusiarczkowe pomiędzy dwoma łańcuchami ciężkimi. [0041] Termin diaciała odnosi się do małych fragmentów przeciwciał z dwoma miejscami wiązania antygenu, które to fragmenty obejmują domenę zmienną łańcucha ciężkiego (V H ) połączoną z domeną zmienną łańcucha lekkiego (V L ) w tym samym łańcuchu polipeptydowym (V H -V L ). Przez użycie łącznika, który jest zbyt krótki by możliwe było parowanie pomiędzy dwiema domenami tego samego łańcucha, forsowane jest parowanie domen z domenami komplementarnymi innego łańcucha i tworzone są dwa miejsca wiązania antygenu. Diaciała opisano pełniej, przykładowo, w EP 4,097; WO 93/11161; oraz Hollinger i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: (1993). [0042] Termin przeciwciała liniowe odnosi się do przeciwciał opisanych w Zapata i wsp. Protein Eng. 8(): 7-62 (199). W skrócie, przeciwciała te obejmują parę tandemowych segmentów Fd (V H -C H1 -V H -C H1 ), które tworzą parę regionów wiążących antygen. Przeciwciała liniowe mogą być bispecyficzne lub monospecyficzne. [0043] Termin funkcjonalny immunologicznie fragment immunoglobuliny w użytym tu znaczeniu odnosi się do fragmentu polipeptydu, zawierającego co najmniej domeny zmienne łańcuchów ciężkiego i lekkiego immunoglobuliny. Funkcjonalny immunologicznie fragment immunoglobuliny jest zdolny do wiązania liganda, zapobiegania wiązania liganda do jego receptora, przerywania odpowiedzi biologicznej wynikającej z wiązania liganda do receptora lub dowolnej z ich kombinacji. Korzystnie, fragment immunoglobuliny funkcjonalny immunologicznie wiąże się specyficznie z IL-21. [0044] Termin przeciwciało monoklonalne w użytym tu znaczeniu nie jest ograniczony do przeciwciał wytwarzanych za pomocą technologii z komórkami hybrydowymi. Termin przeciwciało monoklonalne odnosi się do przeciwciała, które pochodzi z pojedynczego klonu, obejmującego dowolny klon eukariotyczny, prokariotyczny lub fagowy, a nie do metody za pomocą której jest wytworzone. [004] Niniejszy wynalazek dostarcza przeciwciała monoklonalne, jak określono w zastrzeżeniach, które specyficznie wiążą się z białkami i polipeptydami IL-21. Ludzkie i mysie polipeptydy, białka i polinukleotydy kodujące polipeptydy IL-21 ujawniono w Parrish-Novak i wsp., Nature 8:7-63, 03, patenty USA nr i oraz WO 04/0168. Przykładowe przeciwciała obejmują przeciwciała neutralizujące i mogą być mysimi przeciwciałami monoklonalnymi, przeciwciałami humanizowanymi pochodzącymi z mysich przeciwciał monoklonalnych oraz ludzkimi przeciwciałami monoklonalnymi. Przykładowe fragmenty przeciwciał obejmują F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scfv oraz minimalne jednostki rozpoznające. Przeciwciała neutralizujące korzystnie wiążą się z IL-21, tak, że oddziaływanie z białkiem IL-21 jest zablokowane, zahamowane, zredukowane, antagonizowane lub neutralizowane. Opisane są tu epitopy oraz charakterystyczne cechy strukturalne i funkcjonalne definiujące regiony ludzkiego białka IL-21, które zidentyfikowano jako miejsca docelowe dla monoklonalnego przeciwciała terapeutycznego. Przedstawiono przykładowe mysie anty-ludzkie IL-21 przeciwciała monoklonalne oraz szczurze anty-ludzkie przeciwciała monoklonalne oraz pule tych przeciwciał monoklonalnych ze zdolnością do wiązania dzikiego typu ludzkie IL-21, zmutowane białko IL-21 i/lub regiony peptydowe ludzkiej IL-21. Niniejsza specyfikacja opisuje kompozycje obejmujące nośnik i opisane tu peptyd, polipeptyd lub przeciwciało. [0046] Zatem, niniejsza specyfikacja opisuje antagonistów wobec aktywności IL-21, takich jak przeciwciała anty-il-21, które są przydatne do leczenia chorób zapalnych. Zastrzegane aktualnie przeciwciała anty-il-21 są przydatne w leczeniu zapalenia trzustki, cukrzycy typu I (IDDM), choroby Gravesa-Basedowa, nieswoistego zapalenia jelit (IBD), choroby Crohna, wrzodziejącego zapalenia okrężnicy, zespołu nadwrażliwości jelita, stwardnienia rozsianego, reumatoidalnego zapalenia stawów, uchyłkowatości jelit, tocznia rumieniowatego układowego, łuszczycy, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, twardziny 7

9 skóry, twardziny układowej, artropatii łuszczycowej, choroby zwyrodnieniowej stawów, zapalenia atopowego skóry, bielactwa nabytego, choroby przeszczep przeciw gospodarzowi (GVHD), chłoniaka skórnego z limfocytów T (CTCL), zespołu Sjogrena, kłębuszkowego zapalenia nerek, nefropatii IgA, choroby przeszczep przeciw gospodarzowi, odrzucenia przeszczepu, zapalenia atopowego skóry, zespołu antyfosfolipidowego i astmy, oraz innych chorób autoimmunologicznych. [0047] Niniejsza specyfikacja opisuje genetycznie zmienione przeciwciała, które są funkcjonalnymi odpowiednikami przeciwciał opisanych powyżej. Korzystne są zmodyfikowane przeciwciała zapewniające lepszą stabilność i/lub skuteczność terapeutyczną. Przykłady zmodyfikowanych przeciwciał obejmują te z konserwatywnymi podstawieniami reszt aminokwasowych i jedną lub większą liczbą delecji lub addycji aminokwasów, które nie zmieniają zdolności wiązania antygenu na znacząco gorszą. Substytucje mogą mieścić się w zakresie od zmiany lub modyfikacji jednej lub większej liczby reszt aminokwasowych do całkowitego przeprojektowania regionu, dopóty dopóki jest zachowana zdolność terapeutyczna. Przeciwciała można modyfikować potranslacyjnie (np., acetylacja i fosforylacja) lub można modyfikować syntetycznie (np., przyłączenie grup znacznikowych). [0048] Przeciwciała zmienione genetycznie obejmują także przeciwciała chimeryczne, które pochodzą z przeciwciał anty-il-21. Korzystnie, przeciwciała chimeryczne obejmują region zmienny pochodzący z myszy lub szczura i region stały pochodzący od człowieka, tak że przeciwciało chimeryczne posiada dłuższy okres półtrwania i jest mniej immunogenne przy podawaniu człowiekowi. Metoda wykonania przeciwciał chimerycznych jest znana w dziedzinie. Regiony zmienne tych przeciwciał mogą być połączone z regionem stałym ludzkiej IgG dla stworzenia pożądanego przeciwciała chimerycznego. [0049] Korzystnie, opisane tu genetycznie zmienione przeciwciała anty-il-21 obejmują wersję humanizowaną opisanych tu przeciwciał. Przeciwciało humanizowane obejmuje regiony CDR z mysiej immunoglobuliny donorowej oraz regiony zrębowe łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego ludzkiej immunoglobuliny akceptorowej. Metoda wykonania przeciwciała humanizowanego jest ujawniona w patencie USA nr 11; 8089; i Regiony CDR tych przeciwciał można następnie wszczepiać do dowolnych wybranych ludzkich regionów zrębowych, znanych w dziedzinie, w celu wytworzenia pożądanego przeciwciała humanizowanego. [000] Przeciwciała według wynalazku można opisywać lub określać w odniesieniu do epitopu(ów) lub część (części) polipeptydu według wynalazku, które rozpoznają lub swoiście wiążą. Epitop(y) lub część (części) polipeptydu można określić jak tu opisano, np., za pomocą połażenia na końcu N i C, lub przez wielkość sąsiadujących reszt aminokwasowych. Przeciwciała według wynalazku mogą także być opisane lub określone w odniesieniu do reaktywności krzyżowej. Specyfikacja opisuje także przeciwciała, które nie wiążą żadnego analoga, ortologa lub homologa opisanego tu polipeptydu. [001] Binowanie epitopów (ang. epitope binning) odnosi się do zastosowania testów wiązania kompetycyjnego w celu identyfikacji par przeciwciał, które są, lub nie są, zdolne do jednoczesnego wiązania białka IL-21, identyfikując tym samym przeciwciała, które wiążą te same lub zachodzące na siebie epitopy na białku. Rodziny przeciwciał (lub biny) posiadające taką samą swoistość wiązania mogą następnie być użyte do określenia specyficznych epitopów na IL-21. Testy binowania epitopów dostarczają dowodu na to, że obecne są epitopy różne antygenowo. Chociaż, same jako takie, nie identyfikują lub mapują epitopu do specyficznej sekwencji aminokwasowej lub lokalizacji na cząsteczce białka IL-21. [002] Współzawodnictwo o wiązanie można ocenić dla dowolnej pary przeciwciał lub fragmentów. Przykładowo, stosując odpowiednie odczynniki wykrywające, swoistość wiązania przeciwciał lub fragmentów wiążących z dowolnego gatunku/źródła można porównać do swoistości wiązania ujawnionych tu przeciwciał monoklonalnych. Wiązanie epitopu można prowadzić z wyizolowanymi przeciwciałami lub z nadsączami hodowli komórkowych. Często binowanie jest prowadzone z pierwszą rundą nadsączy klonalnych w celu 8

10 ukierunkowania wyboru klonów do dalszego opracowania. Przeciwciała do porównania powinny mieć zasadniczo homogenne domeny wiążące antygen. W przypadku przeciwciał bispecyficznych lub bifunkcyjonalnych swoistość wiązania dwóch różnych miejsc wiązania powinna być oceniana lub binowana niezależnie. [003] Niniejsza specyfikacja opisuje zarówno przeciwciała swoiste wobec receptora jak i przeciwciała swoiste wobec liganda. Dodatkowo do wiązania kompetycyjnego przeciwciał, także może być użyte binowanie epitopów w celu identyfikacji przeciwciał wobec receptora lub liganda, które współzawodnicząc ze sobą kolidują w binowaniu liganda lub jego receptora. Często, korzystne cechy rodziny (lub binu) przeciwciał można skorelować z wiązaniem specyficznego epitopu zdefiniowanego przez bin epitopu. [004] Doświadczenia z wiązaniem kompetycyjnym nie mierzą bezpośrednio powinowactwa wiązania, chociaż przeciwciała do testowania muszą wiązać się wystarczająco silnie, żeby działać jako czynniki współzawodniczące. Ogólnie warunki doświadczenia są zaprojektowane tak, aby zminimalizować wpływy różnic w powinowactwie wiązania. [00] Przeciwciała anty-antygen IL-21 mogą być także przydatne w testach diagnostycznych dla białka IL-21, np., wykrywających jego wytwarzanie w konkretnych komórkach, tkankach lub w surowicy. Przeciwciała przypisane do różnych binów i zdolne do wiązania z różnymi częściami immonogenowymi lub epitopami IL-21 można stosować jako odczynniki w testach kanapkowych. W teście kanapkowym, próbka poddawana analizie jest wychwytywana przez pierwsze przeciwciało, które jest unieruchomione na podłożu stałym, a następnie wykrywana przez drugie przeciwciało, które także wiąże się z badana próbką, tworząc w ten sposób trzyczęściowy kompleks. Patrz, np., paten USA nr Drugie przeciwciało może samo być wyznakowane wykrywalną cząstką (bezpośrednie testy kanapkowe) lub jego pomiar odbywa się przy użyciu przeciwciała anty-immunoglobulinowego, które jest wyznakowane wykrywalną cząstką (pośredni test kanapkowy). Przykładowo, jednym typem testu kanapkowego jest test ELISA, gdzie wykrywalną cząstką jest enzym. [006] Specyficzne wiązanie przeciwciał według wynalazku może być testowane dowolną metodą znaną w dziedzinie. Wiele różnych form testów wiązania kompetycyjnego można stosować do binowania epitopów. Testy immunologiczne, które można stosować obejmują, między innymi, systemy testu kompetycyjnego lub niekompetycyjnego wykorzystujące techniki takie jak Western Blot, radiotesty immunologiczne, ELISA (test enzymatyczno-immunologiczny), immunologiczne testy kanapkowe, testy immunoprecypitacyjne, reakcje precypitacji, reakcje precypitacji z dyfuzją w żelu, testy immunodyfuzyjne, testy aglutynacyjne, testy unieruchomienia dopełniacza, testy immunoradiometryczne, immunologiczne testy fluorescencyjne, immunologiczne testy z białkiem A, wymieniając tylko kilka. Testy takie są rutynowe i dobrze znane w dziedzinie. (patrz, np., Ausubel i wsp., red., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, tom 1, John Wiley & Sons, Inc., New York). Przykładowymi testami immunologicznymi są opisane w skrócie poniżej (lecz nie są do nich ograniczone). Dodatkowo, można prowadzić rutynowy test blokowania krzyżowego, taki jak opisany w Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, red. Harlow i David Lane (1988). [007] Biacore jest tylko jedną z różnych form testu rutynowo stosowanego do panelowania binów epitopów przeciwciał monoklonalnych. Wiele odnośników literaturowych (np. The Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, tom 6.6, red. Glenn E. Morris) opisuje alternatywne metody, które można stosować do binowania przeciwciał i oczekuje się od nich dostarczenia identycznych informacji dotyczących swoistości przeciwciał wobec białka IL-21. Kiedy stosowany jest system Biacore, doświadczenia binowania epitopu prowadzone są z rozpuszczonym, natywnym antygenem. Badania dotyczące binowania epitopu można prowadzić w systemie Biacore 00 system (Biacore, Uppsalla Sweden). Do programowania zadawanych metod można stosować oprogramowanie BIAlogue v Jako przykład użycia systemu Biacore do binowania mysich przeciwciał monoklonalnych wobec IL-21, kozie poliklonalne przeciwciało anty-mysie IgG 9

11 Fc (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) można kowalencyjne unieruchomić na chipie czujnikowym Biacore CM i użyć do wiązania (wychwytywania) pierwszego przeciwciała monoklonalnego serii testów na chipie. Niezajęte miejsca wiązania Fc na chipie są następnie blokowane przy użyciu fragmentu Fc poliklonalnego IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Następnie, wstrzykiwane jest białko IL-21 i umożliwiane jest jego swoiste wiązanie z wychwyconym pierwszym przeciwciałem monoklonalnym. Urządzenie Biacore wykonuje pomiar masy białka związanego z chipem czujnikowym i wiązanie zarówno pierwszego przeciwciała jak i antygenu IL-21 można weryfikować dla każdego cyklu. Po związaniu pierwszego przeciwciała i antygenu z chipem, rozpuszczalne drugie przeciwciało jest wstrzykiwane i umożliwiane jest wiązanie z wcześniej związanym antygenem. Jeśli drugie przeciwciało monoklonalne jest zdolne do wiązania z antygenem IL-21 jednocześnie z pierwszym przeciwciałem monoklonalnym, jego wiązanie jest wykrywane przez Biacore. Jeśli, jednakże, drugie przeciwciało monoklonalne nie jest zdolne do wiązania antygenu IL-21 jednocześnie z pierwszym przeciwciałem monoklonalnym, nie jest wykrywane dodatkowe wiązanie. Każde przeciwciało monoklonalne jest testowane wobec siebie samego jako kontrola negatywna, w celu określenia poziomu sygnału tła (bez wiązania). [008] Do binowania przeciwciał można także użyć test LFC-ELISA (ang. label-free competitive ELISA). Metoda ta została opisana przez Nagata i wsp., J. Immuno Methods 292:141-1, 04. Ta metoda binowania epitopów wykorzystuje biotynylowaną IL-21. Jako przykład binowania mysich przeciwciał monoklonalnych wobec IL-21, płytki mikrotitracyjne są opłaszczane 0 µl/studzienkę 1 µg/ml swoistego przeciwciała koziego anty-mysie IgG Fc-γ (Jackson ImmunoResearch) rozcieńczonego w ELISA B (PBS, 0,1% Tween, 1% BSA). Po wiązaniu tego opłaszczającego przeciwciała przez 3 godz. w temp. pokojowej, każda kondycjonowana pożywka zawierająca mab jest rozcieńczana w ELISA B do stężenia mab w przybliżeniu 0, µg/ml i umożliwiane jest wiązanie do płytek opłaszczonych kozim anty-mysim IgG przez noc w temp. 4 C (mab#1). Równolegle, drugi zestaw kondycjonowanych pożywek (mab#2) jest rozcieńczany w probówkach polistyrenowych do stężenia mab w przybliżeniu 0, µg/ml w ELISA B, mieszany z 0 ng/ml biotynylowanego antygenu IL-21 i inkubowany przez noc w temp. 4 C. Po inkubacji mab#1 z przeciwciałem opłaszczającym, płytki są blokowane niespokrewnionym przeciwciałem w celu wysycenia niezajętych miejsc wiązania na płytce. Mieszaniny mab#2-biotyna-il-21 są dodawane do płytki i umożliwiane jest wiązanie. Jako kontrola (niekompetycyjna) w teście, 0 ng/ml biotynylowanej IL-21 jest dodawane bezpośrednio (bez wstępnej inkubacji z mab#2) do studzienek zawierających unieruchomione mab#1. Po inkubacji z kompleksem biotynylowana-il-21-mab#2, do płytki dodawany jest streptavidih-hrp (Pierce, Rockford, IL) o stężeniu 0, µg/ml. Płytki są wywoływane za pomocą substratu TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) i mierzona jest absorbancja poszczególnych studzienek przy nm za pomocą czytnika płytek (Molecular Devices SpectraMax 3, Sunnyvale, CA). Jeśli mab#1 wiąże inny epitop z mab#2, kompleks biotyna-il-21-mab#2 będzie wiązał się z płytką dając wysoki odczyt absorbancji. Jeśli mab#1 wiąże ten sam epitop co mab#2, kompleks biotyna-il-21-mab#2 nie będzie wiązał się z płytką dając niski odczyt absorbancji. [009] Przeciwciała według wynalazku działają jako antagoniści IL-21. Przykładowo, niniejszy wynalazek obejmuje przeciwciała (jak określono w zastrzeżeniach), które przerywają interakcje pomiędzy receptorem/ligandem IL-21, częściowo lub całkowicie. Wynalazek pokazuje przeciwciała swoiste wobec liganda, które zapobiegają aktywacji receptora. Wynalazek obejmuje przeciwciała neutralizujące, które wiążą ligand i zapobiegają wiązaniu liganda z receptorem, jak również przeciwciała, które wiążą ligand zapobiegając tym samym aktywacji receptora, lecz nie zapobiegając wiązaniu liganda z receptorem. Aktywacja receptora (tj., przekazywanie sygnału) może być określona za pomocą opisanych tu technik lub innym sposobem znanym w dziedzinie. Przykładowo, aktywację receptora można określić przez wykrycie

12 fosforylacji (np., tyrozyny lub seryny/treoniny) receptora lub jego substratu przez immunoprecypitację, a następnie western blot lub analizę opartą na lumineksie (przykładowo, jak opisano powyżej). Specyfikacja opisuje przeciwciała, które hamują aktywność liganda lub receptora o co najmniej 90%, co najmniej 80%, co najmniej 70%, co najmniej 60% lub co najmniej 0% aktywności przy nieobecności przeciwciała. Wytwarzanie przeciwciał antiy-il-21 [0060] Przeciwciała wobec IL-21 można otrzymywać, przykładowo, stosując jako antygen produkt wektora ekspresyjnego IL-21 lub IL-21 wyizolowaną ze źródła naturalnego. Szczególnie przydatne przeciwciała anty- IL-21 wiążą się swoiście z IL-21. Przeciwciała uważane są za swoiście wiążące jeśli wykazują co najmniej jedną z następujących dwóch cech: (1) przeciwciała wiążą się z IL-21 na poziomie progowym aktywności wiązania i (2) przeciwciała nie reagują krzyżowo w sposób znaczący z polipeptydami pokrewnymi z IL-21. [0061] W odniesieniu do pierwszej z cech, przeciwciała wiążą się swoiście z polipeptydem, peptydem lub epitopem IL-21 z powinowactwem wiązania (Ka) równym 6 M -1 lub większym, korzystnie 7 M -1 lub większym, korzystniej 8 M -1 lub większym, a najkorzystniej 9 M -1 lub większym. Powinowactwo wiązania przeciwciała może być łatwo określone przez specjalistę w dziedzinie, przykładowo, za pomocą analizy Scatcharda (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 1:660, 1949) lub stosując handlowo dostępne urządzenie z czujnikiem biologicznym (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). W odniesieniu do drugiej z cech, przeciwciała nie reagują krzyżowo w sposób znaczący z cząsteczkami polipeptydowymi, przykładowo, jeśli wykrywają IL-21, lecz nie wykrywają innych znanych polipeptydów przy użyciu standardowej analizy typu Western blot lub wychwytującej ELISA (ang. capture ELISA). Przykłady znanych pokrewnych polipeptydów obejmują znanych przedstawicieli rodziny IL-2. [0062] Przeciwciała anty-il-21 można wytwarzać stosując peptydy i polipeptydy niosące epitop antygenowy IL-21. Peptydy i polipeptydy niosące epitop antygenowy IL-21 zawierają sekwencję co najmniej dziewięciu, lub pomiędzy 1 do około aminokwasów zawartych w SEKW. NR ID.: 2 lub inną ujawnioną tu sekwencję aminokwasów. Jednakże, do indukowania przeciwciał, które wiążą IL-21 przydatne są także peptydy lub polipeptydy obejmujące większą część sekwencji aminokwasowej, zawierającą do 0 aminokwasów, lub o dowolnej większej długości i zawierającą całą sekwencję aminokwasową. Konieczne jest, aby sekwencja aminokwasowa peptydu niosącego epitop była wyselekcjonowana tak, by dawała zasadniczą rozpuszczalność w rozpuszczalnikach wodnych (tj., aby sekwencja zawierała względnie hydrofobowe reszty, podczas gdy hydrofobowe reszty były zasadniczo pominięte). Ponadto, sekwencje aminokwasowe zawierające reszty prolinowe mogą być także pożądane do produkcji przeciwciała. [0063] Przeciwciała monoklonalne anty-il-21 można wytwarzać metodami znanymi specjalistom w dziedzinie. Monoklonalne przeciwciała gryzoni wobec specyficznych antygenów można uzyskać znanymi metodami (patrz, przykładowo, Kohler i wsp., Nature 26:49 (197), Coligan i wsp. (red.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, str (John Wiley & Sons 1991) [ Coligan ], Picksley i wsp., Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli, w DNA Cloning 2: Expression Systems, wyd. 2, Glover i wsp. (red.), str. 93 (Oxford University Press 199)). [0064] Alternatywną metodą opracowania przeciwciał monoklonalnych in vitro jest wybór cząstek wiążących się z prezentowaną biblioteką fragmentów przeciwciał. Zasadą technologii prezentacji jest utworzenie fizycznego połączenia pomiędzy cząstką wiążącą, a kodującym je materiałem genetycznym. Koncepcja ta była wykorzystywana w wielu sposobach do prezentacji bibliotek białkowych i peptydowych na powierzchniach bakteriofagów, bakterii i drożdży do prezentacji białek przyłączonych do rybosomów in vitro (patrz przykładowo, Rothe i wsp., FASEB J. :199 (06)). Wśród tych technologii najlepiej opracowaną jest prezentacja przeciwciał na powierzchni jednoniciowego bakteriofaga. Typową metodą stosowaną do prezentacji przeciwciała jest fuzja fragmentu Fv pojedynczego łańcucha lub Fd łańcucha ciężkiego (część Fab łańcucha ciężkiego) z genem III białka fagowego. Biblioteki przeciwciał mogą być naiwne, 11

13 reprezentujące naturalny repertuar immunologiczny lub półsyntetyczne, składające się z obszarów zrębowych wziętych z naiwnych matryc ludzkich w kombinacji z bibliotekami syntetycznych sekwencji CDR, w celu zwiększenia zróżnicowania. Faga ze specyficznymi aktywnościami wiązania można izolować z losowych bibliotek fragmentów przeciwciał (w szczególności Fab i scfv) lub peptydów po powtarzających się rundach wzrostu i selekcji (patrz, przykładowo, Hoogenboom, Nature Biotech. 23:1 (0.) [006] W dalszym wykonaniu, przeciwciała według wynalazku można także wytwarzać przy użyciu różnych metod prezentacji na fagu znanych w dziedzinie. W metodach prezentacji na fagu, domeny funkcjonalnego przeciwciała są prezentowane na powierzchni cząsteczek faga, które niosą kodujące je sekwencje polinukleotydowe. W szczególności, faga takiego można wykorzystywać do prezentacji domen wiążących antygen, wyrażonych na bibliotece przeciwciał naiwnego repertuaru lub kombinowanych (np., ludzkich lub mysich). Faga wyrażającego domenę wiążącą antygen, która wiąże interesujący antygen można wyselekcjonować lub zidentyfikować za pomocą antygenu, np., stosując wyznakowany antygen lub antygen związany lub wychwycony przez powierzchnię stałą lub kulkę. Fag stosowany w tych metodach jest zazwyczaj fagiem filamentowym fd i M13, zawierającym wyrażane z faga domeny wiążące z domenami przeciwciała Fab, Fv lub stabilizowanym wiązaniem dwusiarczkowym Fv w rekombinacyjnej fuzji z genem III lub VIII białka fagowego. Przykłady metod prezentacji na fagu, które można wykorzystać do wytwarzania przeciwciała według wynalazku obejmują te ujawnione w Brinkrnan i wsp., J. Immunol. Methods 182:41-0 (199); Ames i wsp., J. Immunol. Methods 184: (199); Kettleborough i wsp., Eur. J. Immunol. 24:92-98 (1994); Persic i wsp., Gene 187:9-18 (1997); Burton i wsp., Advances in Immunology 7: (1994); zgłoszeniu PCT nr PCT/GB91/01134; publikacjach PCT: WO 90/02809; WO 91/737; WO 92/047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 9/1982; WO 9/1; i patentach USA nr ; 2239; 3484; 80717; ; 7073; 8247; 71698; ; 16637; 78022; 68727; i Przeciwciała lub fragmenty przeciwciał można także izolować z bibliotek prezentujących przeciwciała, wytworzonych przy użyciu technik opisanych w McCafferty i wsp., Nature, 348: 2-4 (1990). Clackson i wsp., Nature, 32: (1991) oraz Marks i wsp., J. Mol. Biol., 222: (1991) opisują izolację przeciwciał, odpowiednio, mysich i ludzkich, przy użyciu bibliotek prezentacji na fagu. Kolejne publikacje opisują wytwarzanie przeciwciał ludzkich o wysokim powinowactwie (zakres nm) za pomocą tasowania łańcucha (Marks i wsp., Bio/Technology, : (1992)), jak również kombinatorycznej infekcji i rekombinacji in vivo, jako strategii do konstrukcji bardzo dużych bibliotek fagowych (Waterhouse i wsp., Nuc. Acids. Res., 21: (1993)). Zatem, techniki te są wykonalnymi alternatywami izolacji przeciwciał monoklonalnych wobec tradycyjnych technik wykorzystujących hybrydoma wyrażające przeciwciała monoklonalne. [0066] Jak opisano w powyższych odnośnikach literaturowych, po wyborze faga, regiony kodujące przeciwciała z faga można izolować i używać do wytworzenia całych przeciwciał, w tym przeciwciał ludzkich, lub dowolnego innego pożądanego fragmentu wiążącego antygen i wyrażać w dowolnym pożądanym gospodarzu, włączając komórki ssacze, komórki owadzie, komórki roślinne, drożdże i bakterie, np., jak opisano szczegółowo poniżej. Przykładowo, można także wykorzystać techniki rekombinacyjnej produkcji fragmentów Fab, Fab' i F(ab')2 stosując metody znane w dziedzinie, takie jak te ujawnione w publikacji PCT WO 92/22324; Mullinax i wsp., BioTechniques 12(6): ; oraz Sawai i wsp., AJRI 34:26-34, 199; i Better i wsp., Science 2:41-43, [0067] Przeciwciała ludzkie można także wytwarzać stosując myszy transgeniczne, które nie są zdolne do wyrażania funkcjonalnych endogennych immunoglobulin, lecz mogą wyrażać geny ludzkich immunoglobulin. Przykładowo, kompleksy genów ludzkiego łańcucha ciężkiego i lekkiego immunoglobulin można wprowadzać losowo, lub za pomocą rekombinacji homologicznej, do komórek macierzystych mysich embrionów. Alternatywnie, ludzki region zmienny, region stały i region zróżnicowany można wprowadzić do 12

14 komórek macierzystych mysich embrionów dodatkowo do genów ludzkich łańcuchów ciężkiego i lekkiego. Geny łańcuchów ciężkiego i lekkiego immunoglobulin mysich mogą pozostać niefunkcjonalne oddzielnie lub jednocześnie z wprowadzonymi za pomocą rekombinacji homologicznej loci immunoglobuliny ludzkiej. W szczególności, wytwarzaniu endogennego przeciwciała zapobiega delecja homozygotycznego regionu JH. Zmodyfikowane komórki macierzyste mysich embrionów są namnażane i wprowadzane za pomocą mikroiniekcji do blastocytów w celu wytworzenia myszy chimerycznych. Myszy chimeryczne są następnie rozmnażane w celu uzyskania homozygotycznego potomstwa, które wytwarza ludzkie przeciwciała. Myszy transgeniczne są immunizowane w normalny sposób wyselekcjonowanym antygenem, np., całym lub częścią polipeptydu według wynalazku. Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw antygenowi można uzyskać z immunizowanych myszy transgenicznych przy zastosowaniu tradycyjnej technologii hybrydoma. Transgeny immunoglobuliny ludzkiej niesione przez myszy transgeniczne przechodzą rearanżację podczas różnicowania limfocytów B, a następnie przełączanie klas i mutacje somatyczne. Zatem, stosując taką technikę, niemożliwe jest wytworzenie terapeutycznie przydatnych przeciwciał IgG, IgA, IgM i IgE. W celu przeglądu literatury dotyczącej tej technologii produkcji ludzkich przeciwciał, patrz Lonberg i Huszar (Int. Rev. Immunol. 13:6-93, 199). [0068] W celu zapoznania się ze szczegółowym omówieniem tej technologii wytwarzania ludzkich przeciwciał i ludzkich przeciwciał monoklonalnych oraz z protokołami wytwarzania takich przeciwciał, patrz, np., Jakobovits i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 21 (1993); Jakobovits i wsp., Nature, 362: 2-28 (1993); Bruggermann i wsp., Year in Immuno., 7:33 (1993); publikacje PCT: WO 98/24893; WO 96/396; WO 96/3373; patenty USA nr ; 62126; 63342; 6982; 6616; 4806; i Dodatkowo, do dostarczenia ludzkich przeciwciał skierowanych przeciw wybranemu antygenowi, wytworzonych za pomocą technologii podobnych do opisanych powyżej, można zaangażować firmy takie jak Medarex, Inc. (Princeton, New Jersey) i Genpharm (San Jose, Calif.). Patrz, np. patent USA nr [0069] Przeciwciała według wynalazku można wytwarzać dowolnym, znanym w dziedzinie, sposobem syntezy przeciwciał, w szczególności, syntezy chemicznej lub korzystnie, technikami rekombinacji ekspresyjnej. Rekombinacja ekspresyjna przeciwciała według wynalazku, lub jego fragmentu, pochodnej lub analoga, np., łańcucha ciężkiego lub lekkiego przeciwciała według wynalazku, wymaga konstrukcji wektora ekspresyjnego zawierającego polinukleotyd, który koduje przeciwciało. Po uzyskaniu polinukleotydu kodującego cząsteczkę przeciwciała lub łańcucha ciężkiego lub lekkiego przeciwciała, lub jego część (korzystnie zawierającą domenę zmienną łańcucha ciężkiego lub lekkiego) według wynalazku, można wytworzyć wektor do wytwarzania cząsteczki przeciwciała za pomocą technologii rekombinacji DNA, stosując techniki dobrze znane w dziedzinie. Zatem, opisane są tu metody przygotowania białka przez ekspresję polinukleotydu zawierającego sekwencję nukleotydową kodującą przeciwciało. Metody dobrze znane specjalistom w dziedzinie można stosować do konstrukcji wektorów ekspresyjnych zawierających sekwencje kodujące przeciwciało i odpowiednie sygnały kontroli transkrypcji i translacji. Metody te obejmują, przykładowo, techniki rekombinacji DNA in vitro, techniki syntezy i rekombinacji genetycznej in vivo. Specyfikacja opisuje wektory zdolne do replikacji, obejmujące sekwencję nukleotydową kodującą cząsteczkę przeciwciała według wynalazku, lub jego łańcuch ciężki lub lekki, lub domenę zmienną łańcucha ciężkiego lub lekkiego, funkcjonalnie połączone z promotorem. Wektory takie mogą zawierać sekwencję nukleotydową kodującą region stały cząsteczki przeciwciała (patrz, np., publikacja PCT WO 86/0807; publikacja PCT WO 89/036 i patent USA nr ) oraz może być sklonowana w takim wektorze sekwencja nukleotydowa domeny zmiennej przeciwciała do ekspresji całego łańcucha ciężkiego lub lekkiego. [0070] Wektor ekspresyjny jest przenoszony do komórki gospodarza standardowymi technikami i transfekowane komórki są następnie hodowane standardowymi technikami w celu wytworzenia przeciwciała według wynalazku. Zatem, specyfikacja opisuje komórki gospodarza zawierające polinukleotyd kodujący 13

15 1 2 3 przeciwciało według wynalazku, lub jego łańcuch ciężki lub lekki, funkcjonalnie połączone z heterologicznym promotorem. W celu ekspresji przeciwciała o podwójnym łańcuchu, można doprowadzić do jednoczesnej ekspresji w komórce gospodarza wektorów kodujących zarówno łańcuch ciężki jak łańcuch lekki, aby uzyskać ekspresję cząsteczki całej immunoglobuliny, jak opisano poniżej. [0071] Szereg systemów gospodarz-wektor ekspresyjny można wykorzystać w celu wyrażania cząsteczki przeciwciała według wynalazku. Takie systemy gospodarz-wektor ekspresyjny reprezentują nośniki, dzięki którym można wytwarzać interesujące sekwencje kodujące i następnie oczyszczać, a także reprezentują komórki, które wówczas gdy są transformowane lub transfekowane odpowiednimi kodującymi sekwencjami nukleotydowymi wyrażają cząsteczkę przeciwciała według wynalazku in situ. Obejmują one między innymi mikroorganizmy takie jak bakterie (np., E. coli, B. subtilis), transformowane zrekombinowanymi wektorami ekspresyjnymi, będącymi bakteriofagowym DNA, plazmidowym DNA lub kosmidowym DNA, zawierającymi sekwencje kodujące przeciwciało; drożdże (np., Saccharomyces, Pichia) stransformowane zrekombinowanymi drożdżowymi wektorami ekspresyjnymi, zawierającymi sekwencje kodujące przeciwciało; systemy z komórkami owadów, zainfekowane zrekombinowanymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (np., bakulowirusa), zawierającymi sekwencje kodujące przeciwciało; systemy z komórkami roślinnymi, zainfekowane zrekombinowanymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (np., wirus mozaiki kalafiora, CaMV; wirus mozaiki tytoniu, TMV) lub stransformowane zrekombinowanymi plazmidowymi wektorami ekspresyjnymi (np., plazmid Ti), zawierającymi sekwencje kodujące przeciwciało; systemy z komórkami ssaczymi (np., komórki COS, CHO, BHK, 293, 3T3), niosącymi zrekombinowane konstrukty ekspresyjne zawierające promotory pochodzące z genomu komórek ssaczych (np., promotor metalotioneiny) lub z wirusów ssaczych (np., MPSV, CMV, późny promotor adenowirusa, promotor 7,K wirusa krowianki). Korzystnie, do ekspresji cząsteczki zrekombinowanego przeciwciała stosowane są komórki bakteryjne, takie jak Escherichia coli, i korzystniej komórki eukariotyczne, w szczególności do ekspresji cząsteczek całych zrekombinowanych przeciwciał. Przykładowo, komórki ssacze, takie jak komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), w połączeniu z wektorem, takim jak element promotora głównego pośredniego genu wczesnego ludzkiego cytomegalowirusa, enhancer CMV promotor MPSV stanowią skuteczny systemem ekspresji przeciwciał (Foecking i wsp., 1986, Gene 4:1; Cockett i wsp., 1990, Bio/Technology 8:2). [0072] W systemach bakteryjnych, szereg wektorów ekspresyjnych można korzystnie selekcjonować, w zależności od przeznaczenia wyrażonej cząsteczki przeciwciała. Przykładowo, kiedy duże ilości takiego białka będą produkowane, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych z cząsteczki przeciwciała, mogą być pożądane wektory kierujące wyrażaniem wysokich poziomów, łatwych do oczyszczania, produktów fuzji białkowej. Wektory takie obejmują między innymi, wyrażane w E. coli wektor ekspresyjny pur278 (Ruther i wsp., 1983, EMBO J. 2:1791), w którym sekwencja kodująca przeciwciało może być pojedynczo połączona za pomocą ligacji z wektorem w ramce z regionem kodującym lac Z, tak, że wytwarzana jest taka fuzja białkowa; wektory pin (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:31-39, 198; Van Heeke & Schuster. J. Biol. Chem. 24:03-09, 1989); i jemu podobne. Wektory pgex można także stosować do ekspresji obcych polipeptydów jako fuzje białkowe z S-transferazą glutationową (GST). Zasadniczo, takie fuzje białkowe są rozpuszczalne i można je z łatwością oczyszczać ze zlizowanych komórek przez adsorpcję i wiązanie do macierzy z kulek agarozy połączonej z glutationem, a następnie elucję w obecności wolnego glutationu. Wektory pgex są tak zaprojektowane, że obejmują miejsce trawienia dla trombiny lub proteazy Xa, dzięki czemu produkt docelowy sklonowanego genu można uwolnić od cząstki GST. [0073] W systemach owadzich, jako wektor do ekspresji obcych genów stosowany jest wirus poliedrozy jądrowej Autographa califomica (AcNPV, Autographa califomica nuclear polyhedrosis virus). Wirus jest namnażany w komórkach Spodopteira frugiperda. Sekwencja kodująca przeciwciało może być sklonowana 14

16 pojedynczo, w regionach niebędących znaczącymi dla wirusa (przykładowo gen poliedryny) i umieszczona pod kontrolą promotora AcNPV (przykładowo promotor poliedryny). [0074] W ssaczych komórkach gospodarza, można wykorzystać szereg systemów ekspresyjnych opartych na wirusach. W przypadkach, kiedy jako wektor ekspresyjny stosowany jest adenowirus, sekwencja kodująca interesujące przeciwciało może być połączona z kompleksem kontrolnym transkrypcji/translacji adenowirusa za pomocą ligacji, np., późnego promotora i trzyczęściowej sekwencji liderowej. Następnie można wprowadzić chimeryczny gen do genomu adenowirusa za pomocą rekombinacji in vitro lub in vivo. W wyniku wprowadzenia insercji w region genomu wirusowego nie będący znaczącym dla wirusa (np., region E1 lub E3) powstanie zrekombinowany wirus, żywotny i umożliwiający wyrażanie cząsteczki przeciwciała w zainfekowanych gospodarzach. (np., patrz Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3-39, 1984). Do wydajnej translacji wprowadzonych sekwencji kodujących mogą być także wymagane specyficzne sygnały inicjacyjne. Sygnały te obejmują kodon inicjacji ATG i sekwencje przylegające. Ponadto, kodon inicjacji musi być w ramce odczytu z pożądaną sekwencją kodującą dla zapewnienia translacji całej wstawionej sekwencji. Te egzogenne sygnały kontroli translacji i kodony inicjacji mogą mieć różne pochodzenie, zarówno naturalne jak syntetyczne. Wydajność ekspresji można wzmocnić za pomocą włączenia odpowiednich elementów wzmacniających transkrypcję, terminatorów transkrypcji, etc. (patrz Bittner i wsp., Methods in Enzymol. 13:1-44, 1987). [007] Dodatkowo, można wybrać szczep komórek gospodarza, który moduluje ekspresję wprowadzonych sekwencji lub modyfikuje i przetwarza produkt ekspresji genu w pożądany sposób. Takie modyfikacje (np., glikozylacja) i obróbki (np., cięcie) produktów białkowych mogą być ważne dla funkcji białka. Różne komórki gospodarza posiadają własności i specyficzne mechanizmy potranslacyjnej obróbki i modyfikacji białek i produktów ekspresji genów. Odpowiednie linie komórkowe lub systemy gospodarzy można wybrać dla zapewnienia prawidłowej modyfikacji i obróbki wytworzonych obcych białek. W tym celu można zastosować komórki gospodarzy eukariotycznych, które posiadają maszynerię komórkową dla odpowiedniej obróbki pierwotnego transkryptu, glikozylacji i fosforylacji produktu ekspresji genu. Takie komórki ssaczych gospodarzy obejmują między innymi komórki CHO, VERO, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, i w szczególności, linie komórek raka piersi, takie jak przykładowo BT483, Hs78T, HTB2, BT i T47D, oraz linię normalnych komórek gruczołu sutkowego taką jak, przykładowo, CRL70 i Hs78Bst. [0076] Dla długoterminowej, wydajnej produkcji zrekombinowanych białek, korzystna jest stabilna ekspresja. Przykładowo, można wytworzyć za pomocą inżynierii genetycznej linie komórkowe stabilnie wyrażające cząsteczkę przeciwciała. Zamiast stosowania wektorów ekspresyjnych, które zawierają wirusowe miejsce startu replikacji, komórki gospodarza można transformować DNA kontrolowanym przez odpowiednie elementy kontroli ekspresji (np., promotor, enhancer, sekwencje, terminatory transkrypcji, miejsca poliadenylacji, etc.) i markerem selekcyjnym. Po wprowadzeniu obcego DNA, komórki poddane inżynierii genetycznej można hodować przez 1-2 dni we wzbogaconej pożywce, a następnie przenieść do pożywki selekcyjnej. Marker selekcyjny ze zrekombinowanego plazmidu nadaje oporność na selekcję i umożliwia komórkom stabilną integrację plazmidu do ich chromosomów komórek oraz wzrost do wytworzenia ognisk, które z kolei można klonować i namnażać w linie komórkowe. Metoda ta może być korzystnie stosowana do poddawania inżynierii genetycznej linii komórek, które wyrażają cząsteczkę przeciwciała. Takie linie komórkowe poddane inżynierii genetycznej mogą być szczególnie przydatne w poszukiwaniu i ocenianiu związków, które bezpośrednio lub pośrednio oddziałują z cząsteczką przeciwciała. [0077] Można zastosować szereg systemów selekcji, w tym między innymi można wykorzystać geny kinazy tymidynowej wirusa opryszczki (Wigler i wsp., Cell 11:223, 1977), fosforybozylotransferazy hipoksantynowoguaninowej (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2, 1992) oraz fosforybozylotransferazy adeninowej (Lowy i wsp., Cell 22:817, 1980) odpowiednio w komórkach tk-, hgprt- lub aprt-. Również, jako 1

17 1 2 3 podstawę wyboru można zastosować oporność na antymetabolity, nadawaną przez następujące geny: dhfr, nadający oporność na metotreksat (Wigler i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:37, 1980; O'Hare i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:127, 1981); gpt, nadający oporność na kwas mykofenolowy (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:72, 1981); neo, nadający oporność na aminoglikozyd G-418 (Wu i Wu, Biotherapy 3:87-9, 1991; Tolstoshev, Ann. Rev. Phamacol. Toxicol. 32:73-96, 1993; Mulligan, Science 260: , 1993 oraz Morgan i Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: , 1993; TIB TECH 11():1-21), May, 1993 oraz hygro, nadający oporność na higromycynę (Santerre i wsp., Gene :147, 1984). Metody powszechnie stosowane w dziedzinie technologii rekombinacji DNA, które można zastosować są opisane w Ausubel i wsp. (red.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; i w rozdz. 12 i 13, Dracopoli i wsp. (red.), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre- Garapin i wsp., J. Mol. Biol. :1, [0078] Poziomy wyrażania cząsteczki przeciwciała można zwiększać przez amplifikację wektora (jako praca przeglądowa, patrz Bebbington i Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells, w DNA cloning, tom 3. (Academic Press, New York, 1987)). Kiedy marker w systemie wektorowym umożliwiającym wyrażenie przeciwciała można amplifikować, wzrost inhibitora obecnego w hodowli komórki gospodarza będzie powodował wzrost liczby kopii genu markerowego. Ponieważ amplifikowany region jest związany z genem przeciwciała, produkcja przeciwciała także wzrośnie (Crouse i wsp., Mol. Cell. Biol. 3:27, 1983). [0079] Komórkę można jednocześnie transfekowć dwoma wektorami ekspresyjnymi, pierwszym wektorem kodującym polipeptyd pochodny łańcucha ciężkiego i drugim wektorem kodującym polipeptyd pochodny łańcucha lekkiego. Dwa wektory mogą zawierać identyczne markery selekcyjne, które umożliwiają równe wyrażanie polipeptydów łańcucha ciężkiego i lekkiego. Alternatywnie, można zastosować pojedyncze wektory, które kodują oba polipeptydy łańcucha ciężkiego i lekkiego. W takich sytuacjach, łańcuch lekki powinien być umieszczony przed łańcuchem ciężkim, dla uniknięcia nadmiaru toksycznego, wolnego łańcucha ciężkiego (Proudfoot, Nature 322:2, 1986; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197, 1980). Sekwencje kodujące łańcuchów ciężkiego i lekkiego mogą obejmować cdna lub DNA genomowy. [0080] Cząsteczka przeciwciała według wynalazku wyrażona na drodze rekombinacji może być oczyszczona dowolną, znaną w dziedzinie, metodą oczyszczania cząsteczki immunoglobuliny, przykładowo, za pomocą chromatografii (np., jonowymiennej, powinowactwa, w szczególności powinowactwa do swoistego antygenu po oczyszczaniu na białku A, chromatografii z kolumną rozdzielającą według wielkości), wirowania, zróżnicowanej rozpuszczalności lub dowolną inną standardową techniką oczyszczania białek. [0081] W szczególnych zastosowaniach, może być pożądane przygotowanie fragmentów przeciwciał anty- IL-21. Takie fragmenty przeciwciał można uzyskać, przykładowo, za pomocą hydrolizy proteolitycznej przeciwciała. Fragmenty przeciwciał można uzyskać przez trawienie pepsyną lub papainą całych przeciwciał standardowymi metodami. Dla zilustrowania, fragmenty przeciwciał można wytwarzać za pomocą enzymatycznego cięcia przeciwciał pepsyną dostarczając fragment S, oznaczony jako F(ab')2. Fragment ten można dalej ciąć stosując czynnik redukujący grupę tiolową produkując monowalentne fragmenty 3.S, oznaczone jako Fab'. Ewentualnie, reakcję cięcia można prowadzić z zastosowaniem grup blokujących dla grup sulfhydrylowych, które powstają na skutek cięcia wiązań dwusiarczkowych. Alternatywnie, cięcie enzymatyczne wykorzystujące pepsynę produkuje bezpośrednio dwa monowalentne fragmenty Fab i fragment Fc. Metody te opisano, przykładowo, w Goldenberg, patent USA nr , Nisonofl' i wsp., Arch Biochem. Biophys. 89:2, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 199; Edelman i wsp., w Methods in Enzymology tom 1, str. 422 (Academic Press 1967) oraz w Coligan na str i

18 1 2 3 [0082] Można zastosować inne metody cięcia przeciwciał, takie jak rozdzielenie łańcuchów ciężkich w celu stworzenia fragmentów monowalentnych łańcucha lekkiego-ciężkiego, dalsze cięcie fragmentów lub inne techniki enzymatyczne, chemiczne lub genetyczne, tak długo jak fragmenty będą wiązały antygen, który jest rozpoznawany przez niezmienione przeciwciało. [0083] Przykładowo, fragmenty Fv obejmują zasocjowane łańcuchy VH i VL. Asocjacja ta może być niekowalencyjna, jak opisano w Inbar i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:269, Alternatywnie, łańcuchy zmienne mogą być połączone międzycząsteczkowym wiązaniem dwusiarczkowym lub związane krzyżowo za pomocą substancji chemicznych, takich jak glutaraldehyd (patrz, przykładowo, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992). [0084] Fragmenty Fv mogą obejmować łańcuchy VH i VL połączone za pomocą łącznika peptydowego. Te jednołańcuchowe białka wiążące antygen (scfv) są przygotowywane przez konstruowanie genu strukturalnego obejmującego sekwencje DNA kodujące domeny VH i VL, które są połączone przez oligonukleotyd. Gen strukturalny jest wprowadzany do wektora ekspresyjnego, który jest następnie wprowadzany do komórki gospodarza, takiej jak E. coli. Zrekombinowana komórka gospodarza syntetyzuje pojedynczy łańcuch polipeptydowy z łącznikiem polipeptydowym łączącym dwie domeny V. Metody produkcji scfvs opisano, przykładowo, w Whitlow i wsp., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 (1991) (patrz także, Bird i wsp., Science 242:423, 1988, Ladner i wsp., U.S. Patent No. 4,946,778, Pack i wsp., Bio/Technology 11:1271, 1993 oraz Sandhu, powyżej). [008] Przykładowo, scfv można uzyskać przez eksponowanie limfocytów na polipeptyd IL-21 in vitro, i selekcjonowanie bibliotek prezentujących przeciwciało w fagu lub podobnych wektorach (przykładowo, przez użycie unieruchomionego lub wyznakowanego białka lub peptydu IL-21). Geny kodujące polipeptydy posiadające potencjalne domeny wiążące polipeptyd IL-21 można uzyskać przez przeszukanie bibliotek losowych peptydów prezentowanych na fagu (prezentacja na fagu) lub na bakteriach, takich jak E. coli. Sekwencje nukleotydowe kodujące polipeptydy można uzyskać wieloma innymi drogami, takimi jak losowa mutageneza i synteza losowych polinukleotydów. Takie biblioteki prezentujące losowe peptydy można stosować do poszukiwania peptydów, które oddziałują ze znanymi miejscami docelowymi, którymi mogą być białko lub polipeptyd, takie jak ligand lub receptor, makromolekuła biologiczna lub syntetyczna, lub związki organiczne lub nieorganiczne. Techniki tworzenia i przeszukiwania bibliotek prezentujących losowe peptydy są znane w dziedzinie (Ladner i wsp., patent USA nr 2239, Ladner i wsp., patent USA nr , Ladner i wsp., patent USA nr 3484, Ladner i wsp., patent USA nr oraz Kay i wsp., Phage Display of Peptyds and Proteins (Academic Press, Inc. 1996)) i biblioteki prezentujące losowe peptydy oraz zestawy do przeszukiwania takich bibliotek są dostępne handlowo, przykładowo z CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) i Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). Biblioteki prezentujące losowe peptydy można przeszukiwać przy użyciu sekwencji IL-21 ujawnionych tu w celu zidentyfikowania białek, które wiążą się z IL-21. [0086] Inną formą fragmentów przeciwciał jest peptyd kodujący pojedynczy region determinujący dopasowanie (CDR). Peptydy CDR ( minimalne jednostki rozpoznające ) można uzyskać przez konstruowanie genów kodujących CDR interesującego przeciwciała. Takie geny są przygotowywane, przykładowo, przy użyciu łańcuchowej reakcji polimerazy w celu syntezy regionu zmiennego z RNA komórek produkujących przeciwciało (patrz, przykładowo, Larrick i wsp., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:6 (1991), Courtenay-Luck, Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies, w Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter i wsp. (red.), str. 166 (Cambridge University Press 199) oraz Ward i wsp., Genetic Manipulation and Expression of Antibodies, w Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch i wsp., (red.), str. 137 (Wiley-Liss, Inc. 199)). 17

19 [0087] Alternatywnie, przeciwciało anty-il-21 może pochodzić z humanizowanego przeciwciała monoklonalnego. Humanizowane przeciwciała monoklonalne są wytwarzane przez przeniesienie mysich lub szczurzych regionów determinujących dopasowanie z ciężkiego i lekkiego łańcucha zmiennego immunoglobuliny mysiej do ludzkiej domeny zmiennej. Typowe reszty ludzkich przeciwciał są następnie podstawiane w regiony zrębowe mysich odpowiedników. Użycie składników przeciwciał pochodzących z humanizowanych przeciwciał monoklonalnych eliminuje potencjalne problemy związane z immunogennością mysich regionów stałych. Powszechne techniki klonowania domen zmiennych mysich immunoglobulin opisano, przykładowo, wy Orlandi i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:3833, Techniki produkcji humanizowanych przeciwciał monoklonalnych opisano, przykładowo, w Jones i wsp., Nature 321:22, 1986; Carter i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:428, 1992; Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992; Singer i wsp., J. Immun. :2844, 1993; Sudhir (red.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 199), Kelley, Engineering Therapeutic Antibodies, w Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland i wsp. (red.), str (John Wiley & Sons, Inc. 1996) oraz Queen i wsp., patent USA nr [0088] Możliwe jest także skonstruowanie alternatywnych regionów zrębowych przy użyciu kolekcji białek monomerowych do stworzenia domeny monomerowej. Takie monomerowe domeny mogą być na tyle małe, że będą penetrować tkankę. Domeny monomerowe mogą być naturalnie występującymi lub wariantami nie występującymi w naturze lub ich kombinacjami. Domeny monomerowe mogą tworzyć multimetry z dwóch domen. Domena monomerowa wiąże miejsce analogowe do opisanych tu epitopów, na cząsteczce docelowej. W niektórych przypadkach, multimetr może być utworzony z różnych domen monomerowych. (Patrz, np. zgłoszenie patentu USA i zgłoszenie patentu USA ) [0089] Przeciwciała opisane tu obejmują pochodne, które są zmodyfikowane, tj., przez kowalencyjne przyłączenie cząsteczki dowolnego typu do przeciwciała, tak, że to przyłączenie nie uniemożliwia przeciwciału wiązania z IL-21 lub uniemożliwia aktywację receptora. Przykładowo, lecz nie ograniczająco, pochodne przeciwciała obejmują przeciwciała, które zostały zmodyfikowane, np., przez glikozylację, acetylację, pegilację, fosforylację, amidację, derywatyzację znanymi grupami protegującymi/blokującymi, cięcie proteolityczne, łączenie z ligandem komórkowym lub innym białkiem, etc. Dowolną z wielu chemicznych modyfikacji można prowadzić znanymi technikami, włączając między innymi, specyficzne cięcie chemiczne, acetylację, formylację, metaboliczną syntezę tunikamycyny, etc. Dodatkowo, pochodna może zawierać jeden lub większą liczbę aminokwasów nieklasycznych. [0090] Przeciwciało anty-il-21 może być skoniugowane z wykrywalnym znacznikiem, w celu uzyskania immunokoniugatu anty-il-21. Przydatne wykrywalne znaczniki obejmują, przykładowo, radioizotop, znacznik fluorescencyjny, znacznik chemiluminescencyjny, znacznik enzymatyczny, znacznik bioluminescencyjny lub złoto koloidowe. Metody wytwarzania i wykrywania takich wykrywalnych wyznakowanych immunokoniugatów są dobrze znane zwykłym specjalistom w dziedzinie i zostały opisane szczegółowo poniżej. Wykrywalnym znacznikiem może być radioizotop wykrywany za pomocą autoradiografii. Szczególnie przydatnymi tu izotopami są 3 H, 12 I, 131 I, 3 S i 14 C. [0091] Immunokoniugaty anty-il-21 można także wyznakować za pomocą związku fluorescencyjnego. Obecność przeciwciała wyznakowanego fluorescencyjnie można określić za pomocą ekspozycji immunokoniugatu na źródło światła o odpowiedniej długości fali i wykrycie powstającej fluorescencji. Związki do znakowania fluorescencyjnego obejmują izotiocyjanian fluoresceiny, rodaminę, fikoerytrynę, fikocyjaninę, allofikocyjaninę, o-fitoaldehyd i fluoreskaminę. [0092] Możliwe jest także, aby immunokoniugaty anty-il-21 były wyznakowane wykrywalnym znacznikiem dzięki sprzężeniu składnika przeciwciała ze związkiem chemifluorescencyjnym. Obecność chemiluminescencyjnie wyznakowanego immunokoniugatu jest określana za pomocą wykrywania obecności luminescencji, która powstaje podczas zachodzenia reakcji chemicznej. Przykłady chemiluminescencyjnych 18

20 związków znacznikowych obejmują luminol, izoluminol, aromatyczny ester akrydynowy, imidazol, sól akrydynową i ester oksolanowy. [0093] Podobnie, do wyznakowania immunokoniugatów anty-il-21można użyć związek bioluminescencyjny. Bioluminescencja jest rodzajem chemiluminescencji znalezionej w układach biologicznych, w których białko katalityczne podnosi wydajność reakcji chemiluminescencji. Obecność białka bioluminescencyjnego jest określana przez wykrycie wystąpienia luminescencji. Związki bioluminescencyjne przydatne do znakowania obejmują lucyferynę, lucyferazę i akworynę. [0094] Alternatywnie, immunokoniugaty anty-il-21 można wyznakować wykrywalnym znacznikiem przez połączenie składnika przeciwciała anty-il-21 z enzymem. Kiedy koniugat anty-il-21-enzym jest inkubowany w obecności odpowiedniego substratu, cząstka enzymu reaguje z substratem i wytwarza cząstkę chemiczną, którą można wykryć, przykładowo, za pomocą spektroskopii, fluorymetrii lub metod wizualnych. Przykłady enzymów, które można wykorzystać do znakowania wykrywalnym znacznikiem wieloswoistych immunokoniugatów obejmują β-galaktozydazę, oksydazę glukozy, peroksydazę i alkaliczną fosfatazę. [009] Specjaliści w dziedzinie będą znali inne przydatne znaczniki, które można użyć zgodnie z niniejszym wynalazkiem. Wiązanie cząstek markerowych z przeciwciałami anty-il-21 można osiągnąć stosując standardowe techniki znane w dziedzinie. Typowa metodologia dotycząca tego zagadnienia jest opisana w Kennedy i wsp., Clin. Chim. Acta 70:1, 1976; Schurs i wsp., Clin. Chim. Acta 81:1, 1977; Shih i wsp., Int'l J. Cancer 46:11, 1990; Stein i wsp., Cancer Res. 0:13, 1990 oraz Coligan, powyżej. [0096] Ponadto, wygodne i wszechstronne wykrywanie immunochemiczne można wzmocnić stosując przeciwciała anty-il-21, które skoniugowano z awidyną, streptawidyną i biotyną (patrz, przykładowo, Wilchek i wsp. (red.), Avidin-Biotin Technology, Methods In Enzymology, tom. 184 (Academic Press 1990), oraz Bayer i wsp., Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology, w Methods In Molecular Biology, tom, Manson (red.), str (The Humana Press, Inc. 1992). [0097] Metody prowadzenia testów immunologicznych są ogólnie przyjęte. Patrz, przykładowo, Cook i Self, Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays, w Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter i Ladyman (red.), str , (Cambridge University Press, 199), Perry, The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology, w Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch i Lennox (red.), str. 7-1 (Wiley-Liss, Inc. 199), oraz Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996). [0098] Przeciwciała lub ich fragmenty o wydłużonych okresach półtrwania in vivo można wytwarzać technikami znanymi specjalistom w dziedzinie. Przykładowo, przeciwciała lub ich fragmenty o wydłużonych okresach półtrwania in vivo można wytwarzać modyfikując (np., przez podstawienie, delecję lub dodanie) reszty aminokwasowe zidentyfikowane jako zaangażowane w oddziaływanie pomiędzy domeną Fc i receptorem FcRn (patrz, np., międzynarodowa publikacja nr WO 97/34631 i WO 02/060919, które są tu w całości wprowadzone jako referencje). Przeciwciała lub ich fragmenty o wydłużonych okresach półtrwania in vivo można wytwarzać przez przyłączenie do omawianych przeciwciał lub fragmentów przeciwciał cząsteczek polimerowych, takich jak glikol polietylenowy (PEG) o wysokiej masie cząsteczkowej. PEG można przyłączyć do omawianych przeciwciał lub fragmentów przeciwciał razem z lub bez małego, funkcjonalnego łącznika albo przez specyficzną miejscowo koniugację cząsteczki PEG do końca C lub N omawianych przeciwciał lub fragmentów przeciwciał lub przez grupy aminokwasowe epsilon obecne na resztach lizyny. Wykorzystywana będzie derywatyzacja liniowych lub rozgałęzionych polimerów, w wyniku której dochodzi do niewielkiej utraty aktywności biologicznej. Stopień skoniugowania będzie ściśle monitorowany za pomocą SDS-PAGE i spektrometrii mas dla zapewnienia prawidłowej koniugacji cząsteczek PEG z przeciwciałami. Cząsteczki PEG, które nie uległy reakcji można oddzielić od koniugatów przeciwciało-peg za pomocą, np., chromatografii wykluczania lub jonowymiennej. 19

21 Kompozycje farmaceutyczne [0099] Niniejszy wynalazek dalej obejmuje kompozycje farmaceutyczne, zawierające farmaceutycznie dopuszczalne nośniki oraz przeciwciało, jak określono w zastrzeżeniach. Kompozycja farmaceutyczna może obejmować dodatkowe środki terapeutyczne, w tym między innymi, czynniki cytotoksyczne, cytotoksynę, np., czynnik cytostatyczny lub cytobójczy, środek terapeutyczny lub jon radioaktywnego metalu. Cytotoksyna lub czynnik cytotoksyczny obejmuje dowolny czynnik, który jest szkodliwy dla komórek. Przykłady obejmują paklitaksol, cytochalazynę B, gramicydynę D, bromek etydyny, emetynę, mitomycynę, etopozyd, tenopozyd, winkrystynę, winblastynę, kolchicynę, doksorubicynę, daunorubicynę, dihydroksy antracynodione (ang. dihydroxy anthracin dione), mitoksantron, mitramycynę, aktynomycynę D, 1-dehydrotestosteron, glikokortykoidy, prokainę, tetrakainę, lidokainę, propranolol, i puromycynę oraz ich analogi i homologi. Środki terapeutyczne obejmują między innymi antymetabolity (np., metotreksat, 6-merkaptopurynę, 6-tioguaninę, cytarabinę, -fluorouracyl, dekarbazynę), środki alkilujące (np., mechloretaminę, tioepę, chlorambucyl, melfalan, karmustynę (BSNU) i lomustynę (CCNU), cyklofosfamid, busulfan, dibromomannitol, streptozotocynę, mitomycynę C oraz cis-dichlorodiaminę platyny (II) (DDP), cisplatynę), antracykliny (np., daunorubicynę (wcześniej daunomycyna) oraz doksorubicynę), antybiotyki (np., daktynomycynę (wcześniej aktynomycyna), bleomycynę, mitramycynę i antramycynę (AMC)) oraz środki blokujące podziały mitotyczne (np., winkrystynę i winblastynę). Przykładowo, kompozycja farmaceutyczna może obejmować białko lub polipeptyd posiadające pożądaną aktywność biologiczną. Białka takie mogą obejmować, przykładowo, toksynę taką jak abryna, rycyna A, egzotoksyna z Pseudomonas lub toksyna błonicza; białko takie jak czynnik martwicy nowotworów, α-ifn, β-ifn, czynnik wzrostu nerwu, płytkopochodny czynnik wzrostu, tkankowy aktywator plazminogenu, czynnik zakrzepowy lub czynnik blokujący tworzenie naczyń, np., angiostatyna lub endostatyna; lub czynniki modyfikujące odpowiedź biologiczną, takie jak, przykładowo, limfokiny, interleukina-1 ( IL-1 ), interleukina-2 ( IL-2 ), interleukina-6 ( IL-6 ), czynnik pobudzający kolonie granulocytów i makrofagów ( GM-CSF ), czynnik pobudzający kolonie granulocytów ( G-CSF ) lub inne czynniki wzrostu. [00] Dla celów terapii, cząsteczki przeciwciała anty-il-21 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik są podawane pacjentowi w ilości skutecznej terapeutycznie. Mówi się, że kombinacja cząsteczki terapeutycznej i farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika jest podawana w ilości skutecznej terapeutycznie, jeśli podawana ilość jest znacząca fizjologicznie. Środek jest znaczący fizjologicznie, jeśli wyniki jego obecności wywołują wykrywalną zmianę w fizjologii pacjenta przyjmującego ten środek. Przykładowo, środek stosowany do leczenia zapalenia jest znaczący fizjologicznie, jeśli jego obecność łagodzi odpowiedź zapalną. [01] Kompozycja farmaceutyczna obejmująca przeciwciało anty-il-21 może być dostarczona w formie płynnej, w postaci aerozolu lub w formie stałej. Formy płynne, dla ilustracji, to roztwory do iniekcji lub zawiesiny doustne. Przykłady form stałych obejmują kapsułki, tabletki lub formy o kontrolowanym uwalnianiu. Ta ostatnia jest ilustrowana przez miniosmotyczne pompy lub implanty (Bremer i wsp., Pharm. Biotechnol. :239 (1997); Ranade, Implants in Drug Delivery, w Drug Delivery Systems, Ranade i Hollinger (red.), str (CRC Press 199); Bremer i wsp., Protein Delivery with Infusion Pumps w Protein Delivery: Physical Systems, Sanders i Hendren (red.), str (Plenum Press 1997); Yewey i wsp., Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant, w Protein Delivery: Physical Systems, Sanders i Hendren (red.), str (Plenum Press 1997)). [02] Liposomy dają jedną z możliwości podawania polipeptydów terapeutycznych osobnikowi dożylnie, dootrzewnowo, dooponowo, domięśniowo, podskórnie lub doustnie, wziewnie lub donosowo. Liposomy są mikroskopowymi nośnikami, które składają się z jednej lub większej liczby dwuwarstwowej błony lipidowej otaczającej kompartymenty wodne (patrz, ogólnie, Bakker-Woudenberg i wsp., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect.

22 Dis. 12 (uzupełnienie 1): S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993) oraz Ranade, Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers, w Drug Delivery Systems, Ranade i Hollinger (red.), str (CRC Press 199)). Skład liposomów jest podobny do składu błon komórkowych i dzięki temu liposomy można podawać bezpiecznie i są one degradowane biologicznie. W zależności od sposobu przygotowania liposomy mogą być jednolamellarne lub wielolamelarne, oraz mogą różnić się rozmiarem, ze średnicami mieszczącymi się w zakresie od 0,02 µm do ponad µm. W liposomach można umieszczać różne środki: części hydrofobowe środków w dwuwarstwowej części, a części hydrofilowe środków w ich wewnętrznej wodnej przestrzeni/przestrzeniach (patrz, przykładowo, Machy i wsp., Liposomes In Cell Biology And. Pharmacology (John Libbey 1987) oraz Ostro i wsp., American J. Hosp. Pharm. 46:176 (1989)). Ponadto możliwe jest kontrolowanie dostępności terapeutycznej środka umieszczonego w liposomie przez zmienianie rozmiaru liposomu, liczby podwójnych warstw, składu lipidowego, jak również ładunku i cech charakterystycznych powierzchni liposomów. [03] Alternatywnie, różne ligandy docelowe można związać z powierzchnią liposomu, takie jak przeciwciała, fragmenty przeciwciał, węglowodany, witaminy i białka transportowe. Przykładowo, liposomy można modyfikować rozgałęzionymi pochodnymi galaktozylolipidów do wiązania docelowych asialoglikoproteinowych (galaktozowych) receptorów, które są wyłącznie wyrażane na powierzchni komórek wątroby (Kato i Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287, 1997; Murahashi i wsp., Biol. Pharm. Bull. :29, 1997). Podobnie, Wu i wsp., Hepatology 27:772, 1998, pokazali, że liposomy wyznakowane asialofetuiną charakteryzują się skróconym okresem półtrwania w osoczu i znacząco zwiększają pobieranie liposomów wyznakowanych asialofetuiną przez hepatocyty. Z drugiej strony, gromadzenie w hepatocytach liposomów obejmujących rozgałęzione pochodne galaktozylolipidów można zahamować przez wcześniejszą iniekcję asialofetuiny (Murahashi i wsp., Biol. Pharm. Bull. :29, 1997). Liposomy z ludzką albuminą surowiczą modyfikowaną poliakonityną, dostarczają innego podejścia docelowego umieszczania liposomów na komórkach wątroby (Kamps i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681, 1997). Ponadto, Geho, i wsp., patent USA nr 46044, opisuje system dostarczania oparty na nośniku liposomowym skierowanym na hepatocyty, który jest specyficzny wobec receptorów wątroby i dróg żółciowych związanych z wyspecjalizowanymi komórkami wątroby. [04] W bardziej ogólnym podejściu trafiania w miejsca docelowe tkanek, komórki docelowe są korzystnie wstępnie wyznakowane biotynylowanymi przeciwciałami swoistymi wobec liganda wyrażanego na komórce docelowej (Harasym i wsp., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99, 1998). Po eliminacji z osocza wolnego przeciwciała, podawane są liposomy skoniugowane ze streptawidyną. W innym podejściu, przeciwciała trafiające w miejsca docelowe są bezpośrednio przyłączone do liposomów (Harasym i wsp., ibid. (1998)). [0] Polipeptydy i przeciwciała można umieszczać w liposomach stosując standardowe techniki mikroenkapsulacji białek (patrz, przykładowo, Anderson i wsp., Infect. Immun. 31:99, 1981, Anderson i wsp., Cancer Res. 0:183, 1990 oraz Cohen i wsp., Biochim. Biophys. Acta 63:9, 1991, Alving i wsp. Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies, w Liposome Technology, wyd. 2, tom III, Gregoriadis (red.), str. 317 (CRC Press 1993), Wassef i wsp., Meth. Enzymol. 149:124, 1987). Jak zauważono powyżej, liposomy przydatne terapeutycznie mogą zawierać zróżnicowane składniki. Przykładowo, liposomy mogą obejmować lipidowe pochodne poli(etylenoglikolu) (Allen i wsp., Biochim. Biophys. Acta 1:9, 1993). [06] Mikrosfery z polimerów ulegających degradacji zaprojektowano w celu utrzymania wysokich poziomów systemowych białek terapeutycznych. Mikrosfery są przygotowane z ulegających degradacji polimerów, takich jak poli(laktydo-ko-glikolid) (PLG), polibezwodniki, poliortoestry, polimery octanu etylowinylu nieulegające biodegradacji, gdzie białka są uwięzione w polimerze (Gombotz i Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332, 199; Ranade, Role of Polymers in Drug Delivery, w Drug Delivery Systems, 21

23 Ranade i Hollinger (red.), str (CRC Press 199); Roskos i Maskiewicz, Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery w Protein Delivery: Physical Systems, Sanders i Hendren (red.), str (Plenum Press 1997); Bartus i wsp., Science 281:1161, 1998; Putney i Burke, Nature Biotechnology 16:13, 1998; Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:48, 1998). Nanosfery opłaszczone glikolem polietylenowycm (PEG) mogą także dostarczać nośniki do dożylnego podania białek terapeutycznych (patrz, przykładowo, Gref i wsp., Pharm. Biotechnol. :167, 1997). [07] Specjaliści w dziedzinie mogą wskazać inne formy dawkowania, jak pokazano, przykładowo, w Ansel i Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, wyd. (Lea & Febiger 1990), Gennaro (red.), Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 19 (Mack Publishing Company 199) oraz Ranade i Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996). [08] Kompozycje farmaceutyczne można dostarczać w postaci zestawu obejmującego pojemnik obejmujący przeciwciało neutralizujące anty-il-21. Polipeptydy terapeutyczne można dostarczać w formie roztworu do iniekcji w jednej lub wielu dawkach, w postaci sterylnego proszku, który będzie odtworzony w postaci płynu przed iniekcją. Alternatywnie, zestaw taki może zawierać dozownik proszkowy, generator płynnego aerozolu lub nebulizator do podawania peptydu terapeutycznego. Zestaw taki może dalej obejmować pisemną informację dotyczącą wskazań i stosowania kompozycji farmaceutycznej. [09] Kompozycja farmaceutyczna obejmująca przeciwciała anty-il-21 może być dostarczona w formie ciekłej, w postaci aerozolu lub w formie stałej. Formy płynne, są ilustrowane przez roztwory do iniekcji, aerozole, kropelki, roztwory miejscowe i zawiesiny doustne. Przykłady form stałych obejmują kapsułki, tabletki lub formy o kontrolowanym uwalnianiu. Ta ostatnia jest ilustrowana przez miniosmotyczne pompy lub implanty (Bremer i wsp., Pharm. Biotechnol. :239,1997; Ranade, Implants in Drug Delivery, w Drug Delivery Systems, Ranade i Hollinger (red.), str (CRC Press 199); Bremer i wsp., Protein Delivery with Infusion Pumps, w Protein Delivery: Physical Systems, Sanders i Hendren (red.), str (Plenum Press 1997); Yewey i wsp., Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant, w Protein Delivery: Physical Systems, Sanders i Hendren (red.), str (Plenum Press 1997)). Inne formy stałe obejmują kremy, plastry, inne miejscowe formy i im podobne. Zastosowania terapeutyczne przeciwciał anty-il-21 [01] IL-21 jest cytokiną pochodzącą z populacji CD4 + limfocytów T, ważną dla optymalnej odpowiedzi odpornościowej za pośrednictwem populacji CD8 + limfocytów T, aktywacji komórek NK oraz optymalnych odpowiedzi humoralnych, takich jak produkcja przeciwciał oraz dojrzewanie limfocytów B. Pokazano, że IL- 21 indukuje szereg prozapalnych chemokin i cytokin, takich jak IL-18, IL-1, IL-, IL-6, TNFRII, scd2 oraz RANTES. IL-21 indukuje także odpowiedź ostrej fazy u naczelnych nie będących człowiekiem i u ludzi. Wykazano zwiększone wytwarzanie receptora IL-21 w naskórku pacjentów z twardziną układową (Distler i wsp., Arthritis & Rheumatism 2:86-864, 04) i fibroblastach błony maziowej w reumatoidalnym zapaleniu stawów (Jungel i wsp., Arthritis & Rheumatism 0: , 04). Ponadto, zwiększone wytwarzanie receptora IL-21 mają autoimmunologiczne myszy cukrzycowe NOD (King i wsp., Cell 117:26-277, 04.). Wykazano, że wytwarzanie IgG i IL-21 jest zwiększone w modelu mysim BXSB- Yaa, który rozwija chorobę autoimmunologiczną typu tocznia rumieniowatego (Ozaki i wsp., J. Immunol. 173: , 04); wytwarzanie IL-21 jest wyższe u podatnych na tocznia myszy Sanroque (Vinuesa i wsp. Nature 43:42, 0); wytwarzanie IL-21 jest wyższe u pacjentów z chorobą Crohna (Monteleone, i wsp., Gastroenterology 128: , 0). [0111] Terapeutycznie skuteczna ilość przeciwciała anty-il-21 odnosi się do ilości przeciwciała, które jeśli podane pacjentowi, jest skuteczne w zapobieganiu, opóźnianiu, redukowaniu lub hamowaniu objawów lub aktywności biologicznej związanej z chorobą lub zaburzeniem. Podawanie może składać się z jednej dawki lub wielu dawek, i może być stosowane w połączeniu z podawaniem innych kompozycji farmaceutycznych. 22

24 [0112] Niniejszy wynalazek dostarcza przeciwciała IL-21 i kompozycje farmaceutyczne jak określono w zastrzeżeniach do stosowania w leczeniu chorób autoimmunologicznych lub stanów, takich jak zapalenie trzustki, cukrzyca typu I (IDDM), choroba Gravesa-Basedowa, nieswoiste zapalenie jelit (IBD), choroba Crohna, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, zespół nadwrażliwości jelita grubego, stwardnienie rozsiane, reumatoidalne zapalenie stawów, uchyłkowatość jelit, tocznia rumieniowatego układowego, łuszczycy, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, twardzina skóry, twardzina układowa, artropatia łuszczycowa, choroba zwyrodnieniowa stawów, atopowe zapalenie skóry, bielactwo nabyte, choroba przeszczep przeciw (GVHD) gospodarzowi, chłoniak skórny z limfocytów T (CTCL), zespół Sjogrena, kłębuszkowe zapalenie nerek, nefropatia IgA, choroba przeszczep przeciw gospodarzowi, odrzucenie przeszczepu, zapalenie atopowe skóry, zespół antyfosfolipidowy i astma, oraz innych chorób autoimmunologicznych. Kontaktowe zapalenie skóry [0113] Alergiczne, kontaktowe zapalenie skóry jest definiowane jako reakcja immunologiczna, na antygen, który pozostaje w kontakcie ze skórą, w której pośredniczą limfocyty T. Uważa się, że w rozpoczęcie zapalenia skóry zaangażowana jest populacja CLA+ limfocytów T, ponieważ zależne od alergenu odpowiedzi limfocytów T w większości ograniczają się do populacji komórek CLA+ (Patrz, Santamaria-Babi, L.F., i wsp., J Exp Med 181:193, (199)). Ostatnie dane zakładają, że jedynie limfocyty T pamięci (CD4RO+) CD4+ CLA+ i nie CD8+ proliferują i wytwarzają cytokiny zarówno typu-1 (IFN-γ) jak typu-2 (IL-) w odpowiedzi na nikiel, powszechny alergen nadwrażliwości kontaktowej. Ponadto, liczba komórek wytwarzających CLA w połączeniu z CD4, CD4RO (pamięć) lub CD69 jest zwiększona po pobudzeniu niklem i komórki wytwarzają receptory chemokin CXCR3, CCR4, CCR lecz nie CCR6. Patrz, Moed H., i wsp., Br J Dermatol 1:32, (04). [0114] W modelach zwierzęcych pokazano, że alergiczne, kontaktowe zapalenie skóry jest zależne od limfocytów T oraz, że reagujące alergicznie limfocyty T migrują do miejsca podania alergenu. Patrz ogólnie: Engeman T.M., i wsp., J Immunol 164:7, (00); Ferguson T.A. & Kupper T.S. J Immunol :1172, (1993) oraz Gorbachev A.V. & Fairchild R.L. Crit Rev Immunol. 21:41(01). Atopowe zapalenie skóry [011] Atopowe zapalenie skóry (AD) jest przewlekłą, nawracającą chorobą zapalną skóry z dramatycznym wzrostem zachorowalności w ciągu ostatnich dekad. Klinicznie, AD charakteryzuje się mocnym świądem, często z otarciem naskórka, wykwitami i grudkami, przewlekle nawracającymi. Diagnoza AD w większości opiera się na istotnych i mniej znaczących ustaleniach klinicznych. Patrz, Hanifin J.M., Arch Dermatol 13:11 (1999). Obraz histopatologiczy wykazuje obrzęk międzykomórkowy naskórka, hiperparakeratozę oraz zogniskowaną parakeratozę w ostrych zmianach chorobowych, podczas gdy wyraźny rozrost naskórka z hiperparakeratozą i parakeratozą, akantoza/hipergranuloza i limfocytowa infiltracja przynaczyniowa skóry właściwej oraz obfitość komórek tucznych są oznakami przewlekłych zmianach chorobowych. [0116] Limfocyty T odgrywają główną rolę w zapoczątkowaniu miejscowych odpowiedzi odpornościowych w tkankach i dowody sugerują, że w szczególności limfocyty T infiltrujące skórę mogą odgrywać kluczową rolę w zapoczątkowaniu i podtrzymywaniu zaburzonych odpowiedzi odpornościowych w skórze. W przybliżeniu 90% infiltrujących limfocytów T w skórnych miejscach zapalnych wyrażają związane ze skórnymi limfocytami Ag (CLA+), które wiąże się z selektyną E, indukowalną cząsteczką adhezji na śródbłonku (praca poglądowa Santamaria-Babi L.F., i wsp., Eur J Dermatol 14:13, (04)). Udokumentowano znaczący wzrost populacji CLA+ limfocytów T wśród pacjentów z AD, w porównaniu z osobnikami grupy kontrolnej (Patrz, Teraki Y., i wsp., Br J Dermatol 143:373 (00), podczas gdy inni zademonstrowali, ze populacja CLA+ limfocytów T pamięci od pacjentów z AD preferencyjnie odpowiada na ekstrakt alergenu w porównaniu z populacją CLA- (patrz, Santamaria-Babi, L.F., i wsp., J Exp Med. 181: 193, (199)). U ludzi, łączono patogenezę atopowych zaburzeń skóry ze wzrostem populacji CLA+ limfocytów T, które wyrażają podwyższone poziomy 23

25 cytokin typu Th-2, jak IL- i IL-13. Patrz Akdis M., i wsp., Eur J Immunol :333 (00) oraz Hamid Q., i wsp., J Allergy Clin Immunol 98: 22 (1996). [0117] Myszy NC/Nga spontanicznie rozwijają zmiany chorobowe typu AD, które w wielu aspektach przypominają ludzkie AD, włączając przebieg kliniczny i objawy, histopatologię i immunopatologię, kiedy są hodowane w nieokreślonych, wolnych od patogenu (nie-spf) warunkach, w około 6-8 tygodniu życia. Dla kontrastu, myszy NC/Nga utrzymywane w warunkach SPF nie rozwijają zmian chorobowych. Jednakże, początek spontanicznych zmian chorobowych i drapanie, można zsynchronizować u myszy NC/Nga hodowanych w warunkach SPF przez cotygodniowe, śródskórne iniekcje surowego antygenu drobinek kurzu. Patrz, Matsuoka H., i wsp., Allergy 8:139 (03). Zatem, rozwój AD w NC/Nga jest przydatnym modelem do badania nowych terapeutyków do leczenia AD. [0118] Dodatkowo do modelu NC/Nga spontanicznego AD, uczulanie myszy przez podanie na skórę OVA może także być stosowane jako model indukowania zależnego od antygenu gęstnienia naskórka i skóry, z infiltracją skóry przez komórki jednojądrzaste uczulonych myszy. Zachodzi to zazwyczaj w tym samym czasie co podniesienie poziomów całkowitych i swoistych IgE w surowicy, chociaż w modelu tym normalnie nie pojawia się dysfunkcja bariery skóry lub świąd. Patrz, Spergel J.M., i wsp., J Clin Invest, 1:1614, (1998). Protokół ten można modyfikować w celu zaindukowania zaburzenia bariery skóry i świądu, przez uczulanie myszy transgenicznych DO11. OVA TCR podaniem OVA. Zwiększenie liczby limfocytów T swoistych wobec antygenu, które mogłyby rozpoznać antygen uczulający może zwiększyć poziom zapalny skóry do zaindukowania drapania oraz lichenifikacji/łuszczenia się. Zapalenie stawów [0119] Zapalenie stawów, włączając chorobę zwyrodnieniową stawów, reumatoidalne zapalenie stawów, artretyzm po przebytym urazie, i podobne, są powszechnymi stanami zapalnymi, które będą czerpały korzyść z terapeutycznego użycia przeciwciał o własnościach przeciwzapalnych peptydów wiążących. Przykładowo, reumatoidalne zapalenie stawów (RA) jest chorobą układową, która dotyka cały organizm i jest jedną z najbardziej powszechnych form zapalenia stawów. Charakteryzuje się zapaleniem błony wyściełającej staw, co wywołuje ból, sztywność, ciepło, rumień i obrzęk. Komórki zapalne uwalniają enzymy, które mogą trawić kość i tkankę chrzęstną. W wyniku reumatoidalnego zapalenia stawów, objęta stanem zapalnym wyściółka stawu, błona maziowa, może wnikać i niszczyć kość i tkankę chrzęstną prowadząc, oprócz innych efektów fizjologicznych, do osłabienia stawu i ostrego bólu. Objęty chorobą staw może utracić swój kształt i ułożenie, co prowadzi do bólu i utraty zdolności ruchowych. [01] Reumatoidalne zapalenie stawów (RA) jest chorobą autoimmunologiczną, charakteryzującą się w szczególności stanem zapalnym i następującym uszkodzeniem tkanki, prowadzącym do ciężkiej niepełnosprawności i zwiększonej śmiertelności. W reumatoidalnych stawach wytwarzane są miejscowo różnorodne cytokiny. Szereg badań pokazał, że ważną rolę w mechanizmach zaangażowanych w zapalenie błony maziowej i postępujące niszczenie stawu odgrywają dwie prototypowe cytokiny zapalne, IL-1 i TNFalfa. Rzeczywiście, podanie inhibitorów TNF-alfa i IL-1 pacjentom z RA prowadziło do dramatycznego polepszenia klinicznych i biologicznych objawów zapalnych i redukcji, w obrazie radiologicznym, objawów nadżerek kości i zniszczenia tkanki chrzęstnej. Jednakże, pomimo tych zachęcających wyników, znaczący odsetek pacjentów nie odpowiedział na te czynniki, co sugeruje, że także inne czynniki pośredniczą w patofizjologii zapalenia stawów (Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2):13-149, 02). [0121] W dziedzinie, znanych jest kilka modeli zwierzęcych reumatoidalnego zapalenia stawów. Przykładowo, w modelu zapalenia stawów indukowanego kolagenem (CIA), myszy rozwijają przewlekłe zapalne zapalenie stawów, które bardzo przypomina ludzkie reumatoidalne zapalenie stawów. Ponieważ CIA charakteryzuje się podobnymi cechami immunologicznymi i patologicznymi do RA, tworzy idealny model do poszukiwania potencjalnych ludzkich związków przeciwzapalnych. Model CIA jest dobrze poznanym 24

26 modelem mysim, którego wystąpienie zależy zarówno od odpowiedzi immunologicznej jak odpowiedzi zapalnej. Odpowiedź immunologiczna obejmuje oddziaływanie limfocytów B i populacji CD4+ limfocytów T i odpowiedzi na kolagen, który jest podany jako antygen, i prowadzi do wytworzenia przeciwciała skierowanego przeciw kolagenowi. Faza zapalna jest wynikiem tkankowych odpowiedzi czynników pośredniczących w stanie zapalnym, a w konsekwencji niektórych z nich, przeciwciała reagują krzyżowo z natywnym kolagenem myszy i aktywują kaskadę układu dopełniacza. Zaletą stosowania modelu CIA jest ta, że znane są podstawowe mechanizmy patogenezy. Zidentyfikowano odpowiedni epitop limfocytów T i B na kolagenie typu II i określono różne parametry immunologiczne (np., nadwrażliwość opóźnionego typu i przeciwciało skierowane przeciw kolagenowi) i zapalne (np., cytokiny, chemokiny i enzymy degradujące macierz) związane z autoimmunologicznym zapaleniem stawów, i mogą być one użyte do oceny skuteczności związku testowanego w modelu CIA (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:7-, 1999; Williams i wsp., Immunol. 89: , 1992; Myers i wsp., Life Sci. 61: , 1997 oraz Wang i wsp., Immunol. 92:89-99, 199). [0122] Podawanie przeciwciał anty-il-21 myszom modelu CIA używane jest do oceny stosowania przeciwciał anty-il-21 w celu łagodzenia objawów i zmiany przebiegu choroby. Nieswoiste zapalenie jelit (IBD) [0123] W Stanach Zjednoczonych w przybliżeniu ludzi cierpi z powodu nieswoistego zapalenia jelit (IBD), które może dotyczyć okrężnicy i odbytnicy (wrzodziejące zapalenie okrężnicy) lub obu, jelita cienkiego i grubego (choroba Crohna). Patogeneza tych chorób jest niejasna, lecz wiążą się one z przewlekłym stanem zapalnym dotkniętych tkanek. Wrzodziejące zapalenie okrężnicy (UC) jest chorobą zapalną jelita grubego, powszechnie nazywanego okrężnicą, charakteryzującą się zapaleniem i owrzodzeniem błony śluzowej lub najbardziej wewnętrznej wyściółki okrężnicy. Zapalenie to sprawia, że okrężnica często się opróżnia co prowadzi do biegunki. Objawy obejmują luźny stolec i towarzyszące skurcze brzuszne, gorączkę i utratę masy ciała. Chociaż dokładna przyczyna UC jest nieznana, ostatnie badanie sugeruje, że naturalna obrona organizmu skierowana jest wobec białek znajdujących się w organizmie, które organizm traktuje jako obce ( reakcja autoimmunologiczna ). Przypuszczalnie dzieje się tak dlatego, że są one podobne do białek bakteryjnych w jelicie, i mogą pobudzać lub stymulować proces zapalny, który zaczyna niszczyć wyściółkę okrężnicy. Ponieważ wyściółka okrężnicy jest zniszczona, tworzą się wrzody uwalniające śluz, ropę i krew. Choroba zazwyczaj rozpoczyna się w obszarze odbytniczym i może w końcu rozwinąć się w całym jelicie grubym. Nawracające epizody stanu zapalnego prowadzą do gęstnienia ściany jelita i odbytu z powstawaniem tkanki bliznowatej. W ostrych stanach choroby może pojawić się śmierć tkanki okrężnicy i zakażenie uogólnione (posocznica). Objawy wrzodziejącego zapalenia jelita grubego różnią się intensywnością, a ich początek może być stopniowy lub nagły. Ataki mogą być wywoływane wieloma czynnikami, w tym zakażeniami układu oddechowego lub stresem. [0124] Chociaż obecnie nie ma dostępnego leku na UC, leczenie skupia się na hamowaniu nieprawidłowego procesu zapalnego w wyściółce okrężnicy. Leczenie obejmuje immunosupresanty kortykosteroidowe (np. azatiopryna, merkaptopuryna, i metotreksatem) oraz amino salicylany, dostępne do leczenia choroby. Jednakże długoterminowe stosowanie immunosupresantów, takich jak kortykosteroidy i azatiopryna, mogą wywoływać poważne działania niepożądane, obejmujące rzednięcie kości, zaćmy, zakażenie oraz działanie na wątrobę i szpik kostny. U pacjentów, u których obecne terapie nie są skuteczne opcją pozostaje interwencja chirurgiczna. Operacja prowadzi do usunięcie całej okrężnicy i odbytu. [012] Istnieje kilka modeli zwierzęcych, które częściowo naśladują przewlekłe wrzodziejące zapalenie jelita grubego. Najpowszechniej stosowanym modelem jest model zapalenia jelita grubego indukowany kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym/etanolem (TNBS), który indukuje przewlekłe zapalenie i owrzodzenie w okrężnicy. TNBS wprowadzony do okrężnicy wrażliwej myszy przez wkraplanie wewnątrzodbytnicze 2

27 indukuje komórkową odpowiedź odpornościową z limfocytami T w błonie śluzowej okrężnicy, prowadzącą w tym przypadku do ciężkiego zapalenia błony śluzowej, charakteryzującego się gęstą infiltracją limfocytów T i makrofagów przez całą ścianę jelita grubego. Co więcej, temu histopatologicznemu obrazowi towarzyszy obraz kliniczny postępującej utraty masy ciała (chudnięcie), biegunka krwawa, wypadanie odbytu oraz gęstnienie ściany jelita grubego (Neurath i wsp. Intern. Rev. Immunol. 19:1-62, 00). [0126] W innym modelu zapalenia jelita grubego wykorzystywany jest siarczan dekstranu sodowego (DSS), który indukuje ostre zapalenie jelita grubego manifestujące się biegunką krwawą, utratą masy ciała, skracaniem okrężnicy oraz owrzodzeniem błony śluzowej z infiltracją neutrofili. Wrzodziejące zapalenie jelita grubego indukowane DSS, histologicznie charakteryzuje się infiltracją komórek biorących udział w procesie zapalnym do blaszki właściwej błony śluzowej z hiperplazją limfatyczną, uszkodzeniem krypt oraz owrzodzeniem nabłonka. Uważa się, że zmiany te rozwijają się ze względu na toksyczne działanie DSS na nabłonek i fagocytozę komórek blaszki właściwej oraz wytwarzanie TNF-alfa i IFN-gamma. Pomimo powszechnego użycia, kilka kwestii dotyczących mechanizmów DSS w odniesieniu do choroby u ludzi pozostaje nierozwiązanych. Model z DSS uważany jest za model niezależny od limfocytów T, ponieważ jest obserwowany u zwierząt pozbawionych limfocytów T, takich jak myszy SCID. [0127] Podawanie przeciwciał anty-il-21 modelom z TNBS, DSS lub przeniesionym CD4 można użyć do oceny stosowania antagonistów anty-il-21 w celu łagodzenia objawów i zmiany przebiegu choroby żołądkowo-jelitowej. IL-21 może odgrywać rolę w odpowiedzi zapalnej w zapaleniu jelita grubego, i neutralizacja aktywności IL-21 przez podanie antagonistów IL-21 jest potencjalnym podejściem terapeutycznym w IBD. Łuszczyca [0128] Łuszczyca jest przewlekłym schorzeniem skóry, które dotyczy ponad siedmiu milionów Amerykanów. Łuszczyca pojawia się, kiedy nowe komórki skóry rosną nieprawidłowo, co powoduje rozpalenie, opuchnięcie i łuskowate plamy na skórze, gdzie stara skóra nie jest wystarczająco szybko usuwana. Placek łuszczycy, najczęstsza forma, charakteryzuje się rozpalonymi plamami na skórze ( zmiany chorobowe ) pokrytymi srebrno-białymi łuskami. Łuszczyca może być ograniczona do kilku placków lub dotyczyć mniej lub bardziej rozległych obszarów skóry, występujących najczęściej na skórze głowy, kolanach, łokciach tułowiu. Chociaż jest bardzo widoczna, łuszczyca nie jest chorobą zakaźną. Patogeneza tej choroby dotyczy przewlekłego stanu zapalnego dotkniętych tkanek. Przeciwciała anty-il-21 według niniejszego wynalazku, mogą służyć jako wartościowy lek w redukowaniu zapalenia i skutków patologicznych w łuszczycy, innych zapalnych chorobach skóry i alergiach błon śluzowych oraz chorobach pokrewnych. [0129] Łuszczyca jest zaburzeniem zapalnym skóry z limfocytami T, która może powodować istotny dyskomfort. Jest chorobą dla której nie ma leku i dotyczy ludzi w każdym wieku. Łuszczyca dotyczy w przybliżeniu dwóch procent populacji w Europie i Ameryce Północnej. Chociaż osobnicy z łagodną formą łuszczycy mogą często kontrolować swoją chorobę przez domiejscowe podawanie środków, ponad milion pacjentów na świecie wymaga terapii promieniowaniem ultrafioletowym lub terapii z immunosupresją. Niestety, niedogodności i ryzyko jakie niesie promieniowanie ultrafioletowe oraz toksyczność wielu terapii limituje ich długoterminowe stosowanie. Ponadto pacjenci zazwyczaj mają nawroty łuszczycy, a w niektórych przypadkach nawroty te pojawiają się niedługo po zaprzestaniu terapii immunosupresyjnej. Przeciwciała anty-il-21 można testować stosując opracowany ostatnio model łuszczycy oparty na przeniesieniu CD4+CD4RB (Davenport i wsp., Internat. Immunopharmacol., 2:63-672, 02). [01] Dodatkowo do innych opisanych tu modeli choroby, aktywność przeciwciał anty-il-21 wobec tkanki zapalnej pochodzącej z ludzkich zmian chorobowych łuszczycy można badać in vivo stosując mysi model SCID (ang. severe combined immune deficient). Opracowano kilka mysich modeli, w których do myszy z niedoborem odporności wprowadzono komórki ludzkie (wspólnie określane jako modele ksenogeniczne); 26

28 patrz, przykładowo, Cattan AR, Douglas E, Leuk. Res. 18:13-22, 1994 oraz Flavell, DJ, Hematological Oncology 14:67-82, W ksenogenicznym modelu in vivo łuszczycy, ludzka tkanka łuszczycowa została wszczepiona do mysiego modelu SCID i poddawana ekspozycji na odpowiedniego antagonistę. Ponadto, inne zwierzęce modele łuszczycy w dziedzinie można użyć do oceny stosowania antagonistów IL-21, takie jak model mysi AGR129 ze wszczepioną ludzką tkanką łuszczycowa, poddawany ekspozycji na odpowiedniego antagonistę (np., patrz, Boyman, O. i wsp., J. Exp. Med. Publikacja dostępna on-line #031482, 04). Podobnie, tkanki lub komórki pochodzące z ludzkiego zapalenia jelita grubego, IBD, zapalenia stawów lub innych zapalnych zmian chorobowych można stosować w modelu SCID, w celu oszacowania własności przeciwzapalnych opisanych tu przeciwciał anty-il-21. [0131] Skuteczność leczenia jest mierzona i oceniana statystycznie, jako wzrost efektu przeciwzapalnego w leczonej populacji w czasie, przy użyciu metod znanych w dziedzinie. Niektóre z przykładowych metod obejmują między innymi pomiar, przykładowo, w modelu łuszczycy, grubienia naskórka, liczenie komórek biorących udział w procesie zapalnym w górnej warstwie skóry właściwej oraz różnych poziomów parakeratozy. Metody takie są znane w dziedzinie i opisane; przykładowo, patrz Zeigler, M. i wsp. Lab Invest 81:123, 01; Zollner, T. M. i wsp. J. Clin. Invest. 9:671, 02; Yamanaka, N. i wsp. Microbio.1 Immunol. 4:07, 01; Raychaudhuri, S. P. i wsp. Br. J. Dermatol. 144:931, 01; Boehncke, W. H i wsp. Arch. Dermatol. Res. 291:4, 1999; Boehncke, W. H i wsp.. J. Invest. Dermatol. 116:96, 01; Nickoloff, B. J. i wsp. Am. J. Pathol. 146:80, 199; Boehncke, W. H i wsp. J. Cutan. Pathol. 24:1, 1997; Sugai, J., M. i wsp. J. Demiatol. Sci. 17:8, 1998 oraz Villadsen L.S. i wsp. J. Clin. Invest. 112:171, 03. Zapalenie może być także monitorowane w czasie przy użyciu dobrze znanych metod, takich jak cytometria przepływowa (lub PCR), do ilościowej oceny liczby komórek zapalnych lub zmienionych chorobowo obecnych w próbce, pomiar parametrów (utrata masy ciała, biegunka, krwawienie z odbytu, długość okrężnicy) IBD, pomiar choroby łapy i pomiary zapalenia w modelu CIA RA. Toczeń rumieniowaty układowy [0132] Toczeń rumieniowaty układowy (SLE) jest zaburzeniem dotyczącym kompleksu immunologicznego charakteryzującym się przewlekłą produkcją przeciwciała IgG, skierowanego na powszechnie występujące własne antygeny (np. anty-dsdna). Efekty SLE są bardziej układowe niż zlokalizowane w konkretnym narządzie. Wiele loci chromosomalnych jest łączonych z tą chorobą i mogą one dotyczyć różnych aspektów choroby, takich jak przeciwciał anty-dsdna i kłębuszkowego zapalenia nerek. Wykazano, że populacja CD4+ limfocytów T odgrywa aktywną rolę w mysich modelach SLE (Horwitz, Lupus :319-3, 01; Yellin and Thienel, Curr. Rheumatol. Rep., 2:24-37, 00). Rola populacji CD8+ limfocytów T nie jest jasno określona, lecz istnieją dowody sugerujące, że u pacjentów z toczniem upośledzona jest supresorowa funkcja populacji CD8+ limfocytów T (Filaci i wsp., J. Immunol., 166: , 01; Sakane i wsp., J. Immunol., 137: , 1986). [0133] Pokazano, że IL-21 moduluje odpowiedzi przeciwciał przez bezpośrednie działanie na limfocyty B (Mehta i wsp., J. Immunol., 170: , 03; Ozaki i wsp., Science, 298: , 02; Suto i wsp., Blood, 0:46-473, 02). Przykładowo, Ozaki i wsp., (J. Immunol. 173:361, 04) zademonstrował, że w modelu SLE u myszy BXSB-Yaa, istnieje podwyższony poziom IL-21 w surowicy. Ponadto, ze względu na to, że IL-21 wzmacnia aktywność populacji CD8 + limfocytów T, podawanie przeciwciał anty-il-21 mogłoby dostarczać silniejszą funkcję supresorową limfocytów T u pacjentów z toczniem, gdzie funkcja ta jest upośledzona. [0134] Przeciwciała anty-il-21 można podawać w połączeniu z innymi środkami stosowanymi już w zaburzeniach autoimmunologicznych, włączając modulatory immunologiczne, takie jakie jak IFNγ, NOVANTRONE, ENBREL, REMICADE, LEUKINE i IL-2. Oszacowanie optymalnego poziomu dawki i schematu podawania przeciwciał anty-il-21 przeprowadzane jest różnymi sposobami, włączając badania 27

29 dotyczące farmakokinetyki i farmakodynamiki przeciwciał anty-il-21; określenia skutecznych dawek w modelach zwierzęcych oraz oceny toksyczności przeciwciał anty-il-21. Bezpośrednie pomiary farmakokinetyczne wykonywane na zwierzętach naczelnych oraz próby kliniczne można następnie stosować do przewidywania teoretycznych dawek u pacjentów, którzy otrzymali osocze z poziomami przeciwciała anty-il-21, o wystarczającej ilości i czasie trwania dla osiągnięcia biologicznej odpowiedzi u pacjentów. [013] Wynalazek jest dalej zilustrowany następującymi przykładami, które go nie ograniczają. 1 2 PRZYKŁADY Przykład 1 Wytwarzanie białek IL-21 [0136] Białko IL-21 wytwarzano jak opisano w publikacji patentu USA nr US i WO 04/0168. W skrócie, sekwencję nukleotydową IL-21 optymalizowano i wprowadzano do wektora ekspresyjnego E. coli, który zdeponowano w ATCC pod numerem dostępu PTA-483. Wektor wprowadzono do E. coli szczepu W31 (ATCC nr dostępu 2732). [0137] Komórki gospodarza poddano fermentacji przez hodowanie szczepów E. coli wyrażających IL-21 w odpowiedniej pożywce, w kolbach do wytrząsania hodowli, gdzie odpowiednia pożywka może być uzupełniona węglowodanami, takimi jak fruktoza, glukoza, galaktoza, laktoza i glicerol. Do hodowli można dodać izopropylotiogalaktopiranozyd (IPTG) do stężenia 0,1 do 2,0 mm. [0138] Po fermentacji, komórki zbierano przez wirowanie, ponownie zawieszano w buforze do homogenizacji i homogenizowano. Po zebraniu homogenatu, zawieszano go w roztworze zawierającym guanidynę i nadsącz zawierający rozpuszczone IL-21 dekantowano i zatrzymywano. Stężenie IL-21 we frakcji rozpuszczalnej określano za pomocą HPLC odwróconej fazy. Po rozpuszczeniu ciał inkluzyjnych i denaturacji w roztworze guanidyny zawierającym środek redukujący, zredukowane IL-21 było poddawane utlenianiu w kontrolowanym etapie renaturacji. Etap ten wymaga rozcieńczenia w buforze umożliwiającym ponowne fałdowanie białka, zawierającym chlorowodorek argininy, sole oraz system do zmiany utlenienia. [0139] Oczyszczanie białka IL-21 może obejmować oczyszczanie IL-21 przy użyciu chromatografii oddziaływań hydrofobowych. IL-21 można dalej oczyszczać za pomocą wysokosprawnej chromatografii kationowymiennej. Sposoby oczyszczania IL-21 mogą obejmować zatężanie i prowadzenie wymiany buforu z białkiem. Etap ten jest zaplanowany w celu zatężenia eluatu uzyskiwanego z kolumny wysokosprawnej chromatografii kationowymiennej i wymiany na bufor dla preparatu. Pula końcowego eluatu z kolumny jest zatężana w celu zwiększenia stężenia IL-21. Może być pożądane dalsze oczyszczanie IL-21 w celu usunięcia pozostających nieczystości i zanieczyszczeń. Przykładowo, w celu zmniejszenia poziomu endotoksyn można zastosować kolumnę anionowymienną. 3 Przykład 2 Wytwarzanie białek receptorowych IL-21 [01] Receptor IL-21 (określany także jako zalpha11 lub IL-21r), białko heterodimerowe, można wytwarzać jak opisano w publikacji patentu USA nr US [0141] W skrócie, konstruowany jest wektor ekspresyjny umożliwiający wydzielanie heterodimeru ludzkiego hzalpha11/hil2rgamma. W konstrukcie tym, domena zewnątrzkomórkowa hzalpha11 jest w fuzji z domeną CH1 z IgG γ1. Domena CH1 jest sklonowana w ssaczym wektorze ekspresyjnym. Domena CL1 ludzkiego łańcucha lekkiego κ jest sklonowana w ssaczym wektorze ekspresyjnym. [0142] Tworzony jest konstrukt posiadający ludzkie zalpha11 w fuzji z CH1, i wektor jest sekwencjonowany dla potwierdzenia, że fuzja jest prawidłowa. Można także skonstruować osobny konstrukt posiadający hil2rgamma w fuzji z CL1. Uzyskany wektor jest sekwencjonowany dla potwierdzenia, że fuzja ludzkiego IL-2Rgamma/ CL1 jest prawidłowa. 28

30 1 2 3 [0143] Fuzje ludzkiego zalpha11 (IL-21r) i ludzkiego receptora IL-2R gamma są wyrażane jednocześnie. Ssacze komórki gospodarza są jednocześnie transfekowane każdym wektorem ekspresyjnym metodą znaną specjalistom w dziedzinie. Stransfekowane komórki są selekcjonowane przez dni w metotreksacie (MTX) i G418 (Gibco/BRL) przez dni. Uzyskana pula transfektantów jest ponownie selekcjonowana w MTX i G418 przez dni. [0144] Uzyskana za pomocą podwójnej selekcji pula komórek jest używana do wytworzenia białka. Fabryki (Nunc, Denmark) tej puli są stosowane do wytworzenia kondycjonowanej pożywki. Wolne od surowicy, kondycjonowane pożywki są przepuszczane przez kolumnę z białkiem A i eluowane we frakcjach. Frakcje, w których wykryto najwyższe stężenie pulowano i dializowano (stała odcięcia kd MW) wobec PBS. W końcu, dializowany materiał jest poddawany analizie aminokwasów (AAA). Oczyszczony rozpuszczalny ludzki receptor zalpha11/receptor IL-2Rgamma można stosować do oszacowania jego zdolności do współzawodniczenia o wiązanie ludzkiego liganda zalpha11 w teście proliferacji BaF3. [014] B. Wytworzono zewnątrzkomórkową domenę ludzkiego zalpha11 w fuzji z Fc9 (region Fc ludzkiej gamma1 (numeracja wg. Kabata ; Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health and Human Serv., Bethesa, MD, 1991)) ze znacznikiem GluGlu (Grussenmeyer i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:792-4, 198)) na końcu karboksylowym, za pomocą zachodzącego PCR. cdna wprowadzono do pzmp31 (opisane w zgłoszeniu patentu USA, US03/023414; wektor hybrydowy posiadający enhancer cytomegalowirusa i promotor wirusa mięsaka mieloproliferacyjnego) przez rekombinację w drożdżach. Zewnątrzkomórkową domenę ludzkiego receptora IL2 powszechnego łańcucha gamma poddano fuzji z Fc9 ze znacznikiem 6XHis na końcu karboksylowym Fc9. Konstrukt wprowadzono do pzmp21z za pomocą rekombinacji w drożdżach przy użyciu tej samej metody jak opisano dla zalpha11 Fc9CEE. Uzyskane konstrukty zsekwencjonowano dla potwierdzenia, że wstawki były prawidłowe. Oboma plazmidami transfekowano zawiesinę komórek CHO adaptowanych bez surowicy przez elektroporację i selekcjonowano w pożywkach PFCHO wolnych od białka (BioWhittaker) bez hipoksantyny i tymidyny, z dodaną w stężeniu 0 ng/ml neomycyną. Komórki te selekcjonowano następnie w tej samej pożywce, uzupełnionej wzrastającymi stężeniami metotreksatu, dopóki komórki były oporne na 1 um metotreksat i 0 ng/ml zeomycyny. Komórki badano pod kątem wytwarzania heterodimerowego receptora IL21 za pomocą analizy typu western blot analysis, z wykorzystaniem obecność zarówno znacznika EE jak His. [0146] Białko zcytor26f2 (zewnątrzkomórkowa domena powszechnego łańcucha gamma ludzkiego receptora IL2 poddana fuzji z Fc9 ze znacznikiem 6XHis) jest tak zaprojektowane, że do oczyszczania dostępne są trzy znaczniki (GluGlu, His i Fc), z których dwa są wykorzystywane do lepszego rozróżnienia formy heterodimeru od zanieczyszczeń dwoma homodimerami. Wszystkie cząsteczki zawierające domenę Fc (zanieczyszczenia homodimerowe i docelowy heterodimer) wychwytywano i oczyszczano ze składników komórek gospodarza oraz pokrewnych produktów pożywek. Pule zawierające wszystkie rodzaje cząsteczek zatężano i wstrzykiwano na kolumnę wykluczania przez wielkość (Superdex 0) w celu usunięcia agregatów. Pulę SEC zawierająca wszystkie trzy rodzaje cząsteczek (dwa homodimery i jeden heterodimer) poddawano chromatografii metalopowinowactwa (IMAC) przy użyciu Ni jako jonu przeciwstawnego, przy silnie dyskryminującym ładunku i warunkach elucji. Pula po elucji z IMAC zawierała wysoce oczyszczony heterodimer, zawierający jedynie resztkowe ilości zanieczyszczeń homodimerami. Bufor stosowany w pulowania w IMAC wymieniano na bufor dla preparatu stosując chromatografię wykluczania (Superdex 0), która również usuwa dowolne resztkowe produkty agregacji. Heterodimerowe białko IL-21 stosowano w testach porównujących aktywność neutralizującą przeciwciała. 29

31 Przykład 3 Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych wobec IL-21 [0147] Szczurze przeciwciała monoklonalne są przygotowywane przez immunizację 4 samic szczurzych Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), oczyszczonym zrekombinowanym IL-21. Każdy szczur dostaje początkową iniekcję dootrzewnową (IP) z 2 µg oczyszczonego zrekombinowanego białka w kompletnym adiuwancie Freunda (Pierce, Rockford, IL), a następnie wstrzyknięte IP dawki przypominające z µg oczyszczonego zrekombinowanego białka w niekompletnym adiuwancie Freunda, co dwa tygodnie. Siedem dni po podaniu drugiej dawki przypominającej zwierzęta są skrwawiane i kolekcjonowana jest surowica. [0148] Próbki surowicy szczurzej, swoiste wobec IL-21, są charakteryzowane za pomocą testu ELISA przy użyciu 1 ug/ml oczyszczonego zrekombinowanego białka receptora IL-21, jako swoistego miejsca docelowego przeciwciał. Testy ELISA obejmują przygotowanie antygenu IL-21, opłaszczenie studzienek 96- studzienkowej płytki mikrotitracyjnej antygenem, dodanie badanych surowic szczurzych do studzienek i inkubowanie przez okres czasu pozwalający na związanie przeciwciał z surowic szczurzych z antygenem. Do studzienek dodawane jest drugie przeciwciało wykrywające (które rozpoznaje badane przeciwciała zawarte w surowicy szczura) skoniugowane z wykrywalnym związkiem skoniugownym z wykrywalnym związkiem, takim jak substrat dla enzymu (np., peroksydaza chrzanu lub alkaliczna fosfataza). Specjalista w dziedzinie posiada odpowiednią wiedzę dotyczącą parametrów, które można modyfikować w celu zwiększenia wykrywanego sygnału, jak również innych odmian testów ELISA znanych w dziedzinie. W celu dalszego omówienia testów ELISA patrz, np., Ausubel i wsp., red., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, tom 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at [0149] Splenocyty są zbierane od pojedynczego szczura z wysokim mianem i poddawane fuzji z komórkami szpiczaka SP2/0 (mysimi), przy użyciu PEG 0 w procedurze pojedynczej fuzji (stosunek fuzji splenocytów do komórek szpiczaka 4:1, Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow i D.Lane, Cold Spring Harbor Press). Po 9 dniach wzrostu po fuzji, pule hybrydoma wytwarzających swoiste przeciwciała identyfikowane są za pomocą testu ELISA, przy użyciu 00 ng/ml zrekombinowanego białka IL-21, jako specyficznego miejsca docelowego dla przeciwciał. Pule pozytywnych hybrydoma są dalej analizowane pod kątem zdolności do blokowania aktywności proliferacyjnych komórki ( test neutralizacji ) przez oczyszczone zrekombinowane białko IL-21 wobec komórek BaF3 wyrażających sekwencję receptora IL-21. [0] Pule hybrydoma dające pozytywne wyniki w teście neutralizacji są klonowane co najmniej dwukrotnie za pomocą ograniczonego rozcieńczenia. [011] Przeciwciała monoklonalne produkowane przez klony są charakteryzowane na liczne sposoby, włączając wiązanie (tj., określenie czy każde przeciwciało może hamować wiązanie dowolnego innego wiązania), względne powinowactwo i neutralizację. Monoklonalne przeciwciała oczyszczone z pożywek hodowli tkankowych są charakteryzowane pod kątem ich zdolności do blokowania aktywności proliferacyjnych komórki ( test neutralizacji ) przez oczyszczone zrekombinowane białko IL-21 wobec komórek BaF3 wyrażających sekwencje receptora IL-21. W ten sposób identyfikowane są neutralizujące przeciwciała monoklonalne. [012] Z pul hybrydoma pobierano próbki i poddano badaniu przy użyciu testu neutralizacji i testu bezpośredniego miareczkowania ELISA. W teście tym, próbka była miareczkowana przy użyciu czterokrotnych seryjnych rozcieńczeń w celu zaobserwowania, który klon może utrzymywać najwyższe odczyty OD. Stosując wyniki zarówno testu neutralizacji jak miareczkowania, do dalszej pracy wybrano specyficzne klony z każdej wyjściowej oryginalnej studzienki. Inny test przesiewowy neutralizacji prowadzono dla wszystkich tych próbek w tym samym teście i w tym przypadku liczne linie komórkowe zostały zawężone do czterech głównych. Te zostały poddane dodatkowej rundzie klonowania w celu zapewnienia homogenności hodowli i przeszukane bezpośrednim testem ELISA. Po jednym dodatkowym

32 1 teście miareczkowania wybrano dwa ostateczne klony IL-21 i oznaczono jako (szczurze anty-mysie IL-21, Nr dostępu ATCC PTA-394) i (szczurze anty-ludzkie IL-21, Nr dostępu ATCC PTA-39). Przeciwciała monoklonalne wytwarzane przez te klony hybrydoma można hodować w pożywce hodowlanej zawierającej 90% pożywki Dulbecco w modyfikacji Iscove'a z 2mM L- glutaminą, 0 µg/ml penicyliny i 0 µg/ml siarczanu streptomycyny oraz % surowicą Fetal Clone I (Hyclone Laboratories). Klony można namnażać wychodząc z hodowli 2x komórek/ml i utrzymywać pomiędzy 1x a x komórek/ml w 37 C i -6% CO. Komórki można adaptować w warunkach wolnych od surowicy po kolejnych transferach. Komórki, które są zamrożone są przechowywane w 90% surowicy, % DMSO i przechowywane w fazie oparów zamrażarki z ciekłym azotem. Przykład 4 Przeszukiwanie surowicy pod kątem przeciwciał monoklonalnych [013] Aktywność przeciwciał anty-il-21 jest mierzona przy użyciu testu biologicznego opartego na sile komórek. Test biologiczny wykorzystuje linię komórek reporterowych BaF3, która jest wytworzona za pomocą inżynierii genetycznej w celu wyrażania receptora IL-21 (IL-21R) przez stabilną transfekcję IL-21R cdna. Wzrost stransfekowanych komórek IL-21R/BaF3 silnie zależy od ril-21 lub IL-3 i przy ich braku są one niezdolne do proliferacji i przechodzą apoptozę w ciągu 24 godz. W teście biologicznym opartym na komórkach, stransfekowane komórki IL-21R/BaF3 są inkubowane z różnymi stężeniami surowicy zwierającej przeciwciała anty-il-21 przeciwciała, a następnie mierzona jest proliferacja komórek Przykład Charakterystyka przeciwciał Binowanie epitopu [014] Badania binowania epitopu prowadzono z zastosowaniem Biacore 00 (Biacore, Uppsalla Sweden). Metody programowano przy użyciu Method Definition Language (MDL) i przeprowadzano używając oprogramowanie Biacore Control Software, v 1.2. Kozie poliklonalne przeciwciało anty-mysie Fc IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) jest kowalencyjnie immobilizowane na chipie czujnikowym Biacore CM i stosowane do wiązania (wychwytywania) pierwszego przeciwciała monoklonalnego serii testów na chipie. Niezajęte miejsca wiązania Fc na chipie są następnie blokowane przy użyciu fragmentu Fc poliklonalnego IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Następnie, wstrzykiwane jest białko IL-21 i umożliwiane jest jego swoiste wiązanie z wychwyconym pierwszym przeciwciałem monoklonalnym. Urządzenie Biacore wykonuje pomiar masy białka związanego z chipem czujnikowym, zatem wiązanie zarówno pierwszego przeciwciała jak i antygenu IL-21 można weryfikować dla każdego cyklu. Po związaniu pierwszego przeciwciała i antygenu z chipem, przeciwciało monoklonalne serii testów jest wstrzykiwane jako przeciwciało drugie i umożliwiane jest wiązanie z wcześniej związanym antygenem. Jeśli drugie przeciwciało monoklonalne jest zdolne do wiązania z antygenem IL-21 jednocześnie z pierwszym przeciwciałem monoklonalnym, wykrywany jest wzrost masy na powierzchni chipa, lub wiązanie. Jeśli, jednakże, drugie przeciwciało monoklonalne nie jest zdolne do wiązania antygenu IL-21 jednocześnie z pierwszym przeciwciałem monoklonalnym, nie jest wykrywany dodatkowy wzrost masy na powierzchni chipa, lub wiązanie. Każde przeciwciało monoklonalne jest testowane wobec siebie samego, jako kontrola negatywna, w celu określenia poziomu sygnału tła (bez wiązania). Dane są kompilowane przy użyciu oprogramowania BioEvaluation 3.2 RCI, a następnie przenoszone do arkusza Excel do obróbki danych. Western Blotting [01] Zdolność neutralizujących przeciwciał monoklonalnych z klonów do wykrywania zdenaturowanego i zredukowanego/zdenaturowanego IL-21 z dwóch źródeł jest określana przy użyciu układu Western blot. Jako kontrola pozytywna w układzie Western blot stosowane jest królicze przeciwciało poliklonalne, które wykrywa IL

33 1 2 [016] Białko IL-21 jest nanoszone na żele 4-12% NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen, Carlsbad, CA) w buforze do próbek nie redukującym lub redukującym (Invitrogen) wraz ze standardami masy cząsteczkowej (Patrz, Blue; Invitrogen) i przeprowadzana jest elektroforeza. Po elektroforezie, białko jest przenoszone z żelu, bloty nitrocelulozowe są blokowane przez noc i eksponowane na każde przeciwciało. Bloty są następnie przeszukiwane drugorzędowym przeciwciałem skoniugowanym z peroksydazą chrzanu; owcze anty-mysie IgG-HRP (Amersham: Piscataway, NJ) do przeciwciał monoklonalnych oraz ośle anty-królicze Ig-HRP (Amersham) do przeciwciał poliklonalnych. Związane przeciwciało jest wykrywane za pomocą odczynnika chemiluminescencyjnego (Lumi-Lekki Plus Reagent: Roche, Mannheim, Germany) i obrazy blotów są zapisywane w urządzeniu Lumi-Imager (Mannheim-Boehringer). Przykład 6 Mysi model DTH [017] Odpowiedzi DTH są klasycznymi odpowiedziami odpornościowymi inicjowanymi przez populację CD4+ limfocytów T i pośredniczą w nich limfocyty T, neutrofile i makrofagi. Odpowiedź DTH jest dobrym wskaźnikiem odpowiedzi, w której pośredniczy populacja CD4+ limfocytów T. Myszy są immunizowane podskórnie białkiem owoalbuminy kurzej (OVA) w jednym z dwóch adiuwantów, RIBI lub CFA. Faza ta nazywa się fazą uczulania (0-6 dni). Pomiary uszu są przeprowadzane siedem dni później. Po tym czasie myszom wstrzykiwany jest do ucha kontrolny PBS (ucho lewe) lub OVA (ucho prawe). Faza ta nazywa się fazą prowokowania (7-8 dni)). Odpowiedzi odpornościowe wytwarzane wobec OVA indukują zapalenie w uchu, co powoduje grubienie w ciągu 24 godz. tego ucha, któremu podano OVA, lecz nie tego do którego podano PBS. Pomiar jest przeprowadzany za pomocą suwmiarki. [018] Myszy C7BL/6 (n=8/grupę) immunizowano w kark 0 µg owoalbuminy kurzej (OVA) w postaci emulsji z adiuwantem RIBI (Corixa, Seattle, WA) w całkowitej objętości 0 µl. 0,mg/ml owoalbuminy dodawane jest do pojedynczej fiolki z RIBI i wytrząsane intensywnie przez 2 min. do uzyskania emulsji, która jest wstrzykiwana myszom. Siedem dni po immunizacji, myszom podawane są wstrzyknięcia µl PBS w lewe ucho (kontrola) i µg OVA w PBS w prawe ucho, w objętości µl. Grubość ucha wszystkich myszy jest mierzona przed wstrzyknięciem do ucha (pomiar 0). Grubość ucha jest mierzona w 24 godz. po prowokowaniu. Obliczana jest różnica w grubości ucha pomiędzy pomiarem 0 i pomiarem w 24 godz. i odzwierciedla ona stan zapalny ucha. Grupom myszy są podawane przez wstrzyknięcie dootrzewnowo PBS lub różnych stężeń przeciwciała anty-il-21 od dni 0-6 (faza uczulania) lub od 7-8 dni (faza prowokowania). Wstrzyknięcie dnia 7 i 8 jest podawane 2 godz. przed pomiarem grubości ucha w punktach czasowych 0 i 24 godz. Na koniec 24 godz. okresu, po pomiarze grubości ucha, uszy obcinano i umieszczano w formalinie do analizy histologicznej. 3 4 Przykład 7 Mysi model stwardnienia rozsianego [019] W celu sprawdzenia czy anty-il-21 ma wpływ na stwardnienie rozsiane, badana jest zdolność przeciwciał anty-il-21 do hamowania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE), mysiego modelu. Stosowany jest dobrze scharakteryzowany model immunizacji myszy C7BL/6 peptydem 3- mielinowej glikoproteiny oligodendrocytu (MOG). Badanie jest przeprowadzane w celu określenia czy przeciwciało anty-il-21 może opóźniać i/lub hamować wskaźniki choroby w EAE przez hamowanie prezentacji antygenu za pośrednictwem DC lub przez wzmocnienie odpowiedzi populacji CD8 limfocytów T. Brak skutecznych odpowiedzi populacji CD8 limfocytów T w tym modelu zaostrza EAE (Malipiero i wsp., Eur. J. Immunol., 27: , 1997). Opóźnione rozpoczęcie choroby w modelu EAE w sposób zależny od dawki sugeruje, że stosowanie przeciwciała anty-il-21 może być korzystne w MS. [0160] Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) jest mysim modelem MS. W jednym takim modelu, myszy C7BL/6 są immunizowane 0 µg MOG peptydu (MOG3-) lub 0 µg 32

34 1 2 3 zrekombinowanego białka MOG w postaci emulsji z adiuwantem RIBI. Dwa mililitry 0, mg/ml preparatu MOG3- w PBS dodawane są do fiolki z RIBI i wytrząsane intensywnie do uzyskania roztworu emulsji lub przygotowywany jest roztwór w stosunku 1:1 zrekombinowanego MOG w DFA. Karki myszy są golone i 0 µg MOG/RIBI jest wstrzykiwane s.c w karki myszy. Myszy są ważone 2 dni przed i każdego dnia po immunizacji. Następnie myszom jest podawane i.v., dnia 2, 0 µl toksyny krztuśca (PT), w końcowym stężeniu 0 ng/mysz. Myszy są monitorowane codziennie pod kątem wskaźników klinicznych. Grupom myszy jest podawane i.p. 0 µl PBS, 0 µg BSA, µg -0 µg przeciwciała anty-il-21 w objętości 0 µl od dnia 0- lub 3x tygodniowo, przez 3 tygodnie. Masy ciała myszy, wskaźniki kliniczne oraz zapadalność są oceniane i przygotowywane do analizy. Przykład 8 Mysi model zapalenia okrężnicy CD4+CD4RBhi (CD2-) i łuszczycy [0161] Przeniesienie populacji CD4+ CD4RBhi lub CD4+CD2- limfocytów T do syngenicznych myszy SCID powoduje u myszy zapalenie jelita grubego. Jednoczesne przeniesienie limfocytów T regulatorowych (CD4+CD2+ lub CD4+CD4RBlo) hamuje zapalenie jelita grubego. Jeśli po przeniesieniu limfocytów T CD4+CD2- do myszy, myszom zostanie dodatkowo wstrzyknięta gronkowcowa enterotoksyna B (SEB), myszy nie tylko rozwijają zapalenie jelita grubego lecz także łuszczycę. Przeciwciało anty-il-21 jest podawane od dnia 0-21 po przeniesieniu komórek i objawy zapalenia jelita grubego i łuszczycy są monitorowane. Zahamowanie wskaźników łuszczycy lub zapalenia jelita grubego (histologia) wskazuje, że przeciwciało anty-il-21 może hamować te choroby autoimmunologiczne. [0162] Śledziony i pachwinowe węzły chłonne są izolowane z myszy B.D2. Przygotowywane są zawiesiny pojedynczych komórek i komórki są liczone. Stosując system Miltenyi Bead, komórki CD2+ są sortowane na podstawie pozytywnej selekcji. Komórki są barwione CD2-PE (BD Pharmingen) przy rozcieńczeniu 1:0 i inkubowane przez 1 min. Nadmiar przeciwciał jest odpłukiwany i komórki są inkubowane z µl kulek anty-pe/ 6 komórek przez min. Komórki są płukane PBS i przepuszczane przez kolumnę LS (Miltenyi Biotech). Komórki, które przechodzą przez kolumnę (CD2-) są zachowywane do dalszej analizy. Do tych komórek CD2- dodawany jest koktajl wzbogacony w CD4 (Stem Cell technologies) (1:0) i komórki są inkubowane przez 1 min. Komórki są płukane PBS. Do komórek dodawany jest tetramer antybiotynowy w rozcieńczeniu 1: na 1 min., a następnie koloid magnetyczny (60ul/ 6 komórek) na 1 min. (wszystkie ze Stem Cell Technologies). Komórki są przepuszczane przez kolumnę do selekcji negatywnej (0.", Stem Cell Technologies). Komórki, które przechodzą są komórkami CD4+CD2-. Czystość jest analizowana za pomocą cytometrii przepływowej. 0,4x 6 komórek jest wstrzykiwanych i.v. do naiwnych myszy CB-17 SCID w całkowitej objętości 0 µl. Następnego dnia (d1) myszom jest wstrzykiwane i.p. µg SEB. Objawy łuszczycy i zapalenia jelita grubego pojawiają się po 2- tygodniach. Grupom myszy są wstrzykiwane i.p. PBS, 0 µg BSA lub-0 µg IL-21 od dnia 1- lub 3x tygodniowo, przez 3 tygodnie. [0163] Zahamowanie objawów łuszczycy i zapalenia jelita grubego u myszy traktowanych przeciwciałem anty-il-21 wskazuje, że przeciwciała anty-il-21 mogą hamować autoimmunologiczne objawy w tym modelu łuszczycy i zapalenia jelita grubego. 4 Przykład 9 Mysi model nadwrażliwości kontaktowej [0164] Nadwrażliwość kontaktową u myszy można indukować stosując różne alergeny kontaktowe, włączając dinitrofluorobenzen (DNFB) i oksazolon. Myszy są uczulane miejscowo alergenem w nośniku z acetonu i oliwy z oliwek, a następnie prowokowane w uszy alergenem w samej oliwie z oliwek. Zmiana grubości ucha jest miarą odpowiedzi odpornościowej wobec alergenu. Przeciwciała anty-il-21 są podawane albo w fazie uczulania (d0-) lub w czasie fazy prowokowania (d-6). Zahamowanie procesu grubienia ucha IL-21 wskazuje na rolę IL-21 w hamowaniu nadwrażliwości kontaktowej. 33

35 1 2 3 [016] Myszy C7B1/6 są malowane na karku 0,% DNFB w acetonie: oliwie z oliwek (4:1) lub samym acetonem:oliwą z oliwek w dniu d0. Dnia d, przeprowadzany jest pomiar grubości uszu myszy za pomocą suwmiarki i myszy są prowokowane w uszy samą oliwą z oliwek (kontrola) lub 0,2% DNFB w oliwie z oliwek, przez nakrapianie 2 µl roztworu na ucho. Pomiar zmiany grubości ucha jest przeprowadzany dnia d6 i stan zapalny jest określany jako zmiana grubości ucha pomiędzy dniem d i d6. Grupom myszy są podawane przez wstrzyknięcie i.p. PBS lub -0 µg przeciwciał anty-il-21 w dniach 0- lub dniach -6. [0166] Zahamowanie grubienia uszu przez przeciwciała anty-il-21 pokazuje, że przeciwciała anty-il-21 mogą być przydatne w hamowaniu nadwrażliwości kontaktowej. [0167] Splenocyty są zbierane od dwóch myszy Balb/c z najwyższym mianem, pulowane i poddawane fuzji z komórkami szpiczaka myszy P3-X63-Ag8.63 przy użyciu PEG 1 w procedurze pojedynczej fuzji (stosunek fuzji splenocytów do komórek szpiczaka 2:1, Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow i D. Lane, Cold Spring Harbor Press). Po 9 dniach wzrostu po fuzji identyfikowane są pule hybrydoma wytwarzające swoiste przeciwciała, za pomocą bezpośredniego i wychwytującego testu ELISA, przy użyciu zrekombinowanego białka IL-21, bez znacznika i ludzkiego IgG Fc ze znacznikiem, jako swoistego miejsca docelowego. Pule pozytywnych hybrydoma są dalej analizowane pod kątem zdolności do blokowania aktywności proliferacyjnych komórki ( test neutralizacji ) przez oczyszczone zrekombinowane białko IL-21 wobec komórek BaF3, wyrażających sekwencję receptora IL-21. Monoklonalne przeciwciała oczyszczone z pożywek hodowli tkankowych są charakteryzowane pod kątem ich zdolności do blokowania aktywności proliferacyjnych komórki ( test neutralizacji ) przez oczyszczone zrekombinowane białko IL-21 wobec komórek Baf3 wyrażających sekwencje receptora. W ten sposób identyfikowane są neutralizujące przeciwciała monoklonalne. [0168] Pule hybrydoma dające pozytywne wyniki w teście neutralizacji i ELISA są klonowane co najmniej dwukrotnie za pomocą ograniczonego rozcieńczenia. W testach tych, próbki są miareczkowane przy użyciu czterokrotnych seryjnych rozcieńczeń w celu zaobserwowania, który klon będzie utrzymywać najwyższe odczyty OD. Stosując wyniki zarówno testu neutralizacji jak miareczkowania, do dalszej pracy wybrano dwa specyficzne klony z każdej oryginalnej studzienki wyjściowej. Te zostały poddane dodatkowej rundzie klonowania w celu zapewnienia homogenności hodowli i przeszukane bezpośrednim testem ELISA. Po jednym dodatkowym teście miareczkowania wybrano dwa ostateczne klony. Klony hybrydoma są hodowane w pożywce hodowlanej zawierającej 90% pożywki Dulbecco w modyfikacji Iscove'a z 2mM L-glutaminą, 0 µg/ml penicyliny i 0 µg/ml siarczanu streptomycyny oraz % surowicą Fetal Clone I (Hyclone Laboratories). Klony są namnażane przez zaszczepianie hodowli 2x komórek/ml i utrzymywane pomiędzy 1x a x omórek/ml w 37 C i -6% CO. Komórki są adaptowane w warunkach wolnych od surowicy po kolejnych transferach. Komórki są zamrażane w 90% surowicy, % DMSO i przechowywane w fazie oparów zamrażarki z ciekłym azotem. [0169] Oczyszczone przeciwciała monoklonalne, wytwarzane przez klony hybrydoma, są charakteryzowane wieloma sposobami, włączając binowanie (tj., określające czy każde przeciwciało może hamować wiązanie innego wiązania), mapowanie epitopów przy użyciu peptydów, względne powinowactwo i neutralizację. 4 Przykład 11 Dobór sekwencji peptydowych do zastosowania w ocenie przeciwciał monoklonalnych skierowanych wobec ludzkiego IL-21 [0170] Oszacowanie wiązania mysich przeciwciał anty-ludzkie IL21 z różnymi domenami IL-21 prowadzono częściowo na podstawie zdolności przeciwciał monoklonalnych do wiązania syntetycznych peptydów pochodzących z natywnej sekwencji ludzkiego IL-21. Peptydy o wielkości aminokwasów selekcjonowano, tak aby uzyskać znaczące pokrycie peptydu cytokiny przy skupieniu się na domenach przewidzianych na podstawie badania mutein cytokiny i struktury cytokin pokrewnych do IL-21, ważnych dla 34

36 1 2 3 wiązania receptora i aktywacji. Peptydy o takim zakresie wielkości są również wydajnie produkowane i mają rozmiar, który może dawać ograniczenia struktury drugorzędowej do rozpoznania przez przeciwciało. Peptydy 1, 3 i 4 są zsyntetyzowane z aminowanym końcem karboksylowym, aby lepiej naśladowały ładunek elektrostatyczny znaleziony w wiązaniach natywnego peptydu. [0171] Peptyd #1 [0172] Do jednego peptydu wybrano koniec N ludzkiego IL-21 po ssaczej obróbce peptydowej sekwencji sygnałowej wraz z przylegającą sekwencją aminokwasową IL-21 (SEKW. NR ID.: 6). Wyrażanie u ssaków ludzkiego IL-21 i sekwencjonowanie końca N cytokiny wykazało wcześniej, że po odcięciu peptydu sygnałowego, aminokwasem powstającym na końcu N była piroglutaminianowa pochodna glutaminy-. Pochodna ta została wybrana jako aminokwas końca N peptydu wraz z kolejnymi aminokwasami znalezionymi na końcu N ludzkiego IL-21. Aby pozwolić na wydajne i specyficzne sprzężenie peptydu z białkami nośnikowymi lub macierzą fazy stałej koniecznej do analizy z tym peptydem, na końcu karboksylowym peptydu wprowadzono dodatkową resztę cysteinową. Kompletna sekwencja peptydu jest następująca pirogqdrhmirmrqlidivdqlkcamid (SEKW. NR ID.: 1). [0173] Peptyd #2 [0174] Drugi peptyd wybrano ze względu na jego własności hydrofilowe, obecność reszt prolinowych (przewidywany segment nie będący helisą) oraz jego położenie w sekwencji IL-21 pomiędzy przewidywanymi regionami helis A i B. Koniec peptydu na końcu karboksylowym wybrano ze względu na obecność reszty cysteinowej w sekwencji peptydowej ludzkiego IL-21. Sekwencja peptydu jest następująca NDLVPEFLPAPEDVETNC (SEKW. NR ID.: 2). [017] Peptyd #3 [0176] Ta sekwencja peptydowa została wybrana ze względu na jej przewidywane umiejscowienie obejmujące znaczącą część hydrofilowej struktury IL-21 z helisą C. Ten bardzo hydrofilowy region jest przewidywany jako ważny w oddziaływaniu ligand-receptor i rozpiętość peptydu także była tak wybrana, aby pozwolić na włączenie natywnej reszty cysteinowej (Cys-122) dla umożliwienia wydajnych koniugacji, kiedy jest to odpowiednie, jak zauważono powyżej. Sekwencja peptydu jest następująca NVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCamid (SEKW. NR ID.: 3). [0177] Peptyd #4 [0178] Peptyd ten wyselekcjonowano ze względu na jego umiejscowienie blisko końca karboksylowego cytokiny oraz ze względu na to, że badania wykorzystujące muteiny IL-21 pokazały, że ten region peptydu jest ważny dla aktywacji ligand-receptor, lecz nie wiązania liganda. Pokazano, że mutacja Gln-14 i/lub Ile- 148 w sekwencji peptydu, zaburza aktywację ludzkiego receptora IL-21. Peptyd złożony z 29 aminokwasów rozpoczyna się w natywnej Cys-12, co umożliwia jego użycie w chemicznym sprzęganiu peptydu, jak zauważono powyżej, i kończy się w Ser-13. Seryna ta jest końcowym aminokwasem w mysim IL-21; że położenie tej reszty w sekwencji końca aminowego peptydu pozwala przewidywać, że zawiera on element ludzkiej sekwencji IL-21, który jest ważny dla aktywności liganda. Sekwencja peptydu jest następująca CDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSamid (SEKW. NR ID.: 4). Przykład 12 Test z ufosforylowanym STAT3 do wykrywania neutralizacji IL-21 [0179] Stosowano wcześniej uzyskane transfektanty Baf3/ludzki IL21 receptor (hil-21r) (patrz, patenty USA nr i ). Komórki płukano trzykrotnie w pożywce do testu Baf3, która zawiera: RPMI, 1X Glutamaks, % płodową surowicę bydlęcą, 0 µm beta-merkaptoetanol, 0 µg/ml zeocyny, 1 mg/ml G418 (wszystko z Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Po trzecim płukaniu, komórki liczono za pomocą standardowych metod (hemacytometer) i zawieszano do 6x komórek na ml w pożywce do testu. Następnie komórki wysiewano na 96-studzienkową, okrągłodenną, płytkę do hodowli tkankowych, w ilości 3

37 komórek na studzienkę. Następnie płytki przenoszono do inkubatora hodowli tkankowych na 37 C i przygotowywano inny zestaw płytek do testu. [0180] Płytkę z próbkami przygotowywano następnie z µl 2,0 ng/ml ludzkiego IL-21 uzupełnionego µl jednego z następujących roztworów: rozcieńczona mysia surowica (końcowe stężenia 1:, 1:0 lub 1:0), pożywka, przeciwciało neutralizujące anty-il-21 (różne serie i stężenia), rozpuszczalny hil-21r (Przykład 2) lub niewpływające kontrole. Płytki przenoszono następnie do inkubatora na 37 C. Po - min., zarówno płytkę z komórkami, jak płytki z próbkami wyjmowano z inkubatora i 0µL z każdej studzienki w płytce z próbkami przenoszono do płytki z komórkami i mieszano. Następnie płytki przenoszono z powrotem do inkubatora na 37 C na tylko 8 min. W tym punkcie reakcje hamowano przez umieszczenie płytki na lodzie i dodanie µl schłodzonego w lodzie buforu BioPlex Cell Wash Buffer (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Płytki wirowano przez min. w 0RPM i 4 C. Po wirowaniu, nadsącz odrzucano do zlewu i komórki lizowano w 60 µl buforu BioPlex Cell Lysis Buffer zawierającego Czynnik 1, Czynnik 2 i PMSF (wszystko z BioRad). Zliofilizowane komórki pipetowano dla rozbicia zawiesistego materiału, a następnie wytrząsano przy 600 RPM w 4 C przez min. Płytki ponownie wirowano przez min. przy 00 RPM w 4 C. Po wirowaniu, pobierano µl lizatu i mieszano z µl buforem do testu badania ufosforylowanych białek (Phosphoprotein Testing Assay Buffer, BioRad). [0181] W tym punkcie płytkę z filtrem wstępnie zwilżano 0 µl buforem Phosphoprotein Wash Buffer (PWB), odsysano i dodawano 0 µl kulek PhosphoSTAT3 Coupled Beads (BioRad). Kulki następnie odsysano i płytki płukano trzykrotnie 7 µl PWB. Po ostatnim odessaniu, 0 µl rozcieńczonego lizatu przenoszono do płytki, którą następnie zamykano i wytrząsano przez noc w temp. pokojowej. Następnego rana, płytki płukano trzykrotnie PWB, i dodawano biotynylowane przeciwciała do wykrywania PhosphoSTAT3 (BioRad) na min. w temp. pokojowej. Płytki płukano jeszcze trzykrotnie PWB i następnie dodawano streptawidynę- PE na min. W końcu, płukano trzykrotnie buforem Phosphoprotein Resuspension Buffer (PRB) i kulki zawieszano w 12 µl PRB. [0182] Całkowity ufosforylowany STAT3 mierzono w każdej studzience za pomocą standardowego protokołu dla kolekcji danych z Luminex 0 zgodnie z zaleceniami producenta (Luminex Inc., Austin, TX). Wyniki następnie analizowano i przedstawiano w formie krotności indukcji ufosforylowanego STAT3 w porównaniu z sama pożywką. [0183] Surowice z myszy immunizowanych różnymi peptydami IL-21 (patrz Tabela 1) testowano pod kątem neutralizacji indukowanej IL21 fosforylacji STAT3. IL-21 mieszano wstępnie z rozcieńczoną surowicą przez min. w 37 C. Roztwór ten dodawano następnie do transfektantów Baf3/hIL21R na 8 min. Reakcję hamowano, komórki lizowano i wykonywano pomiar ufosforylowanego STAT3. Krotności wzrostu ufosforylowania STAT3 obliczano przy użyciu oznaczenia dla sama pożywka jako punktu podstawowego. Niższe liczby korelują z silniejszą neutralizacją IL-21. Wyniki zebrano w Tabeli 2, poniżej. [0184] W skrócie: jedna z trzech myszy (#1976) immunizowana peptydem #1 i dwie myszy (#1979, 1980) immunizowane peptydem #2, wytwarzały przeciwciała neutralizujące IL-21. Żadna z myszy immunizowana peptydami #3 i #4 nie wytworzyła przeciwciał neutralizujących. Neutralizacja obserwowana przy rozcieńczeniu w kolumnie 1: może wynikać z wpływu surowicy, a nie swoistej aktywności anty-il-21 (odniesienie do danych surowica niewpływająca ). Tabela 1 Peptydy IL21 I odpowiadające im numery próbek surowic Próbka nr Peptyd nr Peptyd #1 (patrz przykład 11) Peptyd #2 (patrz przykład 11) Peptyd #4 (patrz przykład 11) Peptyd #3 (patrz przykład 11) Peptyd #3 (patrz przykład 11) 36

38 Tabela 2 Średni wzrost poziomów fosforylacji STAT3 w porównaniu z pożywką Rozcieńczenie surowicy Próbka # 1: 1:0 1: ,89,07, ,98,14 8, ,72 8,33 12, ,04 1,81 2, ,6 1,4 1, ,91 9,8 17, ,04,8 12, ,68 12,0 12, ,84,84 11, ,94 12,64 11, ,01 13,41 16, ,48 14,11 17, ,6 8,66 9, ,88 11,63 12, ,6,29 14,8 Kontrole Sama pożywka 1 IL-21 12,4 NMS 11,28 11,72,31 Surowica niewpływająca 3,2 11,09 9, Przykład 13 [018] Opis bezpośredniego testu EIA [0186] Zdolność peptydów ludzkiego IL-21 (Przykład 11) do wiązania przeciwciał anty-ludzkie IL-21 oszacowano stosując bezpośredni test ELISA. W teście tym, studzienki 96-studzienkowych płytek polistyrenowych do ELISA opłaszczano najpierw 0 µl /studzienkę ludzkim białkiem IL-21 w stężeniu 1 µg/ml w buforze do opłaszczania (0,1M Na 2 CO 3, ph 9,6). Płytki inkubowano przez noc w 4 C, po czym niezwiązane peptydy odsysano i płytki płukano dwukrotnie 0 µl /studzienkę buforu płuczącego (PBS- Tween określony jako 0,137M NaCl, 0,0022M KC1, 0,0067M Na 2 HPO 4, 0,00M KH 2 PO 4, 0,0% v/w polisorbat, ph 7,2). Studzienki blokowano 0 µl /studzienkę buforu blokującego (PBS-Tween z 1% w/v bydlęcej albuminy surowiczej (BSA)) przez 1 godz., po czym płytki płukano dwukrotnie buforem płuczącym. Przygotowywano rozcieńczenia przeciwciała w pożywce %FBS/IMDM i ustawiano do stężenia 1 µg/ml. Podwójne próbki z każdego rozcieńczenia przeciwciała przenoszono do płytek z testu, 0 µl /studzienkę, w celu związania peptydów anty-ludzkie IL-21. Po 1 godz. inkubacji w temp. pokojowej, studzienki odsysano i płytki płukano dwukrotnie jak opisano powyżej. Następnie do każdej studzienki dodawano wyznakowane peroksydazą chrzanu, kozie anty-mysie IgG, swoiste wobec Fc (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) w rozcieńczeniu 1:000 z pożywką %/IMDM, 0 µl /studzienkę i płytki inkubowano w temp. pokojowej przez 1 godz. Po usunięciu niezwiązanego przeciwciała skoniugowanego z HRP, płytki płukano pięciokrotnie, do każdej studzienki dodawano 0 µl /studzienkę tetrametylobenzydyny (TMB) (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) i płytki inkubowano przez 3 min. w temp. pokojowej. Wywoływanie barwy hamowano przez dodanie 0 µl /studzienkę odczynnika nm TMB Stop Reagent (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) i wartości absorbancji studzienek odczytywano w instrumencie Molecular Devices Spectra MAX 3 przy nm. 37

39 1 2 Przykład 14 [0187] Charakterystyka przeciwciał neutralizujących [0188] Charakterystyka próbek pochodzących z nadsączy hodowli hybrydoma zawierała testy wiązania wykorzystujące fuzję białkową Fc ludzkiego IL-21, fuzję białkową Fc mysiego IL-21, ludzkie białko IL-21 zmutowane w Gln 14 i Ile148 (SEKW. NR ID.: 6) oraz peptydy opisane powyżej. Fuzje Fc IL-21 ujawniono w patentach USA nr i , a metody wytwarzania fuzji Fc ujawniono w patentach USA nr 27 i Białko mutanta IL-21 opisano w patencie USA nr i zgłoszeniu patentowym nr Tabela 3 Oznaczenie Izotyp Neutralizacja Białko wiążące hil- 21-Fc Muteina wiążąca hil- 21 Binds mil- 21-mFc protein Numer peptydu wiążącego Mysie Ab IgG1 Tak Tak Tak Tak nr 3 Mysie Ab IgG1 Tak Tak Tak Tak nr 3 Mysie Ab IgG1 Tak Tak Nie Tak brak Mysie Ab IgG1 Tak Tak Tak Tak nr 1 Szczurze Ab IgG2a Tak Nie Tak Tak nr 1 [0189] Mysie Ab Próbka ta wiąże strukturę ludzkiego białka IL-21 w obszarze przewidywanym jako rejon helisy C, na podstawie jej zdolności do wiązania Peptydu #3. [0190] Mysie Ab Próbka ta wiąże strukturę ludzkiego białka IL-21 w obszarze przewidywanym jako rejon C-helisa-C, na podstawie jej zdolności do wiązania Peptydu #3. [0191] Mysie Ab Próbka ta wiąże stronę helisy D cząsteczki położoną blisko Q14 i/lub I148 (SEKW. NR ID.: 6), na podstawie jej zdolności do wiązania natywnego hil-21 lecz nie muteiny hil-21. Wydaje się, że wiązanie dotyczy nieciągłego epitopu, na podstawie niezdolności wiązania peptydu #4, który zawiera natywną sekwencję peptydu zmutowanego w muteinę IL-21 lub, że epitop może wymagać obecności Ser14-Ser162 z sekwencji ludzkiego IL-21 (SEKW. NR ID.: 6). [0192] Mysie Ab Próbka ta wiąże strukturę ludzkiego białka IL-21 w obszarze przewidywanym jako rejon helisy A, na podstawie jej zdolności do wiązania Peptydu #1. Na podstawie jej zdolności do umiarkowanego oddziaływania ze skoniugowanym na końcu C Peptydem #1, a bardzo silnego oddziaływania z nieskoniugowanym peptydem, można przewidywać, że epitop dla tego przeciwciała obejmuje środkową lub położoną na końcu C domenę helisy A jaka jest w Peptydzie #1. [0193] Szczurze Ab Na podstawie jego zdolności do słabego oddziaływania zarówno ze skoniugowanym na końcu C, jak nieskoniugowanym Peptydem #1, jego zdolności do neutralizacji hil-21, lecz jego braku zdolności do wychwytywania hil-21-fc z roztworu, ustalono, że przeciwciało to wiąże epitop o dużej nieciągłości na strukturze ludzkiego białka IL-21, na obszarze przewidywanym jako region końca N z IL-21 i helisa A oraz wymaga przestrzeni w pobliżu przyległego regionu końca C z hil-21, gdzie jest połączony z fuzją białkową Fc. 3 Lista sekwencji [0194] <1> ZymoGenetics, Inc. Sivakumar, Pallavur Jaspers, Stephen R. <1> ANTAGONIŚCI IL-21 <1> 0-24PC <> US 60/7,14 <11> <160> 8 <170> FastSEQ dla Windows wersja

40 <2> 1. <211> 21 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> peptyd syntetyczny <2> <221> WARIANT <222> (1)...(1) <223> Xaa = piroglu <2> <221> AMIDACJA <222> (21)...(21) <0> 1 1 <2> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> peptyd syntetyczny <0> 2 2 <2> 3 <211> 26 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> peptyd syntetyczny <2> <221> AMIDACJA <222> (26)...(26) <0> 3 3 <2> 4 <211> 29 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> peptyd syntetyczny <2> <221> AMIDACJA <222> (29)...(29) <0> <2> <211> 642 <212> DNA <213> Homo sapiens <2> <221> CDS <222> (47)...(32) <0> 39

41 <2> 6 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <0> 6 <2> 7

42 <211> 72 <212> DNA <213> Mus musculus <2> <221> CDS <222> (4)...(491) <0> 7 41

43 <2> 8 <211> 146 <212> PRT <213> Mus musculus <0> 8 42

44 1 2 Zastrzeżenia patentowe 1. Przeciwciało zdolne do współzawodnictwa z przeciwciałem monoklonalnym (nr dostępu ATCC PTA-39) o wiązanie antygenu ludzkiego IL-21, przy czym przeciwciało swoiście wiąże się z hil-21, z powinowactwem wiązania 7 M -1 lub większym i neutralizuje ludzkie IL Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, które swoiście wiąże się z epitopem, z którym wiąże się przeciwciało monoklonalne (nr dostępu ATCC PTA-39), z powinowactwem wiązania 7 M -1 lub większym. 3. Przeciwciało według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że przeciwciało jest wyznakowane wykrywalnym markerem, korzystnie wykrywalny marker jest wybrany z grupy składającej się z izotopu radioaktywnego, enzymu, barwnika lub biotyny. 4. Przeciwciało według dowolnego z zastrz. 1-3, znamienne tym, że powinowactwo wiązania wynosi 9 M -1 lub więcej.. Komórka hybrydoma, która wytwarza przeciwciało według zastrz Sposób wytwarzania przeciwciała według zastrz. 2, obejmujący: (a) dostarczenie hybrydoma zdolnej do wytwarzania przeciwciała; oraz (b) hodowanie hybrydoma w warunkach, które umożliwiają wytwarzanie przeciwciała przez hybrydoma. 7. Kompozycja farmaceutyczna obejmująca przeciwciało według dowolnego z zastrz. 1-4 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. 8. Przeciwciało anty-il-21 według dowolnego z zastrz. 1-4 lub kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 7 do zastosowania w leczeniu choroby autoimmunologicznej. 9. Przeciwciało anty-il-21 lub kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 8, przy czym choroba autoimmunologiczna jest wybrana z grupy składającej się z zapalenia trzustki, cukrzycy typu I (IDDM), choroby Gravesa-Basedowa, nieswoistego zapalenia jelit (IBD), choroby Crohna, wrzodziejącego zapalenia okrężnicy, zespołu nadwrażliwości jelita grubego, stwardnienia rozsianego, reumatoidalnego zapalenia stawów, uchyłkowatości jelit, tocznia rumieniowatego układowego, łuszczycy, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, twardziny skóry, twardziny układowej, artropatii łuszczycowej, bielactwa nabytego, choroby przeszczep przeciw gospodarzowi (GVHD), chłoniaka skórnego z limfocytów T (CTCL), zespołu Sjogrena, kłębuszkowego zapalenia nerek, nefropatii IgA, choroby przeszczep przeciw gospodarzowi, odrzucenia przeszczepu, zapalenia atopowego skóry, zespołu antyfosfolipidowego i astmy, oraz innych chorób autoimmunologicznych.. Zastosowanie przeciwciała anty-il-21 według dowolnego z zastrz. 1-4 lub kompozycji farmaceutycznej według zastrz. 7 do wytwarzania leku do leczenia choroby autoimmunologicznej. 43

45 Odnośniki cytowane w opisie Poniższa lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma na celu wyłącznie pomoc dla czytającego i nie stanowi części dokumentu patentu europejskiego. Pomimo, że dołożono największej staranności przy jej tworzeniu, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń i EUP nie ponosi żadnej odpowiedzialności w tym względzie. Dokumenty patentowe cytowane w opisie Literatura niepatentowa cytowana w opisie 44

46 4

47 46

48 47