(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (13) T3 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2010/01 EP B1 (51) Int. Cl. C07K16/28 G01N33/566 C07K7/00 G01N33/68 G01N33/564 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (54) Tytuł wynalazku: Sposób rozpoznawania chorób związanych z przeciwciałem przeciwko receptorowi AT 1 (30) Pierwszeństwo: (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2008/06 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 06/2010 (73) Uprawniony z patentu: Celltrend GmbH, Luckenwalde, DE PL/EP T3 (72) Twórca (y) wynalazku: Schulze-Forster Kai, Teltow, DE Heidecke Harald, Berlin, DE (74) Pełnomocnik: Polservice Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o. rzecz. pat. Bartnik Urszula Warszawa skr. poczt. 335 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 2 Opis Około 100 milionów ludzi w Europie cierpi na którąś z postaci zapalnych lub zwyrodnieniowych chorób reumatycznych, sprawiając, że choroby reumatyczne w społeczeństwach Europejskch stają się dużym problemem. Choroby stawów stanowią połowę wszystkich stanów przewlekłych u osób w wieku 65 lat i więcej. Jakość życia około 7,5% populacji europejskiej jest znacznie i trwale zmniejszana przez ból i ograniczenia czynnościowe wywołane przez choroby reumatyczne. Najbardziej drastycznymi konsekwencjami tych obecnie nieuleczalnych chorób są unieruchomienie i skrócenie przewidywanej długości trwania życia. W samej Europie choroby reumatyczne obciążają gospodarkę kosztami ponad 200 miliardów euro rocznie. Obciążenie społeczne i ekonomiczne, związane z chorobami reumatycznymi, będzie gwałtownie rosło w miarę starzenia się populacji europejskiej. W ostatnich latach opracowano nowy sposób leczenia, polegający na ukierunkowywaniu cząsteczek odgrywających rolę w patogenezie przewlekłych chorób zapalnych. Mimo tych wysiłków nadal nie ma możliwości wyleczenia większości chorób reumatycznych. Do czynników utrudniających terapię należą: przewlekłość zapalenia, procesy autoimmunologiczne i zwyrodnienie układu mięśniowo-kostnego. Jakkolwiek poszczególne choroby reumatyczne różnią się swą immunopatologią, cechują je takie same mechanizmy zapoczątkowywania i utrwalania procesu. Istnieje poza tym istotny potencjał przełożenia korzyści wynikających ze zrozumienia innych chorób obejmujących układ odpornościowy, takich jak na przykład choroby autoimmunologiczne, alergie i

3 3 zakażenia. Różnorodność chorób reumatycznych, wielość tkanek zajmowanych przez te choroby (tkanka kostna, chrząstka, stawy, nerki, skóra, naczynia krwionośne) i podejście wielodyscyplinarne niezbędne do zrozumienia podstaw molekularnych tych chorób powodują, że ich rozpoznanie jest bardzo trudne. Rozpoznanie zapalenia stawów i innych chorób reumatycznych bywa często trudne, ponieważ wiele objawów jest podobnych w różnych chorobach. Do postawienia prawidłowego rozpoznania lekarz musi zapoznać się z wywiadem co do przebytych chorób, przeprowadzić badanie lekarskie, zlecić badania laboratoryjne oraz badania rentgenowskie i inne badania obrazowe. Chorobami reumatycznymi są na przykład reumatoidalne zapalenie stawów, fibromialgia, liszaj rumieniowaty, zespół bólu wielomięśniowego, postepująca twardzina uogólniona, zespół Sjögrena, liszaj rumieniowaty uogólniony i zapalenie stawów. Amerykańskie Towarzystwo Reumatologiczne (American College of Rheumatology) zdefiniowało (1987) kilka kryteriów niezbędnych do rozpoznawania na przykład reumatoidalnego zapalenia stawów. Sztywność poranna utrzymująca się dłużej niż jedną godzinę, zapalenie stawów i obrzęk tkanek miękkich dotyczący więcej niż 3 z 14 stawów/grup stawów, zapalenie stawów ręki, asymetryczne zapalenie stawów, obecność guzków podskórnych w swoistych miejscach, poziom czynnika reumatoidalnego powyżej 95. percentyla i zmiany radiologiczne sugerujące uszkodzenie stawów. Do postawienia rozpoznania konieczne jest spełnienie co najmniej czterech kryteriów, chociaż wielu chorych poddaje się

4 4 leczeniu pomimo, że nie spełniają oni tych kryteriów. Przy klinicznym podejrzeniu reumatoidalnego zapalenia stawów niezbędne jest przeprowadzenie badań immunologicznych, takich jak oznaczenie czynnika reumatoidalnego (RF ang. rheumatoid factor, swoistego przeciwciała). Ujemny wynik oznaczenia RF nie wyklucza reumatoidalnego zapalenia stawów. Niedawno opracowano nowy test serologiczny, oceniający obecność tak zwanych przeciwciał przeciwko cytrulinowanemu białku (ACP ang. anti-citrullinated protein). Podobnie jak oznaczanie RF, test ten umożliwia zidentyfikowanie około 80% wszystkich chorych z reumatoidalnym zapaleniem stawów (ang. rheumatoid arthritis RA), rzadko natomiast bywa dodatni u osób, które nie są chore na RA. Do takich testów, które przeprowadza się tym etapie przeprowadza się zwykle jeszcze kilka testów krwi w kierunku innych przyczyn niż zapalenia stawów, takich jak liszaj rumieniowaty. Do takich testów należy szybkość opadania krwinek czerwonych, czyli odczyn Biernackiego (OB.) ( ang. erythrocite sedimentation rate, ESR), białko c- reaktywne, pełny rozmaz krwi, ocena czynności nerek, oznaczenie enzymów wątrobowych i testy immunologiczne, na przykład przeciwciała przeciwjądrowe (ANA, ang. antinuclear antibody). Jak opisano w odniesieniu do reumatoidalnego zapalenia stawów, które jest jedną z chorób z grupy zapalnych chorób reumatycznych, rozpoznanie w tej dziedzinie chorób jest trudne. Istnieje zatem potrzeba opracowania bezpiecznego i wiarygodnego narzędzia diagnostycznego. W WO 00/39154 A2 opisano szczegółowo peptydy receptora AT 1 i ich zastosowanie do eliminowania swoiście

5 5 wiążących się, fizjologicznych dla komórek, patologicznych przeciwciał w leczeniu stanu przedrzucawkowego, jak również w rozpoznawaniu stanu przedrzucawkowego. Wykazano, że angiotensyna II odgrywa rolę w zapaleniach maziówki u pacjentów (ludzi) z zapaleniem stawów oraz że receptor AT 1 pośredniczy w tym działaniu (Walsh i wsp., 1994, AT1 receptor characteristics of angiotensin analogue binding in human synovium, Br. J. Pharmacol. 112: ). Ponadto do leczenia i profilaktyki indukowanego przez kolagen zapalenia stawów w modelu mysim można stosować kandesartan środek blokujący receptor AT 1 (Dalbeth i wsp., 2005, The non-thiol angiotensin-converting enzyme inhibitor quinaperil supresses arthritis, Rheumatology 44:24-31). Krótki opis wynalazku Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób rozpoznawania zapalnej choroby reumatycznej, w którym określa się obecność lub nieobecność przeciwciała przeciwko receptorowi AT 1 w próbce pochodzącej od diagnozowanego pacjenta, i w którym na obecność choroby wskazuje obecność przeciwciała przeciwko receptorowi AT 1. Autorzy wynalazku stwierdzili, że ponad 1/3 pacjentów (35%) z chorobami reumatycznymi jest pozytywnych pod względem obecności przeciwciała anty- AT 1, podczas gdy u osób bez choroby reumatycznej tylko 8,3% miało dające się wykrywć przeciwciało anty-at 1. Oznaczenia dokonywano w warunkach próby ślepej. U wszystkich pacjentów z chorobami reumatycznymi obecne były ciężkie powikłania, co utrudniało leczenie

6 6 metodami standardowymi. Stwierdzano ewidentną korelację między obecnością przeciwciała anty-at 1 a powikłaniami choroby. W korzystnym wykonaniu wynalazku oznaczenia obecności lub nieobecności przeciwciała przeciwko receptorowi AT 1 dokonuje się przez wykrywanie jednego lub więcej niż jednego przeciwciała dobranego z grupy złożonej z przeciwciała IgA, przeciwciała IgG i przeciwciała IgM, a szczególnie przeciwciała IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. W jednym z wykonań wynalazku, wynalazek dotyczy testu immunologicznego. Istnieje wiele sposobów przeprowadzania testu immunologicznego, w korzystnym wykonaniu wynalazku, a testem immunologicznym jest test lucyferazowy i(lub) ELISA. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest ponadto zastosowanie peptydu receptora AT 1 do rozpoznawania zapalnej choroby reumatycznej. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zestaw badawczy i(lub) diagnostyczny do rozpoznawania zapalnej choroby reumatycznej, zawierający peptyd receptora AT 1. Szczegółowy opis wynalazku Autorzy wynalazku stwierdzili, że można rozpoznawać pewne choroby poprzez wykrywanie obecności lub nieobecności przeciwciała przeciwko receptorowi AT 1 w próbce pobranej od diagnozowanego pacjenta. W istocie autorzy stwierdzili, że u 35% pacjentów z chorobą reumatyczną wynik oznaczania przeciwciała anty-at 1 jest dodatni. To samo przeciwciało anty-at 1 wykrywa się w

7 7 zaledwie 6,2% przypadków u osób niechorujących na chorobę reumatyczną. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zatem sposób rozpoznawania choroby, w którym w próbce pobranej od diagnozowanego pacjenta określa się obecność lub nieobecność przeciwciał przeciwko receptorowi AT 1. Udało się wykazać, że istnieje powiązanie między obecnością przeciwciała przeciwko receptorowi AT 1 a prawdopodobieństwem zapalnej choroby reumatycznej. Dowiedziono, że obecność przeciwciała przeciwko receptorowi AT 1 przyczynia się do powstawania zapalnych chorób reumatycznych. W odniesieniu do niniejszego wynalazku będzie się stosować pewne terminy ogólne, w zdefiniowanym poniżej znaczeniu. Według wynalazku odrzucenie przeszczepu ma oznaczać wywołanie u biorcy reakcji immunologicznej na przeszczep. Reakcja immunologiczna u biorcy jest to swoista reakcja ochronna lub obronna organizmu przeciwko antygenom przeszczepu. Receptor AT 1 może być obecny w swym naturalnym środowisku komórkowym i można go stosować wraz z materiałem związanym z receptorem w jego stanie naturalnym, jak również w postaci izolowanej w odniesieniu do jego struktur pierwszo-, drugo- i trzeciorzędowych; receptor AT 1 jest dobrze znany fachowcom w tej dziedzinie. Na podstawie masy całości receptora w preparacie, który ma być stosowany według wynalazku, izolowany receptor powinien stanowić co najmniej 0,5%, korzystnie co najmniej 5%, korzystniej co najmniej 25% i w szczególnie korzystnym wykonaniu co najmniej 50%.

8 8 Receptor korzystnie stosuje się w postaci izolowanej, to znaczy postaci zasadniczo wolnej od innych białek, lipidów, węglowodanów lub innych substancji naturalnie związanych z receptorem. Zasadniczo wolny oznacza, że receptor jest w co najmniej w 75%, korzystnie co najmniej 85%, korzystniej co najmniej w 95%, szczególnie korzystnie co najmniej w 99% wolny od innych białek, lipidów, węglowodanów lub innych substancji naturalnie związanych z receptorem. W odniesieniu do niniejszego wynalazku można stosować receptor AT 1 występujący naturalnie, jak również wszelkie modyfikacje, mutanty lub pochodne receptora AT 1. Podobnie, według niniejszego wynalazku można stosować receptor AT 1 wytworzony technikami rekombinowania, zawierający modyfikacje aminokwasowe, takie jak inwersje, delecje, insercje, addycje itp., pod warunkiem, że obecna jest ta część zasadniczej funkcji receptora AT 1, a mianowicie zdolność do wiązania przeciwciała. Stosowany receptor AT 1 może także zawierać wyjątkowe aminokwasy i/lub modyfikacje, takie jak alkilacja, utlenienie, modyfikacja tiolowa, denaturacja, oligomeryzacja i tym podobne. Receptor można także wytwarzać sposobami chemicznymi. Według wynalazku receptor AT 1 może być korzystnie białkiem i(lub) peptydem lub białkiem fuzyjnym, który, oprócz innych białek, peptydów lub ich fragmentów, zawiera całość lub część receptora AT 1. Specjaliści w tej dziedzinie mogą, za pomocą konwencjonalnych metod, określać peptydy lub polipeptydy receptora AT 1, które są jego analogami czynnościowymi mają analogiczne właściwości. Na przykład takie polipeptydy lub peptydy

9 9 wykazują 50-60%, 70% lub 80%, korzystnie 90%, korzystniej 95%, najkorzystniej 98% homologię z peptydami identyfikowanymi jako receptor AT 1, przy czym tę homologię można określać na przykład za pomocą algorytmu poszukiwania homologii Smitha-Watermana, stosując na przykład program MPFRCH (Oxford Molecular). Termin peptyd receptora AT 1, stosowany w niniejszym wynalazku, obejmuje także cząsteczki różniące się od pierwotnej sekwencji jedną lub więcej niż jedną delecją, insercją, substytucją i/lub innymi modyfikacjami dobrze znanymi ze stanu techniki i/lub zawierające fragment pierwotnej cząsteczki aminokwasowej, przy czym receptor AT 1 zachowuje wyżej wymienione właściwości. Termin ten obejmuje również warianty i modyfikacje alleli. Sposoby dokonywania wyżej wymienionych zmian sekwencji aminokwasowej są dobrze znane specjaliście w tej dziedzinie i opisano je w standardowych podręcznikach biologii molekularnej, takich jak na przykład Sambrook i wsp., jw. Specjaliści będą również w stanie określić, czy tak zmodyfikowany receptor AT 1 nadal wykazuje wyżej wymienione właściwości. Do peptydów receptora AT 1, które można stosować według wynalazku, należą na przykład AVHYQSN (SEQ ID nr 1), SHFYQTR (SEQ ID nr 2) i/lub GYYFDTN (SEQ ID nr 3). W niniejszym opisie wszystkie z powyżej przedstawionych modyfikacji receptora AT 1 będą określane skróconą nazwą analogicznych funkcjonalnie peptydów lub białek. Próbką w znaczeniu niniejszego wynalazku mogą być wszystkie tkanki lub płyny biologiczne, taki jak krew, chłonka, mocz, płyn mózgowo-rdzeniowy. Próbkę po-

10 10 biera się od pacjenta i poddaje diagnostyce według wynalazku. Przeciwciało przeciwko receptorowi AT 1 w znaczeniu niniejszego wynalazku, które ma być wykrywane, wiąże receptor AT 1 w swoisty sposób. Przeciwciało może być również zmodyfikowane (może to być na przykład przeciwciało oligomeryczne, zredukowane, utlenione lub wyznakowane). Termin przeciwciało przeciwko receptorowi AT 1 w rozumieniu niniejszego opisu obejmuje zarówno nienaruszone cząsteczki, jak i fragmenty przeciwciał przeciwko receptorowi AT 1, takie jak Fab, F(ab') 2 i Fv, zdolne do wiązania swoistego epitopu - determinanty receptora AT 1. W tych fragmentach zdolność przeciwciała (przeciwciał) przeciwko receptorowi AT 1 do wybiórczego wiązania się z jego antygenem lub receptorem jest zachowana częściowo, a fragmenty są zdefiniowane następująco: (1) Fab - fragment zachowujący jednowartościowy, wiążący antygen fragment cząsteczki przeciwciała; można go wytworzyć przez rozcięcie całego przeciwciała za pomocą enzymu papainy, uzyskując przez to nienaruszony łańcuch lekki i część łańcucha ciężkiego; (2) fragment Fab cząsteczki przeciwciała można wytworzyć przez potraktowanie całego przeciwciała pepsyną i następnie redukcję, uzyskując nienaruszony łańcuch lekki i część łańcucha ciężkiego; uzyskuje się dwa fragmenty Fab na cząsteczkę przeciwciała; (3) fragment przeciwciała F(ab') 2, który można wytworzyć przez potraktowanie całego przeciwciała enzymem pepsyną bez późniejszej redukcji; F(ab') 2 jest dimerem złożonym z dwóch fragmentów Fab, utrzymywanych razem przez dwa mostki dwusiarczkowe; (4) Fv

11 11 zdefiniowany jako fragment zmodyfikowany metodami inżynierii genetycznej, zawierający region zmienny łańcucha lekkiego i region zmienny łańcucha ciężkiego ulega ekspresji w postaci dwóch łańcuchów i (5) przeciwciało jednołańcuchowe (ang. single chain antibody SCA), zdefiniowane jako cząsteczka zmodyfikowana metodami inżynierii genetycznej, obejmująca region zmienny łańcucha lekkiego i region zmienny łańcucha ciężkiego, połączone odpowiednim łącznikiem polipeptydowym, w wyniku czego powstaje cząsteczka jednołańcuchowa, która uległa fuzji genetycznej. Termin epitop w znaczeniu niniejszego opisu oznacza dowolną determinantę antygenową na receptorze AT 1. Epitop (determinanta) normalnie składa się z aktywnych chemicznie powierzchniowych grup cząsteczek, takich, jak aminokwasy lub łańcuchy boczne cukrów i normalnie ma swoiste cechy struktury trójwymiarowej, jak również swoiste właściwości w wykresie. Przeciwciało przeciwko receptorowi AT 1 wiąże się swoiście z receptorem AT 1 lub wiążąc się z nim, wykazuje swoistą reaktywność immunologiczną, gdy przeciwciało przeciwko receptorowi AT 1 przejmuje jego funkcję w reakcji wiązania w obecności heterogennej populacji receptorów AT 1 lub ich fragmentów, umożliwiając wyciągnięcie wniosku, czy obecny jest receptor AT 1 czy inna struktura biologiczna. W warunkach testu immunologicznego według niniejszego wynalazku, wyżej wymienione przeciwciała przeciwko receptorowi AT 1 będą korzystnie wiązać się ze swoistą częścią receptora AT 1, przy czym

12 12 nie będzie dochodziło do znaczącego wiązania z innymi białkami obecnymi w próbce. Termin pacjenci w znaczeniu niniejszego wynalazku rozumie się jako wszystkie osoby, zwierzęta, rośliny lub drobnoustroje, niezależnie od tego, czy wykazują one, czy nie wykazują zmian patologicznych. W znaczeniu niniejszego wynalazku próbką od poddawanego diagnostyce pacjenta może być dowolna próbka pobrana z komórek, tkanek, narządów organizmów lub tym podobnych. W korzystnym wykonaniu pacjentem według wynalazku jest człowiek. W dalszym korzystnym wykonaniu wynalazku pacjentem jest człowiek z podejrzeniem zapalnej choroby reumatycznej. Reakcja immunologiczna w znaczeniu niniejszego wynalazku jest to swoista interakcja między receptorem AT 1 albo peptydami lub białkami o analogicznej funkcji a przeciwciałami przeciwko receptorowi AT 1. Reakcję immunologiczną można wykrywać za pomocą różnych testów immunologicznych. Testy immunologiczne w znaczeniu niniejszego wynalazku są to testy wykorzystujące swoistą interakcję między receptorem AT 1 i peptydami lub białkami o analogicznej funkcji a przeciwciałami przeciwko receptorowi AT 1, w celu wykrywania obecności lub określenia stężenia przeciwciał przeciwko receptorowi AT 1. Na przykład wykrywania w oznaczaniu ilościowym przeciwciał przeciwko receptorowi AT 1 można dokonywać za pomocą tych peptydów lub białek o analogicznej funkcji, na przykład poprzez immunoprecypitację lub immunoblotting. Według wynalazku chorobą jest zapalna choroba reumatyczna.

13 13 W korzystnym wykonaniu zapalną chorobę reumatyczną wybiera się z grupy składającej się z reumatoidalnego zapalenia stawów, fibromialgii, liszaja rumieniowatego, zespół bólu wielomięśniowego, postępującej twardziny układowej, zespołu Sjögrena, liszaja rumieniowatego układowego i zapalenie stawów. W bardzo korzystnym wykonaniu zapalną chorobą reumatyczną jest twardzina układowa. W korzystnym wykonaniu wynalazku oznaczenia obecności lub nieobecności przeciwciała przeciwko receptorowi AT 1 dokonuje się przez wykrywanie jednego lub więcej niż jednego przeciwciała wybranego z grupy składającej się z przeciwciała IgA, przeciwciała IgG i przeciwciała IgM. Przeciwciała ludzkie można podzielić na pięć klas immunoglobulin. Klasa A immunoglobulin (IgA) istnieje w postaci rozpuszczonej we krwi, jak również w wariancie wydzielniczym. IgA obejmuje dwie zasadnicze klasy. IgA wydzielnicza składa się z dwóch podstawowych cząsteczek immunoglobulin wraz z łańcuchem J i składową wydzielniczą. Bardziej szczegółowo, cząsteczki Ig są powszechnie obecne w wydzielinach ciała. Klasa IgG immunoglobulin stanowi największą grupę immunoglobulin. Przeciwciała wtórnej odpowiedzi immunologicznej, do której dochodzi po kontakcie układu immunologicznego z danym antygenem, w większej części należą do klasy IgG. W szczególnie korzystnym wykonaniu wynalazku przeciwciało przeciwko receptorowi AT1 wybiera się z grupy składającej się z IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4.

14 14 Testy immunologiczne w znaczeniu niniejszego wynalazku są to testy wykorzystujące swoistą interakcję między receptorem AT 1 i peptydami lub białkami o analogicznej funkcji a przeciwciałem przeciwko receptorowi AT 1 w celu wykrywania obecności lub oznaczania stężenia przeciwciał przeciwko receptorowi AT 1. Na przykład wykrywanie i oznaczanie ilościowe przeciwciała przeciwko receptorowi AT 1 można przeprowadzać za pomocą tych peptydów lub białek o analogicznej funkcji, na przykład poprzez immunoprecypitację lub immunoblotting. Na przykład testy immunologiczne w znaczeniu niniejszego wynalazku można podzielić na następujące etapy: (1) reakcja przeciwciało przeciwko receptorowi AT 1 /receptor AT 1 (2) jeżeli jest to niezbędne oddzielenie kompleksu przeciwciała przeciwko receptorowi AT 1 od innych składników mieszaniny reakcyjnej, zwłaszcza od niezwiązanego przeciwciała przeciwko receptorowi AT 1 (3) pomiar odpowiedzi. W przypadku reakcji przeciwciało przeciwko receptorowi AT 1 /receptor AT 1 możliwe są różne konfiguracje, na przykład (a) precypitacja jednej reakcji z nadmiarem drugiej lub (b) kompetycja między znanymi ilościami przeciwciała przeciwko receptorowi AT 1 lub receptora AT 1 a badanym materiałem. Na przykład, test pod kątem przeciwciał przeciwko receptorowi AT 1 można wykonać poprzez a) zastosowanie nadmiaru receptorów AT 1 /peptydów lub białek o analogicznej funkcji lub b) kompetycję między wyznakowanym przeciwciałem przeciwko receptorowi AT 1, w znanej ilości, a niewyznakowanym przeciwciałem w nieznanej ilości o zdefiniowaną ilość receptora AT 1 lub peptydów lub białek o analogicznej funkcji.

15 15 Receptor AT 1 można unieruchamiać na stałym podłożu w celu umożliwienia rozdzielania kompleksu przeciwciało przeciwko receptorowi AT 1 /receptor AT 1. Materiałem na podłoże stałe może być na przykład nitroceluloza, chlorek poliwinylowy lub polistyren, na przykład studzienka płytki do mikromiareczkowania. Test immunologiczny może zachodzić w środowisku mikropłynu. W celu zmierzenia interakcji przeciwciało przeciwko receptorowi AT 1 /receptor AT 1 można zastosować na przykład wyznakowane przeciwciała przeciwko receptorowi AT 1, wyznakowane receptory AT 1 lub odczynniki drugiego rzędu. Receptor AT 1 można wyznakować na przykład radioaktywnie, enzymami lub związkami fluorescencyjnymi. Niezależnie od zastosowanego znacznika, interakcję między przeciwciałem przeciwko receptorowi AT 1 a receptorem AT 1 można nasilić przez wykorzystanie powinowactwa białek awidyny lub streptawidyny do biotyny. Testami immunologicznymi stosowanymi według wynalazku mogą być: (1) testy immunologiczne z wykorzystaniem znacznika radioaktywnego (a) test radioimmunologiczny z wiązaniem kompetycyjnym (RIA) i (b) test immunoradiometryczny (IRMA); (2) testy immunologiczne z wykorzystaniem znacznika enzymatycznego: (a) enzymatyczne testy immunologiczne (EIA) i (b) enzymatyczne testy immunosorpcyjne (ELISA); (3) testy immunologiczne z zastosowaniem połączenia radioizotopu i znaczników enzymatycznych (ultraczuły enzymatyczny test radioimmunologiczny (USERIA). Ponadto testem immunologicznym według wynalazku może być fluorescencyjny test immunologiczny, test chemiluminescyjny, test aglutynacyjny, test nefelometryczny, test turbidymetryczny, Western Blot,

16 16 kompetycyjny test immunologiczny, niekompetycyjny test immunologiczny, homogenny test immunologiczny, heterogenny test immunologiczny, test reporterowy, na przykład test lucyferazowy. W korzystnym wykonaniu wynalazku testem immunologicznym jest ELISA. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również zastosowanie peptydu receptora AT 1 do rozpoznawania zapalnej choroby reumatycznej. Ponadto w korzystnym wykonaniu w zastosowaniu według wynalazku zapalna choroba reumatyczna należy do grupy obejmującej reumatoidalne zapalenie stawów, fibromialgię, liszaj rumieniowaty, zespół bólu wielomięśniowego, postępującą twardzinę układową, zespół Sjögrena, układowy liszaj rumieniowaty i zapalenie stawów. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest ponadto zestaw badawczy i/lub diagnostyczny do rozpoznawania zapalnej choroby reumatycznej, zawierający peptyd receptora AT 1. W korzystnym wykonaniu zestaw badawczy i/lub diagnostyczny zawiera peptyd receptora AT 1. W korzystnym wykonaniu zestaw badawczy i/lub diagnostyczny według wynalazku służy do rozpoznawania zapalnej choroby reumatycznej, należącej do grupy obejmującej reumatoidalne zapalenie stawów, fibromialgię, liszaj rumieniowaty, zespół bólu wielomięśniowego, postępującą twardzinę układową, zespół Sjögrena, układowy liszaj rumieniowaty i zapalenie stawów. Zestaw do testów immunologicznych według wynalazku zawiera receptor AT 1 albo peptydy lub białka o analogi-

17 17 cznej funkcji per se. Zestaw testowy według niniejszego wynalazku zawiera co najmniej jeden kompletny receptor AT 1 albo czynnościowo analogiczne peptydy lub białka tego receptora, ewentualnie związane z fazą stałą. Zestaw testowy może także zawierać bufory, swoisty koniugat z enzymem, roztwór do płukania, roztwór substratu do wykrywania reakcji immunologicznej i/lub roztwór przerywający reakcję. Za pomocą tych substancji specjalista będzie w stanie przeprowadzić na przykład test ELISA celem wykrywania przeciwciał przeciwko receptorowi AT 1. Bufory, swoisty koniugat plus enzym, roztwór do płukania, roztwór substratu do wykrywania reakcji immunologicznej i roztwór przerywający reakcję są dobrze znane specjaliście. Na przykład wystarczy, żeby test zawierał liofilizowany receptor AT 1 albo peptydy lub białka receptora AT 1 o analogicznej funkcji i wystarczy dodać bufory i inne roztwory tuż przed rozpoczęciem badania materiału biologicznego. Można jednak także zapewnić zestaw testowy z receptorem AT 1 lub czynnościowo do niego analogicznymi peptydami lub białkami, związanymi z fazą stałą. W celu wykrywania przeciwciał przeciwko receptorowi AT 1 swoisty koniugat, roztwór do płukania, roztwór substratu i roztwór przerywający reakcję, które mogą wchodzić w skład zestawu testowego, muszą być dodane w sposób dobrze znany specjaliście. W innym korzystnym wykonaniu wynalazku przewiduje się, że zestaw testowy jest paskiem testowym, zawierającym receptor AT 1 albo czynnościowo do niego analogiczne peptydy lub białka unieruchomione na fazie stałej. Na przykład pasek testowy można zanurzać w su-

18 18 rowicy lub innej próbce pochodzącej od pacjenta i inkubować. Można, wykorzystując swoistą reakcję biochemiczną na pasku testowym po wytworzeniu kompleksu receptor AT 1 /przeciwciało przeciwko receptorowi AT 1, wyzwalać swoistą reakcję barwną, poprzez którą można wykryć przeciwciało przeciwko receptorowi AT 1. Układ testowy według niniejszego wynalazku umożliwia ilościowe oznaczanie przeciwciał przeciwko receptorowi AT 1 bezpośrednio w próbce, na przykład w osoczu pacjentów. Sposób wykrywania według wynalazku oszczędza czas i pieniądze. Można badać dużą ilość próbek i, ze względu na niewielkie ilości niezbędnego sprzętu, można wykorzystywać rutynowe laboratoria. Przykłady Przykład I: Test ELISA dla receptora AT 1 Odpowiednio pokrytą streptawidyną płytkę do mikromiareczkowania ładuje się biotynylowanym peptydem, odpowiadającym odcinkowi sekwencji aminokwasowej receptora AT 1. Takimi peptydami mogą być AVHYQSN (SEQ ID nr 1), SHFYQTR (SEQ ID nr 2) i/lub GYYFDTN (SEQ ID nr 3). W tym celu 100 μl roztworu na studzienkę w płytce do mikromiareczkowania inkubuje się z 5 μg/ml w odpowiednim buforze rozcieńczającym. W celu oznaczenia wiązania nieswoistego studzienki napełnia się także 100 μl buforu rozcieńczającego. Bufor rozcieńczający może zawierać 0,5% bydlęcą albuminę surowicy, 10 mm bufor fosforanowy (ph 7,4), 140 mm NaCl i 0,05% TWEEN 20.

19 19 Po okresie reakcji roztwór peptydu usuwa się przez dekantację i każdą studzienkę płucze się trzykrotnie 250 μl odpowiedniego buforu do płukania. Odpowiedni bufor do płukania może zawierać 10 mm bufor fosforanowy (ph 7,4), 140 mm NaCl i 0,1% TWEEN 20. Następnie 100 μl surowicy na studzienkę rozcieńcza się w buforze rozcieńczającym i umieszcza na płytkach naładowanych peptydem i płytkach kontrolnych, po czym płytki inkubuje się. Następnie studzienki płucze w sposób opisany powyżej. Związane przeciwciała wykrywa się za pomocą koziego przeciwciała skierowanego przeciwko ludzkiej immunoglobulinie G, sprzężonego z peroksydazą. W tym celu przeciwciało rozcieńcza się w buforze rozcieńczającym i inkubuje (100 μl/studzienkę), po czym przeprowadza się trzykrotne płukanie (zob. powyżej). Po dodaniu 100 μl gotowego do użycia roztwóru substratu (na przykład 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny) rozwija się zabarwienie, w zależności od ilości peroksydazy w studzience: reakcję substratu określa się przez dodanie 100 μl 0,5 M kwasu siarkowego. Oznacza się absorpcję przy długości fali 450 nm. Ocenia się różnicę absorpcji między płytką do mikromiareczkowania naładowaną peptydem a płytką kontrolną. Próbki o absorpcji większej od wartości odcięcia uznaje się za dodatnie. Wartość odcięcia oblicza się ze średniej wartości absorpcji dawców ujemnych plus trzykrotność odchylenia standardowego. Ogólnie w teście jednocześnie przeprowadza się kontrolę wartości odcięcia lub serię rozcieńczeń standardowych, umożliwiające oznaczanie ilościowe w jednostkach względnych.

20 20 Przykład II Różne grupy pacjentów (z dodatnim rozpoznaniem), jak również osoby z grupy kontrolnej, badano pod kątem obecności lub nieobecności przeciwciała przeciwko receptorowi AT1. Otrzymane wyniki ukazano w Tabeli I. Tabela 1 Choroba Obecność przeciwciała przeciwko receptorowi AT1 w % Choroba reumatyczna 35 Pacjenci bez zapalnej choroby 8,3 reumatycznej Wykaz sekwencji <110> Celltrend GmbH <120> Sposób rozpoznawania z wykorzystaniem przeciwciała przeciwko receptorowi AT 1 <130> FBP17498 <160> 3 <170> PatentIn wersja 3.3 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Val His Tyr Gln Ser Asn 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens

21 21 <400> 2 Ser His Phe Tyr Gln Thr Arg 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Tyr Tyr Phe Asp Thr Asn 1 5 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób rozpoznawania zapalnej choroby reumatycznej, w którym określa się obecność lub nieobecność przeciwciała przeciwko podtypowi 1 angiotensyny II w próbce pobranej od poddawanego diagnostyce pacjenta, przy czym obecność podtypu 1 przeciwciała przeciwko angiotensynie II wskazuje na istnienie choroby. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zapalna choroba reumatyczna jest wybrana z grupy składającej się z reumatoidalngo zapalenia stawów, fibromialgii, liszaja rumieniowatego, zespół bólu wielomięśniowego, postępującej twardziny układowej, zespołu Sjögrena, układowego liszaja rumieniowatego i zapalenie stawów. 3. Sposób według zastrz. 1 i 2, znamienny tym, że oznaczenia obecności lub nieobecności przeciwciała przeciwko podtypowi 1 receptora angiotensyniy II dokonuje się przez wykrywanie jednego lub więcej

22 22 niż jednego przeciwciała wybranego z grupy obejmującej przeciwciało IgA, przeciwciało IgG i przeciwciało IgM. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że przeciwciało IgG wybiera się z grupy obejmującej IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. 5. Sposób według zastrz. od 1 do 4, znamienny tym, że test immunologiczny wybiera się z grupy obejmującej immunoprecypitację, enzymatyczny test immunologiczny (EIA), test radioimmunologiczny (RIA) lub fluorescencyjny test immunologiczny, test chemiluminescyjny, test aglutynacyjny, test nefelometryczny, test turbidymetryczny, Western Blot, kompetycyjny test immunologiczny, niekompetycyjny test immunologiczny, homogenny test immunologiczny, heterogenny test immunologiczny, test biologiczny i test reporterowy. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że testem reporterowym jest test lucyferazowy. 7. Sposób według zastrz. 5 i 6, znamienny tym, że testem immunologicznym jest ELISA. 8. Zastosowanie peptydu przeciwko receptorowi podtypu 1 angiotensyny II do diagnostyki in vitro zapalnej choroby reumatycznej. 9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że zapalna choroba reumatyczna jest wybrana z grupy składającej się z reumatoidalnego zapalenie stawów, fibromialgii, liszaja rumieniowatego, zespołu bólu wielomięśniowego, postępującej twardziny uogólnionej, zespołu Sjögrena,

23 23 uogólnionego liszaja rumieniowatego i zapalenia stawów. 10. Zastosowanie zestawu diagnostycznego do diagnostyki in vitro zapalnej choroby reumatycznej, znamienne tym, że zestaw zawiera peptyd receptora podtypu 1 angiotensyny II. 11. Zastosowanie zestawu diagnostycznego według zastrz. 10, znamienne tym, że zapalna choroba reumatyczna należy do grupy składającej się z reumatoidalnego zapalenia stawów, fibromialgii, liszaja rumieniowatego, zespołu bólu wielomięśniowego, postępującą twardzinę układowej, zespołu Sjögrena, układowego liszaja rumieniowatego i zapalenia stawów. Celltrend GmbH Zastępca: