(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11)

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US97/00759 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , W097/26010, PCT Gazette nr 32/97 (13) B1 (51) IntCl7 A61K 39/395 C12N 5/12 Zastosowanie przeciwciała monoklonalnego, przeciwciało monoklonalne, hybrydoma, neutralizujący fragment Fab lub fragment F(ab )2, region determinujący dopasowanie (54) łańcucha ciężkiego, region determinujący dopasowanie łańcucha lekkiego, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca region determinujący dopasowanie, zmienione przeciwciało, przeciwciało chimeryczne i kompozycja farmaceutyczna (30) Pierwszeństwo: ,US,60/ ,US,60/ (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 01/99 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 06/04 (73) Uprawniony z patentu: SMITHKLINE BEECHAM CORPORATION, King of Prussia, US UNIVERSITY OF VERMONT AND STATE AGRICULTURAL COLLEGE, Burlington, US (72) Twórcy wynalazku: Michael N. Blackburn, Phoenixville, US William R. Church, Burlington, US Giora Z. Feuerstein, Wynnewood, US Mitchell S. Gross, Wayne, US Andrew J. Nicholas, Chester Springs, US Eduardo A. Padlan, Kensington, US Arunbhai H. Patel, Phoenixville, US Daniel R. Sylvester, Phoenixville, US (74) Pełnomocnik: Bartnik Urszula, POLSERVICE PL B1 (57) 1. Zastosowanie przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia posiadającego samoograniczającą się aktywność neutralizowania do wytwarzania leku do hamowania zakrzepicy u ludzi i zwierząt. 11. Przeciwciało monoklonalne stanowiące środek przeciwkrzepliwy o samoograniczającej się aktywności w stosunku do czynnika krzepnięcia skierowane przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia. 18. Hybrydoma, znamienna tym, że ma charakterystykę identyfikującą linii komórkowej 9E4(2)F4 lub 11G4(1)B Neutralizujący fragment Fab lub fragment F(ab )2, znamienny tym, że jest wytworzony na drodze przegrupowania łańcuchów, prowadzącego do ekspresji łańcucha ciężkiego Fd przeciwciała monoklonalnego w reprodukcyjnej bibliotece Fab lekkiego łańcucha faga włóknistego myszy.

2 Zastosowanie przeciwciała monoklonalnego, przeciwciało monoklonalne, hybrydoma, neutralizujący fragment Fab lub fragment F (ab')2, region determinujący dopasowanie łańcucha ciężkiego, region determinujący dopasowanie łańcucha lekkiego, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca region determinujący dopasowanie, zmienione przeciwciało, przeciwciało chimeryczne i kompozycja farmaceutyczna Zastrzeżenia patentowe 1. Zastosowanie przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia posiadającego samoograniczającą się aktywność neutralizowania do wytwarzania leku do hamowania zakrzepicy u ludzi i zwierząt. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek zawiera dodatkowo kwas acetylosalicylowy. 3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciałem monoklonalnym jest przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikom krzepnięcia wybranym z grupy: czynnik IX, czynnik IXa, czynnik X, czynnik Xa, czynnik XI, czynnik XIa, czynnik VIII, czynnik Villa, czynnik V, czynnik Va. 4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciałem monoklonalnym jest przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikom krzepnięcia wybranym z grupy: czynnik VII, czynnik VIIa lub anty-trombina. 5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciałem monokolnalnym jest przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikowi IX. 6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikowi IX ma charakterystykę identyfikacyjną SB , SB , SB , SB , SB lub SB Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikowi IX ma charakterystykę identyfikacyjną SB Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (aptt) zostaje wydłużony bez znaczniejszego wydłużenia czasu protrombinowego (PT). 9. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że aptt wynosi od około 35 sekund do około sekund. 10. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek przeznaczony jest do leczenia zakrzepicy związanej z zawałem mięśnia serca, niestabilną dusznicą bolesną, migotaniem przedsionków, udarem mózgu, uszkodzeniem nerek, zakrzepem tętnicy płucnej, zakrzepicą żył głębokich, przezskórną angioplastyką wieńcową, zespołem rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego, posocznicą, obecnością sztucznych narządów, przetok i protez. 11. Przeciwciało monoklonalne stanowiące środek przeciwkrzepliwy o samoograniczającej się aktywności w stosunku do czynnika krzepnięcia skierowane przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia. 12. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 11, znamienne tym, że jest skierowane przeciw czynnikom krzepnięcia wybranym z grupy czynnik IX, czynnik IXa, czynnik X, czynnik Xa, czynnik XI, czynnik XIa, czynnik VIII, czynnik Villa, czynnik V, czynnik Va. 13. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 11, znamienne tym, że jest skierowane przeciw czynnikom krzepnięcia wybranym z grupy czynnik VII, czynnik VIIa lub anty-trombina. 14. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 11, znamienne tym, że monoklonalnym przeciwciałem stanowiącym środek przeciwkrzepliwy jest przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikowi IX. 15. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 14, znamienne tym, że ma charakterystykę identyfikującą SB , SB , SB , SB , SB , SB

3 Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 14, znamienne tym, że ma charakterystykę identyfikującą: 9E4(2)F4 lub 11G4(1)B Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 14, znamienne tym, że ma charakterystykę identyfikującą SB Hybrydoma, znamienna tym, że ma charakterystykę identyfikującą linii komórkowej 9E4(2)F4 lub 11G4(1)B Neutralizujący fragment Fab, lub fragment F(ab')2, delecyjnie pozbawiony regionu Fc przeciwciała monoklonalnego stanowiącego środek przeciwkrzepliwy o samoograniczającej się aktywności w stosunku do czynnika krzepnięcia skierowane przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia. 20. Neutralizujący fragment Fab lub fragment F(ab')2, znamienny tym, że jest wytworzony na drodze przegrupowania łańcuchów, prowadzącego do ekspresji łańcucha ciężkiego Fd przeciwciała monoklonalnego w reprodukcyjnej bibliotece Fab lekkiego łańcucha faga włóknistego myszy. 21. Neutralizujący fragment Fab lub fragment F(ab')2, znamienny tym, że jest wytworzony na drodze przegrupowania łańcuchów, w wyniku którego łańcuch lekki przeciwciała monoklonalnego stanowiącego środek przeciwkrzepliwy o samoograniczającej się aktywności w stosunku do czynnika krzepnięcia skierowanego przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia, ulega ekspresji w reprodukcyjnej bibliotece Fab ciężkiego łańcucha faga włóknistego myszy. 22. Region determinujący dopasowanie łańcucha ciężkiego immunoglobuliny o sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej SEQ ID NO NO: 8, 9 i Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca region determinujący dopasowanie immunoglobuliny o sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej SEQ ID NO NO: 8, 9 i Region determinujący dopasowanie łańcucha lekkiego immunoglobuliny o sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej SEQ NO NO: 12, 13 i Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca region determinujący dopasowanie immunoglobuliny o sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej SEQ NO NO: 12, 13 i Zmienione przeciwciało, zawierające łańcuch ciężki i łańcuch lekki, w którym regiony ramki odczytu wspomnianego łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego pochodzą z co najmniej jednego wybranego przeciwciała, a sekwencje aminokwasów regionów determinujących dopasowanie każdego ze wspomnianych łańcuchów pochodzą z przeciwciała monoklonalnego. 27. Zmienione przeciwciało według zastrz. 26, znamienne tym, że jest humanizowane. 28. Humanizowane przeciwciało według zastrz. 27, znamienne tym, że łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 31, 52 lub Humanizowane przeciwciało według zastrz. 27, znamienne tym, że łańuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 44, 57, 62, 74, 78 lub Humanizowane przeciwciało według zastrz. 27, znamienne tym, że łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 31, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: Humanizowane przeciwciało według zastrz. 27, znamienne tym, że łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przestawioną w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: Humanizowane przeciwciało według zastrz. 27, znamienne tym, że łańcuch ciężki ma sekwencją aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: Humanizowane przeciwciało według zastrz. 27, znamienne tym, że łańcuch ciężki na sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: Humanizowane przeciwciało według zastrz. 27, znamienne tym, że łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 78.

4 Humanizowane przeciwciało według zastrz. 27, znamienne tym, że łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 89, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: Przeciwciało chimeryczne zawierające łańcuch ciężki i łańcuch lekki, znamienne tym, że hamuje działanie czynników krzepnięcia pochodzących z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia w sposób samoograniczajacy się, a regiony stałe wspomnianych łańcuchów ciężkiego i lekkiego pochodzą z co najmniej jednego wybranego przeciwciała, a sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych każdego ze wspomnianych łańcuchów pochodzą z przeciwciała monoklonalnego stanowiącego środek przeciwkrzepliwy o samoograniczającej się aktywności w stosunku do czynnika krzepnięcia i które skierowane jest przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia. 37. Przeciwciało według zastrz. 36, znamienne tym, że regiony stałe wybrane są spośród immunoglobulin ludzkich. 38. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera humanizowane przeciwciało obejmujące łańcuch ciężki i łańcuch lekki, w którym regiony ramki odczytu wspomnianego łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego pochodzą z co najmniej jednego wybranego przeciwciała, przy czym sekwencje aminokwasów regionów determinujących dopasowanie każdego ze wspomnianych łańcuchów pochodzą z przeciwciała monoklonalnego, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. 39. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera przeciwciało chimeryczne obejmujące łańcuch ciężki i łańcuch lekki, charakteryzujące się tym, że hamuje działanie czynników krzepnięcia pochodzących z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia w sposób samoograniczający się, a regiony stałe wspomnianych łańcuchów ciężkiego i lekkiego pochodzą z co najmniej jednego wybranego przeciwciała, przy czym sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych każdego ze wspomnianych łańcuchów pochodzą z przeciwciała monoklonalnego stanowiącego środek przeciwkrzepliwy o samoograniczającej się aktywności w stosunku do czynnika krzepnięcia i które skierowane jest przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. 40. Kompozycja według zastrz. 39, znamienna tym, że regiony stałe wybrane są spośród immunoglobulin ludzkich. 41. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 40, znamienna tym, że zawiera ponadto kwas acetylosalicylowy. * * * Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie przeciwciała monoklonalnego (PM), przeciwciało monoklonalne, hybrydoma, neutralizujący fragment Fab lub fragment F(ab')2, region determinujący dopasowanie łańcucha ciężkiego, region determinujący dopasowanie łańcucha lekkiego, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca region determinujący dopasowanie, zmienione przeciwciało, przeciwciało chimeryczne i kompozycja farmaceutyczna. Przeciwciała te są skierowane przeciwko czynnikom krzepnięcia i wiążąc się z ludzkim czynnikiem lub kofaktorem krzepnięcia mają zastosowanie jako samoograniczające się inhibitory zakrzepicy. W prawidłowych warunkach mniejszy lub większy uraz wyzwala w komórkach śródbłonka naczyniowego, wyściełających naczynie krwionośne, reakcję hemostatyczną poprzez sekwencję zjawisk zwaną powszechnie kaskadą krzepnięcia. Kulminacją tej kaskady jest przejście rozpuszczalnego fibrynogenu w nierozpuszczalną fibrynę, która, wraz z płytkami, tworzy miejscową skrzeplinę, czyli zakrzep, zapobiegający wynaczynianiu się składników krwi. Może następnie dojść do gojenia się rany, i potem do rozpuszczenia skrzepliny i przywrócenia integralności naczynia krwionośnego oraz przepływu.

5 Reakcje zachodzące między urazem a wytworzeniem zakrzepu stanowią precyzyjnie regulowany i związany ze sobą ciąg. Pokrótce, we krwi krążącej znajduje się pewna ilość osoczowych białek krzepnięcia w postaci nieaktywnych proenzymów oraz czynniki krzepnięcia. W miejscu urazu gromadzą się aktywne kompleksy enzymatyczne, aktywowane następnie do proteaz serynowych, przy czym każda kolejna proteaza serynowa katalizuje aktywację kolejnego proenzymu do proteazy. Wynikiem tej kaskady enzymatycznej jest to, że każdy kolejny etap zwielokrotnia działanie następnego etapu. Kaskadę krzepnięcia omówiono ogólnie w pierwszym rozdziale Thrombosis and Hemorrhage, pod red. J. Loscalzo i A. Schafer, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Anglia (1994). O ile skuteczne krzepnięcie krwi zmniejsza utratę krwi w miejscu urazu, nieprawidłowe tworzenie zakrzepów w tętnicach lub żyłach jest częstą przyczyną kalectwa i zgonu. Nieprawidłowa aktywność krzepnięcia może być spowodowana przez pewne stany chorobowe i pewne rodzaje terapii (może ona również powodować niektóre z tych stanów chorobowych), jak zawał mięśnia serca, niestabilna dusznica bolesna, migotanie przedsionków, udar mózgu, uszkodzenie nerek, przezskóma angioplastyka wieńcowa, zespół rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego, posocznica, zakrzep tętnicy płucnej i zakrzepica żył głębokich. Problemem jest również tworzenie się zakrzepów na powierzchniach ciał obcych, a mianowicie sztucznych narządów, przetok i protez, na przykład na powierzchni sztucznych zastawek serca. Do obecnie stosowanych, zarejestrowanych środków przeciwkrzepliwych, używanych w leczeniu tych stanów chorobowych, oraz innych zaburzeń zakrzepowo-zatorowych, należą sulfonowane heteropolisacharydy heparyny oraz heparyna o niskiej masie cząsteczkowej (low molecular weight - LMW). Środki te podaje się pozajelitowo; mogą one powodować szybkie i pełne hamowanie krzepnięcia poprzez aktywację inhibitora trombiny, antytrombiny III, oraz unieczynnienie wszystkich czynników krzepnięcia. Heparyna i heparyna LMW, z powodu swej siły działania, mają jednak pewne wady. Głównym powikłaniem jest niekontrolowane krwawienie wskutek prostych ruchów lub kontaktu z przedmiotami, lub krwawienie w miejscach po zabiegu operacyjnym; powikłanie to obserwuje się u 1-7% pacjentów otrzymujących wlew ciągły i u 8-14% pacjentów otrzymujących heparynę okresowo, w postaci bolusów. W celu zmniejszenia do minimum tego ryzyka dokonuje się częstych pobrań krwi w celu ciągłego nadzorowania czasu krzepnięcia, co znacznie powiększa koszt leczenia i dyskomfort pacjenta. Ponadto, zakres terapeutyczny, zapewniający korzystny poziom skuteczności, bez narażania pacjenta na ryzyko krwawienia, jest wąski. Zakres terapeutyczny wynosi od około 1 do poniżej 3 μg heparyny/ml osocza, co powoduje wydłużenie czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji (aptt) do wartości od około 35 do około 100 sekund. Zwiększenie stężenia heparyny do 3 μg/ml powoduje przekroczenie zakresu terapeutycznego, a przy stężeniu powyżej 4 μg/ml nie wykrywa się aktywności krzepnięcia. Tak więc należy zachować dużą ostrożność, tak aby utrzymać stężenie środka w osoczu pacjenta w zakresie terapeutycznym. Innym zarejestrowanym środkiem przeciwkrzepliwym, o powolniejszym i bardziej długotrwałym działaniu, jest warfaryna, pochodna kumaryny. Warfaryna działa poprzez konkurencję z zależną od witaminy K posttranslacyjną modyfikacją protrombiny i innych czynników krzepnięcia zależnych od witaminy K. W przypadku warfaryny, podobnie jak w przypadku heparyny i heparyny LMW, ogólny wzorzec działania przeciwkrzepliwego jest taki, że przy stężeniu nieznacznie tylko przekraczającym zakres terapeutyczny dochodzi do całkowitego zahamowania krzepliwości krwi. Wobec tego istnieje niewątpliwie potrzeba opracowania przeciwkrzepliwego skutecznego w leczeniu zaburzeń zakrzepowo-zatorowych leku, który nie stwarzałby zagrożenia niekontrolowanego krwawienia. Zgodnie z powyższym, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia posiadającego samoogranicząjącą się aktywność neutralizowania do wytwarzania leku do hamowania zakrzepicy u ludzi i zwierząt. Lek ten może zawierać dodatkowo kwas acetylosalicylowy.

6 W korzystnym wykonaniu wynalazku przeciwciałem monoklonalnym jest przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikom krzepnięcia wybranym z grupy: czynnik IX, czynnik IXa, czynnik X, czynnik Xa, czynnik XI, czynnik XIa, czynnik VIII, czynnik Villa, czynnik V, czynnik Va, oraz równie korzystnie przeciwciałem monoklonalnym jest przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikom krzepnięcia wybranym z grupy: czynnik VII, czynnik VIIa lub anty-trombina. Także korzystnie przeciwciałem monokolnalnym jest przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikowi IX. W bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikowi IX ma charakterystykę identyfikacyjną SB , SB , SB , SB , SB lub SB , lub przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikowi IX ma charakterystykę identyfikacyjną SB Inną korzystną cechą wynalazku jest to, że czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (aptt) zostaje wydłużony bez znaczniejszego wydłużenia czsu protrombinowego (PT), a jeszcze bardziej korzystnie aptt wynosi od około 35 sekund do około 100 sekund. Innym korzystnym aspektem wynalazku jest to, że lek przeznaczony jest do leczenia zakrzepicy związanej z zawałem mięśnia serca, niestabilną dusznicą bolesną, migotaniem przedsionków, udarem mózgu, uszkodzeniem nerek, zakrzepem tętnicy płucnej, zakrzepicą żył głębokich, przezskórną angioplastyką wieńcową, zespołem rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego, posocznicą, obecnością sztucznych narządów, przetok i protez. Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało monoklonalne stanowiące środek przeciwkrzepliwy o samoograniczającej się aktywności w stosunku do czynnika krzepnięcia skierowane przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia. Przeciwciało monoklonalne według wynalazku charakteryzuje się tym, że korzystnie jest skierowane przeciw czynnikom krzepnięcia wybranym z grupy czynnik IX, czynnik IXa, czynnik X, czynnik Xa, czynnik XI, czynnik XIa, czynnik VIII, czynnik Villa, czynnik V, czynnik Va. Przeciwciało według wynalazku może być skierowane przeciw czynnikom krzepnięcia wybranym z grupy czynnik VII, czynnik VIIa lub anty-trombina. Bardziej korzystnie monoklonalnym przeciwciałem stanowiącym środek przeciwkrzepliwy jest przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw czynnikowi IX, a najbardziej korzystnie przeciwciało monoklonalne według wynalazku ma charakterystykę identyfikującą SB , SB , SB , SB , SB , SB , lub również korzystnie ma charakterystykę identyfikującą: 9E4(2)F4 lub 11G4(1)B9, ewentualnie ma charakterystykę identyfikującą SB Przedmiotem wynalazku jest hybrydoma, charakteryzująca się tym, że ma charakterystykę identyfikującą linii komórkowej 9E4(2)F4 lub 11G4(1)B9. Przedmiotem wynalazku jest neutralizujący fragment Fab, lub fragment F(ab')2, delecyjnie pozbawiony regionu Fc przeciwciała monoklonalnego stanowiącego środek przeciwkrzepliwy o samoograniczającej się aktywności w stosunku do czynnika krzepnięcia skierowane przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia. Przedmiotem wynalazku jest również neutralizujący fragment Fab lub fragment F(ab')2, który jest wytworzony na drodze przegrupowania łańcuchów, prowadzącego do ekspresji łańcucha ciężkiego Fd przeciwciała monoklonalnego w reprodukcyjnej bibliotece Fab lekkiego łańcucha faga włóknistego myszy. Przedmiotem wynalazku jest także neutralizujący fragment Fab lub fragment F(ab')2, który jest wytworzony na drodze przegrupowania łańcuchów, w wyniku którego łańcuch lekki przeciwciała monoklonalnego stanowiącego środek przeciwkrzepliwy o samoograniczającej się aktywności w stosunku do czynnika krzepnięcia skierowanego przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia, ulega ekspresji w reprodukcyjnej bibliotece Fab ciężkiego łańcucha faga włóknistego myszy. Przedmiotem wynalazku jest region determinujący dopasowanie łańcucha ciężkiego immunoglobuliny o sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej SEQ ID NO NO: 8, 9 i 10.

7 Kolejnym przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca region determinujący dopasowanie immunoglobuliny o sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej SEQ ID NO NO: 8, 9 i 10. Następnym przedmiotem wynalazku jest region determinujący dopasowanie łańcucha lekkiego immunoglobuliny o sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej SEQ NONO: 12, 13 i 14. Przedmiotem wynalazku jest także cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca region determinujący dopasowanie immunoglobuliny o sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej SEQ NO NO: 12, 13 i 14. Przedmiotem wynalazku jest zmienione przeciwciało, zawierające łańcuch ciężki i łańcuch lekki, w którym regiony ramki odczytu wspomnianego łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego pochodzą z co najmniej jednego wybranego przeciwciała, a sekwencje aminokwasów regionów determinujących dopasowanie każdego ze wspomnianych łańcuchów pochodzą z powyżej zdefiniowanego przeciwciała monoklonalnego. Korzystną postacią zmienionego przeciwciała jest przeciwciało humanizowane. Korzystnie to humanizowane przeciwciało charakteryzuje się tym, że łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 31, 52 lub 89 lub humanizowane przeciwciało według wynalazku ma łańuch lekki o sekwencji aminokwasów przedstawionej w SEQ ID NO: 44, 57, 62, 74, 78 lub 99. Jeszcze inną korzystną odmianą zmienionego przeciwciała jest humanizowane przeciwciało charakteryzujące się tym, że łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 31, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 44. Następną korzystną odmianą zmienionego przeciwciała jest humanizowane przeciwciało charakteryzujące się tym, że łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przestawioną w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 57. Kolejną odmianą zmienionego przeciwciała jest humanizowane przeciwciało charakteryzujące się tym, że łańcuch ciężki ma sekwencją aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 62. Następną odmianą korzystną zmienionego przeciwciała może być humanizowane przeciwciało, w którym łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 74, lub też łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 78. Możliwa jest też taka korzystna odmiana humanizowanego przeciwciała, że łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 89, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 99. Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało chimeryczne zawierające łańcuch ciężki i łańcuch lekki, charakteryzujące się tym, że hamuje działanie czynników krzepnięcia pochodzących z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia w sposób samoograniczający się, a regiony stałe wspomnianych łańcuchów ciężkiego i lekkiego pochodzą z co najmniej jednego wybranego przeciwciała, a sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych każdego ze wspomnianych łańcuchów pochodzą z przeciwciała monoklonalnego stanowiącego środek przeciwkrzepliwy o samoograniczającej się aktywności w stosunku do czynnika krzepnięcia i które skierowane jest przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia. Korzystnie w przeciwciele według wynalazku regiony stałe wybrane są spośród immunoglobulin ludzkich. Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera humanizowane przeciwciało stanowiące łańcuch ciężki i łańcuch lekki, w którym regiony ramki odczytu wspomnianego łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego pochodzą z co najmniej jednego wybranego przeciwciała, a sekwencje aminokwasów regionów determinujących dopasowanie każdego ze wspomnianych łańcuchów pochodzą z powyżej zdefiniowanego przeciwciała monoklonalnego oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Kompozycja ta może zawierać ponadto kwas acetylosalicylowy.

8 Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera przeciwciało chimerycznie obejmujące łańcuch ciężki i łańcuch lekki, hamujące działanie czynników krzepnięcia pochodzących z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia w sposób samoograniczający się, a regiony stałe wspomnianych łańcuchów ciężkiego i lekkiego pochodzą z co najmniej jednego wybranego przeciwciała, przy czym sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych każdego ze wspomnianych łańcuchów pochodzą z przeciwciała monoklonalnego stanowiącego środek przeciwkrzepliwy o samoograniczającej się aktywności w stosunku do czynnika krzepnięcia i jest skierowane przeciwko czynnikom krzepnięcia pochodzącym z układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie, regiony stałe mogą być wybrane spośród immunoglobulin ludzkich. Również korzystnie kompozycje te mogą zawierać dodatkowo kwas acetylosalicylowy. Krótki opis rysunków. Figura 1 stanowi wykres wyników doświadczalnych, przedstawiający miareczkowanie prawidłowego osocza ludzkiego mysimi PM BC1, i BC2, skierowanymi przeciwko czynnikowi IX. Figura 2 stanowi wykres wyników doświadczalnych, przedstawiający miareczkowanie prawidłowego osocza ludzkiego mysimi PM 9E4(2)F4 i 11G4(1)B9, skierowanymi przeciwko czynnikowi IX. Figura 3 stanowi wykres wyników doświadczalnych, przedstawiający miareczkowanie prawidłowego osocza ludzkiego mysimi PM HFXHC i HFXLC, skierowanymi przeciwko czynnikowi X, i mysimi PM HFXI, skierowanymi przeciwko czynnikowi XI. Figura 4 stanowi wykres kolumnowy wyników doświadczalnych, przedstawiający wpływ heparyny, kwasu acetylosalicylowego i mysiego PM skierowanego przeciwko czynnikowi IX, na czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (aptt) po 60 minutach w modelu zakrzepicy tętnic szyjnych u szczura. Figura 5 stanowi wykres kolumnowy wyników doświadczalnych, przedstawiający wpływ heparyny, kwasu acetylosalicylowego i mysiego PM skierowanego przeciwko czynnikowi IX, na czas protrombinowy po 60 minutach w modelu zakrzepicy tętnic szyjnych u szczura. Figura 6 stanowi wykres kolumnowy wyników doświadczalnych, przedstawiający wpływ heparyny, kwasu acetylosalicylowego i mysiego PM skierowanego przeciwko czynnikowi IX, na zamknięcie przepływu w tętnicy szyjnej w modelu zakrzepicy tętnic szyjnych u szczura. Figura 7 stanowi wykres kolumnowy wyników doświadczalnych, przedstawiający wpływ heparyny, kwasu acetylosalicylowego i mysiego PM skierowanego przeciwko czynnikowi IX, na ciężar skrzepliny w modelu zakrzepicy tętnic szyjnych u szczura. Figura 8 stanowi wykres kolumnowy wyników doświadczalnych, przedstawiający wpływ heparyny, mysiego PM BC2 skierowanego przeciwko czynnikowi IX, chimerycznego PM skierowanego przeciwko czynnikowi IX i humanizowanego PM skierowanego przeciwko czynnikowi IX na czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (aptt) po 60 minutach w modelu zakrzepicy tętnic szyjnych u szczura. Figura 9 stanowi wykres kolumnowy wyników doświadczalnych, przedstawiający wpływ heparyny, mysiego PM BC2 skierowanego przeciwko czynnikowi IX, chimerycznego PM skierowanego przeciwko czynnikowi IX i humanizowanego PM skierowanego przeciwko czynnikowi IX na ciężar skrzepliny w modelu zakrzepicy tętnic szyjnych u szczura. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie przeciwciała monoklonalnego, zmienione przeciwciała i fragmenty przeciwciał, skierowane przeciwko czynnikom krzepnięcia, cechujące się samoograniczającą aktywnością neutralizującą. Korzystnie, czynnik krzepnięcia należy do układu wewnątrzpochodnego lub części wspólnej kaskady krzepnięcia. Najkorzystniej, przeciwciała skierowane przeciwko czynnikom krzepnięcia stanowią przeciwciała skierowane przeciwko następującym czynnikom: czynnik IX, czynnik IXa, czynnik X, czynnik Xa, czynnik XI, czynnik XIa, czynnik VIII, czynnik Villa, czynnik V, czynnik Va, czynnik VII, czynnik VIIa oraz przeciwko trombinie. Szczególnie korzystne są przeciwciała skierowane przeciwko czynnikowi IX. Przykład przeciwciał skierowanych przeciwko czynnikom krzepnięcia stanowią humanizowane korzystnie, należącym do wewnątrzpochodnego układu krzepnięcia lub części wspólnej kaskady krzepnięcia, w tym z czynnikami IX/IXa, X/Xa,

9 XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa oraz z trombiną, i hamującego zakrzepicę w taki sposób, że zapewnia się ograniczoną modulację krzepnięcia. Ograniczona modulacja krzepnięcia oznacza wydłużenie czasu krzepnięcia, którego miarą jest wydłużenie czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji (aptt), przy czym osocze zachowuje zdolność do krzepnięcia przy maksymalnej wartości aptt mimo zwiększania stężenia przeciwciała monoklonalnego. Ta ograniczona modulacja krzepnięcia różni się zasadniczo od działania nadmiernego stężenia heparyny na osocze, w wyniku którego osocze traci zdolność do krzepnięcia i wykazuje nieskończone wartości aptt. Korzystnie, maksymalna wartość aptt w sposobach według niniejszego wynalazku pozostaje w zakresie terapeutycznym heparyny. Najkorzystniej, maksymalny aptt pozostaje w zakresie od około 35 sek. do około 100 sek., co odpowiada wydłużeniu aptt od około 1,5 do około 3,5 raza w porównaniu z prawidłową próbką kontrolną. W jednym z wykonań niniejszego wynalazku dochodzi do wydłużenia aptt bez istotnego wydłużenia czasu protrombinowego (PT). Zmienione przeciwciało oznacza białko kodowane przez zmieniony region kodujący immunoglobuliny, który można uzyskać poprzez ekspresję w dobranej komórce gospodarza. Do takich zmienionych przeciwciał należą przeciwciała wytwarzane technikami inżynierii genetycznej (na przykład przeciwciała chimeryczne lub humanizowane), lub fragmenty przeciwciał, w których brak jest całości lub fragmentu części stałej immunoglobuliny, na przykład Fv, Fab, Fab' lub F(ab')2, lub tym podobne. Zmieniony region kodujący immunoglobuliny oznacza sekwencję kwasu nukleinowego, kodującą zmienione przeciwciało według niniejszego wynalazku. Kiedy zmienione przeciwciało stanowi przeciwciało przeszczepione przez CDR lub humanizowane, sekwencje kodujące regiony determinujące dopasowanie (CDR), z immunoglobulin nie pochodzących od człowieka, wprowadza się do pierwszego partnera immunoglobuliny, zawierającego ludzkie zmienne sekwencje ramek odczytu. Ewentualnie, pierwszy partner immunoglobuliny jest połączony, w sposób umożliwiający działanie, z drugim partnerem immunoglobuliny. Pierwszy partner immunoglobuliny oznacza sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ludzką ramkę odczytu lub ludzką część zmienną immunoglobuliny, w których natywne (to znaczy występujące w naturze) regiony kodujące CDR zastąpiono regionami kodującymi CDR przeciwciała-dawcy. Ludzka część zmienna może stanowić łańcuch ciężki immunoglobuliny, łańcuch lekki (lub oba łańcuchy), ich analog lub funkcjonalne fragmenty. Takie regiony CDR, umiejscowione w części zmiennej przeciwciał (immunoglobulin), można oznaczać sposobami znanymi ze stanu techniki. Na przykład Kabat i wsp., w Seąuences of Proteins of Immunological Interest, wyd. IV, US Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987) opisał zasady lokalizowania CDR. Ponadto znane są programy komputerowe, za pomocą których można identyfikować regiony/struktury CDR. Drugi partner immunoglobuliny oznacza inną sekwencję nukleotydową kodującą białko lub peptyd, w którym pierwszy partner immunoglobuliny uległ fuzji w ramce lub poprzez konwencjonalną sekwencję łącznikową (to znaczy, z którym jest on związany w sposób umożliwiający działanie). Korzystnie, stanowi go gen immunoglobuliny. Drugi partner immunoglobuliny może stanowić sekwencja kwasu nukleinowego, kodująca całą część stałą dla tego samego (to znaczy homologicznego, przy czym zmienione przeciwciała pierwsze i drugie pochodzą z tego samego źródła) lub dodatkowego (to znaczy heterologicznego) przeciwciała. Może nim być łańcuch ciężki lub lekki immunoglobuliny (lub oba łańcuchy jako część jednego polipeptydu). Drugi partner immunoglobuliny nie jest ograniczony do konkretnej klasy lub izotypu immunoglobulin. Ponadto, drugi partner immunoglobuliny może zawierać fragment części stałej immunoglobuliny, taki na przykład jak znajduje się w Fab lub F(ab')2 (to znaczy, fragment odpowiedniej ludzkiej części stałej lub ramki odczytu). Taki drugi partner immunoglobuliny może również zawierać sekwencję kodującą, integralne białko błony komórkowej, znajdujące się na zewnętrznej powierzchni komórki gospodarza, na przykład jako część biblioteki faga, lub sekwencję kodującą białko do wykrywania diagnostycznego lub analitycznego, na przykład peroksydazę chrzanową, β-galaktozydazę itd.

10 Terminów Fv, Fc, Fd, Fab, Fab' i F(ab')2 używa się w ich konwencjonalnym znaczeniu. Por. na przykład Harlow i wsp., Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988). W rozumieniu niniejszego opisu przeciwciało wytworzone technikami inżynierii genetycznej oznacza rodzaj zmienionego przeciwciała, to znaczy przeciwciała syntetycznego o pełnej długości (na przykład, przeciwciało chimeryczne lub humanizowane, w przeciwieństwie do fragmentu przeciwciała), w którym fragmenty części zmiennych łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego wybranego przeciwciała-biorcy zastąpiono analogicznymi częściami jednego lub więcej przeciwciał-dawców, swoistych względem dobranego epitopu. Do takich cząsteczek należą na przykład przeciwciała cechujące się humanizowanym łańcuchem ciężkim, połączonym z niezmienionym łańcuchem lekkim (lub chimerycznym łańcuchem lekkim), lub odwrotnie. Przeciwciała wytworzone technikami inżynierii genetycznej charakteryzują się również zmianą sekwencji kwasu nukleinowego, kodujących ramki odczytu części zmiennych łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego przeciwciała-biorcy w celu zachowania swoistości wiązania przeciwciała-dawcy. Przeciwciała takie mogą zawierać podstawienie jednego lub kilku CDR (korzystnie, wszystkich) z przeciwciał-biorców przez CDR pochodzące z opisanych przeciwciał-dawców. Przeciwciało chimeryczne oznacza rodzaj przeciwciała wytworzonego technikami inżynierii genetycznej, zawierającego naturalnie występującą część zmienną (łańcuch lekki i łańcuchy ciężkie) pochodzącą z przeciwciała-dawcy, w połączeniu z częściami stałymi łańcuchów lekkich i ciężkich, pochodzących z przeciwciał-biorców. Przeciwciało humanizowane oznacza rodzaj przeciwciała wytworzonego technikami inżynierii genetycznej, którego CDR pochodzą z immunoglobuliny-dawcy, nie pochodzącej od człowieka, przy czym pozostałe fragmenty cząsteczki, pochodzące z immunoglobulin, pochodzą z jednej lub więcej immunoglobulin ludzkich. Ponadto, pozostałe, wspierające części ramek odczytu są zmienione dla zachowania powinowactwa wiązania. Por. na przykład Queen i wsp., Proc. Natl Acad Sci USA, 8 6, (1989), Hodgson i wsp., Bio/Technology, 9,421 (1991). Termin przeciwciało-dawca oznacza przeciwciało monoklonalne lub rekombinacyjne, dostarczające sekwencji kwasu nukleinowego swych części zmiennych, CDR lub innych fragmentów czynnościowych, lub ich analogów, dla pierwszego partnera immunoglobuliny, tak aby zapewnić zmieniony region kodujący immunoglobuliny i w wyniku tego ekspresję zmienionego przeciwciała o swoistości antygenowej i swoistości neutralizującej charakterystycznej dla przeciwciała-dawcy. Jednym z przeciwciał-dawców, korzystnych w zastosowaniu według mniejszego wynalazku, jest samoograniczające się neutralizujące mysie przeciwciało monoklonalne, oznaczone jako BC2. Do innych korzystnych przeciwciał-dawców należą samoograniczające się neutralizujące mysie przeciwciała monoklonalne, oznaczone jako BC1, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFKLC i HFXI. Termin przeciwciało-biorca oznacza przeciwciało monoklonalne lub rekombinacyjne, heterologiczne w stosunku do przeciwciała-dawcy, dostarczające całości lub fragmentu sekwencji kwasu nukleinowego, kodującego jego ramki odczytu łańcuchów ciężkich i/lub lekkich i/lub jego części stałych łańcuchów ciężkich i/lub lekkich dla pierwszego partnera immunoglobuliny. Korzystnie, przeciwciało-biorcę stanowi przeciwciało ludzkie. CDR oznacza sekwencje aminokwasowe regionu determinującego dopasowanie przeciwciała, stanowiące regiony hiperzmienne łańcuchów ciężkich i lekkich immunoglobulin. Por. na przykład Kabat i wsp., w Seąuences of Proteins of Immunological Interest, wyd. IV, US Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). W części zmiennej immunoglobuliny znajdują się trzy CDR, czyli regiony CDR łańcuchów ciężkich i trzy CDR łańcuchów lekkich. Tak więc, termin CDR w rozumieniu niniejszego opisu oznacza wszystkie trzy CDR łańcucha ciężkiego lub wszystkie trzy CDR łańcucha lekkiego, lub zarówno wszystkie CDR łańcuchów ciężkich, jak i wszystkie CDR łańcuchów lekkich, jeżeli jest to odpowiednie. CDR dostarcza większości reszt kontaktowych dla wiązania się przeciwciała z antygenem lub epitopem. CDR według niniejszego wynalazku pochodzą z sekwencji zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich przeciwciała-dawcy, i należą do nich analogi naturalnie występujących CDR, przy czym analogi te mają, lub zachowują, tę samą swoistość wiązania antygenu i/lub zdolność do neutralizacji, co przeciwciało-dawca, z którego pochodzą.

11 Poprzez posiadanie takiej samej swoistości wiązania antygenu lub zdolności do neutralizacji rozumie się, na przykład, że jakkolwiek PM BC2 cechuje się w pewnym stopniu samoograniczającą aktywnością neutralizującą, CDR kodowane przez sekwencję kwasu nukleinowego BC2 w odpowiednim środowisku strukturalnym może wykazywać niższą lub wyższą aktywność. Oczekuje się, że CDR BC2 w takim środowisku będzie jednak rozpoznawać ten sam epitop, lub epitopy, co BC2. Fragment czynnościowy oznacza część sekwencji zmiennej łańcucha ciężkiego lub lekkiego (na przykład, po delecji niewielkiego fragmentu na końcu aminowym lub karboksylowym regionu zmiennego immunoglobuliny), zachowującą tę samą swoistość wiązania antygenu i/lub zdolność do neutralizacji, co przeciwciało, z którego fragment pochodzi. Analog stanowi sekwencję aminokwasową zmodyfikowaną co najmniej jednym aminokwasem, przy czym ta modyfikacja może być chemiczna lub może stanowić substytucję lub przegrupowanie kilku aminokwasów (to znaczy, nie więcej niż 10), przy czym modyfikacja ta umożliwia zachowanie przez tę sekwencję aminokwasową jej charakterystyki biologicznej, na przykład swoistości antygenowej lub wysokiego powinowactwa, sekwencji niezmodyfikowanej. Do przykładów takich analogów należą ciche mutacje, które można wytworzyć poprzez substytucję, tak aby wytworzyć pewne miejsca restrykcyjne endonukleaz wewnątrz lub w sąsiedztwie regionów kodujących CDR. Analogi mogą również stanowić wariacje alleliczne. Wariacja lub modyfikacja alleliczna oznacza zmianę sekwencji kwasu nukleinowego, kodującej sekwencje aminokwasowe lub peptydowe według niniejszego wynalazku. Takie wariacje lub modyfikacje mogą być związane z degeneracją kodu genetycznego lub mogą być celowo wytworzone technikami inżynierii genetycznej dla zapewnienia odpowiedniej korzystnej charakteiystyki. Takie wariacje lub modyfikacje mogą być, lub nie, wynikiem zmian w dowolnej kodowanej sekwencji aminokwasowej. Termin środki efektorowe oznacza niebiałkowe cząsteczki nośnikowe, z którymi zmienione przeciwciała i/lub naturalne lub syntetyczne łańcuchy lekkie lub ciężkie przeciwciał-dawców lub inne fragmenty przeciwciał-dawców można związać środkami konwencjonalnymi. Do takich nośników niebiałkowych należą konwencjonalne nośniki stosowane w diagnostyce, na przykład kulki z polistyrenu lub innego tworzywa sztucznego, polisacharydy, na przykład takie, jak zastosowane w systemie BIAcore (Pharmacia), lub inne substancje niebiałkowe, korzystne w zastosowaniu w medycynie i takie, które można bezpiecznie podawać ludziom i zwierzętom. Do innych czynników efektorowych należą makrocykle, do chelatowania atomów metali ciężkich, lub radioizotopy. Takie środki efektorowe mogą być również korzystne dla zwiększenia czasu półtrwania zmienionych przeciwciał, na przykład glikol polietylenowy. W celu wytworzenia przeciwciał, zmienionych przeciwciał lub fragmentów przeciwciał według niniejszego wynalazku, można stosować przeciwciała gatunków innych niż człowiek, na przykład przeciwciała bydlęce, baranie, małpie, kurze, przeciwciała gryzoni (na przykład mysie i szczurze) w celu wytworzenia korzystnych immunoglobulin po prezentacji ludzkiego czynnika krzepnięcia, korzystnie czynnika IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa lub trombiny, lub epitopu peptydowego jednego z tych czynników. Stosuje się konwencjonalne techniki hybrydoma w celu wytworzenia linii komórkowej hybrydoma, wydzielającej PM inne niż ludzkie, skierowane przeciwko odpowiedniemu czynnikowi krzepnięcia. Hybrydoma takie następnie bada się przesiewowo pod kątem wiązania czynnika IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa lub trombiny, opłaszczonych na 96-zagłębieniowych płytkach, jak to opisano w Przykładach, lub zamiast tego wiązania biotynylowanego czynnika IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa lub trombiny, związanych z płytką opłaszczoną streptawidyną. Zamiast tego można wytwarzać całkowicie ludzkie PM technikami znanymi specjalistom, stosowanymi w niniejszym wynalazku. Przykładem samoograniczającego się, neutralizującego PM według niniejszego wynalazku jest PM BC2, przeciwciało mysie, które można stosować do wytwarzania cząsteczki chimerycznej lub humanizowanej. PM BC2 cechuje się samoograniczającym się hamującym wpływem na czas krzepnięcia. Działanie PM BC2, mierzone jako aptt, wykazuje wartość maksymalną około 100 sekund. PM BC2 wiąże również czynnik IXa, hamuje przejście czynnika IX do IXa i hamuje aktywność czynnika IXa. Dla jego aktywności niezbędne są kofaktory

12 metali dwuwartościowych, przy czym PM wykazuje większą preferencję wobec Ca2+, niż wobec MN2+. Obserwowany IC50 w teście aptt wynosi około 50 nm. PM BC2 wykazuje krzyżową reaktywność międzygatunkową z czynnikami krzepnięcia szczura i należy do izotypu IgG2a. Inne korzystne przeciwciała-dawców stanowią mysie PM BC1, 9E4(2)F4 i 11G4(1)B9. Te PM cechują się samoograniczającym się hamującym wpływem na czas krzepnięcia. Działanie tych PM, mierzone jako aptt, wykazuje wartość maksymalną około sekund dla 9E4(2)F4 i około 80 sekund dla 11G4(1)B9.PM BC1 wiąże się również z czynnikiem IXa, hamuje aktywność czynnika IXa, jednak nie hamuje przejścia czynnika IX w IXa. Do tego działania nie jest niezbędny metal jako kofaktor. Obserwowane IC50 dla BC1 w teście aptt wynosi około 35 nm. PM BC1 należy do izotypu IgG1. Kolejnym korzystnym przeciwciałem-dawcą, cechującym się samoograniczającym się hamującym wpływem na czas krzepnięcia, jest mysie PM HFXLC. Wpływ PM HFXLC na czas krzepnięcia, mierzony jako aptt, wykazuje wartość maksymalną około sekund. PM HFXLC wiąże się z łańcuchem lekkim czynnika X i hamuje aktywność czynników X/Xa. Obserwowane I C 5 0 w teście aptt wynosi około 20 nm. Kolejnym korzystnym przeciwciałem-dawcą, cechującym się samoograniczającym się hamującym wpływem na czas krzepnięcia, jest mysie PM HFXI. Wpływ PM HFXI na czas krzepnięcia, mierzony jako aptt, wykazuje wartość maksymalną około 100 sekund. PM HFXLC wiąże się z czynnikiem XI i hamuje aktywność czynników XI/XIa. Obserwowane IC50 w teście aptt wynosi około 30 nm. Jakkolwiek nie opowiadamy się za żadną konkretną teorią odnośnie mechanizmu działania, jak się wydaje, te PM regulują krzepnięcie w mechanizmie niekompetycyjnym, lub allosterycznym, w którym do tylko częściowego hamowania. Niniejszy wynalazek nie ogranicza się do zastosowania BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC, HFXI lub ich sekwencji hiperzmiennych (to znaczy CDR) Zamiast nich można stosować jakiekolwiek odpowiednie przeciwciała o wysokim powinowactwie, cechujące się samoograniczającą się aktywnością neutralizującą, i odpowiednie CDR. Identyfikację przeciwciał-dawców wponiższym opisie jako BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFKLC lub HFXI przedstawiono jedynie dla ilustracji i uproszczenia opisu. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również zastosowanie fragmentów Fab lub fragmentów F(ab')2, pochodzących z PM, skierowanych przeciwko odpowiednim ludzkim czynnikom lub kofaktorom krzepnięcia. Fragmenty te są korzystne do stosowania jako środki o samoograniczającej się aktywności neutralizującej przeciwko czynnikom krzepnięcia, korzystnie, przeciwko czynnikom IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa lub trombinie. Fragment Fab zawiera cały łańcuch lekki i końcową część aminową łańcucha ciężkiego. Fragment F(ab')2 stanowi fragment utworzony przez dwa fragmenty Fab, związane mostkami dwusiarczkowymi. PM BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC i HFXI oraz inne podobne przeciwciała o wysokim powinowactwie stanowią źródło fragmentów Fab i F(ab )2, które można wytwarzać konwencjonalnymi sposobami, na przykład poprzez rozcięcie PM odpowiednimi enzymami proteolitycznymi, papainą i/lub pepsyną, lub technikami rekombinacyjnymi. Te fragmenty Fab i F(ab')2 są same w sobie korzystne jako środki lecznicze, zapobiegawcze lub diagnostyczne, jak również jako dawcy sekwencji, włączając w to części zmienne i sekwencje CDR korzystne do wytwarzania rekombinacyjnych lub humanizowanych przeciwciał według niniejszego wynalazku. Fragmenty Fab i F(ab')2 można wytwarzać poprzez kombinatoryczną bibliotekę faga (por. na przykład Winter i wsp., Ann. Rev. Immunol., 12: (1994), lub poprzez przegrupowywanie łańcuchów immunoglobulin (por. np. Marks i wsp., Bio/Technology, 10: (1992); obie te publikacje w całości włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie, przy czym umożliwia się wiązanie Fd lub immunoglobuliny vhz dobranego przeciwciała (na przykład BC2) z łańcuchami lekkimi lub ciężkimi rozmaitych immunoglobulinami, V L (lub vk) w celu wytworzenia nowych Fab. Przeciwnie, umożliwia się wiązanie lekkich łańcuchów immunoglobuliny (dobranego przeciwciała) z ciężkimi łańcuchami rozmaitych immunoglobulin, vh(lub Fd), dla wytworzenia nowych Fab. Samoograniczające się, neutralizujące Fab, skierowane przeciwko czynnikowi IX, można wytworzyć poprzez umożliwienie wiązania Fd przeciwciała monoklonalnego BC2 z lekkimi łańcuchami rozmaitych immunoglobulin. Tak

13 więc można wytworzyć neutralizujące Fab o unikalnych sekwencjach (nukleotydowych i aminokwasowych), stosując technikę przegrupowywania łańcuchów. PM BC2 lub inne wyżej opisane przeciwciała mogą dostarczać sekwencji, na przykład zmiennych sekwencji peptydowych łańcuchów ciężkich i/lub lekkich, sekwencji ramek odczytu, sekwencji CDR, ich fragmentów czynnościowych i analogów, oraz kodujących sekwencji kwasu nukleinowego, korzystnych w projektowaniu i wytwarzaniu rozmaitych zmienionych przeciwciał, cechujących się swoistością wiązania antygenu taką samą, jak przeciwciało-dawca. Sekwencje kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku lub jej fragmenty, kodujące zmienne sekwencje peptydowe łańcuchów lekkich i ciężkich, są również korzystne do mutagennego wprowadzania swoistych zmian w obrębie sekwencji kwasu nukleinowego, kodujących regiony CDR lub regiony ramek odczytu, oraz do wprowadzania powstałych zmodyfikowanych sekwencji kwasu nukleinowego, lub takich sekwencji, które uległy fuzji, do plazmidu w celu uzyskania ekspresji. Na przykład, można stosować ciche podstawienia sekwencji nukleinowej regionów kodujących ramkę odczytu i CDR, w celu wytwarzania miejsc enzymów restrykcyjnych, ułatwiających insercję zmutowanych regionów CDR i/lub ramki odczytu. Te regiony kodujące CDR można stosować do wytwarzania humanizowanych przeciwciał według niniejszego wynalazku. Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego BC2 wymieniono w SEQ ID nr 5 i 7. Sekwencje CDR z tego regionu wymieniono w SEQ ID nr 8, 9 i 10. Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego BC2 wymieniono w SEQ ID nr 6 i 11. Sekwencje CDR z tego regionu wymieniono w SEQ ID nr 12, 13 i 14. Biorąc pod uwagę degenerację kodu genetycznego, można wytwarzać rozmaite sekwencje, kodujące zmienne sekwencje aminokwasowe łańcuchów ciężkich i lekkich i sekwencje CDR według niniejszego wynalazku, jak również ich czynnościowe fragmenty lub analogi, posiadające tę samą swoistość antygenową, co przeciwciało-dawca. Izolowane sekwencje kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, lub jego fragmenty, kodujące zmienne sekwencje peptydowe łańcucha lub CDR, można stosować do wytwarzania zmienionych przeciwciał, na przykład przeciwciał chimerycznych lub humanizowanych, lub innych przeciwciał wytwarzanych technikami inżynierii genetycznej według niniejszego wynalazku, po połączeniu w sposób umożliwiający działanie z drugim partnerem immunoglobuliny. Należy zauważyć, że oprócz izolowanych sekwencji kwasu nukleinowego, kodujących części zmienionego przeciwciała i przeciwciał według niniejszego wynalazku, inne takie sekwencje kwasu nukleinowego są objęte zakresem niniejszego wynalazku: na przykład sekwencje komplementarne do natywnych sekwencji kodujących CDR lub komplementarne do zmodyfikowanych ludzkich regionów ramki odczytu, otaczających regiony kodujące CDR. Do korzystnych sekwencji DNA należą sekwencje hybrydyzujące w ścisłych warunkach hybrydyzacji do sekwencji DNA. Por. T. Maniatis i wsp., Molecular Cloning (A Laboratory Manuał), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), str Przykładem takich ścisłych warunków hybrydyzacji jest hybrydyzacja w 4XSSC, w temperaturze 65 C, i następnie płukanie w 0,1XSSC w temperaturze 65 C, przez godzinę. Zamiast tego, innym przykładem ścisłych warunków hybrydyzacji jest hybrydyzacja w 50% formamidzie, 4XSSC, w temperaturze 42 C. Korzystnie, te hybrydyzujące sekwencje DNA mają długość co najmniej około 18 nukleotydów, to znaczy są mniej więcej długości CDR. Zmienione cząsteczki immunoglobulin mogą kodować zmienione przeciwciała, do których należą przeciwciała wytworzone technikami inżynierii genetycznej, na przykład przeciwciała chimeryczne i humanizowane. Korzystny region kodujący zmienionej immunoglobuliny zawiera regiony kodujące CDR, które kodują peptydy posiadające swoistość antygenową przeciwko czynnikom IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa lub trombinie, korzystnie, przeciwciała o wysokim powinowactwie według niniejszego wynalazku, które poddaje się insercji do pierwszego partnera immunoglobuliny, na przykład do ludzkiej ramki odczytu lub ludzkiego regionu zmiennego immunoglobuliny. Korzystnie, pierwszy partner immunoglobuliny łączy się w sposób umożliwiający działanie z drugim partnerem immunoglobuliny. Drugi partner immunoglobuliny jest taki, jak to zdefiniowano powyżej, i może obejmować sekwencję kodującą drugi region przeciwciał, na przykład region Fc. Do drugich partnerów immuno-

14 globulin należą również sekwencje kodujące inną immunoglobulinę, która uległa fuzji z regionem stałym łańcucha lekkiego lub ciężkiego w ramce odczytu lub za pomocą sekwencji łączącej. Technikami inżynierii genetycznej można wytworzyć przeciwciała skierowane przeciwko czynnościowym fragmentom lub analogom czynników krzepnięcia w celu uzyskania zwiększonego wiązania z tym samym przeciwciałem. Drugi partner immunoglobuliny może również być związany ze środkami efektorowymi, zdefiniowanymi powyżej, w tym z niebiałkowymi cząsteczkami nośnikowymi, z którymi drugi partner immunoglobuliny jest związany konwencjonalnymi sposobami w sposób umożliwiający działanie. Fuzji lub łączenia pomiędzy drugimi partnerami immunoglobuliny, na przykład sekwencjami przeciwciał, a środkiem efektorowym można dokonać dowolnymi odpowiednimi sposobami, na przykład z zastosowaniem konwencjonalnych wiązań kowalentnych lub jonowych, fuzji białek lub linkerów krzyżowych hetero-dwufunkcyjnych, na przykład karbodiimidu, aldehydu glutarowego i tym podobnych. Sposoby takie są znane ze stanu techniki i opisane w konwencjonalnych podręcznikach chemii i biochemii. Ponadto, do regionu kodującego zmienioną immunoglobulinę można również wprowadzić konwencjonalne sekwencje łączące, zapewniające po prostu korzystną odległość między drugim partnerem immunoglobuliny a środkiem efektorowym. Takie sekwencje łączące (linkery) są dobrze znane specjalistom. Ponadto, sekwencje sygnałowe cząsteczek według niniejszego wynalazku można modyfikować sposobami znanymi specjalistom w celu zwiększenie ekspresji. Korzystne zmienione przeciwciało zawiera zmienną sekwencję peptydową lub białkową łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego o swoistości antygenowej PM BC2, na przykład łańcucha vhi vl. Inne korzystne zmienione przeciwciało według niniejszego wynalazku cechuje się sekwencją aminokwasową, zawierającą co najmniej jeden, a korzystnie, wszystkie CDR regionu zmiennego łańcuchów ciężkich i/lub lekkich cząsteczki mysiego przeciwciała BC2, przy czym pozostałe sekwencje pochodzą od człowieka, lub jej czynnościowym fragmentem lub analogiem. W innym wykonaniu, do zmienionego przeciwciała według niniejszego wynalazku może być przyłączony dodatkowy środek. Na przykład, można z zastosowaniem rekombinacyjnej technologii DNA wytworzyć zmienione przeciwciało według niniejszego wynalazku, w którym fragment Fc lub domenę CH2 CH3 pełnej cząsteczki przeciwciała zastąpiono enzymem lub inną wykrywalną cząsteczką (na przykład, polipeptydową cząsteczką efektorową lub reporterową). Drugi partner immunoglobuliny może również być połączony w sposób umożliwiający działanie z nieimmunoglobulinowym peptydem, białkiem lub jego fragmentem, heterologicznym w stosunku do sekwencji zawierającej CDR, o swoistości antygenowej przeciwko czynnikowi krzepnięcia, korzystnie, przeciwko czynnikom IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa lub trombinie. Powstałe w wyniku tego białko może wykazywać zarówno swoistość antygenową, jak i charakterystykę nieimmunoglobuliny po ekspresji. Charakterystyka tego partnera fuzji może być na przykład charakterystyką czynnościową, tak jak w przypadku innej domeny wiązani lub receptora, lub charakterystyką terapeutyczną, jeżeli partner fuzji sam w sobie jest białkiem o działaniu terapeutycznym lub ma dodatkową charakterystykę antygenową. Inne pożądane białko według niniejszego wynalazku może zawierać cząsteczkę kompletnego przeciwciała, zawierającą ciężkie i lekkie łańcuchy o pełnej długości lub jakikolwiek osobny ich fragment, takie jak fragmenty Fab lub F(ab')2, dimer łańcucha ciężkiego lub jakiekolwiek minimalne ich fragmenty, takie jak Fv lub przeciwciała o pojedynczym łańcuchu (SCA), albo jakąkolwiek inną cząsteczkę o swoistości takiej samej jaką ma wybrane monoklonalne przeciwciało-dawca, na przykład PM BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC lub HFXI. Białko takie można stosować w postaci przeciwciała zmienionego, albo w postaci niesprzężonej. Ilekroć drugi partner immunoglobuliny pochodzi od przeciwciała innego niż przeciwciało-dawca, na przykład izotyp lub klasa ramki odczytu immunoglobuliny lub stałe regiony, powstaje przeciwciało wytworzone technikami inżynierii genetycznej. Przeciwciała wytworzone technikami inżynierii genetycznej mogą zawierać stałe regiony immunoglobuliny (Ig) i zmienne regiony ramki odczytu pochodzące z jednego źródła, na przykład przeciwciałobiorcę, albo jeden lub większą ilość (korzystnie wszystkie) regiony determinujące dopasowa-

15 nie (CDR) z przeeiwciała-dawcy, na przykład skierowane przeciw czynnikom IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa lub przeciwciała trombinowe opisane w niniejszym opisie. Poza tym, w celu zachowania swoistości wiązania antygenu przez przeciwciało-dawcę, można dokonać zmian (na przykład delecji, podstawień lub addycji) regionu ramki odczytu lekkiej i/lub ciężkiej zmiennej domeny monoklonalnego przeciwciała-dawcy na poziomie kwasu nukleinowego lub aminokwasu, albo regionów CDR-dawcy. Takie wytworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciała przeznaczone są do wykorzystywania jednego, lub obu zmiennych ciężkich i/lub lekkich łańcuchów omawianego PM (ewentualnie zmodyfikowanego, jak to opisano w niniejszym opisie), albo jednego, lub większej ilości CDR o ciężkich lub lekkich łańcuchach. Przeciwciała wytworzone technikami inżynierii genetycznej według wynalazku wykazują samoograniczającą się aktywność neutralizacji. Tego rodzaju wytworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciała mogą obejmować humanizowane przeciwciało, zawierające regiony ramki odczytu wybranej ludzkiej immunoglobuliny lub podtypu albo przeciwciała chimerycznego zawierającego ludzkie regiony stałe łańcuchów ciężkich i lekkich, które uległy fuzji z czynnościowymi fagmentami przeciwciała czynnika krzepnięcia. Odpowiednim ludzkim (lub zwierzęcym) przeciwciałembiorcą może być jakiekolwiek przeciwciało wybrane z typowej bazy danych, na przykład z bazy danych KABAR, bazy danych Los Alamos i bazy danych Swiss Protein, na podstawie homologii z sekwencjami nukleotydów i aminokwasów przeciwciała-dawcy. Do dostarczania zmiennego regionu ramki odczytu o ciężkim łańcuchu, w celu insercji CDR-dawców, może okazać się właściwe przeciwciało ludzkie charakteryzujące się homologią regionu ramki odczytu (na podstawie aminokwasów). W podobny sposób można dobrać odpowiednie przeciwciało-biorcę, zdolne do dostarczania zmiennych regionów ramki odczytu o łańcuchach lekkich. Należy zauważyć, że nie jest tu wymagane pochodzenie ciężkich i lekkich łańcuchów przeciwciała-biorcy od tego samego przeciwciała-biorcy. Korzystnie, heterologiczną ramkę odczytu i regiony stałe dobiera się spośród klas i izotypów immunoglobulin ludzkich, takich jak IgG (podtypy 1 do 4), IgM, IgA i IgE. Jednakże, przeciwciało-biorca nie musi obejmować jedynie sekwencji białkowych immunoglobuliny ludzkiej. I tak, na przykład, można skonstruować taki gen, w którym sekwencja DNA kodująca część łańcucha immunoglobuliny ludzkiej uległa fuzji z sekwencją DNA kodującą nieimmunoglobulinową sekwencję aminokwasów, taką jak polipeptydowa cząsteczka efektorowa lub reporterowa. Szczególnie korzystne przeciwciało humanizowane zawiera CDR z BC2 wbudowane w regiony ramki odczytu wybranej sekwencji przeciwciała ludzkiego. W celu neutralizacji humanizowanych przeciwciał, dokonuje się insercji jednego, dwóch lub trzech CDR ze zmiennych regionów łańcuchów ciężkich i/lub lekkich przeciwciała skierowanego przeciw czynnikowi IX, do regionów ramki odczytu wybranej sekwencji ludzkiego przeciwciała, z zastąpieniem jego natywnych CDR. Korzystnie, w humanizowanym przeciwciele dokonuje się technikami inżynierii genetycznej przekształceń zmiennych domen w ludzkich ciężkich i lekkich łańcuchach, na drodze jednego, lub większej ilości podstawień CDR. Można wykorzystać wszystkie sześć CDR albo rozmaite kombinacje mniejszej (niż sześć) ich ilości. Korzystnie, dokonuje się podstawienia wszystkich sześciu CDR. Możliwe jest tu podstawienie CDR jedynie w ludzkim łańcuchu ciężkim, przy użyciu, jako łańcucha lekkiego, niemodyfikowanego łańcucha lekkiego z ludzkiego przeciwciała-biorcy. W dalszym ciągu alternatywnie, zgodny łańcuch lekki można wybrać spośród innego przeciwciała ludzkiego, przez wykorzystanie typowych baz danych dla przeciwciał. Pozostała część wytworzonego techniką inżynierii genetycznej przeciwciała może pochodzić z jakiejkolwiek stosownej ludzkiej immunoglobuliny-biorcy. Tak więc, humanizowane przeciwciało wytworzone techniką inżynierii genetycznej korzystnie ma budowę naturalnego ludzkiego przeciwciała, lub jego fragmentu, i odznacza się kombinacją właściwości potrzebnych do skutecznych zastosowań terapeutycznych, na przykład do leczenia chorób zakrzepowych i zatorowych u człowieka. Najkorzystniej, humanizowane przeciwciała posiadają sekwencję aminokwasów łańcucha ciężkiego taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 31, 52 lub 89. Także, najkorzystniejsze

16 są humanizowane przeciwciała posiadające sekwencje aminokwasów łańcucha lekkiego taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 44, 57, 62, 74, 78 i 99. Szczególnie korzystne jest przeciwciało humanizowane SB , w przypadku którego łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 31, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 44. Także, szczególnie korzystne jest humanizowane przeciwciało SB , w przypadku którego łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 57. Także, szczególnie korzystne jest humanizowane przeciwciało SB , w przypadku którego łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 62. Także, szczególnie korzystne jest humanizowane przeciwciało SB , w przypadku którego łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 74. Także, szczególnie korzystne jest humanizowane przeciwciało SB , w przypadku którego łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 52, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 78. Także, szczególnie korzystne jest humanizowane przeciwciało SB , w przypadku którego łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 89, a łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasów taką, jaką przedstawiono w SEQ ID NO: 99. Specjaliści w tej dziedzinie techniki rozumieją, że wytworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciało można modyfikować w dalszym ciągu, przez dokonywanie zmian aminokwasów w zmiennej domenie, z uniknięciem niezbędnego w takim przypadku wpływu na swoistość i wysokie powinowactwo przeciwciała-dawcy (to znaczy analoga). Przewiduje się, że aminokwasy łańcuchów ciężkich i lekkich można zastępować innymi aminokwasami, albo w zmiennych domenach ramek odczytu lub w CDR, albo i w jednych i w drugich. Te podstawienia mogą być zapewnione przez przeciwciało-dawcę lub sekwencje największej zgodności z konkretnej podgrupy. Oprócz tego, region stały można zmienić w taki sposób, aby wzmóc lub osłabić selekcyjne właściwości cząsteczek według niniejszego wynalazku. Na przykład, dotyczy to dimeryzacji, wiązania się z receptorami Fc lub zdolności do wiązania się i aktywowania dopełniacza [patrz, na przykład: Angal i in., Mol. Immunol., 30, (1933); Xu i in., J. Biol. Chem., 269, (1994); Winter i in., EP B). Zmienione przeciwciało, stanowiące przeciwciało chimeryczne, różni się do humanizowanych przeciwciał powyżej opisanych tym, że dostarcza całkowite zmienne regiony łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego innego niż ludzkie przeciwciała-dawcy, włącznie z regionami ramki odczytu, razem ze stałymi regionami immunoglobuliny ludzkiej dla obu łańcuchów. Przypuszcza się, że chimeryczne przeciwciała zachowujące dodatkową, inną niż ludzka, sekwencję, pokrewne humanizowanym przeciwciałom według niniejszego wynalazku, mogą wywoływać u ludzi znaczącą odpowiedź immunologiczną. Przwciwciała takie są użyteczne pod względem zapobiegania i leczenia zaburzeń zakrzepowych i zatorowych, jak to omówiono w poniższej części niniejszego opisu. Korzystnie, zmienne sekwencje łańcuchów lekkich i/lub ciężkich oraz CDR z PM BC2, lub inne odpowiednie PM-dawcy, na przykład BC1, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC, HFXI i ich kodujące sekwencje kwasów nukleinowych, wykorzystuje się w konstruowaniu zmienionych przeciwciał, korzystnie przeciwciał humanizowanych, według niniejszego wynalazku, z zastosowaniem następującego sposobu postępowania. Takich samych lub podobnych metod można użyć także do zrealizowania innych wykonań niniejszego wynalazku. Hybrydomę wytwarzającą wybranego PM-dawcę, na przykład mysie przeciwciało BC2, poddaje się, dogodnie, klonowaniu i otrzymuje się DNA łańcuchów ciężkich i łańcuchów lekkich jego regionów zmiennych, z wykorzystaniem sposobów postępowania znanych specjalistom w tej dziedzinie techniki, na przykład metod opisanych w: Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. II, Cold Spring Harbor Laboratory (1989). Zmienne ciężkie i lekkie regiony BC2, zawierające co najmniej regiony kodujące CDR i te części re-

17 gionów lekkiej i/lub ciężkiej zmiennej domeny ramki odczytu PM-biorcy, które są potrzebne do utrzymania swoistości wiązania PM-dawcy, jak również pozostałe, wywodzące się z immunoglobuliny części łańcucha przeciwciała pochodzącego z immunoglobuliny ludzkiej, otrzymuje się z zastosowaniem starterów polinukleotydowych i odwrotnej transkryptazy. Regiony kodujące CDR identyfikuje się z wykorzystaniem znanej bazy danych i przez porównania z innymi przeciwciałami. Następnie można otrzymać przeciwciało chimeryczne mysz-człowiek i poddać je badaniu pod względem zdolności wiązania. Chimeryczne przeciwciało tego rodzaju zawiera całość regionów VH i VL innego niż ludzkie przeciwciała-dawcy, łącznie z regionami stałymi ludzkiej Ig dla obu łańcuchów. Homologiczne regiony ramki odczytu łańcucha ciężkiego regionu zmiennego pochodzącego z ludzkiego przeciwciała identyfikuje się z zastosowaniem skomputeryzowanej bazy danych, na przykład KABAT, a jako przeciwciało-biorcę wybiera się ludzkie przeciwciało wykazujące homologię z BC2. Sekwencje syntetycznych regionów zmiennych ciężkich łańcuchów zawierające regiony kodujące CDR BC2 w obrębie ramki odczytu przeciwciała ludzkiego, zaprojektowane są, z ewentualnymi podstawieniami nukleotydów w regionach ramki odczytu, do włączania miejsc restrykcji. Następnie, przeprowadza się syntezę tej zaprojektowanej sekwencji przy użyciu długich oligomerów syntetycznych. Alternatywnie, zaprojektowaną sekwencję można zsyntetyzować przez doprowadzenie do zachodzenia na siebie oligonukleotydów, amplifikowania metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i skorygowania błędów. W podobny sposób można zaprojektować odpowiedni łańcuch lekki zmiennego regionu ramki odczytu. Humanizowane przeciwciało można wyprowadzić z przeciwciała chimerycznego albo, korzystnie, może być wytworzone na drodze syntezy za pomocą insercji regionów kodujących CDR PM-dawcy z łańcuchów, odpowiednio, ciężkiego i lekkiego w obrębie wybranej ramki odczytu o łańcuchu ciężkim lub lekkim. Alternatywnie, humanizowane przeciwciało według wynalazku można wytworzyć z zastosowaniem typowych metod dokonywania metagenezy. W rezultacie, wytworzone humanizowane przeciwciało zawiera ludzkie regiony ramki odczytu i regiony kodujące CDR PM-dawcy. Można też poddać następnie manipulacjom pozostałości ramki odczytu. Następnie, można przeprowadzić ekspresję otrzymanego tak humanizowanego przeciwciała w rekombinantowych komórkach-gospodarzach, na przykład w komórkach COS lub CHO albo w komórkach szpiczaka. Inne humanizowane przeciwciała można wytworzyć przy użyciu wspomnianej techniki z zastosowaniem innych odpowiednich przeciwciał, nie pochodzących od człowieka, swoistych względem czynnika IX lub innych czynników krzepnięcia krwi, samoograniczających się, neutralizujących i o wysokim powinowactwie. Typowy wektor ekspresyjny lub plazmid rekombinantowy wytwarza się za pomocą usytuowania tych sekwencji kodujących dla zmienionego przeciwciała, w umożliwiające działanie połączenie z typowymi regulatorowymi sekwencjami kontrolnymi, zdolnymi do kontroli replikacji i ekspresji w komórce-gospodarzu i/lub w jej wydzielinie. Do sekwencji regulatorowych należą sekwencje promotorowe, na przykład promotor CMY, oraz sekwencje sygnałowe, które mogą wywodzić się z innych znanych przeciwciał. Podobnie, można wytworzyć drugi wektor ekspresyjny o sekwencji DNA, kodującej lekki lub ciężki łańcuch komplementarnego przeciwciała. Korzystnie, ten drugi wektor ekspresyjny jest identyczny z pierwszym, z różnicą odnoszącą się do sekwencji kodujących i dobieralnych znaczników, w celu zapewnienia, jak tylko jest to możliwe, czynnościowej ekspresji każdego łańcucha polipeptydowego. Alternatywnie, sekwencje kodujące łańcuch ciężki i łańcuch lekki dla zmienionego przeciwciała mogą występować w pojedynczym wektorze. Dokonuje się kotransfekcji wyselekcjonowanej tak komórki-gospodarza z zastosowaniem typowych sposobów postępowania, z udziałem zarówno pierwszego jak i drugiego wektora (albo pojedynczej transfekcji z udziałem pojedynczego wektora), w wyniku czego otrzymuje się transfekowaną komórkę-gospodarza według wynalazku, zawierającą tak rekombinantowe jak i syntetyczne łańcuchy lekkie i łańcuchy ciężkie. Następnie przeprowadza się hodowlę transfekowanej komórki z wykorzystaniem typowych sposobów postępowania, w wyniku czego otrzymuje się wytworzone techniką inżynierii genetycznej przeciwciało we-

18 dług wynalazku. Humanizowane przeciwciało, które obejmuje połączenie obu łańcuchów rekombinantowych, ciężkiego i/lub lekkiego, poddaje się skriningowi z hodowli, z wykorzystaniem stosownej metody, takiej jak ELISA lub RIA. Podobnych typowych metod można użyć do skonstruowania innych zmienionych przeciwciał i cząsteczek według niniejszego wynalazku. Doboru wektorów nadających się do przeprowadzenia etapów klonowania i subklonowania, stosowanych w omawianych metodach i przy konstruowaniu kompozycji według niniejszego wynalazku, dokonać może specjalista w tej dziedzinie techniki. I tak, na przykład, można zastosować wektory klonujące serii puc, na przykład puc19, które są handlowo dostępne w odpowiednich firmach zaopatrujących, takich jak Amersham czy Pharmacia. Poza tym, do klonowania wykorzystać można jakikolwiek wektor zdolny do łatwego replikowania, posiadający znaczną ilość miejsc klonowania i dobieralnych genów (na przykład genów oporności na antybiotyki) i łatwy w manipulowaniu. Stąd też, selekcja wektora klonującego nie jest czynnikiem ograniczającym wykonanie niniejszego wynalazku. Podobnie, wektory stosowane do ekspresji wytwarzanych technikami inżynierii genetycznej przeciwciał według niniejszego wynalazku specjalista w tej dziedzinie techniki może wybrać spośród dowolnych typowych wektorów. Wektory zawierają także wybrane sekwencje regulatorowe (takie jak promotory CMV) kierujące replikacją i ekspresją sekwencji heterologicznego DNA w wybranych komórkach-gospodarzach. Wektory te zawierają powyżej opisane sekwencje DNA, kodujące wytworzone techniką inżynierii genetycznej przeciwciało lub zmieniony region kodujący immunoglobulinę. Oprócz tego, wektory mogą włączać wybrane sekwencje immunoglobulinowe zmodyfikowane w wyniku insercji pożądanych miejsc restrykcyjnych dla ułatwienia manipulacji. Wektory ekspresyjne można także scharakteryzować przez geny nadające się do wzmożenia ekspresji sekwencji heterologicznego DNA, na przykład gen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) ssaków. Do innych korzystnych sekwencji wektorowych należy sekwencja sygnałowa poli A, taka jak pochodząca z bydlęcego hormonu wzrostu (BGH) oraz sekwencja promotora betaglobiny (betaglopro). Wektory ekspresyjne użyteczne w sposobie według niniejszego wynalazku można zsyntetyzować sposobami dobrze znanymi specjalistom w tej dziedzinie techniki. Składniki wektorów tego rodzaju, a mianowicie replikony, geny selekcyjne, wzmacniacze, promotory, sekwencje sygnałowe itp., można otrzymać ze źródeł handlowych lub naturalnych, albo też można zsyntetyzować znanymi sposobami z przeznaczeniem do kierowania ekspresją i/lub wydzielaniem produktu rekombinantowego DNA w organizmie wybranego gospodarza. W omawianym przeznaczeniu można dobrać inne odpowiednie wektory ekspresyjne, których liczne typy znane są w dziedzinie wiedzy dotyczącej ekspresji u ssaków, bakterii, owadów, drożdżaków i grzybów. Wynalazek niniejszy obejmuje swym zakresem linię komórek transfekowanych plazmidem rekombinantowym zawierającym sekwencje kodujące wytworzonych technikami inżynierii genetycznej przeciwciał lub ich zmienione cząsteczki immunoglobuliny. Typowe są również komórki-gospodarze użyteczne przy klonowaniu i innych manipulacjach z udziałem tych wektorów klonujących. Jednakże, i jest to najbardziej pożądane, do replikacji wektorów klonujących i do realizacji innych etapów konstruowania zmienionych przeciwciał według niniejszego wynalazku, używa się komórek pochodzących z rozmaitych szczepów E. coli. Korzystnymi komórkami-gospodarzami lub liniami komórek nadającymi się do ekspresji inżynieryjnego przeciwciała lub zmienionego przeciwciała według wynalazku, są komórki ssaków, takie jak CHO, COS, fibroblast (na przykład 3T3) i komórki szpikowe, korzystniejszymi zaś są CHO i komórka szpikowa. Stosować można komórki ludzkie, umożliwiając w ten sposób modyfikację cząsteczki ludzkimi wzorcami glikozylacji. Alternatywnie, posłużyć się tu można także i innymi liniami komórek eukariotycznych. Sposoby dokonywania selekcji odpowiednich komórek-gospodarzy ssaków i sposoby przeprowadzania transformacji, hodowli, amplifikacji, badania przesiewowego oraz otrzymywania produktu i oczyszczania, są znane w tej dziedzinie wiedzy. Patrz, na przykład: Sambrook i in. (wyżej). Komórki bakteryjne mogą okazać się użyteczne jako komórki-gospodarze nadające się do ekspresji rekombinantowych Fab według niniejszego wynalazku [patrz, na przykład: A. Pluckthun,

19 Immunol. Rev., 130, (1992)]. Jednakże, w wyniku przejawiania przez białka, których ekspresja odbywa się w komórkach bakteryjnych, tendencji do występowania w formie niesfałdowanej lub niewłaściwie sfałdowanej, albo w postaci nieglikozylowanej, każdy rekombinantowy Fab utworzony w komórce bakteryjnej należy poddać badaniu przesiewowemu pod względem zachowania zdolności wiązania antygenu. W przypadku, gdy cząsteczka, której ekspresja dokonała się w danej komórce bakteryjnej, została wytworzona w formie poprawnie sfałdowanej, tę komórkę bakteryjną należy uznać za pożądanego gospodarza. I tak, na przykład, rozmaite szczepy E. coli stosowane do przeprowadzania ekspresji są dobrze znane w biotechnologii jako komórki-gospodarze. Stosować tu można także rozmaite szczepy B. subtilis, Streptomyces, innych bakterii itp. Tam, gdzie jest to pożądane, komórki drożdżaków ze szczepów znanych specjalistom w tej dziedzinie techniki, także są dostępne jako komórki-gospodarze. Dotyczy to również komórek owadzich, na przykład Drosophila i Lepidoptera, a także wirusowych systemów ekspresyjnych. Patrz, na przykład: Miller i in., Genetic Engineering, 8, , Plenum Press (1986) i przytoczone tam odnośniki. Ogólne sposoby umożliwiające konstruowanie wektorów według wynalazku, sposoby dokonywania transfekcji niezbędne do wytwarzania komórek-gospodarzy według wynalazku i sposoby prowadzenia hodowli potrzebne do wytworzenia zmienionego przeciwiała według wynalazku z takich komórek-gospodarzy, są to metody typowe. Podobnie, zmienione przeciwciała według wynalazku, po ich wytworzeniu można poddać wyodrębnianiu z hodowli komórkowej i oczyszczaniu zgodnie z typowymi sposobami postępowania, włącznie z wysalaniem przy użyciu siarczanu amonu, zastosowaniem kolumn powinowactwa, chromatografii kolumnowej, elektroforezy żelowej itp. Techniki te są znane w tej dziedzinie wiedzy i nie stanowią ograniczenia zakresu niniejszego wynalazku. Jeszcze inny sposób dokonywania ekspresji humanizowanych przeciwciał może obejmować ekspresję w zwierzęciu transgenicznym tak, jak to opisano w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr Odnosi się to do systemu ekspresyjnego wykorzystującego promotor kazeiny zwierzęcia, który po transgenicznym włączeniu w organizm ssaka pozwala samicy wytwarzać pożądane rekombinantowe białko w jej mleku. Po dokonaniu ekspresji w pożądany sposób, wytworzone techniką inżynierii genetycznej przeciwciało poddaje się następnie badaniu pod względem jego in vitro aktywności, z zastosowaniem odpowiedniego testu. Obecnie, do oceny jakościowej i ilościowej wiązania się wytworzonego technikami inżynierii genetycznej przeciwciała z czynnikiem IX, lub innymi odpowiednimi czynnikami krzepnięcia, stosuje się typowe formaty testu ELISA. Oprócz tego, można posłużyć się także innymi próbami in vitro w celu sprawdzenia skuteczności neutralizacji, jeszcze przed przeprowadzeniem następujących później klinicznych badań na ludziach, przeprowadzanych w celu dokonania oceny trwałości utrzymywania się, wytworzonego technikami inżynierii genetycznej, przeciwciała w organizmie człowieka, pomimo istnienia zwykłych mechanizmów usuwania. Postępując zgodnie ze sposobami opisanymi odnośnie do humanizowanych przeciwciał wytworzonych z BC2, specjalista w tej dziedzinie techniki może także skonstruować humanizowane przeciwciała z innych przeciwciał-dawców, sekwencji zmiennych regionów i peptydów CDR opisanych w niniejszym opisie. Wytwarzane technikami inżynierii genetycznej przeciwciała można otrzymywać z udziałem regionów zmiennych ramek odczytu potencjalnie rozpoznanych jako własne przez biorców przeciwciała wytworzonego techniką inżynierii genetycznej. Można wprowadzić nieznaczne modyfikacje regionów zmiennych ramek odczytu w celu spowodowania dużego wzmożenia wiązania antygenu i to bez poważniejszego zwiększenia immunogenności u biorcy. Tego rodzaju wytwarzane technikami inżynierii genetycznej przeciwciała mogą skutecznie leczyć ludzi w stanach, w których pośredniczy czynnik krzepnięcia krwi. Przeciwciała te mogą także być użyteczne w diagnostyce takich stanów. Wynalazek niniejszy dotyczy także sposobu hamowania zakrzepicy u zwierząt i, zwłaszcza, u ludzi, polegającego na podawaniu skutecznej dawki monoklonalnego przeciwciała skierowanego przeciw czynnikom krzepnięcia i odznaczającego się samoograniczającą się aktywnością neutralizującą. Korzystnie, czynnik krzepnięcia pochodzi z układu wewnątrzpochodnego

20 lub części wspólnej kaskady krzepnięcia. Najkorzystniej, monoklonalne przeciwciało będące czynnikiem przeciwkrzepliwym stanowi czynnik skierowany przeciw następującym czynnikom: czynnik IX, czynnik IXa, czynnik X, czynnik Xa, czynnik XI, czynnik XIa, czynnik VIII, czynnik Villa, czynnik V, czynnik Va, czynnik VII, czynnik VIIa lub przeciw trombinie. PM mogą obejmować jeden, lub większą ilość przeciwciał wytworzonych technikami inżynierii genetycznej lub przeciwciał zmienionych, opisanych w niniejszym opisie, albo ich fragmentów. Alternatywnie, łącznie z przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciw czynnikowi krzepnięcia można podawać kwas acetylosalicylowy. W niektórych przypadkach, leczenie skojarzone pozwala obniżyć terapeutycznie skuteczną dawkę monoklonalnego przeciwciała skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia. Odpowiedź terapeutyczna wywołana zastosowaniem cząsteczek według niniejszego wynalazku powstaje w wyniku wiązania się ich z odpowiednim czynnikiem krzepnięcia krwi, z następującym potem samoograniczającym się zahamowaniem kaskady krzepnięcia. I tak, cząsteczki według niniejszego wynalazku, występujące w postaci preparatów odpowiednich do zastosowań farmaceutycznych, są wysoce pożądane dla osób wrażliwych na nienormalną aktywność krzepnięcia (lub doświadczających jej) związaną, ale bez ograniczania się tylko do tego, z zawałem mięśnia serca, niestabilną dusznicą bolesną, migotaniem przedsionków, udarem mózgu, uszkodzeniem nerek, zakrzepem tętnicy płucnej, zakrzepicą żył głębokich oraz obecnością sztucznych narządów i implantów protezowych. Zmienionych przeciwciał, przeciwciał i ich fragmentów według niniejszego wynalazku można także używać łącznie z innymi przeciwciałami, w szczególności z ludzkimi PM reagującymi z innymi markerami (epitopami) odpowiedzialnymi za stan, przeciw któremu skierowane jest inżynieryjne przeciwciało według wynalazku. Sądzi się, że użycie środków terapeutycznych według niniejszego wynalazku pożądane jest w przypadku leczenia nieprawidłowych stanów związanych z krzepnięciem w okresie od około 1 dnia do około 3 tygodni. Stanowi to znaczący postęp w porównaniu z obecnie stosowanymi środkami przeciwkrzepliwymi, a mianowicie heparyną i warfaryną. Dawka i długość czasu leczenia związana jest z względnym czasem trwania cząsteczek według niniejszego wynalazku w krążeniu człowieka i fachowiec w tej dziedzinie techniki może je ustalić w zależności od rodzaju poddawanego leczeniu stanu chorobowego i od ogólnego stanu zdrowia pacjenta. Można przyjąć dowolny sposób podawania środka terapeutycznego według wynalazku i dowolną drogę podawania, zapewniającą uwalnianie środka w organizmie przyjmującego. Zmienione przeciwciała, przeciwciała wytworzone technikami inżynierii genetycznej i ich fragmenty, oraz kompozycje farmaceutyczne według wynalazku są szczególnie przydatne do podawania pozajelitowego, to znaczy podskórnego, domięśniowego, dożylnego i donosowego. Środki terapeutyczne według wynalazku można wytwarzać w postaci kompozycji farmaceutycznych zawierających, jako składnik aktywny, skuteczną ilość wytworzonego techniką inżynierii genetycznej (na przykład humanizowanego) przeciwciała według wynalazku w farmaceutycznie dozwolonym nośniku. Alternatywnie, kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą także zawierać kwas acetylosalicylowy. W przypadku profilaktycznego środka według wynalazku, korzystna jest wodna zawiesina lub wodny roztwór, zawierający wytworzone techniką inżynierii genetycznej przeciwciało, korzystnie zbuforowane na poziomie fizjologicznego ph, w postaci gotowej do wstrzyknięcia. Kompozycje przeznaczone do podawania drogą pozajelitową zawierają, na ogół, roztwór wytworzonego techniką inżynierii genetycznej przeciwciała według wynalazku, lub jego koktajl, rozpuszczony w farmaceutycznie dozwolonym nośniku, korzystnie w nośniku wodnym. Można tu zastosować cały szereg różnych nośników wodnych, takich jak, na przykład, 0,4% wodny roztwór chlorku sodu, 0,3% glicyna itp. Roztwory te są jałowe i ogólnie nie zawierają substancji drobnoziarnistych. Roztwory te można wyjaławiać z zastosowaniem typowych, dobrze znanych metod sterylizacji (takich jak, na przykład, sączenie). Kompozycje mogą także zawierać farmaceutycznie dozwolone substancje pomocnicze, odpowiednio do potrzeby przybliżenia warunków fizjologicznych, a mianowicie takich, jak środki służące ustalaniu wartości ph, środki buforujące itd. Stężenie przeciwciała według wynalazku w tego rodzaju preparacie farmaceutycznym może wahać się w bardzo szerokich granicach, to znaczy w zakresie od mniej niż około 0,5% wag,

21 zazwyczaj około 1% wag lub co najmniej około 1% wag, do nawet 15 lub 20% wag. Stężenie to dobiera się przede wszystkim w oparciu o wielkość objętości cieczy, poziom lepkości itd., stosownie do przyjętego konkretnego sposobu podawania leku. I tak, na przykład, kompozycję farmaceutyczną według wynalazku przenaczoną do wstrzykiwań domięśniowych można sporządzić tak, aby zawierała 1 ml jałowej zbuforowanej wody i od około 1 ng do około 100 mg, na przykład od około 50 ng do około 30 mg lub więcej, korzystnie od około 5 mg do około 25 mg, wytworzonego techniką inżynierii genetycznej przeciwciała według wynalazku. Podobnie, kompozycję farmaceutyczną według wynalazku przeznaczoną do wlewów dożylnych można sporządzić tak, aby zawierała około 250 ml jałowego roztworu Ringera i od około 1 mg do około 30 mg, korzystnie od 5 mg do około 25 mg wytworzonego techniką inżynierii genetycznej przeciwciała według wynalazku. Obecnie stosowane sposoby wytwrzania kompozycji nadających się do podawania drogą pozajelitową są dobrze znane i będą oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie techniki. Są one opisane bardziej szczegółowo, na przykład, w: Remington's Pharmaceutical Science, wyd. XV, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. Korzystnie, środek terapeutyczny według wynalazku jako preparat farmaceutyczny występuje w postaci dawek jednostkowych. Odpowiednią dawkę terapeutycznie skuteczną może łatwo ustalić specjalista w tej dziedzinie wiedzy. W celu skutecznego leczenia zaburzeń zakrzepowych lub zatorowych u człowieka lub zwierzęcia, podać należy pozajelitowo, korzystnie i.v. lub i.m., jedną dawkę wynoszącą od około 0,1 mg do około 20 mg białka lub przeciwciała według wynalazku/kg masy ciała. Jeżeli jest to konieczne, dawkę tę można powtórzyć z zachowaniem stosownych odstępów czasu, dobranych jako odpowiednie przez lekarza w trakcie odpowiedzi trombotycznej. Przeciwciała, zmienione przeciwciała lub ich fragmenty opisane w niniejszym opisie można zliofilizować w celu przechowywania i odtworzenia postaci pierwotnej, w odpowiednim nośniku, przed użyciem. Wykazano, że ten sposób postępowania jest skuteczny dla typowych immunoglobulin i można tu posłużyć się znanymi w tej dziedzinie techniki metodami liofilizacji i odtwarzania postaci pierwotnej. Wynalazek objaśniają następujące konkretne przykłady, nie ograniczające zakresu wynalazku w żaden sposób. Przykład 1 Wytwarzanie i badanie przesiewowe przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw czynnikowi IX. Myszom, samicom Balb/C, wstrzyknięto ludzki czynnik IX, jak to opisali R. Jenny i in. [Prep. Biochem., 16, (1986)]. Typowo, każda mysz otrzymała początkowe wstrzyknięcie 100 μg białka rozpuszczonego w 0,15 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i zmieszanej z 0,15 ml kompletnego adiuwanta Freunda. Mniej więcej co dwa tygodnie, w okresie 2-3 miesięcy, wykonywano uodpornianie przypominające z użyciem 50 μ g białka w 0,15 ml PBS z 0,15 niekompletnego adiuwanta Freunda. Po ostatnim podaniu dawki przypominającej, mysz otrzymała 50 μg czynnika IX w PBS, na trzy dni przed fuzją komórek śledziony i szpiczaka. Komórki śledziony wyodrębniono z uodpornionej myszy i dokonano ich fuzji z komórkami szpiczaka NS-1 [G Kohler i in., Eur. J. Immunol., 6, (1976)] z użyciem poli (glikolu etylenowego), jak to opisali V. T. Oi i in. w Selected methods in Cellular Immunology, red. B. B. Mishel i S. M. Shigii, Freeman Press, San Francisco. Po fuzji, komórki ponownie zawieszono w podłożu RPMI 1640 zawierającym 10% płodowych surowic cielęcych i podwielokrotne porcje umieszczono w dołkach czterech 24-dołkowych płytek zawierających w dołkach po 0,5 ml podłoża z płynem z płukania otrzewnowego kondycjonowanego komórkami. Następnego dnia, do każdego dołka wprowadzono 1,0 ml 2 x 10-4 M hipoksantyny, 8 x 10-7 M aminopteryny i 3,2 x 10-5 M płodowych surowic cielęcych. Komórki dokarmiano co 3-4 dni przez usunięcie połowy podłoża i zastąpienia jej świeżym podłożem zawierającym 1 x 10-4 M hipoksantyny i 1,6 x 10-5 M tymidyny. Po upływie około dwóch tygodni, z każdego dołka pobrano 1,0 ml podłoża hybrydomowego i poddano badaniu pod względem obecności przeciwciał skierowanych przeciw czynnikowi IX, z zastosowaniem testu ELISA, jak to opisali R. J. Jenny i in. [Meth. Enzy-

22 mol., 222, (1993)]. Mówiąc krótko, czynnik IX unieruchamiano na dołkach z tworzywa sztucznego w 96-dołkowych płytkach do mikromiareczkowania. Hybrydomowe supernatanty lub rozcieńczenia oczyszczonego przeciwciała inkubowano następnie w dołkach. Dołki przemyto i obecność kompleksów przeciwciało-antygen wykrywano drugim, kozim przeciwciałem przeciw mysiej immunoglobulinie, sprzężonym z peroksydazą chrzanową i chromogennym substratem odianizydyną. Dołki zawierające przeciwciała skierowane przeciw czynnikowi IX subklonowano za pomocą ograniczenia rozcieńczenia i hodowli w 96-dołkowych płytkach. Supernatant z klonowanych hodowli komórek hybrydomowych poddano badaniu przesiewowemu na obecność przeciwciała przeciw czynnikowi IX z zastosowaniem testu ELISA powyżej opisanego i komórki z hybrydomów pozytywnych ekspandowano i zamrażano, po czym przetrzymywano w ciekłym azocie, a następnie prowadzono ich wzrost jako guzów puchlinowych u myszy. Przykład 2 Samoograniczające się działanie przeciwciał, stanowiących czynnik przeciwkrzepliwy, w procesie krzepnięcia krwi. Wpływ wzrostu stężenia przeciwciał stanowiących czynnik przeciwkrzepliwy na czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (aptt) osocza ludzkiego określano przy użyciu fibrometru (Becton-Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Maryland) przy użyciu metody odniesieniowej Baxtera LIB0293-J, nowelizacja 3/93 (Baxter Scientific, Edison, New Jersey). Przed rozpoczęciem eksperymentu, do 5 ml probówki wprowadzono 2 do 3 ml 0,02 M CaCl2 i probówkę umieszczono w ogrzewanej komorze fibrometru. Próbki osocza ludzkiej krwi albo pobierano na świeżo i przetrzymywano na lodzie, albo rekonstytuowano zgodnie z zaleceniami wytwórcy z Hemostasis Reference Plasma (American Diagnostics, Greenwich, Connecticut). Nie rozfrakcjonowaną heparynę z błon śluzowych świńskiego jelita (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri), heparynę o małej masie cząsteczkowej z błon śluzowych świńskiego jelita (Lovenox, sól sodowa enoksaparyny, Rhóne-Poulenc Rorer Pharmaceuticals, Collegeville, Pennsylvania) lub środki przeciwkrzepliwe PM, wytworzono jako mniej więcej 50 μm roztwory macierzyste, kolejno rozcieńczane bezpośrednio do badanego osocza. Jako materiał odniesieniowy do badań włączono ślepą próbę zawierającą osocze bez środka przeciwkrzepliwego. Dwa naczynka fibrometru fibrotube wypełniono, odpowiednio, 100 μl badanej plazmy lub 100 μl badanej plazmy ze środkiem przeciwkrzepliwym i 125 μl aktywowanego aktyną odczynnika cefaloplastynowego (odczynnik aktynowy z kefaliny mózgu królika w kwasie elaginowym, dostępny z firmy Baxter Scientific) i umieszczono w dołkach fibrometru, w temperaturze 37 C. Po upływie minuty, 100 μl odczynnika aktynowego przeniesiono do naczynka zawierającego osocze i zawartość wymieszano kilkakrotnie pipetą. Po upływie trzech minut inkubacji, do mieszaniny plazmy i odczynnika aktynowego wprowadzono 100 μl CaCl2, uprzednio ogrzanego do temperatury 37 C, przy użyciu wyzwalacza Automatic Pipette/Timer (Becton- Dickinson). Czas skrzepnięcia rejestrowano i otrzymane wyniki przedstawiono na fig. 1 jako czas krzepnięcia w funkcji końcowego stężenia antykoagulanta w całkowitej objętości testowej wynoszącej 300 μl. Stężenie nominalne czynnika IX w próbie wynosiło nm. Wyniki przedstawione na fig. 1 uwidaczniają wpływ wzrostu stężenia mysich PM BC1 i BC2 skierowanych przeciw czynnikowi krzepnięcia IX na czas krzepnięcia aptt. Oba PM hamują krzepnięcie przez przedłużenie aptt i oba PM osiągają poziom wpływu końcowego nasycenia na aptt. Wartości IB50 są podobne do siebie przy ~35 nm i ~50 nm dla, odpowiednio, BC1 i BC2, ale różnica w maksimum odpowiedzi dla dwu przeciwciał jest wyraźna. Stężenie nasycające BC1 wydłuża aptt o około 50% do ~40 sekund. Z drugiej strony, BC2 wydłuża aptt 3,5-krotnie do około ~90 sekund. Docelowy zakres terapeutyczny przyjmowany w terapii przeciwkrzepliwej przy użyciu heparyny został uwydatniony. Wyniki wykazują, że dwa PM ograniczają terapeutyczny zakres aptt heparyny. Właściwości PM BC1 i BC2 zestawionono w poniższej tabeli I. Każdy PM BC rozpoznaje zarówno zymogen, czynnik krzepnięcia IX, jak i aktywną proteazę, czynnik krzepnięcia

23 IXa, ale tylko BC2 jest zdolny do blokowania tak aktywowania zymogenu jak i aktywności proteazy. Stwierdzono, że BC1 i BC2 krzyżowo reagują z czynnikiem krzepnięcia IV małpy Cynomologous. Oprócz tego, BC2 także reaguje krzyżowo z czynnikiem krzepnięcia IX szczura. Tabela 1 Zestawienie in vitro właściwości PM skierowanych przeciw czynnikowi krzepnięcia IX BC1 BC2 Wiąże czynnik IX tak tak Wiąże czynnik IXa tak tak Hamuje przekształcenie IX w IXa nie tak Hamuje aktywność IXa w kompleksie Xazy tak tak Zapotrzebowanie na kofaktora nie ma metale dwuwartościowe Ca2+ > Mn2+ apttmax x /aptt normalny IC50, nm Reaktywność krzyżowa gatunkowa małpa szczur, małpa. Izotyp IgG1 IgG2a Wyniki przedstawione na fig. 2 pokazują wpływ wzrostu stężenia PM 9E4(2)F4 i 11G4(1)B9 skierowanych przeciw czynnikowi krzepnięcia IX na czas krzepnięcia aptt. Osocze do badania rozcieńczono do połowy normalnego stężenia, w wyniku czego otrzymano wyjściowy aptt wynoszący 45 sekund. Oba PM hamowały krzepnięcie przez przedłużenie aptt, i oba PM osiągały poziom wpływu końcowego nasycenia na aptt. Stężenia nasycające 9E4(2)F4 i 11G4(1)B9 wydłuża aptt do sekund w przypadku 9E4(2)F4 i do -80 sekund w przypadku 11G4(1)B9. Otrzymane wyniki wskazują na to, że dwa PM znajdują się na górnym końcu terapeutycznego zakresu aptt heparyny. Wyniki przedstawione na fig. 3 pokazują wpływ wrostu stężenia PM HFXLC skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia X (w funkcji epitopu o lekkim łańcuchu), PM HFXHC skierowanego przeciw czynnikowi X (w funkcji epitopu o ciężkim łańcuchu) oraz PM HFXI skierowanego przeciw czynnikowi XI, na czas krzepnięcia aptt. Wspomniane PM otrzymano z firmy Enzyme Laboratories (South Bend, IN). PM HFXLC i HFXI hamują krzepnięcie przez przedłużenie aptt, i oba PM osiągają poziom wpływu końcowego nasycenia na aptt. Wartość IC50 dla HFXLC wynosi -40 nm; stężenie nasycające wydłuża aptt do -60 sekund. Wartość IC50 dla HFXI wynosi -20 nm; stężenie nasycające wydłuża aptt do -100 sekund. Otrzymane wyniki wskazują na to, że HFXLC znajduje się wewnątrz terapeutycznego zakresu aptt heparyny, podczas gdy HFXI znajduje się na górnym końcu terapeutycznego zakresu heparyny. HFXHC nie wywiera żadnego wpływu na czas krzepnięcia aptt. Samoograniczające się wydłużenie aptt zaobserwowano także w przypadku przeciwciał skierowanych przeciw czynnikowi krzepnięcia VID, kofaktorowi dla czynnika krzepnięcia Xa. I tak, na przykład, przeciwciało przeciw ludzkiemu czynnikowi VIH, SAF8C-IG, dostarczone przez firmę Affinity Biologicals Inc., powodowało wydłużenie aptt do najwyżej -65 sekund. Półmaksymalne wydłużenie apttt uzyskiwano przy zastosowaniu około 100 nm przeciwciała.

24 Przkład 3 Skuteczność PM skierowanych przeciw mysiemu czynnikowi krzepnięcia IX w szczurzym modelu skrzepliny. Do dokonania oceny skuteczności działania przeciwciał skierowanych przeciw czynnikowi IX w zapobieganiu zakrzepicy tętniczej zaadaptowano szczurzy model zakrzepicy tętnicy szyjnej opisany przez Schumachera i in. [J. Cardiac Pharm., 22, (1993)]. Model ten obejmuje odcinkowe uszkodzenie śródbłonka szyjnego tlenem rodnikowym wytwarzanym przez FeCl3, przy czym roztwór nanoszono na powierzchnię tętnicy szyjnej. Mówiąc krótko, szczury znieczulono solą sodową pentobarbitalu, po czym w żyłę szyjną wprowadzono kaniulę w celu umożliwienia wstrzyknięć dożylnych, a w lewą arterię udową wprowadzono kaniulę w celu monitorowania ciśnienia krwi i częstości akcji serca. Tętnicę szyjną wyizolowano metodą aseptyczną przez chirurgiczne nacięcie karku i wyposażono w magnetyczny zgłębnik do mierzenia przepływu w celu dokonywania pomiarów przepływu krwi. Po okresie stabilizowania, ustalono parametry linii odniesienia dla następujących zmiennych: przepływ szyjny krwi, ciśnienie tętnicze, częstość akcji serca, czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (aptt) i czas protrombinowy (PT). Następnie, na tętnicę nałożono, na okres 15 minut, wstępnie zmierzony kawałek bibuły filtracyjnej Whatman nasączonej 50% roztworem FeCl3 w celu całkowitego uszkodzenia znajdujących się pod bibułą komórek śródbłonka. Po usunięciu bibuły nasączonej FeCl3 eksperyment prowadzono w ciągu 60 minut, aż do zakończenia. Po zakończeniu eksperymentu, skrzeplinę szyjną wycięto z tętnicy szyjnej i zważono. Wszystkie środki podawano na 15 minut przed rozpoczęciem uszkadzania śródbłonka szyjnego. Badano wpływ następujących zabiegów i porównywano z działaniem PM BC2 skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX. 1. Heparyna: 15, 30, 60 lub 120 jedn/kg bolus, a następnie wlew, odpowiednio, 0,5, 1, 2 lub 4 jedn/kg/min, w ciągu 60 minut. 2. Kwas acetylosalicylowy (ASA, aspiryna): 5 mg/kg bolus. 3. PM BC2 skierowane przeciw czynnikowi krzepnięcia IX: 1, 3 lub 6 mg/kg bolus, a następnie wlew, odpowiednio, 0,3, 1 lub 2^k/kg/min, w ciągu 60 minut. 4. Heparyna: 30 jedn/kg bolus + 1 jedn/kg/min + ASA w dawce 5 mg/kg. 5. PM BC2 skierowane przeciw czynnikowi krzepnięcia IX: 1 mg/kg + 0,3 ((ig/kg/min + ASA w dawce 5 mg/kg. Figury 4 i 5 przedstawiają porównawczą farmakologię reżymu przeciwkrzepliwego/trombotycznego za pomocą uwidocznienia wpływu heparyny, ASA i PM BC2 skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX na aptt (fig. 4) i PT (fig. 5). Jako podstawowe kryterium oceny skuteczności w funkcji odpowiedzialności środków przeciwkrzepliwych/trombotycznych za krwawienie przyjęto w niniejszym badaniu kluczowy wskaźnik skłonności do krwawienia, a mianowicie aptt. Wyniki przedstawione na fig. 4 wykazują zależne od dawki wydłużenie aptt przez działanie heparyny w dwu wyższych dawkach, z maksymalną wartością tego wydłużenia czasu krzepnięcia znajdującą się już poza granicą testu. Sam ASA nie powoduje znaczniejszego wydłużenia aptt, ale w przypadku kombinacji z heparyną obserwuje się wyraźnie zaznaczony efekt synergistyczny. PM skierowane przeciw czynnikowi krzepnięcia IX wywierały niewielki wpływ na aptt i nawet w najwyższych dawkach wydłużenie czasu krzepnięcia nie przekraczało 3-krotnego zakresu skutków działania typowych środków przeciwkrzepliwych stosowanych w praktyce klinicznej. Najbardziej znaczące jest to, że niskie dawki PM BC2 skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX w kombinacji z ASA nie powodowały żadnej zmiany aptt. Na figurze 5 przedstawiono dane wskazujące na to, że PT także ulegał znacznemu wydłużeniu w wyniku działania heparyny, użytej w dwu wyższych dawkach, i kombinacji ASA + heparyna, ale nie w wyniku podawania dawek PM skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX samego lub podawanego łącznie z ASA. Wpływ działania heparyny, ASA i PM skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX na zamknięcie tętnicy szyjnej przedstawiono na fig. 6. Pokazane wyniki wskazują na to, że tętnice szyjne wszystkich zwierząt potraktowanych vehiculum zwierają się w odpowiedzi na uszkodzenie. Dawka heparyny w uzależniający sposób hamowała zatykanie się tętnicy

25 się tętnicy szyjnej. W przypadku dawki najwyższej, heparyna całkowicie zapobiegała zamknięciu się tętnicy szyjnej. Jednakże, dla tej dawki wcale nie można było zapoczątkować koagulacji. Sam ASA wywierał jednynie niewielki wpływ na zamykanie tętnicy szyjnej. Także w połączeniu z heparyną, ASA w żadnej mierze nie zabezpieczał arterii szyjnej przed zamknięciem. PM skierowane przeciw czynnikowi krzepnięcia IX, w dwu wyższych dawkach, całkowicie blokowało zamknięcie tętnicy szyjnej, bez przedłużenia koagulacji poza klinicznie pożądany zakres docelowy. PM skierowane przeciw czynnikowi krzepnięcia IX w niższej dawce, samo zupełnie nie chroniące drożności tętnicy, wykazywało całkowite zahamowanie zamkykania się tętnicy szyjnej przy podawaniu łącznie z ASA. Wpływ działania heparyny, ASA i omawianego PM na masę skrzepliny przedstawiono na fig. 7. Heparyna w sposób zależny od dawki powodowała zmniejszenie masy skrzepliny w tętnicy szyjnej. Jednakże, pomimo całkowitej blokady krzepnięcia, w tętnicy szyjnej ciągle jeszcze można było znaleźć pewną resztkową ilość skrzepliny. ASA sam, lub w kombinacji z heparyną (reżym przewidujący 30 jedn/kg), wywierał jedynie częściowy wpływ na masę skrzepliny. PM skierowane przeciw czynnikowi krzepnięcia IX powodowało w sposób zależny od dawki zmniejszenie masy skrzepliny, a w dawce wysokiej rzeczywiście całkowicie zapobiegało tworzeniu się skrzepliny. Ponadto, kombinacja PM skierwanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX w niskiej dawce i ASA, a więc reżym pozwalający na całkowite zapobieżenie zamknięciu się arterii szyjnej bez szkodliwego wpływu na wskaźniki krzepnięcia, w zupełności zapobiegał powstawaniu skrzepliny. Badania przeprowadzone na szczurzym modelu zakrzepicy szyjnej wyraźnie wykazują skuteczność działania omawianego PM w zapobieganiu zakrzepicy w modelu poważnego, tworzącego skrzepliny, uszkodzenia tętniczego. Najbardziej znacząca jest skuteczność PM skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX wykazana w obrębie zakresu pożądanego tearpeutycznego docelowego działania przeciwkrzepliwego, zdefiniowanego wartością aptt. Poza tym, heparyna będąca aktualnie typowym środkiem przeciwkrzepliwym, osiągała skuteczność porównywalną ze skutecznością PM skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX jedynie w przypadku dawek poważnie upośledzających krzepnięcie, aż do poziomu, przy którym dochodzi do powstawania krwi niezdolnej do skrzepnięcia. Jest rzeczą interesującą, że zaobserwowane wzajemne wzmożenie działania i synergizm nabyty przez leczenie skojarzone ASA i heparyną, wykazano także wtedy, gdy ASA podawano razem z PM skierowanym przeciw czynnikowi krzepnięcia IX. Jednakże, inaczej niż ma to miejsce w przypadku kombinacji heparyny z ASA, prowadzącej do wzajemnego wzmożenia zarówno działania przeciwzakrzepowego jak i przeciwkrzepliwego, kombinacja PM skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX i ASA powodowała wzajemne wzmożenie działania przeciwzakrzepowego, ale bez zgodnego z nim wpływu na parametry krzepnięcia krwi ex vivo. W ujęciu łącznym, dane te wykazują przewagę zdolności omawianego PM do działania przeciwzakrzepowego nad zdolnością heparyny, ASA lub kombinacji heparyny i ASA. Przykład 4 Mikroskopia elektronowa skaningowa szczurzego modelu zakrzepicy. Odcinki tętnicy szyjnej szczura pobrano z kontroli, samego chlorku żelaza (III) i chlorku żelaza (III) + 6 mg/kg przeciwciała skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX, 3/grupę, po upływie 15 minut od zastosowania chlorku żelaza (III). Tętnice utrwalono za pomocą perfimdowania formaldehydem i podwiązano ponad i pod strefą uszkodzoną. Utrwalone tętnice odwodniono i po inkubacji w heksametylodisilazanie wysuszono w eksykatorze. Wysuszone tętnice otwarto wzdłużnie i po odpowienim umieszczeniu w króćcach poddano badaniu metodą mikroskopii elektronowej skaningowej (SEM) z powleczeniem, przez napylenie, złotem. SEM tętnic kontrolnych wykazała obecność zasadniczo normalnego śródbłonka z rzadkimi, rozsianymi płytkami. Zaobserwowano kilka pęknięć śródbłonka, przypuszczalnie powstałych w wyniku uszkodzenia mechanicznego podczas zabiegu chirurgicznego. Leżąca poniżej błona podstawna pokryta była dywanem płytek. U szczurów kontrolnych nie zaobserwowano oznak obecności skrzepliny. SEM tętnic potraktowanych chlorkiem żelaza(iii) potwierdziła obecność dużych skrzeplin ściennych, zajmujących dużą część światła naczynia. Skrzepliny złożone były z zagrego-

26 wanych płytek, krwinek czerwonych oraz bezpostaciowej i włóknistej substancji białkopodobnej. Wspomniana substancja białkopodobna wykazuje zgodność z fibryną. Śródbłonek tętnic był w większości zakryty dużymi skrzeplinami. Tam, gdzie było to widzialne, śródbłonek pokrywający obszar potraktowany chlorkiem żelaza(m) obłożony był licznymi przywartymi płytkami i bezpostaciową substancją białkopodobną. SEM szczurzych tętnic potraktowanych chlorkiem żelaza (III), a także przeciwciałem czynnika krzepnięcia IX, wykazała, że w świetle naczynia w większości nie było skrzepliny. Śródbłonek pokrywający obszar potraktowany chlorkiem żelaza (III) wykazywał ekstensywne uszkodzenie, a pewna ilość powierzchni obłożona była przywartymi płytkami i agregatami płytek, jednakże stwierdzono tam tylko niewielką ilość substancji białkopodobnej, względnie nie było jej tam wcale. Przykład 5 Analiza sekwencyjna ciężkiego i lekkiego łańcucha cdna PM BC2 skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX. Całkowity RNA oczyszczono przy użyciu TriReagent (Molecuar Researc Center, Inc., Cincinnati, OH) zgodnie z protokołem wytwórcy RNA wytrącono izopropanolem i rozpuszczono w 0,5% SDS, po czym doprowadzono do 0,5 M NaCl. RNA Poli A+ wyodrębniono z zastosowaniem Dynabeads Oligo (dt)2 5 (Dynal A.S., Lake Success, NY) zgodnie z protokołem wytwórcy. RNA w formie Poli A+ wyeluowano z kuleczek i zawieszono w buforze TE. Dwanaście porcji podwielokrotnych po 100 ng RNA poddano odwróconej transkrypcji przy użyciu zestawu RT-PCR zgodnie z instrukcją wytwórcy (Boehringer Mannheim nr kat ) z zastosowaniem oligo-dt do napiętnowania. W przypadku łańcucha ciężkiego, amplifikowanie PCR 6 hybryd RNA/DNA przeprowadzono w 25 cyklach przy użyciu mysiego startera zawiasowego IgG2a (SEQ ID NO: 1) i startera sekwencji sygnałowej łańcucha ciężkiego (SEQ ID NO: 2). Podobnie, w przypadku łańcucha lekkiego, amplifikowanie metodą PGR 6 hybryd RNA/DNA przeprowadzono w 25 cyklach przy użyciu mysiego startera kappa (SEQ ID NO: 3) i startera degenerowanej sekwencji sygnałowej łańcucha lekkiego (SEQ ID NO: 4). Produkty PCR uzyskane z każdej z 12 amplifikacji ligowano do wektora PCR2000 (TA Cloning Kit, Invitrogen, nr kat. K ). Kolonie rekombinantowych klonów pobrano w sposób losowy i sporządzono minipreparaty plazmidowego DNA z zastosowaniem metody ekstrakcji alkalicznej, opisanej przez Bimboima i Doly'ego [Nuci. Acids Res., 7, 1513 (1979)]. Wyizolowany plazmidowy DNA poddano trawieniu z udziałem EcoRI i zanalizowano na 0,8% żelu agarozowym. Dwuniciowe inserty DNA o odpowiedniej wielkości, to znaczy -700 pz w przypadku łańcucha ciężkiego i -700 pz w przypadku łańcucha lekkiego poddano sekwencjonowaniu z zastosowaniem zmodyfikowanej metody Sangera. Porównano sekwencję wszystkich 12 łańcuchów ciężkich i lekkich w celu utworzenia sekwencji największej zgodności zmiennego regionu łańcucha ciężkiego BC2 (SEQ ID NO: 5) i sekwencji największej zgodności zmiennego regionu łańcucha lekkiego BC2 (SEQ ID NO: 6). Analiza sekwencyjna cdna regionu zmiennego łańcucha ciężkiego BC2 potwierdziła obecność otwartej ramki odczytu o 363 nukleotydach, kodującej sekwencję 121 aminokwasów (SEQ ID NO: 7). Sekwencje łańcucha ciężkiego CDR1, 2 i 3 są wyszczególnione w SEQ ID NO NO: odpowiednio 8, 9 i 10. Analiza sekwencyjna cdna zmiennego regionu łańcucha lekkiego BC2 potwierdziła obecność otwartej ramki odczytu o 321 nukleotydach, kodującej sekwencję 107 aminokwasów (SEQ ID NO: 11). Sekwencje łańcucha lekkiego CDR1, 2 i 3 wyszczególniono w SEQ ID NO NO: odpowiednio 12, 13 i 14. Przykład 6 Przeciwciała humanizowane. Sześć humanizowanych przeciwciał oznaczonych SB , SB , SB , SB , SB i SB tak zaprojektowano, aby zawierały powyżej opisane mysie CDR w ramce odczytu przeciwciała ludzkiego.

27 SB SB zawiera łańcuch ciężki F9HZHC 1-0 i łańcuch lekki F9HZLC 1-0. Syntetyczny zmienny region humanizowanego łańcucha ciężkiego F9HZHC 1-0 był zaprojektowany z zastosowaniem trzech pierwszych regionów ramki odczytu łańcucha ciężkiego otrzymanego z immunoglobuliny RF-TS3'CL [J.D. Capra i in., J. Clin. Invest. 86, (1990), zidentyfikowanej w bazie danych KABAT jako Kabpro:Hhcl0w] i CDR łańcucha ciężkiego BC2 poprzednio opisanego. Nie przeprowadzono żadnych podstawień aminokwasów ramki odczytu, które by mogły wywrzeć wpływ na prezentację CDR. Utworzono cztery zachodzące na siebie syntetyczne oligonukleotydy (SEQ ID NO NO: 15, 16, 17 i 18) które sprzęgnięte i przedłużone kodują aminokwasy przedstawiające sobą region zmienny łańcucha ciężkiego, i obejmujące CDR3 (SEQ ID NO NO: 19 i 20). Następnie, ten syntetyczny gen amplifikowano z zastosowaniem starterów PCR (SEQ ID NO NO: 21 i 22) i ligowano do wektora pcr2000 (TA cloning Kit, Intvitrogen, nr kat. K ), po czym izolowano z produktu restrykcyjnego trawienia Spel, KpnI. Drugi fragment DNA kodujący sekwencję sygnałową campath obejmujący pięć pierwszych aminokwasów regionu zmiennego (SEQ ID NO NO: 23 i 24) utworzono na drodze amplifikacji metodą PCR odpowiedniego regionu konstrukcji kodującej humanizowany ciężki łańcuch antywirusa oskrzelowego (SEQ ID NO: 25) z udziałem dwóch starterów (SEQ ID NO NO: 26 i 27), a następnie trawienia z udziałem enzymów restrykcyjnych EcoRI i Spel. Utworzone tak dwa fragmenty ligowano do EcoRl, wektora ekspresyjnego z komórek ssaka pfhzhc2-6pcd trawionego KpnI, zawierającego pozostałą część ludzkiej ramki odczytu o wysokiej zgodności 4 i region stały IgGl. Wektor zawierał pojedynczą mutację aminokwasową wektora pfhzhc2-3pcd, jak opisano w opublikowanym międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr W094/ Końcową pozostałość struktury 2 (reszta 49) zmutowano od Ser do Ala za pomocą trawienia pfhzhc2-3pcd z udziałem Xbal i EcoR5 i wbudowania łącznika utworzonego z dwóch syntetycznych oligonukleotydów (SEQ ID NO NO: 28 i 29). Sekwencję insertu F9HZHC 1-0 przedstawiono w SEQ ID NO NO: 30 i 31. Syntetyczny zmienny region zhumanizowanego łańcucha lekkiego F9HZLC 1-0 był zaprojektowany z zastosowaniem regionów ramki odczytu ludzkiego łańcucha lekkiego otrzymanego z immunoglobuliny LS8'CL [Carmack i in., J. Exp. Med., 169, (1989)], zidentyfikowanej w bazie danych KABAT jako Kabpro:Hkl318] i CDR łańcucha lekkiego BC2 poprzednio opisanych. Nie przeprowadzono żadnych podstawień aminokwasów struktury, które by mogły wywrzeć wływ na prezentację CDR. Utworzono dwa zachodzące na siebie syntetyczne oligonukleotydy (SEQ ID NO NO: 32 i 33) które sprzęgnięte i przedłużone kodują aminokwasy przedstawiające sobą region zmienny łańcucha lekkiego (SEQ ID NO NO: 34 i 35). Następnie, ten syntetyczny gen amplifikowano przy użyciu starterów PCR (SEQ ID NO NO: 36 i 37) i ligowano do wektora pcr2000 (TA cloning Kit, Intvitrogen, nr kat. K ), po czym izolowano z produktu restrykcyjnego trawienia Scal, SacII. Drugi fragment DNA kodujący sekwencję sygnałową campath, obejmujący dwa pierwsze aminokwasy zmiennego regionu (SEQ ID NO NO: 38 i 39) utworzono na drodze amplifikacji metodą PCR odpowiedniego regionu konstrukcji kodującego humanizowany łańcuch ciężki antywirusa oskrzelowego (SEQ ID NO: 25) z udziałem dwóch starterów (SEQ ID NO NO: 26 i 40), a następnie trawienia z udziałem enzymów restrykcyjnych EcoRI i Scal. Utworzone tak dwa fragmenty ligowano do EcoRI, wektora eksresyjnego z komórek ssaka pfhzlcl-2pcn trawionego SacII, zawierającego pozostałą część zgodnej ludzkiej ramki odczytu 4 i stały region kappa. Wektor zawierał pojedynczą mutację aminokwasową wektora pfhzlcl-lpcn, opisaną w opublikowanym międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr W094/ Końcową pozostałość ramki odczytu 2 zmutowano od Ser do Ala za pomocą trawienia pfhzlcl-pcn z udziałem Smal i KpnI i wbudowania łącznika utworzonego z dwóch syntetycznych oligonukleotydów (SEQ ID NO NO: 41 i 42). Sekwencję insertu F9HZLC 1-0 przedstawiono w SEQ ID NO NO: 43 i 44. SB SB zawiera łańcuch ciężki F9HZHC 1-1 i łańcuch lekki F9HZLC 1-1. Te konstrukcje łańcucha ciężkiego i lekkiego oparte są na, odpowiednio, F9HZHC 1-0 i F9HZLC 1-0,

28 jednakże zawierają podstawienia aminokwasów ramki odczytu, co może wpływać na prezentację CDR. F9HZHC 1-1 posiada trzy podstawienia aminokwasów ramki odczytu, co może wpływać na prezentację CDR. Utworzono dwa zachodzące na siebie syntetyczne oligonukleotydy (SEQ ID NO NO: 45 i 46), które sprzęgnięte i przedłużone kodują aminokwasy przedstawiające sobą zmienioną część zmienionego zmiennego regionu łańcucha ciężkiego (SEQ ID NO NO: 47 i 48). Ten gen syntetyczny amplifikowano następnie przy użyciu starterów PGR (SEQ ID NO NO: 49 i 50), ligowano do wektora pcr2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, nr kat. K ) i izolowano z produktu trawienia EcoNI, KpnI. Fragment ten ligowano do wektora F9HZHC1-0 (SEQ ID NO: 30) trawionego EcoNI, KpnI. Sekwencja insertu F9HZHC 1-1 jest przedstawiona w SEQ ID NO NO: 51 i 52. F9HZLC 1-1 posiada cztery podstawienia aminokwasów ramki odczytu, które mogą wpływać na prezentację CDR. Utworzono dwa syntetyczne oligonukleotydy (SEQ ID NO NO: 53 i 54), które sprzęgnięte zawierają lepkie końce KpnI ibamhi i kodują aminokwasy przedstawiające sobą zmienioną część zmiennego regionu łańcucha lekkiego (SEQ ID NO: 55). F9HZLC 1-0 (SEQ ID NO: 43) poddano trawieniu z udziałem enzymów restrykcyjnych KpnI ibamhi i ligowano do syntetycznego DNA. Sekwencję insertu F9HZLC 1-1 przedstawiono w SEQ ID NO NO: 56 i 57. SB SB zawiera łańcuch ciężki F9HZHC 1-1 (powyżej opisany) (SEQ ID NO: 52) i łańcuch lekki F9HZLC 1-2. Produkt konstrukcji łańcucha lekkiego oparty jest na F9HZLC 1-1, jednakże zawiera on jedno dodatkowe podstawienie aminokwasów konstrukcji, które może wpływać na prezentację CDR. Utworzono dwa syntetyczne oligonukleotydy (SEQ ID NO NO: 58 i 59), które sprzęgnięte zawierają lepkie końce BamHI i Xbal i kodują aminokwasy przedstawiające sobą zmienioną część zmiennego regionu łańcucha lekkiego (SEQ ID NO: 60). Wektor F9HZLC 1-1 (SEQ ID NO: 56) poddano trawieniu z udziałem enzymów restrykcyjnych Bam HI i Xbal i ligowano do syntetycznego DNA. Sekwencję insertu F9HZLC 1-2 przedstawiono w SEQ ID NO NO: 61 i 62. SB SB zawiera łańcuch ciężki F9HZHC 1-1 (powyżej opisany) (SEQ ID NO: 52) i łańcuch lekki F9HZLC 2-0. Syntetyczny zmienny region humanizowanego łańcucha lekkiego F9HZLC 2-0 zaprojektowano z zastosowanim regionów ramki odczytu ludzkiego łańcucha lekkiego otrzymanego z immunoglobuliny REI [Palm i Hilschmann, Z. Physiol. Chem., 354, (1973)], zidentyfikowanej z bazie danych KABAT jako Kabpro: HKL111) i CDR lekkiego łańcucha BC2 poprzednio opisanego. Wprowadzono pięć ludzkich zgodnych podstawień aminokwasów. Dokonano sześciu mysich podstawień aminokwasów ramki odczytu, które mogą wpływać na prezentację CDR. Utworzono dwa zachodzące na siebie syntetyczne oligonukleotydy (SEQ ID NO NO: 63 i 64), które sprzęgnięte i przedłużone, kodują aminokwasy przedstawiające sobą zmienny region lekkiego łańcucha (SEQ ID NO NO: 65 i 66). Ten syntetyczny gen amplifikowano następnie przy użyciu starterów PCR (SEQ ID NO NO: 67 i 68), ligowano do wektora pcr2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, nr kat. K ) i wyodrębniano z produktu trawienia Scal, SacII. Drugi fragment DNA kodujący sekwencję sygnałową campath obejmujący dwa pierwsze aminokwasy regionu zmiennego (SEQ ID NO: 38) wytworzono na drodze amplifikacji metodą PCR odpowiedniego regionu konstrukcji kodującej humanizowany łańcuch ciężki antywirusa oskrzelowego (SEQ ID NO: 25) przy użyciu dwóch starterów (SEQ ID NO NO: 26 i 69) i za pomocą trawienia przy udziale dwóch enzymów restrykcyjnych EcoRI i Scal. Trzeci fragment DNA kodujący pozostałość ludzkiej ramki odczytu 4 (SEQ ID NO: 70) i zawierający lepkie końce SacII i Narl, utworzono za pomocą sprzęgnięcia dwóch syntetycznych oligonukleotydów (SEQ ID NO NO: 71 i 72). F9HZLC 1-0 (SEQ ID NO: 43) poddano trawieniu z udziałem enzymów restrykcyjnych EcoRI i Narl i ligowano do trzech fragmentów DNA. Sekwencję insertu F9HZLC 2-0 przedstawiono w SEQ ID NO NO: 73 i 74).

29 SB SB zawiera łańcuch ciężki F9HZHC 1-1 (SEQ ID NO: 52) i łańcuch lekki F9HZLC 1-3, pojedynczą mutację aminkwasową F9HZLC 1-2 (SEQ ID NO 62). F9HZLC 1-2 amplifikowano metodą PCR przy użyciu dwóch starterów (SEQ ID NO NO: 26 i 69) i poddano trawieniu z udziałem enzymów restrykcyjnych EcoRI i Scal. Wyodrębniono fragment 94 pz (SEQ ID NO NO: 75 i 76). Fragment ten ligowano do wektora F9HZLC 1-2 trawionego EcoRI, Scal, w wyniku czego otrzymano konstrukcję w postaci łańcucha lekkiego F9HZLC 1-3. Sekwencję insertu F9HZLC 1-3 przedstawiono w SEQ ID NO NO: 77 i 78). SB SB zawiera syntetyczny region zmienny humanizowanego łańcucha ciężkiego F9HZHC 3-0 i łańcuch lekki F9HZLC 3-0. Utworzono cztery zachodzące na siebie syntetyczne oligonukleotydy (SEQ ID NO NO: 79, 80, 81 i 82), które sprzęgnięte i przedłużone kodują aminokwasy przedstawiające sobą zmieniony zmienny region łańcucha ciężkiego (SEQ ID NO NO: 83 i 84). Ten gen syntetyczny amplifikowano następnie przy użyciu starterów PCR (SEQ ID NO NO: 85 i 86), ligowano do wektora pcr2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, nr kat. K ) i izolowano z produktu restrykcyjnego trawienia Stul, KpnI). Wyodrębniony fragment ligowano do wektora F9HZHC 1-1 (SEQ ID NO: 52) trawionego Stul, KpnI. Wektor ten poddano następnie trawieniu z udziałem EcoEI, Spel w celu usunięcia sekwencji sygnałowej. Fragment DNA kodujący sekwencję sygnałową campath (SEQ ID NO: 23) obejmujący pięć pierwszych aminokwasów regionu zmiennego utworzono na drodze amplifikacji, metodą PCR, F9HZHC 2-0 przy użyciu dwóch starterów (SEQ ID NO NO: 26 i 87) i trawienia z udziałem enzymów restrykcyjnych EcoRI i Spel. Utworzony fragment ligowano do wektora. Sekwencję insertu F9HZHC 3-0 przedstawiono w SEQ ID NO NO: 88 i 89. Utworzono cztery zachodzące na siebie syntetyczne oligonukleotydy (SEQ ID NO NO: 90, 91, 92 i 93), które sprzęgnięte i przedłużone kodują aminokwasy przedstawiające sobą region zmienny łańcucha lekkiego (SEQ ID NO NO: 94 i 95). Ten gen syntetyczny amplifikowano następnie przy użyciu starterów PCR (SEQ ID NO NO: 96 i 97) i ligowano do wektora pcr2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, nr kat. K ), po czym wyodrębniono z produktu restrykcyjnego trawienia Sciai, Narl. Wyodrębniony fragment ligowano do wektora F9HZLC 1-3 (SEQ ID NO: 77) trawionego Scal, Narl. Sekwencję insertu F9HZLC 3-0 przedstawiono w SEQ ID NO NO: 98 i 99. Dokonano ekspresji humanizowanego PM skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX w komórkach CHO. Przeprowadzono hodowlę linii komórek DG-44, przystosowanych do wzrostu zawiesinowego w podłożu nie zawierającym surowicy, w 100 ml podłoża nie zawierającego białka, zawierającego IX nukleozydów i 0,05% F68, w 250 ml jednorazowych jałowych kolbach Erlenmeyera (Corning), na wstrząsarce płytowej Innova 2100 (New Brunswick Scientific), przy 150 obr/min, w temperaturze 37 C, w atmosferze 5% C02/95% powietrza, w nawilżanym inkubatorze. Komórki te pasażowano przy 4 x 105 komórek/ml dwa razy tygodniowo, 15 a.g każdego z wektorów pcn-lc-lekki łańcuch i pcd-hc-ciężki łańcuch przeprowadzono w postać liniową za pomocą trawienia z udziałem N otl, po czym współwytrącono w warunkach jałowych i ponownie zawieszono w 50 il buforu 1X TE (10 mm Tris, 1 mm EDTA, ph 7,5). Przeprowadzono elektroporację DNA z zastosowaniem Bio-Rad Gene Puiser (Bio-Rad Laboratories) do komórek Acc-098 z zastosowaniem metody Hensley'a i in. [J. Biol. Chem., 269, (1994)]. 1,2 x 107 komórek przemyto jeden raz w 12,5 ml lodowato zimnego buforu PBSucrose (PBS, 272 mm sacharozy, 7 mm fosforanu sodu, ph 7,4, 2 mm MgCh), ponownie zawieszono w 0,8 ml PBS, wprowadzono do 50 al roztworu DNA i inkubowano na lodzie w ciągu 15 minut. Komórki poddano pulsowaniu przy 380 V i 25 mikro faradach, po czym inkubowano na lodzie w ciągu 10 minut. Następnie komórki wprowadzono na 96-dołkowe płytki do hodowli w ilości 5 x 105 komórek/płytkę, w podłożu podtrzymującym, w ciągu 24 godzin przed dokonaniem selekcji. Selekcję komórek przeprowadzono pod względem oporności na G418 (400 ng/ml) (Geneticin, Life Technologies, Inc.), w podłożu podtrzymującym. Na 24 godziny przed wykonaniem badania, komórki odżywiono dodaniem 150 fj.1 podłoża podtrzymującego.

30 Kondycjonowane podłoże z pojedynczych kolonii poddano badaniu z zastosowaniem elektrochemiluminiscencyjnej metody wykrywania (ECL), przy użyciu analizatora Rigen (IGEN, Inc.). Patrz: Yang i in. [(Biotechnology, 12, (1994)]. Wszystkie roztwory potrzebne do realizacji badania (bufor do badań) i do pracy analizatora (środek do czyszczenia komórek) otrzymano z IGEN. Przeciwciała [Anti-Human IgG (g-chain specific), Sigma Chemicals] oraz F(ab') 2 Fragment to Human IgG (H+L) (Kirkekaard & Peny Laboratories Inc.) były znakowane przy użyciu TAG-NHS-ester (IGEN, Inc.) przy stosunku molowym TAG: białko wynoszącym 7:1, podczas gdy odczynnik Protein A (Sigma) był znakowany przy użyciu Biotin-LC-Sulfo-NHS-ester (IGEN, Inc.) przy stosunku molowym Biotyn: białko wynoszącym 20 : 1, w obu przypadkach zgodnie z zaleceniami firmy IGEN. Magnetyczne kuleczki opłaszczone streptawidyną (M-280) otrzymano z firmy Dynal. Testy immunologiczne przeprowadzono przy użyciu następującego protokołu. Na jedną próbkę używano 50 μl kuleczek opłaszczonych streptawidyną (końcowe stężenie 600 μg/ml, rozcieńczenie w PBS, ph 7,8, z 1,25% Tween) i mieszano z 50 μl Biotin-Protein A (końcowe stężenie wynosiło 1 μg/rozcieńczenie w PBS, ph 7,8, z 1,25% Tween), po czym inkubowano w temperaturze pokojowej w ciągu 15 minut, przy mieszaniu. Następnie dodano 50 μl przeciwciał TAG (mieszanina o końcowym stężeniu wynoszącym 1,25 μg/ml F(ab')2 Fragment to Human IgG (H+L) i 0,25 μg/ml Anti-Human IgG (g-chain specific), rozcieńczenie w PBS, ph 7,8, z 1,25% Tween) i roztwór wprowadzono do 50 μl kondycjonowanego podłoża, po czym inkubowano, przy mieszaniu, w temperaturze pokojowej w ciągu godziny. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano 200 μl buforu do badań i próbkę poddano analizie w analizatorze Origen I, w celu wykonania pomiaru poziomu ECL. Otrzymane wyniki wykazały, że około 20-37% poddanych badaniu kolonii wydzielało ponad 15 ng/ml przeciwciała przy średnim poziomie ekspresji wynoszącym około 150 ng/ml. Humanizowane PM skierowane przeciw czynnikowi krzepnięcia IX poddano oczyszczaniu z kondycjonowanych podłoży przy użyciu Procep A w etapie wychwytywania, z następującą potem chromatografią jonowymienną w celu zredukowania ilości obciążenia DNA. Do przygotowania kolumny (o stosunku średnicy do wysokości wynoszącym 1 : 1) użyto materiału sorbującego Procep A (Bioprocessing Ltd., Durham, Anglia). Sklarowane, kondycjonowane podłoża wprowadzano do kolumny z szybkością około 150 cm/godzinę. Kolumnę przemyto kolejno solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), PBS zawierającą 1 M NaCl i w końcu PBS. Substancje związane odzyskano za pomocą elucji przy użyciu 0,1 M kwasu octowego. Eluat doprowadzono do ph 5,5 i rozcieńczono wodą (1 : 4). Rozcieńczony roztwór wprowadzono na kolumnę S-Sepharose (2,5 x 13 cm), którą wstępnie zrównoważono 20 mm octanem sodu, ph 5,5, przy 80 cm/godzinę. Kolumnę przemywano buforem octanowym, aż do otrzymania stałego poziomu wartości odniesienia, po czym związane białko wyeluowano przy użyciu 20 mm fosforanu sodu, ph 7,4, przy 25 cm/godzinę. Produkt elucji przesączono przez 0,4 mikrometrową membranę i przechowywano w temperaturze 4 C. Przykład 7 Chimeryczne przeciwciało mysz-człowiek. 100 ng RNA BC2 poddano odwróconej transkrypcji przy stosowaniu zestawu RT-PCR zgodnie z instrukcjami wytwórcy (Boehringer Mannheim nr kat ) przy użyciu do napiętnowania oligo-dt, po czym amplifikowano metodą PCR przy użyciu syntetycznych starterów ScaI (SEQ ID NO: 100) i NarI (SEQ ID NO: 101), w wyniku czego otrzymano zmienny region łańcucha lekkiego BC2 o końcach Scal, Nar1 (SEQ ID NO NO: 102 i 103). Tak otrzymany DNA ligowano do F9HZHC1-3 trawionego ScaI, NarI (SEQ ID NO: 77) i trawiono ScaI, NarI, w wyniku czego otrzymano chimeryczny łańcuch lekki mysz-człowiek F9CHLC (SEQ ID NO NO: 104 i 105). 100 ng RBA BC2 poddano odwrotnej transkrypcji przy stosowaniu zestawu RT-PCR zgodnie z instrukcjami wytwórcy (Boehringer Mannheim, nr kat ), przy użyciu do napiętnowania oligo-dt, a następnie amplifikowano metodą PCR przy użyciu syntetycznych starterów Spel (SEQ ID NO: 106) i NheI (SEQ ID NO: 107), w wyniku czego otrzymano zmienny region łańcucha ciężkiego BC2 o końcach SpeI, Nhe 1 (SEQ ID NO NO: 108 i 109). Sekwencję sygnałową campath amplifikowano metodą PCR z łańcucha ciężkiego RSVHZ19

31 (SEQ ID NO: 25) przy użyciu starterów EcoRI (SEQ ID NO: 26) i SpeI (SEQ ID NO: 87). Te dwa fragmenty DNA ligowano do wektora IL4CHHCpcd trawionego EcoRI, NheI, opisanego w opublikowanym międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr W095/07301, z zastąpieniem zmiennego regionu IL4 mysim zmiennym regionem BC2, skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX, w wyniku czego otrzymano chimeryczny łańcuch ciężki myszczłowiek F9CHHC (SEQ ID NO NO: 110 i 111). Kotransfekcję i oczyszczanie chimerycznego przeciwciała mysz-człowiek chafix przeprowadzono sposobem opisanym powyżej odnośnie do konstrukcji humanizowanych. Przykład 8 Skuteczność działania humanizowanych PM skierowanych przeciw czynnikowi krzepnięcia IX w szczurzym modelu skrzepliny. Do dokonania oceny skuteczności działania humanizowanych przeciwciał skierowanych przeciw czynnikowi krzepnięcia IX w zapobieganiu zakrzepicy tętniczej, posłużono się opisanym w powyższym przykładzie 3 szczurzym modelem zakrzepicy tętnicy szyjnej. Ustalono podstawowe parametry dla szyjnego przepływu krwi, ciśnienia tętniczego, częstości akcji serca, drożności naczyń i czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji (aptt). Po upływie 15 minut, w ciągu 10 minut powodowano zaistnienie uszkodzenia szyjnego. Wartości poszczególnych parametrów oznaczono po upływie 60 minut od zaistnienia uszkodzenia szyjnego. Skrzeplinę szyjną wycięto z tętnicy szyjnej i zważono. Wszystkie środki podawano dożylnie na 15 minut przed zaistnieniem uszkodzenia szyjnego. Zbadano skutki następujących zabiegów i wyniki porównano z wynikami otrzymanymi dla PM BC2 skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX. 1. Vehiculum 2. chαfik: 3 mg/kg bolus 3. SB : 3 mg/kg bolus 4. SB : 3 mg/kg bolus 5. SB : 3 mg/kg bolus 6. SB : 3 mg/kg bolus 7. SB : 3 mg/kg bolus 8. Heparyna: 60 jednostek/kg (bolus) + 2 jednostki/kg/min (wlew). Jako podstawowe kryterium oceny skuteczności w funkcji odpowiedzialności środków przeciwkrzepliwych/trombotycznych za krwawienie, przyjęto w niniejszym badaniu aptt. Wyniki przedstawione na fig. 8 wykazują, że humanizowane PM skierowane przeciw czynnikowi krzepnięcia IX, a mianowicie SB , SB , SB , SB i SB wywierały niewielki wpływ na aptt w przypadku dawki wynoszącej 3,0 mg/kg, mieszczącej się w zakresie klinicznie akceptowanym. Wpływ PM skierowanych przeciw czynnikowi krzepnięcia IX na masę skrzepliny przedstawiono na fig. 9. Otrzymane wyniki pokazują, że wszystkie humanizowane PM są w równej mierze skuteczne pod względem redukowania masy skizepliny. Badania przeprowadzone na szczurzym modelu zakrzepicy szyjnej wyraźnie wykazują skuteczność humanizowanych PM skierowanych przeciw czynnikowi krzepnięcia IX w zapobieganiu zakrzepicy w wysoce aktywnym pod względem tworzenia skrzeplin modelu uszkodzenia tętniczego. Najbardziej znacząca jest skuteczność wszystkich humanizowanych PM skierowanych przeciw czynnikowi krzepnięcia IX wykazywana w obrębie pożądanego terapeutycznego przeciwkrzepliwego zakresu określanego przez aptt. Przykład 9 Właściwości biochemiczne i biofizyczne przeciwciała. Masę cząsteczkową SB oznaczono z zastosowaniem MALD-MS i stwierdzono, że wynosi ona Da. Identyczną wartość dało analityczne ultrawirowanie SB W obecności czynnika IX + Ca2+, przeciwciała wywodzące się z BC2 osiadały przy wartości masy wynoszącej Da, co odpowiada połączonej masie PM i dwóch cząsteczek czynnika krzepnięcia IX. Nie stwierdzono występowania wyżej uporządkowanych agregatów

32 w obecności lub nieobecności czynnika krzepnięcia IX. Kinetykę wiązania się czynnika krzepnięcia IX z SB oceniano metodą analizy BIAcore z udziałem przeciwciała związanego z powierzchnią unieruchomionego białka A. Użyto rekombinantowego ludzkiego czynnika krzepnięcia IX (rhfix, Genetics Institute) przy 49 nm i pomiary przeprowadzono w obecności 5 mm Ca2+. Wzajemne oddziaływanie charakteryzowano przez szybkie asocjowanie: kas = 2,0 x 105 M-1s-1i względnie małą szybkość dysocjacji: kdys = 4,1 x 10-4 s-1. Wartość Kd obliczona dla wiązania się czynnika krzepnięcia IX wynosiła 1,9 nm. W tabeli 1 zestawiono właściwości biofizyczne SB Tabela 1 Podsumowanie właściwości biofizycznych SB Izotyp IgG1, kappa Czystość według SDS-PAGE >95% (w warunkach redukujących) Masa cząsteczkowa: spektrometria masowa Da ultrawirowanie analityczne Da Stechiometria wiązania się czynnika IX: 1,5 mola czynnika izotermiczna kalorymetria miareczkowa IX : 1 mol PM Powinowactwo wiązania się czynnika IX: izotermiczna kalorymetria miareczkowa Kd = 4 nm (25 C) biosensor Kd = 2 nm Kinetyka wiązania się czynnika IX: biosensor kas = 2,0 x 105 M-1s-1 kdys = 4 x 10-4 s-1 W tabeli 2 zestawiono właściwości odnoszące się do wiązania się czynnika krzepnięcia IX z przeciwciałami monoklonalnymi według niniejszego wynalazku. Obliczone stałe dysocjacji były w zasadzie identyczne w granicach błędu doświadczenia. Tabela 2 Kinetyka wiązania się czynnika krzepnięcia IX z PM skierowanym przeciw czynnikowi krzepnięcia IX PM kas (M-1s-1) kdys (s-1) obliczono Kd (nm) SB ,0 x 105 4,1 x ,9 BC2 4,8 x 105 9,1 x ,9 Chf9 2,4 x 105 3,0 x ,3 SB ,5 x 105 2,8 x ,7-5,1 SB ,5 x 105 1,8 x ,1-2,3 SB ,2 x 105 4,1 x ,8 SB ,2 x 105 9,9 x ,1 SB ,1 x 106 1,2 x ,5

33 Wzajemne oddziaływania między rhfix i SB , BC2 i innymi humanizowanymi konstrukcjami charakteryzowano metodą mikrokalorymetrii miareczkowej, umożliwiającej mierzenie wzajemnych oddziaływań związanych z wiązaniem się w roztworze, na podstawie ciepła wewnętrznego wiązania. Do kalorymetru wstrzyknięto 9 porcji 106 μm FIX z zawartością 2 μm PM SB Wiązanie, jako wydzielone ciepło, wykryto w 4 pierwszych wstrzyknięciach. W przypadku pięciu ostatnich wstrzyknięć miejsca wiązania PM były wysycone FIX i zaobserwowano jedynie ciepło tłowe, wynikające z mieszania. Otrzymane wyniki wskazują, że punkt równowagi występował, tak jak tego oczekiwano, przy stosunku molowym bliskim 2 FIX na przeciwciało monoklonalne. Analiza danych, wykonana nieliniową metodą najmniejszych kwadratów, pozwoliła ustalić powinowactwo wiązania. Powinowactwo rhfix mab zmierzono w zakresie temperatur od 34 do 44 C w 10 mm HEPES, 10 mm CaCl2, 150 mm NaCl, ph 7,4. Otrzymane dane pozwalają określić powinowactwo w temperaturze 37 C bezpośrednio, a powinowactwo w temperaturze 25 C przez obliczenie z równania van't Hoffa. Dane zamieszczone w poniższej tabeli 3 pokazują, że powinowactwa SB , BC2 i innych humanizowanych konstrukcji w granicach błędu (współczynnik 2) są takie same. Tabela 3 Wyniki kalorymetrii miareczkowej dla PM skierowanych przeciw czynnikowi krzepnięcia IX PM Kd, nm przy 25 C Kd, nm przy 37 C Stosunek molowy wiązania FIX/PM BC ,4 SB ,9 SB ,7 SB ,5 SB ,8 Wszystkie PM, a mianowicie SB , SB , SB i SB wykazywały bardzo podobną stabilność termiczną w badaniu metodą kalorymetrii skaningowej różnicowej. Ich niefałdujące Tmmieściły się w zakresie od 70 do 75 C, co wskazuje na dużą stabilność wobec denaturacji powodowanej działaniem ciepła. Przykład 10 Mechanizm hamowania działania czynnika krzepnięcia IX, w którym pośredniczy przeciwciało. Skonstruowno bibliotekę chimerycznych konstrukcji złożonych z sekwencji czynnika krzepnięcia IX włączanych na drodze cięcia i składania do konstrukcji homologicznego białkowego czynnika VII. Biblioteki tej użyto do mapowania epitopu PM BC2 skierowanego przeciw czynnikowi krzepnięcia IX [patrz: Cheung i in., Thromb. Res., 80, (1995)]. Wiązanie mierzono z zastosowaniem urządzenia BioCore 2000 Surface Plasmon Resonance. Przeciwciało BC2 sprzężono bezpośrednio ze skrawkiem na drodze reakcji NHS/EDC. Wiązanie mierzono w ciągu 2 minut czasu kontaktowania przy 20 μl/min, z udziałem 200 μm każdej z podanych konstrukcji, w 25 mm MOPS, ph 7,4, 0,15 NaCl, 5 mm CaCl2. Przebieg dysocjacji śledzono i kontrolowano w ciągu 3 minut przy użyciu tego samego buforu z pominięciem białka. Nie wykryto żadnego wiązania się dla konstrukcji typu dzikiego w obecności 50 mm EDTA. Otrzymane wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 4.

34 Tabela 4 Podsumowanie danych dotyczących wiązania się konstrukcji czynnika krzepnięcia IX z przeciwciałem BC2 Konstrukcja IXa z osocza r-ix VII z osocza IX LC/VII HC IX-A/VII VII gla/ix VII-A/IX VII gla (IX 3-11)/IX VII gla (IX 3-6)/IX VII gla (IX 9-11 )/IX IX K5A Stopień związania się Wiąże się Wiąże się Brak wiązania Wiąże się Wiąże się Brak wiązania Brak wiązania Wiąże się Bardzo niski stopień wiązania się Bardzo niski stopień wiązania się Wiąże się Powyższe dane wykazują, że konstrukcje zawierające łańcuch lekki czynnika krzepnięcia IX i łańcuch ciężki czynnika krzepnięcia VII (IX LC/VII HC); domeny gla czynnika krzepnięcia IX i aromatyczne domeny pakietowe (IX-A/VIII); reszty 3-11 domeny gla czynnika VIII w obrębie domeny gla czynnika VII (VII gla (IX 3-11)/IX; oraz czynnik IX posiadający podstawienie lizyny do alaniny przy reszcie 5 (IX K5A), wykazują wiązanie się z BC2. Konstrukcja VE gla (IX 3-11 )/IX wykazywała wiązanie się z BC2 równoważne wiązaniu się czynnika krzepnięcia IX typu dzikiego (IXa z osocza i r-ix). Tak więc, przeciwciało wiąże się z epitopem zawartym w obrębie reszt 3-11 domeny gla czynnika krzepnięcia IX. Wynalazek niniejszy można zrealizować w innych konkretnych postaciach wykonania bez odejścia od istoty lub podstawowych cech znamiennych wynalazku i zgodnie z tym należy odnieść się nie tyle do powyższego opisu, ile raczej do załączonych zastrzeżeń, wskazujących zakres wynalazku.

35 Wykaz sekwencji (1) Informacja ogólna Zgłaszający: Blackburn, Michael Church, William Gross, Mitchell Feuerstein, Giora Nichols, Andrew Padlan, Eduardo Patel, Arunbhai Sylvester, Daniel Tytuł wynalazku: Środki przeciwkrzepliwe użyteczne w leczeniu zakrzepicy (iii) Liczba sekwencji: 111 Adres do korespondencji: (A) (B) (C) (D) (E) Adres: SmithKline Beecham Corporation Ulica : 709 Swedeland Road Miasto: King of Prussia Stan: PA Kraj: USA (F) Kod pocztowy (ZIP) : Postać czytelna dla komputera: (A) Typ nośnika: dyskietka (B) Komputer: zgodny z IBM (C) System operacyjny: DOS (D) Oprogramowanie: FastSEQ Version 1.5 Dane dotyczące niniejszego Zgłoszenia: (h) Numer Zgłoszenia: (B: Data złożenia: 16 stycznia 1997 (C) Klasyfikacja:

36 (vii) Dane dotyczące Zgłoszenia poprzedzającego: (A) Numer Zgłoszenia: 60/ (B) Data złożenia: 24 października 1996 (viii) Informacja o rzeczniku patentowym/pełnomocniku: (A) Nazwisko: Baumeister, Kirk (B) Numer rejestracyjny: (C) Numer sprawy/akt rzecznika patentowego: P50438 (ix) Informacja dotycząca telekomunikacji: (A) Telefon: (B) Telefax: (C) Telex: (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:1: (A) Długość: 20 par zasad (C) (D) Struktura niciowa: nić pojedyncza Topologia: liniowa (iii) Hipotetyczna: nie (ix) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO : 1 CATCCTAGAG TCACCGAGGA 20 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N O:2: (A) Długość: 21 par zasad

37 (iii) Hipotetyczna: Nie (xi) Antysensowna: Nie Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:2: AGCTGCCCAA AGTGCCCAAG C 21 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO :3: (A) Długość: 36 par zasad (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:3: CTAACACTCA TTCCTGTTGA AGCTCTTGAC AATGGG 36 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:4: (A) Długość: 21 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy

38 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:4: GATTTTCARG TGCAGATTTT C 21 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:5: (A) Długość: 363 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :5: CAGATCCAGT TGGTGCAGTC TGGACCTGAG CTGAAGAAGC CTGGAGAGAC AGTCAAGATC 60 TCCTGCAAGG CTTCTGGGTA CACCTTCACA AACTATGGAA TGAACTGGGT GAAGCAGGCT 120 CCAGGAAAGG GTTTAAAGTG GATGGGCTGG ATAAACACCA GAAATGGAAA GTCAACATAT 180 GTTGATGACT TCAAGGGACG GTTTGCCTTC TCTTTGGAAA GCTCTGCCAG CACTGCCAAT 240 TTGCAGATCG ACAACCTCAA AGATGAGGAC ACGGCTACAT ATTTCTGTAC AAGAGAAGGG 300 AATATGGATG GTTACTTCCC TTTTACTTAC TGGGGCCAAG GGACTCTGGT CACTGTCTCT 360 GCA 363 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:6: (A) Długość: 321 par zasad

39 : (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:6: CAAATTGTTC TCTCCCAGTC TCCAGCAATC CTGTCTGCAT CTCCAGGGGA GAAGGTCACA 60 ATGACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTAAAT TACATGCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGA 120 TCCTCCCCCA AACCCTGGAT TTATGCCACA TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGCTCGC 180 TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCAGCAGAGT GGAGGCTGAA 240 GATGCTGCCA CTTATTACTG CCAGCAGTGG AGTATTAACC CACGGACGTT CGGTGGAGGC 300 ACCAAGCTGG AAATCAAACG G 321 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:7: (A) Długość: 121 aminokwasów (B) Typ: aminokwasową Typ cząsteczki: peptyd wewnętrzny (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N O:7 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Pho

40 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn Leu Gln Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO :8: (A) Długość: 5 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa Typ cząsteczki: peptyd (xi) wewnętrzny Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:8: Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:9: (A) Długość: 17 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (Cy Struktura niciowa: nić pojedyncza CD) Topologia: liniowa Typ cząsteczki: peptyd wewnętrzny

41 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:9: Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:10: (A) długość: 12 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) Struktura niciowa: pojedyncza Typ cząsteczki: peptyd (xi) wewnętrzny Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:10: Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:11: (A) Długość: 107 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa Typ cząsteczki: peptyd wewnętrzny

42 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:11: Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Il e Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Il e Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Il e Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Il e Asn Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Il e Lys Arg (2) Iformacja dotycząca SEQ ID NO :12: charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 10 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa Typ cząsteczki: peptyd wewnętrzny (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:12: Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:13:

43 (A) Długość: 7 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C; Struktura niciowa: nić pojedyncza Typ cząsteczki: peptyd wewnętrzny (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :13: Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:14: (A) Długość: 9 aminokwasów (B ) Typ: aminokwasowa Typ cząsteczki: peptyd (xi) wewnętrzny Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:14: Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 1 5 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:15: (A) Długość: 104 par zasad

44 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:15: CAACTAGTGC AATCTGGGTC TGAGTTGAAG ABGCCTGGGG CCTCAGTGAA GGTTTCCTGC 60 AAGGCCTCTG GATACACCTT CACTAACTAT GGAATGAACT GGGT 104 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO :16: (A) Długość: 108 par zasad (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :16: TTGAAGTCAT CAACATATGT TGACTTTCCA TTTCTGGTGT TTATCCATCC CATCCACTCG 60 AGCCCTTGTC CAGGGGCCTG TCGCACCCAG TTCATTCCAT AGTTAGTG 108 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO :17: (A) Długość: 107 par zasad

45 (xi) : Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:17: GTCAACATAT GTTGATGACT TCAAGGGGCG GTTTGTCTTC CCTCTGTCAG CACGGCATAT 60 CTACAGATCA GCAGCCTAAA GGCTGACGAC ACTGCAGTGT ATTACTG 107 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:18: (A) Długość: 91 par zasad (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:18: GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGCACA 60 GTAATACACT GCAGTGTCGT CAGCCTTTAG G 91 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:19: (A) Długość: 337 par zasad

46 (ix) Cecha znamienna: (A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: (C) Inna informacja: (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:19: A CTA GTG CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC TCA GTG AAG 49 Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys GTT TCC TGC AAG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT GGA ATG AAC 97 Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC GAG TGG ATG GGA TGG ATA 45 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC AAG GGG CGG 193 Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg TTT GTC TTC TCC TTG GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTA CAG ATC 241 Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile AGC AGC CTA AAG GCT GAC GAC ACT GCA GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAA 289 Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC CAG GGT ACC 337 Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:20:

47 (A) Długość: 112 aminokwasów (B) Typ: aminokwasową Typ cząsteczki: białko wewnętrzny (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:20: Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:21: (A) Długość: 33 par zasad

48 (ivl (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :21: GCTACTAGTG CAATCTGGGT CTGAGTTGAA GCC 33 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:22: (A) Długość: 30 par zasad (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :22: TGGGTACCCT GGCCCCAGTA AGTAAAAGGG 30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:23: (A) Długość: 97 par zasad Tyo cząsteczki: cdna (ix) Źródło pierowtne: Cecha znamienna:

49 (A5) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: (D) Inna informacja: (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :23: GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe 1 5 TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG GTC CAA CTA GT 97 Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Val Gln Leu (2) Informacja dotycząca SEQ ID NQ:24: (A) Długość: 23 aminokwasów (B) Typ: aminokwas Typ cząsteczki: białko wewnętrzny (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :24: Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Val Gln Leu 20 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:25: (A) Długość: 110 par zasad

50 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :25: GGAGACGCCA TCGAATTCTG AGCACACAGG ACCTCACCAT GGGATGGAGC TGTATCATCC 60 TCTTCTTGGT AGCAACAGCT ACAGGTGTCC ACTCCCAGGT CCAACTGCAG 110 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO :26: (A) Długość: 21 par zasad (C) Struktura niciowa (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :26: GGAGACGCCA TCGAATTCTG A 21 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:27: (A) Długość: 30 par zasad

51 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :27: GATTGCACTA GTTGGACCTG CGAGTGGACA 30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N O :28: (A) Długość: 77 par zasad (xi) Źródło pierowtne: Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:28: CTAGAGTGGG TCGCAGAGAT CTCTGATGGT GGTAGTTACA CCTACTATCC AGACACTGTG 60 ACGGGCCGGT TCACGAT 77 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO :29: (A) Długość: 73 pary zasad tb) Typ: kwas nukleinowy

52 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:29: ATCGTGAACC GGCCCGTCAC AGTGTCTGGA TAGTAGGTGT AACTACCACC ATCAGAGATC 60 TCTGCGACCC ACT 73 (2) Informaja dotycząca SEQ ID N0:30: (A) Długość: 363 par zasad (ix) Cecha znamienna: (A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: (D) Inna informacja: F9HZHC 1-0 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:30: CAG GTG CAA CTA GTG CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC 4 8 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr GGA ATG AAC TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC GAG TGG ATG 14 4 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met GGA TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAr GTT GAT GAC TTC 192 Gly Tro Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe

53 AAG GGA CGG-TTT GTC TTC TCC TTG GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT 24 0 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr CTA CAG ATC AGC AGC CTA AAG GCT GAC GAC ACT GCA GTG TAT TAC TGT 288 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys GCG AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC 336 Ala Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly CAG GGT ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 363 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:31: (A) Długość: 121 aminokwasów (B ) Typ: aminokwasową Typ cząsteczki: białko (xi) wewnętrzny Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:31: Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe

54 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Tle Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser (2) Informacjas dotycząca SEQ ID NO:32: (A) Długość: 165 par zasad ID) Topologia: liniowa (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :32: AGTACTGACA CAGTCTCCAG CCACCCTGTC TTTGTCTCCA GGGGAAAGAG CCACCCTCTC 60 CTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT GCACTGGTAC CAACAGAGAC CTGGCCAGGC 120 TCCCAGGCTC CTCATCTATG CCACTAGTAA CCTGGCTTCT GGCAT 165 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:33: (A) Długość: 146 par zasad

55 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :33: CCGCGGGTTR ATACTCCCACT GCTGACAGTA ATAAACCGCA AAATCTTCAG GCTCTAGACT 60 GCTGATGGTG AGAGTGAAAT CTGTCCCAGA CCCGGATCCA CTGAACCTGG CTGGGATGCC 120 AGAAGCCAGG TTACTAGTGG CATAGA 14 6 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:34: (A) Długość: 280 par zasad (ix) Cecha znamienna (A) Nazwa/klucz: Sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: (D) Inna informacja: (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :34: A GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA 49 Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG 97 Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp

56 TAC CAA CAG AGA CCT GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT GCC ACT 14 5 Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu lie Tyr Ala Thr AGT AAC CTG GCT TCT GGC ATC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC GGG TCT 193 Ser Asn Leu Ala Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTA GAG CCT GAA GAT TTT 241 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe GCG GTT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG 280 Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser lie Asn Pro Arg (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:35: (A) Długość: 93 aminokwasów (B) Typ: aminokwasową Typ cząsteczki: białko (xi) wewnętrzny Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:35: Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

57 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO :36: (A) Długość: 27 par zasad (xi) Iznaczenie sekwencji: SEQ ID N O :36: TCGAGTACTG ACACAGTCTC CAGCCAC 27 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N O:37: (A) Długość: 27 par zasad (B) Typ: Kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa; nić pojedyncza (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 37: GACCGCGGGT TAATACTCCA CTGCTGA 27

58 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:38: (A) Długość: 94 par zasad (iii) (ix) Hipotetyczna: nie Cecha znamienna: (A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: (D) Inna informacja: (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:38: GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe 1 5 TTG GTA, GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC GAG ATA GTA CT 94 Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Glu Ile Val (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:39: (A) Długość: 22 aminokwasów (B) Typ: aminokwas Typ cząsteczki: białko (i v ) wewnętrzny

59 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :39: Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Glu Ile Val 20 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:4Q: (A) Długość: 30 par zasad (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:40: GACTGTGTCA GTACTATCTC GGAGTGGACA 30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:41: (A) Długość: 55 par zasad źródło pierwotne:

60 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :41: GGGCAGCCTC CTAAGTTGCT CATTTACTGG GCGTCGACTA GGGAATCTGG GGTAC 55 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:42: (A) Długość: 51 par zasad td) Topologia: liniowa (xi ) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:42: CCCAGATTCC CTAGTCGACG CCCAGTAAAT GAGCAACTTA GGAGGCTGCC C 51 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:43: (A) Długość: 321 par zasad (iii) Hipotetyczna: nia (ix) Cecha znamienna: (A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: (D) Inna informacja: F9HZLC1-0

61 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :43: GAA ATA GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG 48 Glu Il e Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met CAC TGG TAC CAA CAG AGA CCT GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT 144 His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Il e Tyr GCC ACT AGT AAC CTG GCT TCT GGC ATC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC 192 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Il e Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser GGG TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTA GAG CCT GAA 240 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Il e Ser Ser Leu Glu Pro Glu GAT TTT GCG GTT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG 288 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Il e Asn Pro Arg Thr TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGA Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Il e Lys Arg (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO :44: (A) Długość: 107 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C) Struktura niciowa: Typ cząsteczki: białko wewnetrzny

62 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:44: Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly TcJ Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:45: (A) Długość: 134 par zasad (J) Topologia: liniowa (xi) Tyy fragmentu: Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:45: CCTGGACAAG GGCTCAAGTG GATGGGATGG ATAAACACCA GAAATGGAAA GTCAACATAT 60 GTTGATGACT TCAAGGGACG GTTTGTCTTC TCTCTAGACT CCTCTGTCAG CACGGCATA7 120 CTACAGATCA GCAG 134

63 (2) Informacja dotycząca ID NO :46: (A) Długość: 134 par zasad (3) Typ: kwas nukleinowy (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :46: GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGTACA 60 GTAATACACT GCAGTGTCGT CAGCCTTTAG GCTGCTGATC TGTAGATATG CCGTGCTGAC 120 AGAGGAGTCT AGAG 134 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:47: (A) Długość: 225 par zasad (C) Struktura niciowa: pojedyncza (ix) Cecha znamienna: (A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: (D) Inna informacja: (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 47:

64 CCT GGA CAA GGG CTC AAG TGG ATG GGA TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA 48 Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GTC TTC TCT CTA 96 Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu GAC TCC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTA CAG ATC AGC AGC CTA AAG GCT 144 Asp Ser Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala GAC GAC ACT GCA GTG TAT TAC TGT ACG AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT 192 Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC CAG GGT ACC Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:48: ta) Długość: 75 aminokwasów (B) Typ: aminokwas Typ cząsteczki: białko wewnętrzny (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :48: Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile As,n Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu

65 Asp Ser Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln lie Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:49: (A) Długość: 27 par zasad (g) Typ: kwas nukleinowy (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:49: TTTCCTGGAC AAGGGCTCAA GTGGATG 2 7 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:50: (A) Długość: 24 par zasad (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:50

66 TTTGGTACCC TGGCCCCAGT AAGT 24 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:51: (A) Długość : 363 par zasad (D) Topologia : liniowa (ix) Cecha znamienna: (A) Nazwa/klucz: Sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: (D) Inna informacja: F9HZHC 1-1 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:51: CAG GTG CAA CTA GTG CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC 4 8 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr GGA ATG AAC TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC AAG TGG ATG 14 4 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met GGA TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC 192 Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe AAG GGA CGG TTT GTC TTC TCT CTA GAC TCC TCT GTC AGC ACG GCA TAT 24 0 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Ser Ser Val Ser Thr- Ala Tyr

67 CTA CAG ATC AGC AGC CTA AAG GCT GAC GAC ACT GCA GTG TAT TAC TGT 288 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys ACG AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC 336 Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly CAG GGT ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 363 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:52: (A) Długość: 121 aminokwasów (B) Typ: aminokwasową (C) Struktura niciowa: pojedyncza Typ cząsteczki: białko (xi) wewnętrzny Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:52: Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Ser Ser Val Ser Thr Ala Tyr

68 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 53: Charakterystyka sekwencji : (A) Długość: 82 par zasad (ii} (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :53: CAACAGAGAC CTGGCCAGGC TCCCAAGCCC TGGATCTATG CCACGAGTAA CCTGGCTAGC 60 GGCGTCCCAG CCAGGTTCAG TG 82 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:54: (A) Długość: 90 par zasad

69 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:54: GATCCACTGA ACCTGGCTGG GACGCCGCTA GCCAGGTTAC TCGTGGCATA GATCCAGGGC 60 TTGGGAGCCT GGCCAGGTCT CTGTTGGTAC 90 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO :55: (A) Długość: 27 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa Typ cząsteczki: peptyd (xi) wewnętrzny Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:55: Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser (2} Informacja dotycząca SEQ ID N O:56: (A) Długość: 321 par zasad

70 (ix) Cecha znamienna: (A} Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: (D) Inna informacja: F9HZLC 1-1 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:56: GAA ATA GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met CAC TGG TAC CAG CAG AGA CCT GGC CAG GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT 14 4 His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr GCC ACG AGT AAC CTG-GCT AGC GGC GTC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC 192 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser GGG TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTA GAG CCT GAA 24 0 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu GAT TTT GCG GTT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG 288 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGA 321 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:57: (A) Długość: 107 aminokwasów (B) Typ: aminokwasową (C) Struktura liniowa: nić pojedyncza

71 Typ cząsteczki: białko (xi) wewnętrzny Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:57: Glu Ile Val Leu Thr Gln 5er Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly IS His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glv Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:58: (A) Długość: 41 par zasad (C) Struktura niciowa: nić pjedyncza (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :58: GATCCGGGTC TGGGACAGAT TACACTCTCA CGATATCCAG T 4 1

72 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:59: (A) Długość: 41 par zasad (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:59: CTAGACTGGA TATCGTGAGA GTGTAATCTG TCCCAGACCC G 41 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:60: (A) Długość: 13 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa Typ cząsteczki: peptyd (xi) wewnętrzny Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:60: Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser (2) Indormacja dotycząca SEQ ID NO:61:

73 (A) Długość: 321 par zasad (ix) Cecha znamienna: (A) Nazwa/klucz: Sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: (D) Inna informacja: F9HZLC 1-2 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:61: GAA ATA GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG 4 8 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met CAC TGG TAC CAA CAG AGA CCT GGC CAG GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT 144 His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr GCC ACG AGT AAC CTG GCT AGC GGC GTC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC 192 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser GGG TCT GGG ACA GAT TAC ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA GAG CCT GAA 240 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu GAT TTT GCG GTT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG 288 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr

74 TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC A A A CGA 321 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:62: (A) Długość: 107 aminokwasów (BI Typ: aminokwasowa Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczna: nie wewnętrzny (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 62: Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO :63: (A) Długość: 165 par zasad

75 (B) Typ: kwas nukleinowy (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:63: AGTACTCACC CAGAGCCCAA GCAGCCTGAG CGCCAGCGTG GGTGACAGAG TGACCATCAC 60 CTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT GCACTGGTAC CAGCAGAAGC CAGGTAAGGC 120 TCCAAAGCCT TGGATCTACG CCACTAGTAA CCTGGCTTCT GGTGT 165 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:64: (A) Długość: 161 par zasad (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:64: CCGCGGGTTA ATACTCCACT GCTGGCAGTA GTAGGTGGCG ATATCCTCTG GCTGGAGGCT 60 GCTGATGGTG AAGGTGTAGT CTGTACCGCT ACCGGATCCG CTGAATCTGC TTGGCACACC 120 AGAAGCCAGG TTACTAGTGG CGTAGATCCA AGGCTTTGGA G 161 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO :65: (A) Długość: 280 par zasad

76 (ni) (ix) Hipotetyczna: nie Cecha znamienna: (A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: (D) Inna informacja: (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:65: A GTA CTC ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA 49 Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg GTG ACC ATC ACC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG 97 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp TAC CAG CAG AAG CCA GGT AAG GCT CCA AAG CCT TGG ATC TAC GCC ACT 14 5 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr AGT AAC CTG GCT TCT GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGA TCC GGT AGC 193 Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GGT ACA GAC TAC ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAT ATC 241 Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile GCC ACC TAC TAC TGC CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG 280 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg (2} Informacja dotycząca SEQ ID NO:66:

77 (A) Długość: 93 aminokwasów (B) Typ: aminokwasową typ cząsteczki: białko Antysensowan: nie (v ) wewnętrzny (vl) (xi) Źródło pierwotne Opis sekwencji: SEQ ID N0:66: Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:67: (A) Długość: 27 par zasad (ni) Hipotetyczna: nie

78 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N O :67: TTTAGTACTC ACCCAGAGCC CAAGCAG 27 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:68: (A) Długość: 27 par zasad (i:) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :68: TTCCGCGGGT TAATACTCCA CTGCTGG 27 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO :69: (A) Długość: 33 par zasad (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:69: CTCGAGCAGT ACTATCTGGG AGTGGACACC TGT 33

79 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:70: (A) Długość: 17 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa Typ cząsteczki: peptyd N-końcowy (xi} Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :70: Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala (2} Informacja dotycząca SEQ ID NO:71: (i} (A) Długość: 48 par zasad (iv} (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :71: GGACGTTCGG CCAAGOGACC AAGGTGGAAA TCAAACGGAC TGTGGCGG 4 8 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:72:

80 (A) Długość: 52 par zasad (ii} (xi) Typ fagmentu: Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:72: CGCCGGCACR GTCCGTTTGA TTTCCACCTT GGTCCCTTGG CCGAACGTCC GC 52 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:73: (A) Długość: 321 par zasad (ix) Cecha znamienna: (A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) LOCATTON: (D) Inna informacja: F9HZLC 2-0 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :73: CAG ATA GTA CTC ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC AGC GTG GGT 43 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

81 GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met CAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGT AAG GCT CCA AAG CCT TGG ATC TAC 144 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr GCC ACT AGT AAC CTG GCT TCT GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGA TCC 192 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser GGT AGC GGT ACA GAC TAC ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG 240 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 7C GAT ATC GCC ACC TAG TAC TGC CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG 288 Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG 321 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO :74: (A) Długość: 107 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C) Struktura sieciowa: nić pojedyncza (xi) Typ cząsteczki: białko Hipotetyczna: nie wewnętrzny Źródło wewnętrzne: Oznakowaniwe sekwencji: SEQ ID NO:74: Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser val Gly

82 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:75: (A) Długość: 94 par zasad (vi: (ix) Cecha znamienna: (A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: (D) Inna informacja: (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:75: GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe 1 5

83 TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG ATA GTA CT 94 Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Ile Val Leu (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:76: (A) Długość: 23 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C} Struktura niciowa: nić pojedyncza Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczna: nie (xi) wewnętrzny Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:76: Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Ile Val Leu 20 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO :77 (A) Długość: 401 par zasad (ix) Cecha znamienna: (A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca

84 (B) Lokalizacja: (C) Inna informacja: F9HZLC 1-3 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:77: GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe 1 5 TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG ATA GTA CTG ACA CAG 101 Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA GCC ACC CTC TCC 14 9 Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG TAC CAA CAG AGA 197 Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Arg CCT GGC CAG GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT GCC ACG AGT AAC CTG GCT 24 5 Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala AGC GGC GTC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC GGG TCT GGG ACA GAT TAC 293 Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA GAG CCT GAA GAT TTT GCG GTT TAT TAC 341 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG TTC GGC GGA GGG ACC AAG 38 9 Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys GTG GAG ATC AAA Val Glu Ile Lys 125 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:78:

85 (A) Długość: 125 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczna : nie internal (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :78: Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO :79: (A) Długość: 81 par zasad (B} Typ: kwas nukleinowy

86 (iv} (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :79: AGGCCTCTGG ATACACCTTC ACTAACTATG GAATGAACTG GGTGCGACAG GCCCCTGGAC 60 AAGGGCTCGA GTGGATGGGA T 81 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:80: (A) Długość: 99 par zasad (BI Typ: kwas nukleinowy (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:80: TGTCTAGAGA GAAGACAAAC CGTCCCTTGA AGTCATCAAC ATATGTTGAC TTTCCATTTC 60 TGGTGTTTAT CCATCCCATC CACTCGAGCC CTTGTCCAG 99 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NQ:81: (A) Długość: 87 par zasad (C } Struktura niciowa: nić pojedyncza

87 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :81: GGTTTGTCTT CTCTCTAGAC ACCTCTGTCA GCACGGCATA TCTACAGATC AGCAGCCTAA 60 AGGCTGAGGA CACTGCAGTG TATTTCT 87 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NQ:82: SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) Długość: 86 par zasad td) Topologia: liniowa (xi) Antysensowna: Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:82: GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGTACA 60 GAAATACACT GCAGTGTCCT CAGCCT (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO :83: (A) Długość: 278 par zasad

88 (ix) Cecha znamienna: (A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: (D) Inne informacje: (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :83: AG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT GGA ATG AAC TGG GTG CGA 47 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC GAG TGG ATG GGA TGG ATA AAC ACC AGA 95 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GTC TTC 143 Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe TCT CTA GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTA CAG ATC AGC AGC CTA 191 Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu AAG GCT GAG GAC ACT GCA GTG TAT TTC TGT ACG AGA GAA GGG AAT ATG 239 Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC CAG GGT ACC 278 Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO :84: (A) Długość: 92 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (ii} Typ cząsteczki: białko

89 (v} (xi) Anysensowna: nie wewnętrzny Źródło pierotne: Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:84: Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tvr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr (2) Informacja dotycząca SEQ ID N O :85: (A) Długość: 30 par zasad (iii) Hipoteczna: nie (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:85: AGGCCTCTGG ATACACCTTC ACTAACTATG 30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:86:

90 (A) Długość: 26 par zasad (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:86: GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAG 2 6 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:87: (A) Długość: 37 par zasad (iii} Hipotetyczna: nie (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N O :87: CCAGACTCGA CTAGTTGGAT CTGGGAGTGG ACACCTG 37 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N O:88: (A) Długość: 446 par zasad

91 (ix) Cecha znamienna: (A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: (D) inna informacja: F9HZHC 3-0 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :88: GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe 1 5 TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG ATC CAA CTA GTG CAA 101 Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC 149 Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys AAG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT GGA ATG AAC TGG GTG CGA 197 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC GAG TGG ATG GGA TGG ATA AAC ACC AGA 245 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GTC TTC 293 Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe TCT CTA GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTA CAG ATC AGC AGC CTA 341 Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu

92 AAG GCT GAG GAC ACT GCA GTG TAT TTC TGT ACG AGA GAA GGG AAT ATG 389 Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC CAG GGT ACC CTG GTC ACC 437 Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr GTC TCC TCT 446 Val Ser Ser 140 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO :89: (A) Długość: 140 aminokwasów (B) Typ: aminokwas Typ cząsteczki: białko (xi) wewnętrzny Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:89: Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser

93 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:90: (A) Długość: 90 par zasad (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO: 90: AGTACTGACA CAGTCTCCAT CCTCCCTGTC TGCATCTGTT GGGGACAGAG TCACCATCAC 60 TTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT 90 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:91: Charakterysyka sekwencji: (A) Długość: 108 par zasad (v )

94 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:91: CTTGATGGGA CGCCGCTAGC CAGGTTACTC GTGGCATAGA TCCAGGGCTT GGGAGCTTTG 60 CCAGGTTTCT GTTGGTACCA GTGCATGTAA TTTACACTTG AGCTGGCC 108 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:92: (A) Długość: 108 par zasad (Bj Typ: kwas nukleinowy (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N O :92: TAACCTGGCT AGCGGCGTCC CATCAAGGTT CAGTGGATCC GGGTCTGGGA CAGATTACAC 60 TCTCACGATA TCCAGTCTAC AACCTGAAGA TTTTGCGACT TATTACTG 108 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:93: (A) Długość: 102 par zasad (ivy (v ) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:93:

95 GGCGCCGCCA CAGTTCGTTT GATCTCCAGC TTGGTCCCTC CGCCGAACGT CCGCGGGTTA 60 ATACTCCACT GCTGACAGTA ATAAGTCGCA AAATCTTCAG GT 102 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:94: (A) Długość: 330 par zasad. (ix) Cecha znamienna: (A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: (D) Inna informacja: (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:94: A GTA CTG ACA CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTT GGG GAC AGA 49 Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg GTC ACC ATC ACT TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG 97 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn -Tyr Met His Trp TAC CAA CAG AAA CCT GGC AAA GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT GCC ACG 14 5 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr AGT AAC CTG GCT AGC GGC GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGA TCC GGG TCT 193 Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GGG ACA GAT TAC ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA CAA CCT GAA GAT TTT 241 Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe

96 GCG ACT TAT TAC TGT CAG CAG -TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG TTC GGC 28 9 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly GGA GGG ACC AAG CTG GAG ATC AAA CGA ACT GTG GCG GCG CC 330 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:95: (A) Długość: 109 aminokwasów (B) Typ: aminokwasową (C) Struktura niciowa: pojedyncza Typ cząsteczki: białko (xi) wewnętrzny Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:95: Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp Tyr Gla Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Thr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

97 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:96: (A) Długość: 26 par zasad (iii) Hiptetyczna: nie (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID Np:96: CAAGTACTGA CACAGTCTCC ATCCTC 26 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:97: (A) Długość: 26 par zasad (ii} Typ fagmentu: (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO :97: AGGGCGCCGC CACAGTTCGT TTGATC 2 6 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:98:

98 (A) Długość: 412 par zasad (ix) Cecha znamienna: (A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: (D) Inna informacja: F9HZLC 3-0 (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:98: GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe 1 5 TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG ATA GTA CTG ACA CAG 101 Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTT GGG GAC AGA GTC ACC ATC ACT 149 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG TAC CAA CAG AAA 197 Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys CCT GGC AAA GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT GCC ACG AGT AAC CTG GCT 245 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala AGC GGC GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGA TCC GGG TCT GGG ACA GAT TAC 293 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr

99 ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA CAA CCT GAA GAT TTT GCG ACT TAT TAC 341 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG TTC GGC GGA GGG ACC AAG 38 9 Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys CTG GAG ATC AAA CGA ACT GTG GC 412 Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Val 125 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:99: (A) Długość: 129 aminokwasów (B) Typ: aminokwsowa Typ cząsteczki: białko (xi) wewnętrzny Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:99: Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

100 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Val (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:100: (A) Długość: 26 par zasad (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:100: CAAATAGTAC TCTCCCAGTC TCCAGC 26 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:101: (A) Długość: 41 par zasad (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:101:

101 GGATAAGCTT GGCGCCGCAA CAGTCGGTTT GATTTCCAGC T 41 (2) Iformacja dotycząca SEQ ID NO:102: (A) Długość: 335 par zasad Hipotetyczna: nie (ix) Cecha znamienna: (A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: (D) Inna informacja: (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:102: CAG ATA GTA CTC TCC CAG TCT CCA GCA ATC CTG TCT GCA TCT CCA GGG 43 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly GAG AAG GTC ACA ATG ACT TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met CAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AAA CCC TGG ATT TAT 14 4 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp lie Tyr GCC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GCT CGC TTC AGT GGC AGT 152 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAA Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Arg Val Glu Ala Glu

102 GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCA CGG ACG 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG ACT GTT GCG GCG CC 335 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:103: (A) Długość: 112 aminokwasów (B) Typ: aminokwasową Typ cząsteczki: białko (xi) Typ fragmenty: wewnętrzny Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:103: Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser lie Asn Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

103 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:104: (A) Długość: 318 par zasad (ix) Cecha znamienna: (A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: (D) Inna informacja: (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:104: CAG ATA GTA CTC TCC CAG TCT CCA GCA ATC CTG TCT GCA TCT CCA GGG 48 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly GAG AAG GTC ACA ATG ACT TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met CAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AAA CCC TGG ATT TAT 14 4 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp lie Tyr GCC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GCT CGC TTC AGT GGC AGT 192 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAA 24 0 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Arg Val Glu Ala Glu

104 GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCA CGG ACG 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:105: (A) Długość: 106 aminokwasów (B) Typ: aminokwasową Typ cząsteczki: białko (xi) wewnętrzny Oznaczenie sekwencji: SEQ ID NO:105: Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser lie Asn Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys

105 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:106: (A) Długość: 30 par zasad (lv) (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:106: CAGATCCAAC TAGTGCAGTC TGGACCTGAG 30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:107: Charakterystyka sekwencji (A) Długość: 32 par zasad (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:107: TTAAGCTTGC TAGCTGCAGA GACAGTGACC AG 32 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:108: (i} (A) Długość: 369 par zasad lb) Typ: kwas nukleinowy

106 (ix) Cecha znamienna: (A) Nazwa/klucz: sekwencja genetyczna (B) Lokalizacja: (B) Inna informacja: (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:108: CAG ATC CAA CTA GTG CAG TCT GGA CCT GAG CTG AAG AAG CCT GGA GAG 48 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu ACA GTC AAG ATC TCC TGC AAG GCT TCT GGG TAC ACC TTC ACA AAC TAT 96 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr GGA ATG AAC TGG GTG AAG CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTA AAG TGG ATG 144 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met GGC TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC 192 Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAA AGC TCT GCC AGC ACT GCC AAT 240 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn TTG CAG ATC GAC AAC CTC AAA GAT GAG GAC ACG GCT ACA TAT TTC TGT 288 Leu Gln Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys ACA AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC 336 Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly

107 CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA GCT AGC 369 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:109: (A) LENGTH: 123 aminokwasów (B) Typ: aminokwas Typ cząsteczki: białko wewnętrzny (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N O :109: Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met y Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn Leu Gln Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys rhr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly jln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser

108 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:110: (A) Długość: 363 par zasad (ix') Cecha znamienna : (A) Nazwa/klucz: sekwencja kodująca (B) Lokalizacja: (D) Inna informacja: (xi) Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:110: CAG ATC CAA CTA GTG CAG TCT GGA CCT GAG CTG AAG AAG CCT GGA GAG 4 8 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu ACA GTC AAG ATC TCC TGC AAG GCT TCT GGG TAC ACC TTC ACA AAC TAT 96 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr GGA ATG AAC TGG GTG AAG CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTA AAG TGG ATG 14 4 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met GGC TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC 192 Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAA AGC TCT GCC AGC ACT GCC AAT 24 0 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn TTG CAG ATC GAC AAC CTC AAA GAT GAG GAC ACG GCT ACA TAT TTC TGT 288 Leu Gln Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

109 ACA AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC 336 Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 363 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:111: (1) (A) Długość: 121 aminokwasów (B) Typ: aminokwasową Typ cząsteczki: białko (xi) wewnętrzny Oznaczenie sekwencji: SEQ ID N0:111: Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn Leu Gln Ile Asp Asn Leu.Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

110 Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

111