Analizy wielkoskalowe w badaniach chromatyny

Transkrypt

1 Analizy wielkoskalowe w badaniach chromatyny

2 Analizy wielkoskalowe wykorzystujące mikromacierze

3 DNA Genotypowanie: zróżnicowane wewnątrz genów RNA Komórka eukariotyczna Ekspresja genów: Które geny? Poziom ekpresji? Pracownia Analiz Mikromacierzy 3

4 DNA Mikromacierze umożliwiają kompleksowe badanie genomów Zróżnicowanie na obszarze całego genomu (SNP, CNV) RNA Analiza zmian poziomów ekspresji Analiza wariantów alternatywnego składania genów (ang. splicing) Zmiany wzoru metylacji i analiza regulacji genów (zmiany epigenetyczne) Zmiany poziomu mirna Pracownia Analiz Mikromacierzy

5 Co to jest mikromacierz? Mikromacierz zawiera zestaw tysięcy różnych fragmentów DNA, o znanej sekwencji które umieszczone są w uporządkowany sposób na stałym podłożu najczęściej szklanym lub plastikowym Umożliwia jednoczesną ocenę poziomu tysięcy cząsteczek DNA lub RNA w badanej próbie (nie daje możliwości dokładnego pomiaru bezwzględnego poziomu zawartości poszczególnych cząsteczek w próbce) Zasada działania mikromacierzy opiera się na hybrydyzacji komplementarnych do siebie cząsteczek kwasów nukleinowych Pracownia Analiz Mikromacierzy

6 Typy Mikromacierzy podział ze względu na budowę sond Mikromacierze cdna Mikromacierze oligonukleotydowe 25 nukleotydowe sekwencje - Affymetrix 60 nukleotydowe sekwencje - Agilent Pracownia Analiz Mikromacierzy

7 Mikromacierze - dwukolorowe i jednokolorowe Pracownia Analiz Mikromacierzy

8 Affymetrix, NimbleGen Agilent Illumina Pracownia Analiz Mikromacierzy

9 GeneChip System, the Affymetrix GeneChip Scanner 3000 Targeted Genotyping (TG) Dwie stacje płuczące Skaner z automatycznym odczytem 48 płytek Rozbudowa Laboratorium Projektowania Molekularnego oraz Zastosowań Genomiki i Proteomiki w Centrum Doskonałości BioExploratorium. Projekt współfinansowany przez Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego. Programy do analizy danych Partek Genomics Suite Ingenuity ChAS Pracownia Analiz Mikromacierzy

10 Synteza oligonukleotydów sterowana światłem - Fotolitografia Feature Lamp Mask Chip Pracownia Analiz Mikromacierzy 10

11 Pracownia Analiz Mikromacierzy

12 Pracownia Analiz Mikromacierzy

13 Pracownia Analiz Mikromacierzy

14 Pracownia Analiz Mikromacierzy

15 Mikromacierz typu GeneChip Obszar, do którego hybrydyzują cząsteczki o komplementarnej sekwencji * * * * * 5 µm 1.28cm Miliony kopii oligonukleotydu o określonej sekwencji >6.500,000 różnych komplementarnych sond 1.28cm Pracownia Analiz Mikromacierzy

16 Pracownia Analiz Mikromacierzy

17 Mikromacierze tilingowe Genome Exon A Exon B 35 bp spacing 35 bp 10 bp gap

18 Sekwencjonowanie Nowej Generacji NGS Next Generation Sequencing

19

20 Wspólne elementy dla wszystkich typów sekwenatorów 1. Losowa fragmentacja nici DNA, dołączanie odpowiednich dla platformy linkerów (konstrukcja biblioteki) 2. Amplifikacja biblioteki (na podłożu szklanym lub plastikowym) 3. Setki tysięcy reakcji sekwencjonowania przeprowadzone równocześnie odczytywane przez instrument ( massively parallel sequencing ) 4. Odczyty pozwalają na porównania ilościowe 5. Metody pozwlające na odczytywanie sekwencji z dwóch stron cząsteczki

21 Roche 454 Konstrukcja biblioteki i emulsyjny PCR Losowa fragmentacja Doligowanie adaptorów Biblioteka jednoniciowych fragmentów DNA z dołaczonymi adaptorami Emulsyjny PCR Amplifikacja DNA na kulkach

22 Roche pyrosekwencjonowanie Nałożenie kulek na płytkę Dodanie złoża zawierającego odpowiednie enzymy Kulki zawierające miliony kopii pojedynczego klonalnego fragmentu DNA

23 Illumina Fragmenty DNA

24 Illumina

25 Fosforylacja (seryna, treonina) Acetylacja (lizyna) Metylacja (lizyna, arginina) ADP-rybozylacja Modyfikacje histonów rdzeniowych Ubikwitynylacja (lizyna) Sumoilacja (lizyna) monometylacja dimetylacja trimetylacja symetryczna dimetylacja asymetryczna dimetylacja monometylacja Current Opinion in Cell Biology 2003, 15: B.Turner, Cell 2002

26 Zmiana struktury chromatyny Hamowanie oddziaływania czynników białkowych Nowe miejsca wiązania dla czynników białkowych

27 Uzyskanie przeciwciał specyficznych w stosunku do, poznanych potranslacyjnych modyfikacji histonów rdzeniowych zrewolucjonizowało naszą wiedzę o chromatynie Podstawowe narzędzie badawcze

28 Immunoprecypitacja chromatyny - CHIP

29 ChIP chip ChIP Seq Immunoprecypitacja Immunoprecypitacja Oczyszczanie DNA Oczyszczanie DNA Amplifikacja Dołączenie sekwencji adaptorowych Hybrydyzacja do mikromacierzy Tworzenie zbiorów Sekwencjonowanie Mapowanie rejonów w genomie Mapowanie rejonów w genomie nature reviews genetics volume 9 march 2008 ChIP chromatin immunoprecipitation

30 Metody wielkoskalowe pozwoliły na lepsze zrozumienie roli metylacji DNA, znaczenia lokalizacji nukleosomów i funkcji potranslacyjnych modyfikacji histonów dla regulacji transkrypcji genów

31 Przeciwciała specyficzne w stosunku do potranslacyjnych modyfikacji histonów rdzeniowych Podstawowe narzędzie badawcze

32 Rola modyfikacji potranslacyjnych histonów w regulacji procesu transkrypcji Bing Li i wsp., Cell 128 (2007)

33 Badanie kombinatoryczności wzoru 39 modyfikacji histonowych w limfocytach T CD4+ za pomocą metody ChIP-seq Histon H3 H3K4me3 H3K4me2 H3K4me1 H3K4ac H3K27me3 H3K27me2 H3K27me1 H3K27ac H3K9me3 H3K9me2 H3K9me1 H3K9ac H3K79me3 H3K79me2 H3K79me1 H3R2me2 H3R2me1 H3K36me3 H3K36me1 H3K36ac H3K14ac H3K18ac H3K23ac Histon H4 H4K20me3 H4K20me1 H2BK5me1 H4K5ac H4K8ac H4K12ac H4K16ac H4K91ac Histon H2B H2BK12ac H2BK20ac H2BK120ac H2BK5ac H2BK5ac Histon H2A H2AK5ac H2AK9ac H2A.Z NATURE GENETICS VOLUME 40 [ NUMBER 7 [ JULY 2008

34 Wzór modyfikacji histonowych w chromatynie genu ZMND8 NATURE GENETICS VOLUME 40 [ NUMBER 7 [ JULY 2008

35 17 modyfikacji histonowych zwykle obecnych w obszarach promotorów genów aktywnych transkrypcyjnie NATURE GENETICS VOLUME 40 [ NUMBER 7 [ JULY 2008