(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. A61K 39/00 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 16/18 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-21 () Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr /33 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 16/12 (73) Uprawniony z patentu: ZymoGenetics, Inc., Seattle, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 STEPHEN R. JASPERS, Edmonds, US MARK W. RIXON, Issaquah, US STACEY R. DILLON, Seattle, US FREDERICK J. RAMSDELL, Bainbridge Island, US CECILE M. KREJSA, Seattle, US EUGENE C. YI, Mill Creek, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Agnieszka Żebrowska-Kucharzyk PATPOL KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 1 2 3 Opis [0001] Układ odpornościowy stanowi pierwszą linię obrony organizmu przed chorobami wywoływanymi przez patogeny, takie jak bakterie, wirusy, grzyby itd., jak również przed chorobami spowodowanymi przez nieprawidłowy wzrost własnych komórek i tkanek organizmu (tj. guzy nowotworowe). Normalnie, układ odpornościowy jest w stanie rozróżniać prawidłowe komórki organizmu lub własne od obcych komórek patogenów lub komórek nieprawidłowych lub niebędących własnymi. Procesy, dzięki którym układ odpornościowy powstrzymuje się przed reagowaniem wobec własnego organizmu nazywa się tolerancją. Czasami układ odpornościowy traci zdolność rozpoznawania komórek własnych jako prawidłowych, a następująca dalej odpowiedź skierowana przeciwko tkance lub komórkom prowadzi do utraty tolerancji, stanu reakcji autoimmunologicznej. Patologie wynikające z reakcji autoimmunologicznej mają często poważne konsekwencje kliniczne i stanowią jeden z głównych problemów zdrowotnych na świecie, zwłaszcza w krajach rozwiniętych. [0002] IL-21 jest silną immunomodulującą cytokiną typu I w postaci wiązki czterech α-helis, która wiąże się z heterodimerycznym receptorem składającym się z IL-21R i wspólnego łańcucha gamma (przegląd w: Spolski i Leonard, Annu Rev Immunol. Nov 8; 07). IL-21 jest wytwarzana przez NK-T i limfocyty T CD4+ (w tym prozapalne komórki Th17 i folikularne limfocyty T pomocnicze (T FH ), które są ważne dla odpowiedzi ośrodka rozmnażania (centrum germinalnego)), i wykazuje efekt plejotropowy zarówno wobec wrodzonej jak i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, w tym wpływa na zwiększoną proliferację limfocytów B i T, zwiększoną cytotoksyczność populacji CD8+ limfocytów T i komórek NK (ang. natural killer), różnicowanie limfocytów B w komórki osocza wydzielające immunoglobuliny, oraz regulację linii komórek Thl7. IL-21 może także hamować funkcję prezentacji antygenu komórek dendrytycznych i może w pewnych warunkach indukować apoptozę w limfocytach B i komórkach NK. IL-21 wykazuje silne działanie przeciwnowotworowe, ale jest również związana z rozwojem różnych chorób autoimmunologicznych, w tym tocznia rumieniowatego układowego (SLE), reumatoidalnego zapalenia stawów (RA), nieswoistego zapalenia jelit (IBD) i łuszczycy (przegląd w: Spolski i Leonard, Annu Rev Immunol. Nov. 8, 07). [0003] Pokazano, że IL-21 moduluje odpowiedź w postaci produkcji przeciwciał, działając bezpośrednio na limfocyty B. (Mehta i wsp., J. Immunol., 170: , 03; Ozaki i wsp., Science, 298: , 02; Suto i wsp., Blood, 0:46-473, 02). IL-21 może indukować różnicowanie dziewiczych ludzkich limfocytów B w komórki osocza wydzielające przeciwciała (Ozaki i wsp. J. Immunol. 173:361, 04; Ettinger i wsp., J Immunol. 17: , 0; Ettinger i wsp., J Immunol. 178: , 07; Kuchen i wsp. J Immunol. 179:886-96, 07) oraz stymulować wytwarzanie IgE w ludzkich limfocytach B (Kobayashi i wsp. Human Immunol. doi::16/j.humimm.08..) U zwierząt z niedoborem IL-21 lub IL-21R, wytwarzanych jest mniej komórek wydzielających przeciwciała w wyniku reakcji ośrodka rozmnażania, a dojrzewanie powinowactwa jest ograniczone (Zotos i wsp., praca przesłana). Pozapęcherzykowe komórki wytwarzające przeciwciała, odgrywające rolę w reakcji autoimmunologicznej, wymagają pokrewnej pomocy z podzbioru wyspecjalizowanych limfocytów T CD4, które wydzielają IL-21 (Odegard, i wsp., JEM (12): , 08). 1

3 [0004] Wytwarzanie przeciwciał przeciwko allogenicznym cząsteczkom MHC jest kluczowym zjawiskiem w odrzuceniu przeszczepu. Biorcy przeszczepu, u których wzrasta miano przeciwciał anty- MHC (wysoko zimmunizowani pacjenci po przeszczepie) są narażeni na ryzyko przewlekłego odrzucania i są słabymi kandydatami do nowych przeszczepów z powodu prawdopodobieństwa reakcji odrzucenia nowego przeszczepu z udziałem przeciwciał (Smith i wsp., Am J Transplantation 8: 1-11, 08). W szczurzym modelu ostrego odrzucenia przeszczepu allogenicznego nerki, poziom IL- 21 i IL-21R jednoznacznie wzrastał w wewnątrznaczyniowych komórkach jednojądrzastych alloprzeszczepów nerki, ale nie izoprzeszczepów (Hecker i wsp., Immunobiology: doi:.16/j.imbio (08)). W ludzkich przeszczepach serca ulegających odrzuceniu, poziomy wyrażania IL- 21 i IL-21 R korelują ze stopniem odrzucenia przeszczepu wg ISHLT, a najwyższe wyrażanie występuje w stopniach 1R i 2R (Baan i wsp., Transplantation 83(11): , 07). [000] W chorobie przeszczep przeciw gospodarzowi (GVHD), odpowiedź anty-allo zachodzi za pośrednictwem niekontrolowanej aktywacji limfocytów T z przeszczepu, które kierują odpowiedź zapalną przeciwko tkankom gospodarza. Limfocyty T regulatorowe (Treg) mogą modulować tę odpowiedź w modelach zwierzęcych. Pokazano, że IL-21 przeciwdziała funkcjom regulacyjnym Treg (Clough i wsp., J Immunol 180: , 08). W modelach mysich GVHD, transfer limfocytów T z niedoborem IL-21 prowadził do znaczącego ograniczenia objawów klinicznych i punktacji histologicznej oraz zwiększenia przeżywalności, w porównaniu z limfocytami T typu dzikiego (WT). Zmniejszoną częstość występowania limfocytów T wydzielających IFN-gamma i zwiększoną częstość występowania limfocytów Treg zaobserwowano w błonie śluzowej okrężnicy. Zablokowanie IL-21 za pomocą przeciwciała monoklonalnego (mab) anty-mil-21 i transferu limfocytów T WT prowadziło do uzyskania podobnych wyników (Bucher i wsp., Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) : abstrakt nr 2342). [0006] Pokazano również niedawno, że IL-21 jest zarówno wytwarzana jak i wymagana do różnicowania mysich prozapalnych limfocytów Th17 (Korn i wsp. Nature. 448: , 07; Nurieva i wsp. Nature 448: , 07; Zhou i wsp., Nat Immunol. 8: , 07 ; Wei i wsp. J Biol Chem. 282: , 07). Ludzkie limfocyty Th17 również wytwarzają IL-21 i trwają badania w celu ustalenia, czy IL-21 działa jako czynnik autokrynny dla ludzkich limfocytów Th17, jak to ma miejsce w przypadku mysich limfocytów Th17. Ozaki i wsp. (J. Immunol. 173:361, 04) wykazali, że wyrażanie IL-21 jest podwyższone u podatnych na toczeń myszy BXSB-Yaa, organizmie modelowym dla rumieniowatego tocznia układowego (SLE), w wieku, w którym wczesna charakterystyka procesów autoimmunologicznych staje się po raz pierwszy widoczna. Leczenie tych myszy BXSB-Yaa przy użyciu rozpuszczalnego mysiego receptora IL-21 (mil-21r-fc) częściowo hamuje różne parametry choroby, w tym kłębuszkowe zapalenie nerek (Bubier i wsp., Ann N Y Acad Sci. 11 :90-601, 07). Leczenie za pomocą mil-21r-fc okazało się być skuteczne w innym przedklinicznym modelu choroby SLE, u myszy MRL/lpr (Herber i wsp. J. Immunol. 178: , 07), a także w indukowanym kolagenem zapaleniu stawów (CIA) modelu reumatoidalnego zapalenia stawów (Young i wsp., Arthr Rheum 6: , 07). Wstępne dane dla ludzi również sugerują rozregulowanie IL-21 i IL-21 R w SLE (Mitoma i wsp. Int J Mol Med.16:609-61, 0; Wang i wsp., Chinese J. Cell. Mol. Immunol. 2

4 (11):41-42, 07; Sawalha i wsp. Ann Rheum Dis 67: , 08). Niedawno, Rus i wsp. zaprezentowali dane uzyskane od 24 pacjentów z SLE i 1 zdrowych pacjentów kontrolnych (Nguyen i wsp., ACR/ARHP Scientific Meeting, 1760/482, października 08, San Francisco, CA). Rus i wsp. wykazali, że 1) ekspresja mrna IL-21 jest znacznie podwyższona w limfocytach T CD4+ od pacjentów z toczniem w porównaniu z kontrolą, 2) poziomy IL-21 są znacząco podwyższone w surowicy od pacjentów z czynną chorobą w porównaniu z pacjentami z nieaktywnym SLE lub kontrolą, 3) IL-21 wzmaga proliferację limfocytów T CD4+ i limfocytów B CD19+ u pacjentów i osób kontrolnych w sposób zależny od dawki, 4) IL-21 wzmaga indukowane przez anty-cd40 różnicowanie komórek osocza u normalnych pacjentów kontrolnych i pacjentów z SLE, oraz ) podwyższone poziomy IL-21 mogą przyczyniać się do proliferacji autoreaktywnych limfocytów T CD4+ i różnicowania komórek osocza w przebiegu SLE. [0007] Monteleone i wsp. wykazali, że ekspresja RNA i wyrażanie białka IL-21 jest zwiększona w objętej stanem zapalnym, ale nie w nieobjętej stanem zapalnym tkance od pacjentów z chorobą Crohna (CD) (oraz, w mniejszym stopniu, z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego) oraz, że wytwarzanie IL-21 przez komórki CD3+ z komórek jednojądrzastych blaszki właściwej od pacjentów z CD ulega również zwiększeniu (Monteleone i wsp. Gastroenterology 128: , 0; Monteleone i wsp. Gut : , 06; Peluso i wsp., J Immunol 178: , 07). Autorzy ci zasugerowali, że IL-21 reguluje eksperymentalne zapalenie jelita grubego przez modulowanie równowagi pomiędzy limfocytami T regulatorowymi (Treg) a limfocytami Th17 (Fantini i wsp. Eur. J. Immunol. 37: , 07). Hamowanie IL-21 in vivo rozpuszczalnym receptorem IL- 21 czy to w mysim, czy w szczurzym modelu zapalenia jelita grubego, prowadzi do znacznego ograniczenia objawów klinicznych zapalenia jelita grubego (Young i wsp. US 06/ ). [0008] Wyrażanie receptora IL-21 zachodzi w komórkach NK, i wykazano, że komórki NK odpowiadają na leczenie IL-21 zarówno in vivo jak i in vitro. U pacjentów onkologicznych, którym podano rekombinowaną ludzką IL-21, zaobserwowano zmienione schematy recyrkulacji w subpopulacjach limfocytów obejmujących komórki NK, oraz zwiększone wyrażanie markerów aktywacji komórek NK i cytolityczną zdolność efektorową (Frederiksen, i wsp., Cancer Immunol Immunother 7(): , 08). W chorobach autoimmunologicznych, aktywność komórek NK może odgrywać rolę w promowaniu stanu zapalnego i związanego z nim uszkodzenia tkanki. Zasiedlenie tkanki (ang. tissue homing) przez komórki NK jest ukierunkowane przez chemoatraktanty uwalniane w miejscu zapalenia (Morris i Ley, Curr Mol Med.;4(4):431-8, 04). Komórki NK blaszki właściwej (LPNK) od pacjentów z chorobą Crohna uwalniały większe ilości IFN-γ i TNF-α w wyniku stymulacji in vitro z użyciem IL-21 i IgG, w porównaniu z komórkami LPNK od pacjentów kontrolnych (Liu i Jiu, Chronic Inflammation of Liver and Gut, Falk Symposium, abstrakt nr 163, 14-1 marca 08). Pojawiły się również doniesienia, że komórki NK regulują reakcję autoimmunologiczną i odrzucenie przeszczepu przez ich oddziaływania z komórkami dendrytycznymi (DC), przez zabijanie niedojrzałych lub aktywowanych DC, oraz przez uwalnianie cytokin, które wpływają na funkcje wprowadzania w stan aktywacji i prezentacji antygenu DC (Vivier i wsp., Nat Immunol 9():03-, 08; Laffont i wsp., Blood 112: ). Porównanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej od wykazujących tolerancję i niewykazujących tolerancji biorców przeszczepu 3

5 allogenicznego wątroby pokazało zmiany w programie transkrypcyjnym komórek NK (Martinez- Llordella i wsp., J Clin Invest 118(8): , 08). Zatem, zablokowanie IL-21 może modulować stan aktywacji komórek NK, organiczać ich wkład w zapalenie tkanki w chorobach autoimmunologicznych oraz zmieniać przebieg kliniczny odrzucenia przeszczepu. Pojawiły się również doniesienia, że komórki NK regulują reakcję autoimmunologiczną i odrzucenie przeszczepu przez ich oddziaływania z komórkami dendrytycznymi (DC), przez zabijanie niedojrzałych lub aktywowanych DC i przez uwalnianie cytokin, które wpływają na stan aktywacji i zmieniają funkcje prezentacji antygenu DC. Zatem, zablokowanie IL-21 może modulować stan aktywacji komórek NK i ograniczać ich wkład w zapalenie tkanki w chorobach autoimmunologicznych. W dokumencie US 07/17247 opisano IL-21 i IL-22. W dokumentach WO 07/ i US 07/ opisano antagonistów IL-21. W zgłoszeniu WO 06/38 opisano sposoby i kompozycje do leczenia patologii związanych z IL-21. W zgłoszeniu WO 06/07027 opisano epitopy antygenowe IL-21, powiązane przeciwciała i ich zastosowanie w dziedzinie medycyny. W dokumencie DK opisano leczenie lub zapobieganie chorobom autoimmunologicznym i utajonej cukrzycy o podłożu autoimmunologicznym u dorosłych. Caruso i wsp., J. Gastroenterology 132(1), stycznia 07, strony , opisują funkcjonalną rolę IL-21 w promowaniu syntezy chemoatraktanta dla limfocytów T MIP-3alpha przez komórki nabłonka jelit. Herber D. i wsp., J. Immunology 178(6), 1 marca 07, strony , donoszą, że IL-21 ogrywa patogenną rolę w modelu myszy podatnych na toczeń, a jego zablokowanie z użyciem IL-21 R.Fc ogranicza postęp choroby. Young D.A. i wsp., Arthritics & Rheumatism 6(4), 1 kwietnia 07, strony , donoszą, że zablokowanie IL-21/IL- 21 szlaku receptora przynosi poprawę w chorobie w modelach zwierzęcych reumatoidalnego zapalenia stawów. Baan C.C. i wsp., Transplantation 83(11), 1 czerwca 07, strony , donoszą, że IL-21 jest graczem zależnym IL-2 w procesach odrzucenia przeszczepu. [0009] Przedmiotem niniejszego wynalazku są przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-21, jak określono w zastrzeżeniach. W niniejszym opisie przedstawiono zastosowanie tych przeciwciał do hamowania objawów i aktywności biologicznej, które manifestują się w postaci zaburzeń autoimmunologicznych i zapalnych i są związane z oddziaływaniami z receptorem IL-21/IL-21. KRÓTKI OPIS FIGUR [00] Fig. 1 przedstawia dopasowanie reszt aminokwasowych obejmujących regiony zmienne łańcucha ciężkiego przeciwciał oznaczonych numerami klonów (78), (97), (7), (2), 366,328. (328). Fig. 2 przedstawia dopasowanie reszt aminokwasowych obejmujących region zmienny łańcucha lekkiego przeciwciał opisanych powyżej. Fig. 3 ilustruje widma masowe MALDI/TOF regionów sekwencji peptydu IL-21 uzyskanych z samej IL- 21 oraz kompleksu immunologicznego IL-21. Sekwencje peptydowe IL-21, EKKPPKEF (SEKW. NR: 2 od reszty 129 do 136) (m/z, 02,619 Da) i LERFKSLL (SEKW. NR: 2 od reszty 137 do 144) (m/z, 0,6091 Da) z IL-21 w stanie wolnym (A). Przesunięcie masy peptydu spowodowane zachowaniem deuterowania grupy amidowej w obecności IL-21 mab (B). Inny region sekwencji peptydu IL-21, KSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS (SEKW. NR: 2 od reszty 141 do 162) (m/z, 219,241) z IL-21 w 4

6 stanie wolnym (C). Częściowe przesunięcie masy peptydu spowodowane zachowaniem deuterowania grupy amidowej w obecności IL-21 mab (D). Fig. 4 ilustruje wybrane chromatogramy jonowymienne acetylowanych i nieacetylowanych peptydów. Chromatogram dla wybranego pojedynczego jonu acetylowanego TCPSCDSYEKKPPKEF (SEKW. NR: 2 od reszty 119 do 136) (m/z, 1986 Da) wyizolowanego z samej IL-21 (A) i ten sam zapis chromatograficzny kompleksu immunologicznego IL-21 (B). Osadzone widmo masowe przedstawia stan o potrójnym ładunku masy peptydu (m/z, 662.9). Trzeci zapis przedstawia chromatogram dla wybranego jonu peptydu przy m/z 18 Da, który stanowi acetylowany KSLLQKMI (SEKW. NR: 2 od reszty 141 do 148) wyizolowany z samej IL-21 (C) i ten sam zapis chromatograficzny kompleksu immunologicznego IL-21 (D). Osadzone widmo masowe przedstawia stan o podwójnym ładunku masy peptydu (m/z, 09,1) KRÓTKI OPIS WYNALAZKU [0011] W jednym z aspektów, niniejszy opis przedstawia przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-21, wykazujące co najmniej 80% identyczności z resztami aminokwasowymi do 14 z SEKW. NR: 29 i co najmniej 80% identyczności z resztami aminokwasowymi 21 do 126 z SEKW. NR: 37. W pewnych przykładach wykonania, przeciwciała obejmują zmiany o co najmniej 80% identyczności występujące w regionie zmiennym łańcucha ciężkiego CDR1 z SEKW. NR: 31. [0012] Przedmiotem niniejszego wynalazku jest przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-21 zawierające: (a) region łańcucha ciężkiego, w którego skład wchodzi: (i) region zmienny łańcucha ciężkiego CDR1 obejmujący SEKW. NR: 31; (ii) region zmienny łańcucha ciężkiego CDR2 obejmujący SEKW. NR: 33; i (iii) region zmienny łańcucha ciężkiego CDR3 obejmujący SEKW. NR: 3; oraz (b) region łańcucha lekkiego, w którego skład wchodzi: (i) region zmienny łańcucha lekkiego CDR1 obejmujący SEKW. NR: 39; (ii) region zmienny łańcucha lekkiego CDR2 obejmujący SEKW. NR: 41; i (iii) region zmienny łańcucha lekkiego CDR3 obejmujący SEKW. NR: 43. W pewnych przykładach wykonania, wynalazek dostarcza przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiej IL-21 zawierającego reszty aminokwasowe do 14 z SEKW. NR: 29 i reszty aminokwasowe 21 do 126 z SEKW. NR: 37. W innych przykładach wykonania, przeciwciało zawiera ponadto reszty aminokwasowe 1 do 14 z SEKW. NR: 29 i reszty aminokwasowe 1 do 126 z SEKW. NR: 37. Inny przykład wykonania niniejszego wynalazku dostarcza hybrydomy oznaczonej jako , przy czym hybrydoma ta jest zdeponowana w American Type Culture Collection, mając oznaczenie patentowe w depozycie patentowym ATCC PTA-8790, i zakres wynalazku obejmuje przeciwciało wytwarzane przez tę hybrydomę. [0013] Inny aspekt niniejszego wynalazku dostarcza przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiej IL-21, jak określono w zastrzeżeniach, zawierającego: (a) region łańcucha ciężkiego, w którego skład wchodzi: (i) region zmienny łańcucha ciężkiego CDR1 obejmujący SEKW. NR: 47; (ii) region zmienny łańcucha ciężkiego CDR2 obejmujący SEKW. NR: 49; i (iii) region zmienny łańcucha ciężkiego CDR3 obejmujący SEKW. NR: 1; oraz (b) region łańcucha lekkiego, w którego skład wchodzi: (i) region zmienny łańcucha lekkiego CDR1 obejmujący SEKW. NR: ; (ii) region zmienny łańcucha lekkiego CDR2 obejmujący SEKW. NR: 7; i (iii) region zmienny łańcucha lekkiego CDR3 obejmujący SEKW. NR: 9. W pewnych przykładach wykonania, wynalazek dostarcza przeciwciała monoklonalnego

7 1 2 3 przeciwko ludzkiej IL-21, jak określono w zastrzeżeniach, zawierającego reszty aminokwasowe do 14 z SEKW. NR: 4 i reszty aminokwasowe 21 do 126 z SEKW. NR: 3. W innych przykładach wykonania, przeciwciało, jak określono w zastrzeżeniach, zawiera ponadto reszty aminokwasowe 1 do 14 z SEKW. NR: 4 i reszty aminokwasowe 21 do 126 z SEKW. NR: 3. W niniejszym opisie przedstawiono hybrydomę oznaczoną jako , przy czym hybrydoma ta jest zdeponowana w American Type Culture Collection, mając oznaczenie patentowe w depozycie patentowym ATCC PTA Wynalazek ten obejmuje przeciwciało wytwarzane przez tę hybrydomę, jak określono w zastrzeżeniach. [0014] Niniejszy opis przedstawia przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-21, wykazujące co najmniej 80% identyczności z resztami aminokwasowymi do 141 z SEKW. NR: 13 i co najmniej 80% identyczności z resztami aminokwasowymi 21 do 126 z SEKW. NR: 21. W jednym z przykładów wykonania, zakres wynalazku obejmuje przeciwciało monoklonalne, w którym wszelkie zmiany aminokwasowe stanowią konserwatywne zmiany aminokwasowe. [001] Niniejszy opis przedstawia przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-21 zawierające: (a) region łańcucha ciężkiego, w którego skład wchodzi: (i) region zmienny łańcucha ciężkiego CDR1 obejmujący SEKW. NR: 1; (ii) region zmienny łańcucha ciężkiego CDR2 obejmujący SEKW. NR: 17; i (iii) region zmienny łańcucha ciężkiego CDR3 obejmujący SEKW. NR: 19; oraz (b) region łańcucha lekkiego, w którego skład wchodzi: (i) region zmienny łańcucha lekkiego CDR1 obejmujący SEKW. NR: 23; (ii) region zmienny łańcucha lekkiego CDR2 obejmujący SEKW. NR: 2; i (iii) region zmienny łańcucha lekkiego CDR3 obejmujący SEKW. NR: 27. Niniejszy opis przedstawia przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-21 zawierające reszty aminokwasowe do 141 z SEKW. NR: 13 i reszty aminokwasowe 21 do 126 z SEKW. NR: 21. W niniejszym opisie przedstawiono reszty aminokwasowe 1 do 141 z SEKW. NR: 13 i reszty aminokwasowe 1 do 126 z SEKW. NR: 21. Niniejszy opis przedstawia hybrydomę oznaczoną jako , przy czym hybrydoma ta jest zdeponowana w American Type Culture Collection, mając oznaczenie patentowe w depozycie patentowym ATCC PTA-8791, i przeciwciało wytwarzane przez tę hybrydomę. [0016] W innym aspekcie, niniejszy opis przedstawia przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-21, zawierające: (a) region łańcucha ciężkiego, w którego skład wchodzi: (i) region zmienny łańcucha ciężkiego CDR1 obejmujący SEKW. NR: 79; (ii) region zmienny łańcucha ciężkiego CDR2 obejmujący SEKW. NR: 81; i (iii) region zmienny łańcucha ciężkiego CDR3 obejmujący SEKW. NR: 83; oraz (b) region łańcucha lekkiego, w którego skład wchodzi: (i) region zmienny łańcucha lekkiego CDR1 obejmujący SEKW. NR: 87; (ii) region zmienny łańcucha lekkiego CDR2 obejmujący SEKW. NR: 89; i (iii) region zmienny łańcucha lekkiego CDR3 obejmujący SEKW. NR: 91. Niniejszy opis przedstawia przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-21 zawierające reszty aminokwasowe do 136 z SEKW. NR: 77 i reszty aminokwasowe 23 do 129 z SEKW. NR: 8. W niniejszym opisie przedstawiono reszty aminokwasowe 1 do 136 z SEKW. NR: 77 i reszty aminokwasowe 1 do 129 z SEKW. NR: 8. Niniejszy opis przedstawia hybrydomę, oznaczoną jako , przy czym hybrydoma ta jest zdeponowana w American Type Culture Collection, mając oznaczenie patentowe w depozycie patentowym ATCC PTA-8787, i przeciwciało wytwarzane przez tę hybrydomę. 6

8 [0017] Niniejszy opis przedstawia przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-21, zawierające: (a) region łańcucha ciężkiego, w którego skład wchodzi: (i) region zmienny łańcucha ciężkiego CDR1 obejmujący SEKW. NR: 63; (ii) region zmienny łańcucha ciężkiego CDR2 obejmujący SEKW. NR: 6; i (iii) region zmienny łańcucha ciężkiego CDR3 obejmujący SEKW. NR: 67; oraz (b) region łańcucha lekkiego, w którego skład wchodzi: (i) region zmienny łańcucha lekkiego CDR1 obejmujący SEKW. NR: 71; (ii) region zmienny łańcucha lekkiego CDR2 obejmujący SEKW. NR: 73; i (iii) region zmienny łańcucha lekkiego CDR3 obejmujący SEKW. NR: 7. Niniejszy opis przedstawia przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-21, zawierające reszty aminokwasowe do 139 z SEKW. NR: 61 i reszty aminokwasowe 23 do 129 z SEKW. NR: 69. Niniejszy opis przedstawia reszty aminokwasowe 1 do 139 z SEKW. NR: 61 i reszty aminokwasowe 1 do 129 z SEKW. NR: 69. Niniejszy opis przedstawia hybrydomę, oznaczoną jako , przy czym hybrydoma ta jest zdeponowana w American Type Culture Collection, mając oznaczenie patentowe w depozycie patentowym ATCC PTA-8789 i przeciwciało wytwarzane przez tę hybrydomę. [0018] Niniejszy opis przedstawia hybrydomę, oznaczoną jako , przy czym hybrydoma ta jest zdeponowana w American Type Culture Collection, mając oznaczenie patentowe w depozycie patentowym ATCC PTA-8788, i przeciwciało wytwarzane przez tę hybrydomę. [0019] Niniejszy opis przedstawia wyizolowane przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z nieciągłym epitopem, obejmującym co najmniej dwa regiony na białku IL-21, przy czym pierwszy region składa się z co najmniej jednego aminokwasu od reszty Ile4 do reszty Leu6 z SEKW. NR: 2, a drugi region składa się z co najmniej jednej reszty aminokwasowej Glu129 do reszty Leu144 z SEKW. NR: 2; jak na przykład taki, w którym pierwszy region składa się z pomiędzy 1 a 12 aminokwasów od reszty Ile4 do reszty Leu6 of SEKW. NR: 2, a drugi region składa się z pomiędzy 1 a 16 aminokwasów od reszty Glu129 do reszty Leu144 z SEKW. NR: 2. [00] W każdym aspekcie opisanych powyżej wynalazków zawarty jest przykład wykonania, w którym przeciwciało monoklonalne zawiera ponadto fragment Fc, oraz inny przykład wykonania, w którym fragment Fc jest wybrany z grupy składającej się z IgG1, IgG2 i IgG4, oraz inny przykład wykonania, w którym fragment Fc wykazuje ograniczoną funkcję efektorową. [0021] Przedmiotem niniejszego wynalazku jest przeciwciało, jak określono w zastrzeżeniach, do stosowania w leczeniu chorób, w których pośredniczą folikularne pomocnicze limfocyty T lub chorób, w których pośredniczą limfocyty B, u pacjenta, przez podawanie terapeutycznej ilości zastrzeganych przeciwciał monoklonalnych przeciwko ludzkiej IL- 21, opisanych w niniejszym dokumencie, przy czym choroby, w których pośredniczą folikularne pomocnicze limfocyty T lub choroby, w których pośredniczą limfocyty B, są wybrane z grupy składającej się z rumieniowatego tocznia układowego, utraty słuchu na tle autoimmunologicznym, choroby Gravesa-Basedowa, pęcherzycy zwykłej, miastenii, zapalenia rdzenia i nerwów wzrokowych, zespołu Goodpasture'a, autoimmunologicznego zapalenia nerek, krioglobulinemii, zespołu Guillaina-Barrégo, przewlekłej zapalnej polineuropatii demielinizacyjnej (CIDP), autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej i idiopatycznej plamicy małopłytkowej (ITP). [0022] Niniejszy opis przedstawia leczenie chorób, w których pośredniczą limfocyty TH1 lub TH17, u pacjenta, za pomocą podawania terapeutycznej ilości zastrzeganych przeciwciał monoklonalnych 7

9 przeciwko ludzkiej IL-21, opisanych w niniejszym dokumencie, przy czym choroby, w których pośredniczą limfocyty TH1 lub TH17, wybiera się z grupy składającej się z łuszczycy, spondyloartropatii, odczynowego zapalenia stawów, enteropatycznego zapalenia stawów, autoimmunologicznego zapalenia mięśnia sercowego, choroby Kawasakiego, choroby trzewnej (celiakii), zapalenia błony naczyniowej, choroby Behçeta, choroby wieńcowej, przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) i śródmiąższowej choroby płuc. [0023] Przedmiotem niniejszego wynalazku jest przeciwciało, jak określono w zastrzeżeniach, do stosowania w leczeniu nieswoistego zapalenia jelit (IBD) u pacjenta, przy czym nieswoiste zapalenie jelit zostało wybrane z grupy składającej się z choroby Crohna, wrzodziejącego zapalenia jelita grubego i zespołu jelita drażliwego. [0024] W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza przeciwciała, jak określono w zastrzeżeniach, do stosowania w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów u pacjenta. [002] W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza przeciwciała, jak określono w zastrzeżeniach, do stosowania w leczeniu stwardnienia rozsianego u pacjenta. [0026] W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza przeciwciała, jak określono w zastrzeżeniach, do stosowania w leczeniu cukrzycy typu I (IDDM) u pacjenta. [0027] W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza przeciwciała, jak określono w zastrzeżeniach, do stosowania w leczeniu zespołu Sjögrena u pacjenta. [0028] W innym aspekcie, niniejszy opis przedstawia leczenie pacjenta po przeszczepie przez podawanie terapeutycznej ilości zastrzeganych przeciwciał monoklonalnych przeciwko ludzkiej IL-21, opisanych w niniejszym dokumencie, przy czym zostaje wytłumiona reakcja odrzucenia przeszczepu, zostaje ustalona tolerancja w przedtransplantacyjnym schemacie leczenia lub następuje zmniejszenie miana alloprzeciwciał u pacjenta. [0029] W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza przeciwciała jak określono w zastrzeżeniach, do stosowania w leczeniu choroby autoimmunologicznej u pacjenta przez podawanie terapeutycznej ilości zastrzeganych przeciwciał monoklonalnych przeciwko ludzkiej IL-21, opisanych w niniejszym dokumencie, przy czym choroba autoimmunologiczna została wybrana z grupy, w której skład wchodzą: zapalenie trzustki, choroba zapalna mięśni (miopatia zapalna) (zapalenie wielomięśniowe, zapalenie skórno-mięśniowe), mikroskopowe zapalenie naczyń, autoimmunologiczna niedokrwistość aplastyczna, autoimmunologiczne zapalenie tarczycy, autoimmunologiczne zapalenie wątroby, zespół (ziarniniakowatość) Wegenera, uchyłkowatość, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, sklerodermia, twardzina układowa, łuszczycowe zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, atopowe zapalenie skóry, bielactwo nabyte, choroba przeszczep przeciw gospodarzowi (GVHD), chłoniak skórny T-komórkowy (CTCL), kłębuszkowe zapalenie nerek, nefropatia IgA, wysoka immunizacja pacjentów po przeszczepie, zespół antyfosfolipidowy i astma. OPIS WYNALAZKU [0032] Następujące definicje przedstawiono, aby ułatwić zrozumienie wynalazków opisanych w niniejszym dokumencie. [0033] Określenia przy końcu aminowym i przy końcu karboksylowym są stosowane w niniejszym opisie do określenia pozycji w obrębie polipeptydów. Jeśli pozwala na to kontekst, określenia te 8

10 stosuje się w odniesieniu do określonej sekwencji lub części polipeptydu, dla oznaczenia bliskości lub względnej pozycji. Na przykład, pewna sekwencja usytuowana na końcu karboksylowym względem sekwencji odniesienia w obrębie polipeptydu jest zlokalizowana w pobliżu końca karboksylowego sekwencji odniesienia, ale niekoniecznie znajduje się przy końcu karboksylowym kompletnego polipeptydu. [0034] Określenie antagonista odnosi się do dowolnego związku, w tym białka, polipeptydu, peptydu, przeciwciała, fragmentu przeciwciała, dużej cząsteczki lub małej cząsteczki (poniżej kd), która zmniejsza aktywność, aktywację lub funkcję innej cząsteczki. Antagoniści IL-21 powodują, co najmniej jeden z następujących efektów: zmniejszenie funkcji immunologicznej komórek NK, komórek dendrytycznych, subpopulacji limfocytów T i subpopulacji limfocytów B; wiązanie IL-21 tak, że oddziaływanie białka IL-21 z jego receptorem jest zablokowane, zahamowane, zredukowane lub zobojętnione. [003] Przeciwciała (Ab) i immunoglobuliny (Ig) są to glikoproteiny o takiej samej charakterystyce strukturalnej. Podczas gdy przeciwciała wykazują specyficzność wiązania do swoistego antygenu, immunoglobuliny obejmują zarówno przeciwciała jak i inne cząsteczki podobne do przeciwciał, pozbawione swoistości antygenowej. Polipeptydy tego drugiego rodzaju są, na przykład, wytwarzane na niskich poziomach przez układ limfatyczny i na podwyższonych poziomach przez szpiczaki. Zatem, w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, określenie przeciwciało lub peptyd(y) stanowiący(-e) przeciwciało odnosi się do nienaruszonego przeciwciała, lub jego fragmentu wiążącego, który współzawodniczy z nienaruszonym przeciwciałem o swoiste wiązanie i obejmuje przeciwciała chimeryczne, humanizowane, w pełni ludzkie i przeciwciała o podwójnej swoistości. W pewnych przykładach wykonania, fragmenty wiążące wytwarza się za pomocą technik rekombinacji DNA. W dodatkowych przykładach wykonania, fragmenty wiążące wytwarza się za pomocą cięcia enzymatycznego lub chemicznego nienaruszonych przeciwciał. Fragmenty wiążące obejmują, ale nie ograniczają się one do wymienionych, Fab, Fab, F(ab ) 2, Fv i przeciwciała jednołańcuchowe, ScFv. Przeciwciała i immunoglobuliny natywne są to zwykle heterotetrameryczne glikoproteiny o masie około 000 daltonów, składające się z dwóch identycznych łańcuchów lekkich (L) i dwóch identycznych łańcuchów ciężkich (H). Każdy łańcuch lekki jest połączony z łańcuchem ciężkim jednym kowalencyjnym wiązaniem dwusiarczkowym, natomiast liczba wiązań dwusiarczkowych jest zróżnicowana pomiędzy łańcuchami ciężkimi różnych izotypów immunoglobulin. Każdy łańcuch ciężki i lekki ma również regularnie rozmieszczone wewnątrzłańcuchowe mostki dwusiarczkowe. Każdy łańcuch ciężki ma na jednym końcu domenę zmienną (VH), po czym następuje pewna liczba domen stałych. Każdy łańcuch lekki ma domenę zmienną na jednym końcu (VL) i domenę stałą na drugim końcu; domena stała łańcucha lekkiego jest wyrównana z pierwszą domeną stałą łańcucha ciężkiego, a domena zmienna łańcucha lekkiego jest wyrównana z domeną zmienną łańcucha ciężkiego. Uważa się, że określone reszty aminokwasowe tworzą obszar wzajemnego oddziaływania pomiędzy domenami zmiennymi łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego (Chothia i wsp., J. Mol. Biol. 186:61 (198); Novotny i Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:492 (198)). [0036] Określenie przeciwciało chimeryczne lub przeciwciała chimeryczne odnosi się do przeciwciał, których geny łańcucha lekkiego i ciężkiego zostały skonstruowane, zazwyczaj za pomocą 9

11 technik inżynierii genetycznej, z genów regionu zmiennego i stałego immunoglobulin należących do różnych gatunków. Na przykład, segmenty zmienne genów z mysiego przeciwciała monoklonalnego można połączyć z ludzkimi segmentami stałymi, takimi jak gamma 1 i gamma 3. Typowe chimeryczne przeciwciało terapeutyczne jest zatem białkiem hybrydowym składającym się z domeny zmiennej lub wiążącej antygen z przeciwciała mysiego i domeny stałej z ludzkiego przeciwciała, jakkolwiek można wykorzystać inne gatunki ssaków. W szczególności, przeciwciało chimeryczne uzyskuje się za pomocą techniki rekombinowanego DNA, w której całość lub część regionów stałego i zawiasowego łańcucha lekkiego, łańcucha ciężkiego lub obu łańcuchów immunoglobuliny, jest zastępowane odpowiednimi regionami łańcucha lekkiego lub łańcucha ciężkiego immunoglobuliny z innego zwierzęcia. Tym sposobem, część wiążąca antygen rodzicielskiego przeciwciała monoklonalnego jest przeszczepiona na szkielecie przeciwciała innego gatunku. [0037] Określenie epitop odnosi się do dowolnej determinanty białkowej zdolnej do swoistego wiązania z immunoglobuliną lub receptorem limfocytów T. Determinanty epitopowe składają się zwykle z chemicznie aktywnych ugrupowań powierzchniowych cząsteczek, takich jak aminokwasowe lub cukrowe łańcuchy boczne i zazwyczaj wykazują one specyficzną trójwymiarową charakterystykę strukturalną, a także specyficzną charakterystykę ładunku. W szczególności, określenie epitop IL-21, w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, odnosi się do części polipeptydu IL-21 posiadającej aktywność antygenową lub immunogenną u zwierzęcia, korzystnie u ssaka, a najkorzystniej u myszy lub człowieka. Epitop posiadający aktywność immunogenną stanowi część polipeptydu IL-21, która wywołuje odpowiedź w postaci produkcji przeciwciał u zwierzęcia. Epitop posiadający aktywność antygenową stanowi część polipeptydu IL-21, z którą immunoswoiście wiąże się przeciwciało, określoną jakimkolwiek sposobem dobrze znanym w tej dziedzinie, na przykład, za pomocą testów immunologicznych. Epitopy antygenowe nie muszą koniecznie być immunogenne. Epitopy nieciągłe są to epitopy konformacyjne utworzone z co najmniej dwóch odrębnych regionów w sekwencji pierwszorzędowej białka IL-21. Epitopy konformacyjne tracą zdolność swoistego wiązania w obecności rozpuszczalników denaturujących (np. w analizach Western blot). [0038] Przedmiotem niniejszego wynalazku są przeciwciała monoklonalne i fragmenty przeciwciał, jak opisano w zastrzeżeniach, które wiążą się specyficznie z białkami i polipeptydami IL-21. Ludzkie i mysie polipeptydy IL-21, białka i polinukleotydy kodujące te polipeptydy ujawniono w pracy Parrish- Novak i wsp., Nature 408:7-63, 03; w dokumentach patentowych St. Zjedn. nr i ; oraz W niniejszym dokumencie przedstawiono strukturalną i funkcjonalną charakterystykę określającą regiony (epitopy) ludzkiego białka IL-21, które zostały zidentyfikowane jako cele dla terapeutycznego przeciwciała monoklonalnego. Przedstawiono przykładowe ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-21. Niektóre z tych przeciwciał mają zdolność wiązania natywnej ludzkiej IL-21, rekombinowanej ludzkiej IL-21 typu dzikiego, rekombinowanego zmutowanego białka IL-21 i/lub regionów peptydowych ludzkiej IL-21. [0039] Przedmiotem niniejszego wynalazku są przeciwciała przeciwko IL-21, jak opisano w zastrzeżeniach, mające zastosowanie w postępowaniu terapeutycznym w chorobach autoimmunologicznych i zapalnych. Na przykład, przeciwciała przeciwko IL-21 mają zastosowanie w leczeniu łuszczycy, zapalenia trzustki, cukrzycy typu I (IDDM), choroby Gravesa-Basedowa,

12 nieswoistego zapalenia jelit (IBD), choroby Crohna, wrzodziejącego zapalenia jelita grubego, zespołu jelita drażliwego, stwardnienia rozsianego, reumatoidalnego zapalenia stawów, odczynowego zapalenia stawów, enteropatycznego zapalenia stawów, spondyloartropatii, autoimmunologicznego zapalenia mięśnia sercowego, choroby Kawasakiego, choroby trzewnej (celiakii), zapalenia błony naczyniowej, choroby Behçeta, choroby wieńcowej, przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP), śródmiąższowej choroby płuc, choroby zapalnej mięśni (miopatii zapalnej) (zapalenia wielomięśniowego, zapalenia skórno-mięśniowego), mikroskopowego zapalenia naczyń, autoimmunologicznej niedokrwistości aplastycznej, autoimmunologicznego zapalenia tarczycy, autoimmunologicznego zapalenia wątroby, zespołu (ziarniniakowatości) Wegenera, uchyłkowatości, tocznia rumieniowatego układowego, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, sklerodermii, twardziny układowej, łuszczycowego zapalenia stawów, zapalenia kości i stawów, atopowego zapalenia skóry, bielactwa nabytego, choroby przeszczep przeciw gospodarzowi (GVHD), chłoniaka skórnego T-komórkowego (CTCL), zespołu Sjögrena, kłębuszkowego zapalenia nerek, nefropatii IgA, autoimmunologicznego zapalenia nerek, pęcherzycy zwykłej, miastenii, utraty słuchu na tle autoimmunologicznym, zapalenia rdzenia i nerwów wzrokowych, zespołu Goodpasture'a, krioglobulinemii, zespołu Guillaina-Barrégo, przewlekłej zapalnej polineuropatii demielinizacyjnej (CIDP), autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej, idiopatycznej plamicy małopłytkowej (ITP), odrzucenia przeszczepu, wysoko zimmunizowanych pacjentów po przeszczepie, zespołu antyfosfolipidowego, alergii i astmy, oraz innych chorób autoimmunologicznych, lub innych chorób, w którym mediatorem jest IL-21 i agoniści receptora IL-21. [0040] U wyższych kręgowców zidentyfikowano pięć klas immunoglobulin, IgG, IgA, IgM, IgD i IgE. Białka IgG, IgD i IgE są połączonymi w charakterystyczny sposób wiązaniami dwusiarczkowymi heterotetramerami składającymi się z dwóch identycznych łańcuchów ciężkich i dwóch identycznych łańcuchów lekkich. Zazwyczaj, IgM występuje w postaci pentameru lub tetrameru, podczas gdy IgA występuje w postaci dimeru lub tetrameru. Można wprowadzać modyfikacje w ugrupowaniu immunoglobuliny. [0041] IgG stanowi główną klasę, ponieważ istnieje zwykle jako drugie najobficiej występujące białko w osoczu. U ludzi, IgG składa się z czterech podklas, oznaczonych IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Każdy łańcuch ciężki immunoglobuliny posiada region stały, który składa się z domen białkowych regionu stałego (C H 1, zawias, C H 2 i C H 3), które są niezmienne dla danej podklasy. Regiony stałe łańcucha ciężkiego klasy IgG są oznaczane greckim symbolem γ. Na przykład, immunoglobuliny z podklasy IgG1 zawierają region stały łańcucha ciężkiego γ1. [0042] Fragment Fc lub domena Fc składają się z regionów zawiasowych łańcucha ciężkiego połączonych wiązaniem dwusiarczkowym, domen C H 2 i C H 3. W immunoglobulinowych białkach fuzyjnych, w charakterze ugrupowania immunoglobuliny stosuje się często domeny Fc z podklasy IgG1, ponieważ IgG1 wykazuje najdłuższy okres półtrwania w surowicy spośród wszystkich białek surowicy. Długi okres półtrwania w surowicy może stanowić pożądaną cechę charakterystyczną białka dla badań na zwierzętach i potencjalnego zastosowania terapeutycznego u ludzi. Dodatkowo, podklasa IgG1 wykazuje najsilniejszą zdolność do realizowania funkcji efektorowych z udziałem przeciwciał. Podstawową funkcją efektorową, która może być najbardziej użyteczna w 11

13 immunoglobulinowym białku fuzyjnym, jest zdolność przeciwciała IgG1 do pośredniczenia w cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał. Z drugiej strony, mogłoby to stanowić niepożądaną funkcję w przypadku białka fuzyjnego, które funkcjonuje głównie jako antagonista. W podklasie IgG1 zidentyfikowano kilka określonych reszt aminokwasowych, które są ważne dla aktywności mediowanej przez region stały przeciwciała. Włączenie lub wyłączenie tych określonych aminokwasów pozwala zatem na włączenie lub wyłączenie określonej aktywności mediowanej przez region stały immunoglobuliny (zob. dokumenty patentowe St. Zjedn ; ). [0043] Wytworzono zmodyfikowany fragment Fc ludzkiej IgG1 w celu stworzenia białek fuzyjnych Fc. Na przykład, mutacje Fc4, Fc i Fc6 mające na celu ograniczenie funkcji efektorowych, w którym mediatorem jest fragment Fc, przez ograniczenie wiązania FcγRI i wiązania dopełniacza Clq opisano w zgłoszeniu patentowym St. Zjedn. Ameryki W szczególności, wprowadzono trzy substytucje aminokwasowe w celu ograniczenia wiązania FcγRI. Są to substytucje w pozycjach według numeracji EU 234, 23 i 237. Wykazano, że substytucje w tych pozycjach zmniejszają wiązanie z FcγRI (Duncan i wsp., Nature 332:63 (1988)). Takie substytucje aminokwasowe mogą również zmniejszać wiązanie FcγRIIa, a także wiązanie FcγRIII (Sondermann i wsp., Nature 406:267 (00); Wines i wsp., J.Immunol. 164:313 (00)). Mutacje te nie mają wpływu na wiązanie z FcRn, które sprzyja długiemu okresowi półtrwania w surowicy dzięki odzyskiwaniu IgG przez szlak recyklingu endocytarnego (ang. endocytic recycling pathway). [0044] Kilka grup opisało znaczenie pozycji 3 i 331 według numeracji EU dla wiązania dopełniacza Clq a następnie unieruchomienia dopełniacza (Canfield i Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991); Tao i wsp., J. Exp. Med. 178:661 (1993)). Wprowadzono podstawienia aminokwasowe w tych pozycjach w Fc4, aby ograniczyć unieruchomienie dopełniacza. Domena C H 3 fragmentu Fc4 jest identyczna ze znajdującą się w odpowiednim polipeptydzie typu dzikiego, za wyjątkiem kodonu stop, który został zmieniony z TGA na TAA w celu wyeliminowania potencjalnego miejsca metylacji metylazą dam, gdy sklonowane DNA hoduje się w szczepach dam plus E. coli. We fragmencie Fc, reszta argininy na pozycji 218 według numeracji EU jest zastąpiona przez lizynę, a pozostała część sekwencji Fc odpowiada powyższemu opisowi dla Fc4. [004] Niniejszy opis przedstawia genetycznie zmienione przeciwciała, które są funkcjonalnie równoważne przeciwciałom opisanym powyżej. Korzystne są zmodyfikowane przeciwciała zapewniające lepszą stabilność i/lub skuteczność terapeutyczną. Przykłady zmodyfikowanych przeciwciał obejmują te z konserwatywnymi substytucjami reszt aminokwasowych i jedną lub większą liczbą delecji lub addycji aminokwasów, które nie mają znaczącego szkodliwego wpływu na zdolność wiązania antygenu. Substytucje mogą mieścić się w zakresie od zmiany lub modyfikacji jednej lub większej liczby reszt aminokwasowych aż do całkowitego przeprojektowania pewnego regionu, o ile tylko zachowana jest możliwość zastosowania terapeutycznego. Przeciwciała według niniejszego wynalazku można modyfikować potranslacyjnie (np. acetylowanie i fosforylacja) lub mogą być modyfikowane syntetycznie (np. przyłączenie grupy znacznikowej). [0046] Przeciwciała według niniejszego wynalazku można opisywać lub określać pod względem epitopu(-ów) lub części polipeptydu IL-21 według niniejszego wynalazku, które rozpoznają lub z którymi swoiście się wiążą. Epitop(y) lub część (części) polipeptydu (-ów) można określać zgodnie z 12

14 opisem przedstawionym w niniejszym dokumencie, np. na podstawie pozycji względem N-końca i C- końca, lub przez rozmiar sąsiadujących reszt aminokwasowych. Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą też być opisywane lub określane w kategoriach ich reaktywności krzyżowej. Wynalazek obejmuje przeciwciała, które nie wiążą żadnego innego analoga, ortologa lub homologa polipeptydu według niniejszego wynalazku. [0047] Grupowanie ze względu na epitop (ang. epitope binning) dotyczy zastosowania kompetycyjnych testów wiązania do identyfikacji par przeciwciał, które są, lub nie są, zdolne do jednoczesnego wiązania białka IL-21, a tym samym identyfikacji przeciwciał, które wiążą się z tymi samymi lub zachodzącym na siebie epitopami na białku. Rodziny przeciwciał (lub grupy) posiadające taką samą lub zachodzącą na siebie specyficzność wiązania mogą następnie być użyte, aby pomóc w zdefiniowaniu specyficznych epitopów na IL-21. Eksperymenty z grupowaniem ze względu na epitop dostarczają dowodu na to, że są obecne epitopy różne antygenowo. Jednakże, same przez się, nie identyfikują one, ani nie mapują (przypisują) epitopu do konkretnej sekwencji aminokwasowej lub lokalizacji na cząsteczce białka IL-21. [0048] Współzawodnictwo o wiązanie można ocenić dla dowolnej pary przeciwciał lub fragmentów. Na przykład, stosując odpowiednie odczynniki do detekcji, swoistość wiązania przeciwciał lub fragmentów wiążących z dowolnego gatunku/źródła można porównać ze swoistością wiązania przeciwciał monoklonalnych ujawnionych w niniejszym dokumencie. Grupowanie ze względu na epitop można wykonywać z wyizolowanymi przeciwciałami lub z nadsączami hodowli komórkowych. Często, grupowanie wykonuje się z pierwszą rundą nadsączy z hodowli klonów w celu ukierunkowania wyboru klonów do dalszego opracowania. Przeciwciała do porównania powinny mieć zasadniczo jednorodne domeny wiążące antygen. W przypadku przeciwciał bispecyficznych lub dwufunkcyjnych swoistość wiązania dwóch różnych miejsc wiążących powinna być oceniana lub grupowana niezależnie. [0049] Niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciał swoistych wobec liganda, jak określono w zastrzeżeniach. Dodatkowo oprócz kompetycyjnego wiązania przeciwciał, grupowanie ze względu na epitop można również stosować do identyfikacji przeciwciał wobec receptora lub liganda, które współzawodnicząc ze sobą wpływają na wiązanie liganda z jego receptorem lub aktywację za pośrednictwem liganda jego receptora. Często, korzystne właściwości rodziny (lub sortu) przeciwciał można skorelować z wiązaniem ze specyficznym epitopem zdefiniowanym przez sort epitopu. [000] Doświadczenia z kompetycyjnym wiązaniem nie mierzą bezpośrednio powinowactwa wiązania, jednakże poddawane testom przeciwciała muszą wiązać się wystarczająco silnie, aby działały jako przeciwciała współzawodniczące. Ogólnie warunki doświadczalne projektuje się tak, aby zminimalizować wpływ różnic w powinowactwie wiązania. [001] Przeciwciała anty-il-21 mogą również znaleźć zastosowanie w testach diagnostycznych na obecność białka IL-21, np. wykrywających jego wyrażanie w określonych komórkach, tkankach lub surowicy. Przeciwciała przypisane do różnych sortów i zdolne do wiązania z różnymi częściami immunogennymi lub epitopami IL-21 można stosować jako odczynniki w testach kanapkowych. W teście kanapkowym, analit stonowiący badaną próbkę jest wychwytywany przez pierwsze przeciwciało, które jest unieruchomione na stałym podłożu, a następnie wykrywany przez drugie przeciwciało, które również wiąże się z tym analitem, tworząc w ten sposób nierozpuszczalny 13

15 trzyczęściowy kompleks. Zob., np. dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr Drugie przeciwciało może być samo wyznakowane wykrywalnym ugrupowaniem (bezpośrednie testy kanapkowe) lub jego pomiar może odbywać się z użyciem przeciwciała anty-immunoglobulinowego, które jest wyznakowane wykrywalnym ugrupowaniem (pośredni test kanapkowy). Na przykład, jednym z rodzajów testów kanapkowych jest test ELISA, w którym to przypadku wykrywalnym ugrupowaniem jest enzym. [002] Swoiste wiązanie przeciwciał według niniejszego wynalazku można oznaczać dowolną metodą znaną ze stanu techniki. Do grupowania ze względu na epitop można stosować kompetycyjne testy wiązania w wielu różnych formatach. Do testów immunologicznych, które można stosować należą, ale nie ograniczają się one do wymienionych, systemy testów kompetycyjnych i niekompetycyjnych przy użyciu technik takich jak Western blot, testy radioimmunologiczne, ELISA (test immunoenzymatyczny), kanapkowe testy immunologiczne, testy immunoprecypitacyjne, reakcje z precypityną (reakcje precypitacji), reakcje z precypityną (reakcje precypitacji) z dyfuzją w żelu, testy immunodyfuzyjne, testy aglutynacyjne, testy unieruchomienia dopełniacza, testy immunoradiometryczne, fluorescencyjne testy immunologiczne, testy immunologiczne z białkiem A, wymieniając tylko kilka. Testy takie są rutynowe i dobrze znane w tej dziedzinie (zob. np. Ausubel i wsp., red., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, tom 1, John Wiley & Sons, Inc., Nowy Jork). Przykładowe testy immunologiczne opisano pokrótce poniżej (ale nie są one przedstawione z zamiarem ograniczenia wynalazku). Dodatkowo, można wykonać rutynowy test blokowania krzyżowego, taki jak opisany w: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow i David Lane (1988). [003] BIACORE (GE Healthcare, Piscataway, NJ) jest tylko jedną z różnego rodzaju form testów metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego, które stosuje się rutynowo do paneli sortów epitopów przeciwciał monoklonalnych. W wielu źródłach (np. The Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, tom 66, red. Glenn E. Morris Humana Press, 1996) opisano alternatywne metody, które można stosować do grupowania przeciwciał i można oczekiwać, że będą one dostarczały porównywalnych informacji dotyczących specyficzności wiązania przeciwciał z białkiem IL-21. Przy zastosowaniu systemu BIACORE, wykonuje się eksperymenty z grupowaniem ze względu na epitop z rozpuszczalnym, natywnym lub rekombinowanym antygenem. Badania z grupowaniem ze względu na epitop można prowadzić w systemie BIACORE00 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Do zaprogramowania uruchamianych metod można stosować oprogramowanie BIAlogue v Jako przykład zastosowania BIACORE do grupowania mysich przeciwciał monoklonalnych hodowanych przeciwko IL-21, kozie poliklonalne przeciwciało przeciwko mysiemu fragmentowi Fc IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) można kowalencyjnie unieruchomić na mikroukładzie (chipie) czujnikowym BIACORE CM i użyć do wiązania (wychwytywania) pierwszorzędowego przeciwciała monoklonalnego z badanej serii na mikroukładzie. Niezajęte miejsca wiązania Fc na mikroukładzie są następnie blokowane przy użyciu fragmentu Fc poliklonalnej IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Następnie wstrzykuje się białko IL-21 i umożliwia jego specyficzne wiązanie z wychwyconym pierwszorzędowym przeciwciałem monoklonalnym. Przyrząd BIACORE mierzy masę białka związanego z mikroukładem czujnikowym, 14

16 a związanie zarówno przeciwciała pierwszorzędowego jak i antygenu IL-21 można zweryfikować dla każdego cyklu. Po związaniu przeciwciała pierwszorzędowego i antygenu z mikroukładem, wstrzykuje się rozpuszczalne drugorzędowe przeciwciało i umożliwia się jego związanie z wcześniej związanym antygenem. Jeżeli drugorzędowe przeciwciało monoklonalne jest zdolne do wiązania antygenu IL-21 jednocześnie z pierwszorzędowym przeciwciałem monoklonalnym, wówczas jego wiązanie jest wykrywane przez BIACORE. Jeśli jednak drugorzędowe przeciwciało monoklonalne nie jest zdolne do wiązania antygenu IL-21 jednocześnie z pierwszorzędowym przeciwciałem monoklonalnym, nie jest wykrywane żadne dodatkowe wiązanie. Każde przeciwciało monoklonalne jest testowane wobec samego siebie jako kontrola negatywna, w celu określenia poziomu sygnału tła (bez żadnego wiązania). [004] Do grupowania przeciwciał można również stosować bezznacznikowy format kompetycyjnego testu ELISA (LFC-ELISA). Sposób ten został opisany przez Nagata i wsp., J. Immuno Methods 292:141-1, 04. Ta metoda grupowania ze względu na epitop wykorzystuje biotynylowaną IL-21. Jako przykład grupowania mysich przeciwciał monoklonalnych hodowanych przeciwko IL-21, płytki do mikromiareczkowania są opłaszczane w ilości 0 µl/dołek 1 µg/ml koziego swoistego przeciwciała przeciwko mysiemu fragmentowi Fc-γ IgG (Jackson ImmunoResearch) rozcieńczonego w ELISA B (PBS, 0,1% Tween, 1% BSA). Po związaniu tego opłaszczającego przeciwciała w ciągu 3 godzin w temperaturze otoczenia, każdą kondycjonowaną pożywkę zawierającą mab rozcieńcza się w ELISA B, otrzymując przybliżone stężenie mab wynoszące 0, µg/ml i umożliwia jego związanie z płytkami opłaszczonymi kozią anty-mysią IgG przez noc w temperaturze 4 C (mab nr 1). Równolegle, drugi zestaw kondycjonowanych pożywek (mab nr 2) rozcieńcza się w probówkach polistyrenowych do około 0, µg/ml mab w ELISA B, miesza z 0 ng/ml biotynylowanego antygenu IL-21 i inkubuje przez noc w temperaturze 4 C. Po inkubacji mab nr 1 z przeciwciałem opłaszczającym, płytki blokuje się niespokrewnionym przeciwciałem w celu wysycenia niezajętych miejsc wiązania na płytce. Do płytki dodaje się mieszaniny mab nr 2-biotyna-IL-21 i umożliwia wiązanie. Jako kontrolę (niekompetycyjną) w tym teście, dodaje się 0 ng/ml biotynylowanego IL-21 bezpośrednio (bez wstępnej inkubacji z mab nr 2) do dołków zawierających unieruchomione mab nr 1. Po inkubacji z kompleksem biotynylowana- IL-21-mAb nr 2, do płytek dodaje się streptawidynę-hrp (Pierce, Rockford, IL) w stężeniu 0, µg/ml. Płytki wywołuje się za pomocą substratu TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD), i mierzy się absorbancję poszczególnych dołków przy 40 nm za pomocą czytnika płytek (Molecular Devices SPECTRAMAX 340, Sunnyvale, CA). Jeżeli mab nr 1 wiąże się z innym epitopem niż mab nr 2, kompleks biotyna-il-21-mab nr 2 będzie wiązał się z płytką dając wysoki odczyt absorbancji. Jeżeli mab nr 1 wiąże się z tym samym epitopem co mab nr 2, kompleks biotyna-il-21-mab nr 2 nie będzie się wiązał z płytką dając w efekcie niski odczyt absorbancji. [00] Swoiste wobec liganda przeciwciała według niniejszego wynalazku, jak opisano w zastrzeżeniach, mogą po prostu wiązać się lub działać jako antagoniści IL-21. Niniejsze ujawnienie obejmuje przeciwciała które nie zakłócają oddziaływań receptor IL-21/ligand albo zakłócają oddziaływania receptor IL-21/ligand czy to częściowo, czy całkowicie. Wynalazek prezentuje przeciwciała specyficzne dla liganda, które zapobiegają aktywacji receptora. Wynalazek ten obejmuje przeciwciała neutralizujące, które wiążą ligand i zapobiegają wiązaniu liganda z receptorem, a także 1

17 przeciwciała, które wiążą ligand, zapobiegając tym samym aktywacji receptora, ale nie zapobiegają wiązaniu liganda z receptorem. Aktywację receptora (tj. sygnalizację) można określić za pomocą technik opisanych w niniejszym dokumencie lub skądinąd znanych ze stanu techniki. Na przykład, aktywację receptora można określić przez wykrywanie fosforylacji (np. tyrozyny lub seryny/treoniny) receptora lub jego substratu za pomocą immunoprecypitacji, a następnie analizy opartej o Western blot lub Luminex (na przykład, jak opisano powyżej). W określonych przykładach wykonania, przeciwciała hamują aktywność liganda lub receptora o co najmniej 90%, co najmniej 80%, co najmniej 70%, co najmniej 60% lub co najmniej 0% aktywności w nieobecności przeciwciała. Wytwarzanie przeciwciał anty-il-21 [006] Przeciwciała przeciwko IL-21 można otrzymywać stosując na przykład jako antygen białko, które jest produktem wektora ekspresyjnego dla IL-21, albo IL-21 wyizolowaną ze źródła naturalnego. Przeciwciała anty-il-21 według niniejszego wynalazku wiążą się swoiście z IL-21. Uważa się, że przeciwciała wiążą się swoiście, jeżeli przeciwciała te wykazują co najmniej jedną z następujących dwóch właściwości: (1) przeciwciała wiążą się z IL-21 na poziomie progowym aktywności wiązania, i (2) przeciwciała nie reagują krzyżowo w sposób znaczący z polipeptydami spokrewnionymi z IL-21. Pokrewne polipeptydy mogą obejmować tych spośród innych członków cytokin typu 1, które wiążą receptory zawierające wspólny łańcuch gamma (γc), takie jak IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 i IL-1. [007] W odniesieniu do pierwszej z cech, przeciwciała wiążą się swoiście, jeżeli wiążą się one z polipeptydem, peptydem lub epitopem IL-21 z powinowactwem wiązania znajdującym odzwierciedlenie w mierzonych stałych powinowactwa. W celu wyznaczenia charakterystyki powinowactwa, pomiary kinetycznych stałych szybkości, stałych równowagi reakcji asocjacji i stałe równowagi reakcji dysocjacji oceniono dla oddziaływania antagonistów IL-21 z antygenem IL-21 metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Stała szybkości asocjacji (k a (M -1 s -1 )) to wartość, która odzwierciedla szybkość tworzenia kompleksu antygen-antagonista. Stała szybkości dysocjacji (k d (s -1 )) to wartość, która odzwierciedla stabilność kompleksu. Równowagowe powinowactwo wiązania wyraża się zwykle jako albo stała równowagi dysocjacji (K D (M)), albo stała równowagi asocjacji (K A (M -1 )). K D otrzymuje się przez podzielenie stałej szybkości dysocjacji przez stałą szybkości asocjacji (k d /k a ), natomiast K A otrzymuje się przez podzielenie stałej szybkości asocjacji przez stałą szybkości dysocjacji (k a /k d ). Antagoniści o podobnej wartości K D (lub podobnej wartości K A ) mogą mieć zmieniające się w szerokim zakresie stałe szybkości asocjacji i dysocjacji. W konsekwencji, pomiar wartości k a i k d a także K A lub K D pomaga bardziej jednoznacznie opisać powinowactwo oddziaływania antagonista-antygen. Korzystne powinowactwo przeciwciała znajduje odzwierciedlenie w stałej K A (stałej równowagi reakcji asocjacji) wynoszącej 6 M -1 lub więcej, korzystnie 7 M -1 lub więcej, bardziej korzystnie 8 M -1 lub więcej, a najkorzystniej 9 M -1 lub więcej. Powinowactwo wiązania przeciwciała może być łatwo określone przez osobę o przeciętnych umiejętnościach w tej dziedzinie, na przykład za pomocą analizy Scatcharda (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 1:660, 1949), lub z wykorzystaniem dostępnego w handlu urządzenia z czujnikiem biologicznym. W odniesieniu do drugiej z cech, przeciwciała nie reagują krzyżowo w sposób znaczący z pokrewnymi cząsteczkami polipeptydów, jeżeli na przykład wykrywają one IL-21, ale nie wykrywają innych znanych polipeptydów przy zastosowaniu standardowej analizy Western blot lub 16

18 wychwytującego testu ELISA (capture ELISA). Przykłady znanych pokrewnych polipeptydów obejmują znanych członków rodziny IL-2, do której należy IL-21 (na przykład, 1L-2, IL-4, IL-7, IL- 9 i IL-1). [008] Monoklonalne przeciwciała anty-il-21 można wytwarzać stosując peptydy i polipeptydy niosące epitop antygenowy IL-21. Przeciwciała według niniejszego wynalazku wiążą peptydy i polipeptydy niosące epitop antygenowy zawierające sekwencję co najmniej dziewięciu, lub pomiędzy 1 a około aminokwasów zawartych w obrębie SEKW. NR:2 lub inną sekwencję aminokwasową ujawnioną w niniejszym dokumencie. Jednakże, peptydy lub polipeptydy zawierające większą część sekwencji aminokwasowej zawierającej od do 0 aminokwasów, lub dowolną długość do i włącznie z całą sekwencją aminokwasową polipeptydu są również przydatne do indukowania przeciwciał, które wiążą się z IL-21. Pożądane jest, aby sekwencja aminokwasowa peptydu niosącego epitop była wybrana tak, aby zapewnić istotną rozpuszczalność w rozpuszczalnikach wodnych (tj. sekwencja zawiera relatywnie hydrofilowe reszty, podczas gdy reszty hydrofobowe są zwykle pominięte). Ponadto, sekwencje aminokwasowe zawierające reszty proliny mogą być także pożądane dla produkcji przeciwciał na dużą skalę. [009] Monoklonalne przeciwciała anty-il-21 można otrzymywać sposobami znanymi osobom biegłym w dziedzinie wynalazku. Przeciwciała monoklonalne gryzoni wobec specyficznych antygenów można uzyskać znanymi sposobami (zob. na przykład, Kohler i wsp., Nature 26:49 (197), Coligan i wsp. (red.), Current Protocols in Immunology, tom 1, strony (John Wiley & Sons 1991) [ Coligan ], Picksley i wsp., Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli, w: DNA Cloning 2: Expression Systems, wydanie 2, Glover i wsp. (red.), strona 93 (Oxford University Press 199)). [0060] Przeciwciała według wynalazku mogą być wytwarzane dowolną znaną ze stanu techniki metodą syntezy przeciwciał, w szczególności, za pomocą syntezy chemicznej lub korzystnie, technikami ekspresji rekombinacyjnej. Ekspresja rekombinacyjna przeciwciała według wynalazku, lub jego fragmentu, pochodnej lub analogu, np. łańcucha ciężkiego lub lekkiego przeciwciała według wynalazku, wymaga konstrukcji wektora ekspresyjnego zawierającego polinukleotyd kodujący to przeciwciało. Po otrzymaniu polinukleotydu kodującego cząsteczkę przeciwciała albo łańcuch ciężki lub lekki przeciwciała, lub jego część (korzystnie zawierającą domenę zmienną łańcucha ciężkiego lub lekkiego), według wynalazku, można uzyskać wektor do wytwarzania cząsteczki przeciwciała za pomocą technologii rekombinowanego DNA, z wykorzystaniem technik dobrze znanych w tej dziedzinie. Zatem, w niniejszym dokumencie opisano sposoby wytwarzania białka przez ekspresję polinukleotydu zawierającego sekwencję nukleotydową kodującą przeciwciało. Można zastosować sposoby, które są dobrze znane osobom biegłym w dziedzinie wynalazku, do konstrukcji wektorów ekspresyjnych zawierających sekwencje kodujące przeciwciało i odpowiednie sygnały kontroli transkrypcji i translacji. Metody te obejmują, na przykład, techniki rekombinacji DNA in vitro, techniki syntezy i rekombinacji genetycznej in vivo. W niniejszym opisie przedstawiono wektory zdolne do replikacji, zawierające sekwencję nukleotydową kodującą cząsteczkę przeciwciała według wynalazku, albo jej łańcuch ciężki lub lekki, albo domenę zmienną łańcucha ciężkiego lub lekkiego, funkcjonalnie połączoną z promotorem. Wektory takie mogą zawierać sekwencję nukleotydową kodującą region stały cząsteczki przeciwciała (zob. np. publikacja PCT WO 86/0807; publikacja PCT WO 89/036; i 17

19 dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr ), a domena zmienna przeciwciała może być sklonowana do takiego wektora do ekspresji całego łańcucha ciężkiego lub lekkiego. [0061] Wektor ekspresyjny przenosi się do komórki gospodarza za pomocą tradycyjnych technik i transfekowane komórki hoduje się następnie stosując tradycyjne techniki w celu wytworzenia przeciwciała według wynalazku. Tak więc, w niniejszym opisie przedstawiono komórki gospodarza zawierające polinukleotyd kodujący przeciwciało według wynalazku, albo jego łańcuch ciężki lub lekki, połączony funkcjonalnie z heterologicznym promotorem. W korzystnych przykładach wykonania, w celu wyrażania przeciwciał o podwójnym łańcuchu, wektory kodujące oba łańcuchy, lekki i ciężki, mogą ulegać jednoczesnemu wyrażaniu w komórce gospodarza w celu wyrażania całej cząsteczki immunoglobuliny, jak opisano szczegółowo poniżej. [0062] Można wykorzystać szereg systemów gospodarz-wektor ekspresyjny w celu wyrażania cząsteczek przeciwciał według wynalazku. Takie systemy gospodarz-wektor ekspresyjny reprezentują nośniki, dzięki którym można wytwarzać a następnie oczyszczać interesujące sekwencje kodujące, ale także reprezentują komórki, w których może, gdy są one transformowane lub transfekowane odpowiednimi kodującymi sekwencjami nukleotydowymi, zachodzić wyrażanie cząsteczki przeciwciała według wynalazku in situ. Zaliczają się do nich, ale nie ograniczają się one do wymienionych, mikroorganizmy takie jak bakterie (np. E. coli, B. subtilis) transformowane rekombinowanymi wektorami ekspresyjnymi stanowiącymi DNA bakteriofaga, DNA plazmidowe lub DNA kosmidowe, zawierającymi sekwencje kodujące przeciwciało; drożdże (np. Saccharomyces, Pichia) transformowane rekombinowanymi drożdżowymi wektorami ekspresyjnymi zawierającymi sekwencje kodujące przeciwciało; owadzie systemy komórkowe zainfekowane rekombinowanymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (np. bakulowirusa) zawierającymi sekwencje kodujące przeciwciało; roślinne systemy komórkowe zainfekowane rekombinowanymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (np. wirusa mozaiki kalafiora, CaMV; wirusa mozaiki tytoniu, TMV) lub transformowane rekombinowanymi plazmidowymi wektorami ekspresyjnymi (np. plazmid Ti) zawierającymi sekwencje kodujące przeciwciało; lub ssacze systemy komórkowe (np. komórki COS, CHO, BHK, 293, 3T3) niosące rekombinowane konstrukty ekspresyjne zawierające promotory wyprowadzone z genomu komórek ssaczych (np. promotor genu metalotioneiny) lub z wirusów ssaczych (np. MPSV, CMV, późny promotor adenowirusa; promotor 7,K wirusa krowianki). Korzystnie, komórki bakteryjne takie jak Escherichia coli, a bardziej korzystnie, komórki eukariotyczne, zwłaszcza w celu ekspresji całej cząsteczki rekombinowanego przeciwciała, stosuje się do ekspresji cząsteczki rekombinowanego przeciwciała. Na przykład, komórki ssacze, takie jak komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), w połączeniu z wektorem takim jak element promotora głównego pośredniego genu wczesnego ludzkiego cytomegalowirusa, wzmacniacz CMV lub promotor MPSV stanowi skuteczny układ ekspresyjny dla przeciwciał (Foecking i wsp., 1986, Gene 4:1; Cockett i wsp., 1990, Bio/Technology 8:2). [0063] W systemach bakteryjnych, można korzystnie wybrać szereg wektorów ekspresyjnych w zależności od przeznaczenia uzyskiwanej w wyniku wyrażania cząsteczki przeciwciała. Na przykład, kiedy ma zostać uzyskana duża ilość takiego białka do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych z cząsteczki przeciwciała, mogą być pożądane wektory kierujące ekspresją wysokich poziomów 18

20 produktów białek fuzyjnych, które są łatwe do oczyszczania. Do wektorów takich należą, ale nie ograniczają się one do wymienionych, wektor ekspresyjny dla E. coli pur278 (Ruther i wsp., 1983, EMBO J. 2:1791), w którym sekwencja kodująca przeciwciało może być poddana indywidualnie lizie do wektora w ramce z regionem kodującym lacz, dzięki czemu wytwarzane jest białko fuzyjne; wektory pin (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:31-39, 198; Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:03-09, 1989); i tym podobne. Można stosować również wektory pgex do ekspresji obcych polipeptydów w postaci białek fuzyjnych z S-transferazą glutationową (GST). Ogólnie, takie białka fuzyjne są rozpuszczalne i mogą zostać łatwo oczyszczone ze zlizowanych komórek przez adsorpcję i związanie z matrycą glutation-kulki z agarozą, a następnie wymywanie w obecności wolnego glutationu. Wektory pgex projektuje się tak, aby zawierały miejsca cięcia dla trombiny lub proteazy czynnika Xa, dzięki czemu produkt docelowy sklonowanego genu można uwolnić od ugrupowania GST. [0064] W systemie owadzim, Autographa califomica, jako wektor do ekspresji obcych genów stosowany jest wirus poliedrozy jądrowej (AcNPV). Wirus rozwija się w komórkach Spodoptera frugiperda. Sekwencja kodująca przeciwciało może być sklonowana indywidualnie do nieistotnych regionów (na przykład genu poliedryny) wirusa i umieszczona pod kontrolą promotora AcNPV (na przykład promotora poliedryny). [006] W ssaczych komórkach gospodarza można wykorzystać szereg systemów ekspresyjnych opartych na wirusach. W przypadkach, w których jako wektor ekspresyjny stosowany jest adenowirus, sekwencja kodująca interesujące przeciwciało może być zligowana z kompleksem kontrolnym transkrypcji/translacji adenowirusa, np. późnego promotora i trzyczęściowej sekwencji liderowej. Ten chimeryczny gen można następnie wstawić do genomu adenowirusa za pomocą rekombinacji in vitro lub in vivo. W wyniku wprowadzenia insercji w regionie genomu wirusowego nieistotnym dla wirusa (np., regionie E1 lub E3) powstanie zrekombinowany wirus, który jest żywotny i zdolny do wyrażania cząsteczki przeciwciała w zainfekowanych gospodarzach (np. zob. Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3-39, 1984). Do wydajnej translacji wprowadzonych sekwencji kodujących przeciwciało mogą być także wymagane specyficzne sygnały inicjacyjne. Sygnały te obejmują kodon inicjacji ATG i sekwencje przylegające. Ponadto, kodon inicjacji musi być w fazie z ramką odczytu pożądanej sekwencji kodującej dla zapewnienia translacji całej wstawki. Te egzogenne sygnały kontroli translacji i kodony inicjacji mogą mieć rózne pochodzenie, zarówno naturalne jak i syntetyczne. Wydajność ekspresji moża poprawić przez włączenie odpowiednich elementów wzmacniających transkrypcję, terminatorów transkrypcji itd. (zob. Bittner i wsp., Methods in Enzymol. 13:1-44, 1987). [0066] Dodatkowo, można wybrać szczep komórek gospodarza, który moduluje ekspresję wprowadzonych sekwencji lub modyfikuje i przetwarza produkt ekspresji genu w specyficzny pożądany sposób. Takie modyfikacje (np. glikozylacja) i przetwarzanie (np. cięcie) produktów białkowych mogą być ważne dla funkcji białka. Różne komórki gospodarzy posiadają charakterystyczne i specyficzne mechanizmy potranslacyjnej obróbki i modyfikacji białek i produktów ekspresji genów. Można wybrać odpowiednie linie komórkowe lub systemy gospodarzy dla zapewnienia poprawnej modyfikacji i przetwarzania obcego białka uzyskanego w wyniku ekspresji. W 19

21 tym celu można wykorzystać eukariotyczne komórki gospodarza, które posiadają maszynierię komórkową do prawidłowej obróbki pierwotnego transkryptu, glikozylacji i fosforylacji produktu genu. Takie ssacze komórki gospodarzy obejmują, ale nie ograniczają się one do wymienionych, CHO, VERO, BHK, HeIa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, a w szczególności, linie komórek raka piersi, takie jak na przykład BT483, Hs78T, HTB2, BT i T47D, oraz linie normalnych komórek gruczołu sutkowego, takie jak na przykład, CRL70 i Hs78Bst. [0067] Dla długoterminowej, wydajnej produkcji rekombinowanych białek, korzystne jest stabilne wyrażanie. Na przykład, można zaprojektować linie komórkowe, które wykazują stabilne wyrażanie cząsteczki przeciwciała. Zamiast stosowania wektorów ekspresyjnych zawierających wirusowe miejsca początku replikacji, komórki gospodarza można transformować DNA kontrolowanym przez odpowiednie elementy kontroli ekspresji (np. promotor, wzmacniacz, sekwencje, terminatory transkrypcji, miejsca poliadenylacji itd.) oraz marker selekcyjny. Po wprowadzeniu obcego DNA, zmodyfikowane genetycznie komórki można hodować przez 1-2 dni we wzbogaconej pożywce, a następnie przenieść do pożywki selekcyjnej. Marker selekcyjny w rekombinowanym plazmidzie nadaje odporność na selekcję (czynnik selekcyjny) i umożliwia komórkom stabilną integrację plazmidu do ich chromosomów oraz wzrost z utworzeniem ognisk, które z kolei można klonować i namnażać w linie komórkowe. Sposób ten można korzystnie stosować do projektowania linii komórkowych wykazujących ekspresję cząsteczki przeciwciała. Takie modyfikowane genetycznie linie komórkowe mogą być szczególnie przydatne w przeszukiwaniu i ocenie związków, które oddziałują bezpośrednio lub pośrednio z cząsteczką przeciwciała. [0068] Można stosować szereg systemów selekcji, w tym, między innymi, można wykorzystać geny kinazy tymidynowej wirusa opryszczki pospolitej (Wigler i wsp., Cell 11:223, 1977), fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej (Szybalska i Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2, 1992), i fosforybozylotransferazy adeninowej (Lowy i wsp., Cell 22:817, 1980) odpowiednio w komórkach tk-, hgprt- lub aprt-. Ponadto, jako podstawę selekcji można wykorzystać oporność na antymetabolity nadawaną przez następujące geny: dhfr, który nadaje oporność na metotreksat (Wigler i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:37, 1980; O Hare i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:127, 1981); gpt, który nadaje oporność na kwas mykofenolowy (Mulligan i Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:72, 1981); neo, który nadaje oporność na aminoglikozyd G-418 (Wu i Wu, Biotherapy 3:87-9, 1991; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:73-96, 1993; Mulligan, Science 260: , 1993; oraz Morgan i Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: , 1993; TIB TECH 11():1-21), maj 1993; oraz hygro, który nadaje oporność na higromycynę (Santerre i wsp., Gene :147, 1984). Sposoby powszechnie znane w dziedzinie techniki rekombinowanego DNA, które można zastosować, opisano w Ausubel i wsp. (red.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; oraz w rozdziałach 12 i 13, Dracopoli i wsp. (red.), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapin i wsp., J. Mol. Biol. :1, [0069] Poziomy wyrażania cząsteczek przeciwciała można zwiększać przez amplifikację wektora (zob. praca przeglądowa Bebbington i Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, tom 3. (Academic Press, Nowy Jork,

22 )). Kiedy marker w systemie wektorowym wykazującym wyrażanie przeciwciała może ulegać amplifikacji, zwiększenie poziomu inhibitora obecnego w hodowli komórki gospodarza będzie powodowało wzrost liczby kopii genu markerowego. Ponieważ amplifikowany region jest związany z genem przeciwciała, produkcja przeciwciała także wzrośnie (Crouse i wsp., Mol. Cell. Biol. 3:27, 1983). [0070] Komórka gospodarza może być kotransfekowana dwoma wektorami ekspresyjnymi, pierwszym wektorem kodującym polipeptyd pochodzący z łańcucha ciężkiego i drugim wektorem kodującym polipeptyd pochodzący z łańcucha lekkiego. Te dwa wektory mogą zawierać identyczne markery selekcyjne, które umożliwiają równe wyrażanie polipeptydów łańcucha ciężkiego i lekkiego. Alternatywnie, można wykorzystać pojedynczy wektor, który koduje oba polipeptydy łańcucha ciężkiego i lekkiego. W takich sytuacjach, łańcuch lekki powinien być umieszczony przed łańcuchem ciężkim, aby uniknąć nadmiaru toksycznego wolnego łańcucha ciężkiego (Proudfoot, Nature 322:2, 1986; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197, 1980). Sekwencje kodujące dla łańcuchów ciężkiego i lekkiego mogą zawierać cdna lub DNA genomowe. [0071] Po uzyskaniu wyrażanej rekombinacyjnie cząsteczki przeciwciała według wynalazku, jak określono w zastrzeżeniach, może być ona oczyszczona dowolną znaną ze stanu techniki metodą oczyszczania cząsteczki immunoglobuliny, na przykład, za pomocą chromatografii (np. jonowymiennej, powinowactwa, w szczególności powinowactwa do swoistego antygenu po oczyszczaniu na białku A i chromatografii z kolumną rozdzielającą według wielkości), wirowania, zróżnicowania rozpuszczalności, lub dowolną inną standardową techniką oczyszczania białek. [0072] W szczególnych zastosowaniach, pożądane może być przygotowanie fragmentów przeciwciał anty-il-21. Takie fragmenty przeciwciał można otrzymać, na przykład, za pomocą hydrolizy proteolitycznej przeciwciała. Fragmenty przeciwciał można otrzymać przez trawienie pepsyną lub papainą całych przeciwciał tradycyjnymi sposobami. Dla zilustrowania, fragmenty przeciwciał można uzyskać przez rozszczepienie enzymatyczne przeciwciał pepsyną w celu uzyskania fragmentu S, oznaczonego jako F(ab )2. Fragment ten może być dalej rozszczepiony za pomocą tiolowego środka redukującego z uzyskaniem monowalentnych fragmentów 3.S Fab. Opcjonalnie, reakcję rozszczepienia można prowadzić z zastosowaniem grupy blokującej dla grup sulfhydrylowych, które powstają w wyniku rozszczepienia wiązań dwusiarczkowych. Alternatywnie, w wyniku rozszczepienia enzymatycznego przy użyciu pepsyny uzyskuje się bezpośrednio dwa monowalentne fragmenty Fab i fragment Fc. Sposoby te zostały opisane, na przykład, przez Miltona Goldenberga, patent Stanów Zjednoczonych nr , Nisonoff i wsp., Arch Biochem. Biophys. 89:2, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 199; Edelman i wsp., w: Methods in Enzymology tom 1, strona 422 (Academic Press 1967), oraz przez Coligan na stronach i [0073] Można stosować również inne metody cięcia przeciwciał, takie jak rozdzielanie łańcuchów ciężkich w celu utworzenia monowalentnych fragmentów łańcucha lekkiego-ciężkiego, dalsze rozszczepienie fragmentów lub inne techniki enzymatyczne, chemiczne lub genetyczne, o ile tylko fragmenty te będą wiązały się z antygenem, który jest rozpoznawany przez nienaruszone przeciwciało. 21

23 [0074] Na przykład, fragmenty Fv obejmują zasocjowane łańcuchy VH i VL. Asocjacja ta może być niekowalencyjna, jak opisano przez Inbar i wsp., Proc. Nat l Acad. Sci. USA 69:269, Alternatywnie, łańcuchy zmienne mogą być połączone międzycząsteczkowym wiązaniem dwusiarczkowym lub usieciowane za pomocą substancji chemicznych, takich jak aldehyd glutarowy (zob. na przykład, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992). [007] Fragmenty Fv mogą obejmować łańcuchy VH i VL połączone za pomocą łącznika peptydowego. Te jednołańcuchowe białka wiążące antygen (scfv) wytwarza się przez skonstruowanie genu strukturalnego zawierającego sekwencje DNA kodujące domeny VH i VL połączone oligonukleotydem. Gen strukturalny wprowadza się do wektora ekspresyjnego, który wprowadza się następnie do komórki gospodarza, takiej jak E. coli. Rekombinowane komórki gospodarza syntezują pojedynczy łańcuch polipeptydowy z łącznikiem peptydowym łączącym te dwie domeny V. Sposoby wytwarzania białek scfv zostały opisane, na przykład, przez Whitlow i wsp., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 (1991) (zob. również, Bird i wsp., Science 242:423, 1988, Ladner i wsp., dokument patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4,946,778, Pack i wsp. Bio/Technology 11:1271, 1993 oraz Sandhu, powyżej). [0076] Jest również możliwe skonstruowanie alternatywnych regionów zrębowych przy użyciu kolekcji białek monomerowych z utworzeniem domeny monomerowej. Takie domeny monomerowe mogą być na tyle małe, aby wnikać do tkanek. Domeny monomerowe mogą stanowić domeny występujące naturalnie lub warianty niewystępujące w naturze bądź ich kombinacje. Domeny monomerowe mogą tworzyć multimery z dwóch lub większej liczby domen. Domena monomerowa wiąże pewną pozycję, analogicznie do opisanych tu epitopów, na cząsteczce docelowej. W niektórych przypadkach może być utworzony multimer z różnego rodzaju domen monomerowych. (Zob., np. zgłoszenie patentowe St. Zjedn. Ameryki i zgłoszenie patentowe St. Zjedn. Ameryki ) [0077] Przeciwciała według niniejszego wynalazku, jak opisano w zastrzeżeniach, obejmują pochodne, które są zmodyfikowane, tj. przez kowalencyjne przyłączenie do przeciwciała dowolnego rodzaju cząsteczki w taki sposób, że kowalencyjne przyłączenie nie uniemożliwia przeciwciału wiązania IL-21 lub blokowania aktywacji receptora. Na przykład, ale nie z zamiarem ograniczenia wynalazku, pochodne przeciwciała obejmują przeciwciała, które zostały zmodyfikowane, np. przez glikozylację, acetylowanie, pegylację, fosforylację, amidowanie, tworzenie pochodnej za pomocą znanych grup zabezpieczających/blokujących, cięcie proteolityczne, łączenie z ligandem komórkowym lub innym białkiem, itd. Można przeprowadzać dowolną z wielu modyfikacji chemicznych znanymi technikami, w tym, ale nie wyłącznie, przez specyficzne cięcie chemiczne, acetylowanie, formylowanie, syntezę metaboliczną tunikamycyny, itd. Dodatkowo, pochodna może zawierać jeden lub większą liczbę aminokwasów nieklasycznych. [0078] Przeciwciało anty-il-21 może być skoniugowane z wykrywalnym znacznikiem z utworzeniem immunokoniugatu anty-il-21. Do odpowiednich wykrywalnych znaczników należą, na przykład, radioizotop, znacznik fluorescencyjny, znacznik chemiluminescencyjny, znacznik enzymatyczny, znacznik bioluminescencyjny lub złoto koloidalne. Sposoby wytwarzania i wykrywania takich znakowanych w sposób możliwy do wykrycia immunokoniugatów są dobrze znane osobom o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie i zostały opisane bardziej szczegółowo poniżej. 22

24 Wykrywalny znacznik może stanowić radioizotop wykrywany za pomocą autoradiografii. Izotopami szczególnie przydatnymi dla celów niniejszego wynalazku są 3 H, 12 I, 131 I, 3 S i 14 C. [0079] Immunokoniugaty anty-il-21 można także znakować związkiem fluorescencyjnym. Obecność przeciwciała znakowanego fluorescencyjnie stwierdza się przez ekspozycję immunokoniugatu na światło o odpowiedniej długości fali i wykrycie powstałej fluorescencji. Związki do znakowania fluorescencyjnego obejmują izotiocyjanian fluoresceiny, rodaminę, fikoerytrynę, fikocyjaninę, allofikocyjaninę, aldehyd o-ftalowy, barwniki Alexa (Fluor), nanocząstki fluorescencyjne (np. kropki kwantowe) i fluoreskaminę. [0080] Możliwe jest także, że immunokoniugaty anty-il-21 będą znakowane w sposób możliwy do wykrycia przez sprzęganie komponentu stanowiącego przeciwciało ze związkiem chemiluminescencyjnym. Obecność wyznakowanego chemiluminescencyjnie immunokoniugatu stwierdza się przez wykrywanie obecności luminescencji, która powstaje w trakcie przebiegu reakcji chemicznej. Przykłady związków do znakowania chemiluminescencyjnego obejmują luminol, izoluminol, aromatyczny ester akrydynowy, imidazol, sól akrydynową i ester szczawianowy. [0081] Podobnie, związek bioluminescencyjny można użyć do wyznakowania immunokoniugatów anty-il-21. Bioluminescencja jest rodzajem chemiluminescencji spotykanej w układach biologicznych, w której białko katalityczne zwiększa wydajność reakcji chemiluminescencji. Obecność białka bioluminescencyjnego stwierdza się przez wykrywanie obecności luminescencji. Związki bioluminescencyjne, które są przydatne do znakowania, obejmują lucyferynę, lucyferazę i akworynę. [0082] Alternatywnie, immunokoniugaty anty-il-21 mogą być znakowane w sposób możliwy do wykrycia przez połączenie komponentu stanowiącego przeciwciało anty-il-21 z enzymem. Gdy koniugat anty-il-21-enzym jest inkubowany w obecności odpowiedniego substratu, ugrupowanie enzymu reaguje z substratem z wytworzeniem ugrupowania chemicznego, które można wykryć, na przykład, metodami spektrofotometrycznymi, fluorometrycznymi lub wizualnymi. Przykłady enzymów, które można wykorzystać do znakowania w sposób możliwy do wykrycia wieloswoistych immunokoniugatów obejmują β-galaktozydazę, oksydazę glukozową, peroksydazę i fosfatazę alkaliczną. [0083] Osoby biegłe w dziedzienie wynalazku będą znały inne odpowiednie znaczniki, które można wykorzystać w niniejszym wynalazku. Wiązanie ugrupowań znacznikowych z przeciwciałami anty-il- 21 można osiągnąć stosując standardowe techniki znane w dziedzinie wynalazku. Typowa metodologia w tym zakresie została opisana przez następujących autorów: Kennedy i wsp., Clin. Chim. Acta 70:1, 1976; Schurs i wsp., Clin. Chim. Acta 81:1, 1977; Shih i wsp., Int l J. Cancer 46:11, 1990; Stein i wsp., Cancer Res. 0:13, 1990; oraz Coligan, powyżej. [0084] Ponadto, wygodę i uniwersalność detekcji immunochemicznej można zwiększyć stosując przeciwciała anty-il-21, które skoniugowano z awidyną, streptawidyną i biotyną (zob. na przykład, Wilchek i wsp. (red.), Avidin-Biotin Technology, Methods In Enzymology, tom 184 (Academic Press 1990), oraz Bayer i wsp., Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology, w: Methods In Molecular Biology, tom, Manson (red.), strony (The Humana Press, Inc. 1992). [008] Sposoby wykonywania testów immunologicznych są dobrze ugruntowane. Zob., na przykład, Cook i Self, Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays, w: Monoclonal Antibodies: 23

25 Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (red.), strony 180-8, (Cambridge University Press, 199), Perry, The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology, w: Monoclonal Antibodies: Principles and Applications. Birch and Lennox (red.), strony 7-1 (Wiley-Liss, Inc. 199), oraz Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996). [0086] Przeciwciała lub ich fragmenty o wydłużonych okresach półtrwania in vivo można wytwarzać za pomocą technik znanych specjalistom w dziedzinie. Na przykład, przeciwciała lub ich fragmenty o wydłużonych okresach półtrwania in vivo można wytwarzać przez modyfikację (np. podstawienie, delecję lub addycję) reszt aminokwasowych zidentyfikowanych jako zaangażowane w oddziaływanie pomiędzy domeną Fc a receptorem FcRn (zob. np. International Publication Nos. WO 97/34631 and WO 02/060919). Przeciwciała lub ich fragmenty o wydłużonych okresach półtrwania in vivo można wytwarzać przez przyłączenie do wspomnianych przeciwciał lub fragmentów przeciwciał cząsteczek polimerów, takich jak glikol poliletylenowy (PEG) o wysokiej masie cząsteczkowej. PEG można przyłączyć do wspomnianych przeciwciał lub fragmentów przeciwciał wraz z albo bez wielofunkcyjnego łącznika albo przez miejscowo-specyficzną koniugację cząsteczki PEG, na przykład, do N- lub C-końca wspomnianych przeciwciał lub fragmentów przeciwciał, albo przez grupy epsilonaminowe obecne na resztach lizyny. Wykorzystywane będzie otrzymywanie pochodnych polimerowych liniowych lub rozgałęzionych, w wyniku którego dochodzi do minimalnej utraty aktywności biologicznej. Stopień skoniugowania będzie ściśle monitorowany za pomocą SDS-PAGE i spektrometrii mas celem zapewnienia prawidłowej koniugacji cząsteczek PEG z przeciwciałami. Nieprzereagowane cząsteczki PEG można oddzielić od koniugatów przeciwciało-peg, np. za pomocą chromatografii wykluczania przestrzennego lub chromatografii jonowymiennej. Kompozycje farmaceutyczne [0087] W niniejszym opisie przedstawiono kompozycje farmaceutyczne zawierające dopuszczalny farmaceutycznie nośnik oraz polipeptyd lub przeciwciało opisane w niniejszym dokumencie. Kompozycja farmaceutyczna może zawierać dodatkowe środki terapeutyczne, w tym, ale nie wyłącznie, środki cytotoksyczne, cytotoksynę, np. środek cytostatyczny lub cytobójczy, środek terapeutyczny lub radioaktywny jon metalu. Cytotoksyna lub środek cytotoksyczny obejmuje dowolny czynnik, który jest szkodliwy dla komórek. Do przykładów należą paklitaksel, cytochalazyna B, gramicydyna D, bromek etydyny, emetyna, mitomycyna, etopozyd, tenopozyd, winkrystyna, winblastyna, kolchicyna, doksorubicyna, daunorubicyna, dihydroksyantracenodion, mitoksantron, mitramycyna, aktynomycyna D, 1-dehydrotestosteron, glukokortykoidy, prokaina, tetrakaina, lidokaina, propranolol i puromycyna oraz ich analogi lub homologi. Środki terapeutyczne obejmują, ale nie ograniczają się one do wymienionych, antymetabolity (np. metotreksat, 6-merkaptopurynę, 6- tioguaninę, cytarabinę, -fluorouracyl, dekarbazynę), środki alkilujące (np. mechloretaminę, tiotepę, chlorambucyl, melfalan, karmustynę (BSNU) i lomustynę (CCNU), cyklofosfamid, busulfan, dibromomannitol, streptozotocynę, mitomycynę C i cis-dichlorodiamino-platynę (II) (DDP cisplatyna), antracykliny (e.g., daunorubicynę (wcześniej daunomycyna) i doksorubicynę), antybiotyki (np. daktynomycynę (wczześniej aktynomycyna), bleomycynę, mitramycynę i antramycynę (AMC)), oraz środki antymitotyczne (np. winkrystynę i winblastynę). Na przykład, kompozycja farmaceutyczna może 24

26 zawierać białko lub polipeptyd posiadające pożądaną aktywność biologiczną. Białka takie mogą obejmować, na przykład, toksynę taką jak abryna, rycyna A, egzotoksyna z Pseudomonas lub toksyna błonicza; białko takie jak czynnik martwicy nowotworu, α-ifn, β-ifn, czynnik wzrostu nerwów, płytkopochodny czynnik wzrostu, tkankowy aktywator plazminogenu, środek zakrzepowy lub środek antyangiogenny, np. angiostatynę lub endostatynę; albo modyfikatory odpowiedzi biologicznej, takie jak na przykład, limfokiny, interleukina-1 (IL-1), interleukina-2 (IL-2), interleukina-6 (IL-6), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF), przeciwciała zaprojektowane do antagonizowania modyfikatorów odpowiedzi biologicznej, inne przeciwciała, inne białka fuzyjne Fc lub inne czynniki wzrostu. [0088] Dla celów terapii, cząsteczki przeciwciała anty-il-21 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik podaje się pacjentowi w ilości skutecznej terapeutycznie. Kombinację cząsteczki terapeutycznej według niniejszego wynalazku i dopuszczalnego farmaceutycznie nośnika określa się jako podawaną w ilości skutecznej terapeutycznie, jeżeli podawana ilość jest istotna fizjologicznie. Środek jest istotny fizjologicznie, jeżeli jego obecność daje w efekcie wykrywalną zmianę w fizjologii pacjenta przyjmującego ten środek. Na przykład, środek stosowany w terapii zapalenia jest istotny fizjologicznie, jeżeli jego obecność łagodzi odpowiedź zapalną. [0089] Mikrosfery z polimerów ulegajacych degradacji zaprojektowano w celu utrzymania wysokich poziomów ogólnoustrojowych białek terapeutycznych. Mikrosfery wytwarza się z ulegających degradacji polimerów, takich jak poli(laktydo-ko-glikolid) (PLG), polibezwodniki, poli (orto estry), nieulegające biodegradacji polimery octanu etylowinylu, w których białka są uwięzione w polimerze (Gombotz i Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332, 199; Ranade, Role of Polymers in Drug Delivery, w: Drug Delivery Systems, Ranade i Hollinger (red.), strony 1-93 (CRC Press 199); Roskos i Maskiewicz, Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery, w: Protein Delivery: Physical Systems, Sanders i Hendren (red.), strony 4-92 (Plenum Press 1997); Bartus i wsp., Science 281:1161, 1998; Putney i Burke, Nature Biotechnology 16:13, 1998; Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:48, 1998). Nanosfery powlekane glikolem polietylenowym (PEG) może również stanowić nośniki do podawania dożylnego białek terapeutycznych (zob. na przykład, Gref i wsp., Pharm. Biotechnol. :167, 1997). [0090] Osoby biegłe w dziedzinie wynalazku mogą wskazać inne postacie dawkowania, jak przedstawione, na przykład, przez Ansel i Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, wydanie (Lea & Febiger 1990), Gennaro (red.), Remington s Pharmaceutical Sciences, wydanie 19 (Mack Publishing Company 199), oraz przez Ranade i Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996). [0091] Kompozycje farmaceutyczne można dostarczać w postaci zestawu zawierającego pojemnik, w którym znajduje się przeciwciało neutralizujące anty-il-21. Polipeptydy terapeutyczne można stosować w postaci roztworu do wstrzyknięć, w pojedynczej lub wielokrotnych dawkach, lub w postaci jałowego proszku, który zostanie odtworzony przed iniekcją. Alternatywnie, zestaw taki może zawierać dyspergator suchego proszku, generator płynnego aerozolu lub nebulizator do podawania polipeptydu terapeutycznego. Zestaw taki może zawierać ponadto pisemną informację dotyczącą wskazań i stosowania kompozycji farmaceutycznej. 2

27 1 2 3 [0092] Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciała anty-il-21 może być dostarczona w postaci ciekłej, w postaci aerozolu lub w postaci stałej. Przykładami postaci ciekłych są roztwory do wstrzykiwań, aerozole, kropelki, roztwory do stosowania miejscowego i zawiesiny doustne. Do przykładowych postaci stałych należą kapsułki, tabletki i postacie o kontrolowanym uwalnianiu. Tę ostatnią postać można zilustrować przy pomocy minipomp osmotycznych i implantów (Bremer i wsp., Pharm. Biotechnol. :239,1997; Ranade, Implants in Drug Delivery, w: Drug Delivery Systems, Ranade i Hollinger (red.), strony (CRC Press 199); Bremer i wsp., Protein Delivery with Infusion Pumps, w: Protein Delivery: Physical Systems, Sanders i Hendren (red.), strony (Plenum Press 1997); Yewey i wsp., Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant, w: Protein Delivery: Physical Systems, Sanders i Hendren (red.), strony (Plenum Press 1997)). Inne stałe postacie obejmują kremy, pasty, inne postacie do stosowania miejscowego i tym podobne. Zastosowania terapeutyczne przeciwciał anty-il-21 [0093] IL-21 jest cytokiną pochodzącą z populacji CD4 + limfocytów T, ważną dla optymalnej odpowiedzi odpornościowej z udziałem populacji CD8 + limfocytów T, aktywacji komórek NK i optymalnych odpowiedzi humoralnych, takich jak wytwarzanie przeciwciał i dojrzewanie limfocytów B. Pokazano, że IL-21 indukuje szereg prozapalnych chemokin i cytokin, takich jak IL-18, IL-1, IL-, IL- 6, IL-7A, IL-17F, TNFRII, scd2 i RANTES. IL-21 indukuje także odpowiedź ostrej fazy u naczelnych innych niż człowiek i u ludzi po podaniu w iniekcji IV lub SC (Dodds i wsp., Cancer Immunol Immunother 17 października 08 [publikacja elektroniczna]). In vitro, stymuluje wzrost pewnych populacji komórek nowotworowych układu odpornościowego, takich jak komórki szpiczaka mnogiego i komórki ostrej białaczki limfoblastycznej T-komórkowej (Brenne i wsp. Blood 99(): (02), dicarlo E, i wsp. Cancer Immunol Immunother 6(9): (07)). IL-21 jest także produkowana przez komórki Reed-Sternberga w chłoniaku Hodgkina (Lamprecht i wsp., Blood 112(8): , 08). Wykazano zwiększoe wyrażanie receptora IL-21 w naskórku u pacjentów z twardziną układową (Distler i wsp., Arthritis & Rheumatism 2:86-864, 04) i fibroblastach błony maziowej w reumatoidalnym zapaleniu stawów (Jungel i wsp., Arthritis & Rheumatism 0: , 04). Ponadto, u autoimmunologicznych myszy cukrzycowych NOD następuje zwiększone wyrażanie receptora IL-21 (King i wsp., Cell 117:26-277, 04.) Wykazano, że wyrażanie IgG i IL-21 ulega zwiększeniu w modelu na myszach BXSB-Yaa, u których rozwija się choroba autoimmunologiczna zbliżona do tocznia rumieniowatego (Ozaki i wsp., J. Immunol. 173: , 04); wyrażanie IL-21 jest wyższe u myszy sanroque podatnych na tocznia (Vinuesa i wsp. Nature 43:42, 0); wyrażanie IL-21 jest wyższe w tkankach jelita objętych procesem zapalnym w porównaniu z tkankami, w których nie występuje proces zapalny, od pacjentów z chorobą Crohna (Monteleone, i wsp., Gastroenterology 128: , 0). Nadprodukcja IL-21 występuje także w błonie śluzowej pacjentów z chorobą trzewną (celiakią) (Finn i wsp. Gut, PMID: , 07). [0094] Skuteczna terapeutycznie ilość przeciwciała anty-il-21 odnosi się do ilości przeciwciała, która po podaniu pacjentowi jest skuteczna w zapobieganiu, opóźnianiu, redukowaniu lub hamiowaniu objawu lub aktywności biologicznej związanej z chorobą lub zaburzeniem. Podawanie może składać 26

28 1 2 3 się z pojedynczej dawki lub dawek wielokrotnych i może być stosowane w kombinacji z innymi kompozycjami farmaceutycznymi. [009] Przedmiotem niniejszego wynalazku są kompozycje i zastosowanie przeciwciał monoklonalnych anty-il-21 w leczeniu chorób lub stanów zapalnych i immunologicznych, takich jak łuszczyca, zapalenie trzustki, cukrzyca typu I (IDDM), choroba Gravesa-Basedowa, nieswoiste zapalenie jelit (IBD), choroba Crohna, wrzodziejące zapalenie jelita grubego, zespół jelita drażliwego, stwardnienie rozsiane, reumatoidalne zapalenie stawów, odczynowe zapalenie stawów, enteropatyczne zapalenie stawów, spondyloartropatia, autoimmunologiczne zapalenie mięśnia sercowego, choroba Kawasakiego, choroba trzewna (celiakia), zapalenie błony naczyniowej, choroba Behçeta, choroba wieńcowa, przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), śródmiąższowa choroba płuc, choroba zapalna mięśni (miopatia zapalna) (zapalenie wielomięśniowe, zapalenie skórnomięśniowe), mikroskopowe zapalenie naczyń, autoimmunologiczna niedokrwistość aplastyczna, autoimmunologiczne zapalenie tarczycy, autoimmunologiczne zapalenie wątroby, zespół (ziarniniakowatość) Wegenera, uchyłkowatość, toczeń rumieniowaty układowy, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, sklerodermia, twardzina układowa, łuszczycowe zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, atopowe zapalenie skóry, bielactwo nabyte, choroba przeszczep przeciw gospodarzowi (GVHD), chłoniak skórny T-komórkowy (CTCL), zespół Sjögrena, kłębuszkowe zapalenie nerek, nefropatia IgA, autoimmunologiczne zapalenie nerek, pęcherzyca zwykła, miastenia, utrata słuchu na tle autoimmunologicznym, zapalenie rdzenia i nerwów wzrokowych, zespół Goodpasture'a, krioglobulinemia, zespół Guillaina-Barrégo, przewlekła zapalna polineuropatia demielinizacyjna (CIDP), autoimmunologiczna niedokrwistość hemolityczna, idiopatyczna plamica małopłytkowa (ITP), odrzucenie przeszczepu, wysoko zimmunizowani pacjenci po przeszczepie, zespół antyfosfolipidowy, alergia i astma, oraz inne choroby autoimmunologiczne. W niniejszym opisie przedstawiono kompozycje i zastosowania przeciwciał monoklonalnych anty-il-21 w leczeniu pewnych nowotworów z komórek układu odpornościowego takich jak szpiczak mnogi, ostra białaczka limfoblastyczna T-komórkowa lub chłoniak Hodgkina. Kontaktowe zapalenie skóry [0096] Alergiczne kontaktowe zapalenie skóry definiuje się jako reakcję immunologiczną na antygen wchodzący w kontakt ze skórą, w której pośredniczą limfocyty T. Uważa się, że populacja CLA+ limfocytów T jest zaangażowana w inicjację zapalenia skóry, ponieważ zależne od alergenu odpowiedzi limfocytów T ograniczają się w większości do populacji CLA+ komórek (Zob. Santamaria- Babi i wsp., J Exp Med 181:193, (199)). Według ostatnich danych odkryto, że jedynie limfocyty T pamięci (CD4RO+) CD4+ CLA+, a nie CD8+, ulegają proliferacji i wytwarzają oba rodzaje cytokin typu 1 (IFN-γ) i typu 2 (IL-) w odpowiedzi na nikiel, częsty alergen nadwrażliwości kontaktowej. Ponadto, liczba komórek wyrażających CLA w kombinacji z CD4, CD4RO (komórkami pamięci) lub CD69 ulega zwiększeniu po stymulacji specyficznej dla niklu i wykazują one ekspresję receptorów chemokin CXCR3, CCR4, CCR, ale nie CCR6. Zob. Moed i wsp., Br J Dermatol 1:32, (04). [0097] W modelach zwierzęcych wykazano, że alergiczne kontaktowe zapalenie skóry jest zależne od limfocytów T i że reagujące na alergeny limfocyty T migrują do miejsca podania alergenu. Zob. 27

29 1 2 3 ogólnie: Engeman, i wsp., J Immunol 164:7, (00); Ferguson i Kupper, J Immunol :1172, (1993); oraz Gorbachev i Fairchild, Crit Rev Immunol. 21:41(01). [0098] Podanie przeciwciał anty-il-21 myszom w modelach nadwrażliwości kontaktaktowej stosuje się do oceny możliwości zastosowania klinicznego przeciwciał anty-il-21 do łagodzenia objawów i modyfikacji przebiegu choroby. Atopowe zapalenie skóry [0099] Atopowe zapalenie skóry (AD) jest to przewlekła nawracająca choroba zapalna skóry o dramatycznie rosnącej częstości występowania w ciągu ostatnich dekad. Klinicznie AD charakteryzuje się silnie swędzącymi, często z występującym otarciem naskórka, wykwitami i grudkami, które wykazują przewlekły nawrotowy przebieg. Diagnoza AD opiera się najczęściej na istotnych i mniej istotnych wynikach klinicznych. Zob. Hanifin J.M., Arch Dermatol 13:11 (1999). Obraz histopatologiczny ujawnia stan gąbczasty (międzykomórkowy obrzęk naskórka), hiperparakeratozę i ogniskową parakeratozę w ostrych zmianach chorobowych, podczas gdy wyraźny rozrost naskórka z hiperparakeratozą i parakeratozą, akantozą/hipergranulozą i okołonaczyniowymi naciekami limfocytarnymi skóry właściwej oraz obficie występujące komórki tuczne są oznakami przewlekłych zmian chorobowych. [00] Limfocyty T odgrywają główną rolę w inicjacji miejscowych odpowiedzi immunologicznych w tkankach, a dowody sugerują, że naciekające skórę limfocyty T mogą, w szczególności, odgrywać kluczową rolę w inicjacji i podtrzymywaniu rozregulowanych odpowiedzi immunologicznych w skórze. W przybliżeniu w 90% naciekających limfocytów T w miejscach skóry, w których występuje proces zapalny, następuje wyrażanie skórnego antygenu związanego z limfocytami, który wiąże selektynę E, indukowalną cząsteczkę adhezji na śródbłonku (przegląd w: Santamaria-Babi, i wsp., Eur J Dermatol 14:13, (04)). Udokumentowano znaczący wzrost populacji CLA+ krążących limfocytów T wśród pacjentów z AD w porównaniu z osobnikami grupy kontrolnej (Zob. Teraki, i wsp., Br J Dermatol 143:373 (00), podczas gdy inni autorzy wykazali, że populacja CLA+ limfocytów T pamięci od pacjentów z AD odpowiada wybiórczo na wyciąg alergenu w porównaniu z populacją CLA- (Zob. Santamaria-Babi, L.F., i wsp., J Exp Med.181:193, (199)). U ludzi, patogenezę atopowych zaburzeń skóry łączono ze wzrostem populacji CLA+ limfocytów T, które wyrażają cytokiny typu Th-2 takie jak IL- i IL-13, na podwyższonym poziomie. Zob. Akdis i wsp., Eur J Immunol :333 (00); oraz Hamid i wsp., J Allergy Clin Immunol 98: 22 (1996). [01] U myszy NC/Nga rozwijają się spontanicznie zmiany chorobowe zbliżone do AD, które w wielu aspektach przypominają ludzkie AD, włączając w to przebieg kliniczny i objawy, obraz histopatologiczny i obraz immunopatologiczny, gdy hodowane są one w nieokreślonych, wolnych od patogenu (nie-spf) warunkach, w około 6-8 tygodniu życia. W przeciwieństwie do tego, u myszy NC/Nga utrzymywanych w warunkach SPF nie rozwijają się zmiany chorobowe skóry. Jednakże, pojawienie się spontanicznych zmian chorobowych skóry i drapania można zsynchronizować u myszy NC/Nga hodowanych w warunkach SPF przez cotygodniowe śródskórne wstrzykiwanie surowego antygenu roztoczy kurzu. Zob. Matsuoka i wsp., Allergy 8:139 (03). Zatem, rozwój AD u myszy NC/Nga stanowi użyteczny model do oceny nowych środków terapeutycznych do leczenia AD. 28

30 [02] Dodatkowo oprócz modelu NC/Nga spontanicznego AD, uczulanie myszy przez podanie na skórę OVA można również wykorzystać jako model indukowania zależnego od antygenu pogrubienia naskórka i skóry właściwej z naciekiem z komórek jednojądrzastych w skórze uczulonych myszy. Zbiega się to zwykle w czasie z podniesieniem poziomów całkowitych i swoistych IgE w surowicy, jednakże w modelu tym nie pojawia się normalnie dysfunkcja bariery skóry lub świąd. Zob. Spergel i wsp., J Clin Invest, 1:1614, (1998). Protokół ten można zmodyfikować w celu indukowania dysregulacji bariery skóry i świądu przez uczulanie myszy transgenicznych DO11. OVA TCR za pomocą OVA. Zwiększenie liczby swoistych wobec antygenu limfocytów T, które mogłyby rozpoznać antygen uczulający, może zwiększyć poziom stanu zapalnego w skórze w celu wywołania widocznego drapania i lichenifikacji/łuszczenia skóry. [03] Podawanie przeciwciał anty-1l-21 myszom w modelach atopowego zapalenia skóry stosuje się do oceny możliwości zastosowania klinicznego przeciwciał anty-il-21 do łagodzenia objawów i modyfikacji przebiegu choroby. Zapalenie stawów [04] Zapalenie stawów, w tym zapalenie kości i stawów, reumatoidalne zapalenie stawów, pourazowe zapalenie stawów i tym podobne, są częstymi stanami zapalnymi, w których można by odnieść korzyści z zastosowania terapeutycznego przeciwciał o właściwościach przeciwzapalnych i polipeptydów wiążących. Na przykład, reumatoidalne zapalenie stawów (RA) jest chorobą ogólnoustrojową, która wpływa na cały organizm i jest jedną z najczęstszych postaci zapalenia stawów. Charakteryzuje się ona stanem zapalnym błony wyściełającej staw, powodującym ból, sztywność, uczucie gorąca, zaczerwienienie i obrzęk. Komórki zapalne uwalniają enzymy, które mogą trawić kość i tkankę chrzęstną. W wyniku reumatoidalnego zapalenia stawów, objęta procesem zapalnym wyściółka stawu, błona maziowa, może wnikać i uszkadzać kość i tkankę chrzęstną prowadząc, oprócz innych efektów fizjologicznych, do osłabienie stawu i silnego bólu. Zajęty staw może utracić swój kształt i dopasowanie, co powoduje ból i utratę ruchomości. Reumatoidalne zapalenie stawów [0] Reumatoidalne zapalenie stawów (RA) to choroba o podłożu immunologicznym charakteryzująca się w szczególności stanem zapalnym i następczym uszkodzeniem tkanki prowadzącym do ciężkiej niepełnosprawności i zwiększonej umieralności. Rozmaite cytokiny wytwarzane są miejscowo, w stawach dotkniętych chorobą. Liczne badania wykazały, że w mechanizmach zaangażowanych w zapalenie błony maziowej i w postępujące niszczenie stawu ważną rolę odgrywają dwie prototypowe cytokiny prozapalne, IL-1 i TNF-alfa. Istotnie, podanie inhibitorów TNF-alfa i IL-1 pacjentom z RA prowadziło do radykalnej poprawy klinicznych i biologicznych objawów stanu zapalnego i zmniejszenia radiologicznych oznak erozji kości i zniszczenia tkanki chrzęstnej. Jednakże, pomimo tych zachęcających wyników, znaczący odsetek pacjentów nie reagował na te środki, co sugeruje, że inne mediatory są również zaangażowane w patofizjologię zapalenia stawów (Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2):13-149, 02). [06] W dziedzinie, znanych jest kilka modeli zwierzęcych reumatoidalnego zapalenia stawów. Na przykład, w modelu zapalenia stawów indukowanego kolagenem (CIA), u myszy rozwija się przewlekłe zapalenie stawów, które bardzo przypomina ludzkie reumatoidalne zapalenie stawów. 29

31 Ponieważ CIA charakteryzuje się podobnymi cechami immunologicznymi i patologicznymi co RA, stanowi ono idealny model do poszukiwania potencjalnych ludzkich związków przeciwzapalnych. Model CIA jest dobrze znanym modelem u myszy, którego wystąpienie zależy zarówno od odpowiedzi immunologicznej jak i odpowiedzi zapalnej. Odpowiedź immunologiczna obejmuje oddziaływanie limfocytów B i populacji CD4+ limfocytów T w odpowiedzi na kolagen, który podaje się jako antygen, i prowadzi do wytwarzania przeciwciał przeciwko kolagenowi. Faza zapalna jest wynikiem tkankowych odpowiedzi mediatorów stanu zapalnego, w konsekwencji reakcji krzyżowej niektórych z tych przeciwciał z natywnym kolagenem myszy i aktywacji kaskady dopełniacza. Zaletą stosowania modelu CIA jest to, że znane są podstawowe mechanizmy patogenezy. Zidentyfikowano odpowiednie epitopy limfocytów T i limfocytów B na kolagenie typu II i określono różne parametry immunologiczne (np. nadwrażliwość typu późnego i przeciwciało przeciwko kolagenowi) i zapalne (np. cytokiny, chemokiny i enzymy degradujące macierz) związane z zapaleniem stawów o podłożu immunologicznym, i mogą być więc użyte do oceny skuteczności badanego związku w modelu CIA (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-, 1999; Williams i wsp., Immunol. 89: , 1992; Myers i wsp., Life Sci. 61: , 1997; oraz Wang i wsp., Immunol. 92:89-99, 199). [07] Podawanie przeciwciał anty-il-21 tymże myszom w modelu CIA służy do oceny stosowania przeciwciał anty-il-21 do łagodzenia objawów i modyfikacji przebiegu choroby. Nieswoiste zapalenie jelit (IBD) [08] W Stanach Zjednoczonych w przybliżeniu osób cierpi z powodu nieswoistego zapalenia jelit (IBD) które może dotyczyć albo okrężnicy i odbytnicy (wrzodziejące zapalenie jelita grubego), albo zarówno jelita cienkiego jak i grubego (choroba Crohna). Patogeneza tych chorób jest niejasna, ale wiążą się one z przewlekłym stanem zapalnym dotkniętych tkanek. Wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) to choroba zapalna jelita grubego, określanego zwykle jako okrężnica, charakteryzująca się stanem zapalnym i owrzodzeniem błony śluzowej lub najbardziej wewnętrznej wyściółki okrężnicy. Zapalenie to powoduje częste opróżnianie okrężnicy, co prowadzi do biegunki. Objawy obejmują rozluźnienie stolca i związane z tym skurcze w jamie brzusznej, gorączkę i utratę wagi. Chociaż dokładna przyczyna UC jest nieznana, ostatnie badania sugerują, że naturalne siły obronne organizmu skierowane są przeciwko białkom w organizmie, które układy odpornościowe traktują jako nie będące własnymi ( reakcja autoimmunologiczna ). Być może, ponieważ przypominają one białka bakteryjne w jelicie, białka te mogą pobudzać lub stymulować proces zapalny, który zaczyna niszczyć wyściółkę okrężnicy. Gdy wyściółka okrężnicy zostaje zniszczona, tworzą się wrzody uwalniające śluz, ropę i krew. Choroba zazwyczaj rozpoczyna się w obszarze odbytniczym i może w końcu rozwinąć się w całym jelicie grubym. Nawracające epizody stanu zapalnego prowadzą do pogrubienia ścianki jelita i odbytnicy z powstaniem blizny. W przypadku nasilonej choroby może nastąpić martwica tkanki okrężnicy lub sepsa. Objawy wrzodziejącego zapalenia jelita grubego różnią się stopniem nasilenia, a ich pojawienie się może być stopniowe lub nagłe. Ataki mogą być prowokowane wieloma czynnikami, w tym zakażeniami dróg oddechowych lub stresem. [09] Chociaż obecnie nie ma dostępnego leku na UC, leczenie skupia się na hamowaniu nieprawidłowego procesu zapalnego w wyściółce okrężnicy. Sposoby terapii obejmujące

32 1 2 3 kortykosteroidy, immunosupresanty (np. azatiopryna, merkaptopuryna i metotreksat) i aminosalicylany są dostępne w leczeniu choroby. Jednakże długoterminowe stosowanie immunosupresantów, takich jak kortykosteroidy i azatiopryna, może wywoływać poważne działania niepożądane, w tym zrzeszotnienie kości, zaćmy, zakażenia oraz wpływać na wątrobę i szpik kostny. U pacjentów, u których stosowane obecnie terapie nie są skuteczne, opcję stanowi zabieg chirurgiczny. Jednakże, zabieg chirurgiczny polega na usunięciu całej okrężnicy i odbytnicy. [01] Istnieje kilka modeli zwierzęcych, które mogą częściowo naśladować przewlekłe wrzodziejące zapalenie jelita grubego. Najszerzej stosowanym modelem jest model zapalenia jelita grubego indukowanego kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym/etanolem (TNBS), który indukuje przewlekły stan zapalny i owrzodzenie okrężnicy. TNBS wprowadzony do okrężnicy podatnej myszy przez wkraplanie wewnątrzodbytnicze indukuje odpowiedź odpornościową z udziałem limfocytów T w błonie śluzowej okrężnicy, prowadzącą w tym przypadku do ciężkiego zapalenia błony śluzowej charakteryzującego się gęstym naciekiem limfocytów T i makrofagów w obrębie całej ściany jelita grubego. Ponadto, temu obrazowi histopatologicznemu towarzyszy obraz kliniczny postępującej utraty wagi (chudnięcia), krwawej biegunki, wypadania odbytnicy i pogrubienia ściany jelita grubego (Neurath i wsp. Intern. Rev. Immunol. 19:1-62, 00). Adoptywny transfer dziewiczych limfocytów T do myszy z drobnym niedopasowaniem zgodności tkankowej lub myszy syngenicznych z obniżoną odpornością prowadzi do rozwoju zapalenia jelita grubego (Leach MW i wsp. 1996, Powrie F i wsp., 1997) a także zmian skórnych przypominających łuszczycę (Schon MP i wsp., Nat Med. 2:183-8, 1997; Davenport CM i wsp., Int Immunopharmacol. :63-72, 02). Transplantacja jedynie 0,2 miliona limfocytów T CD4+CD2- z myszy BALB/C lub B.D2 do myszy C.B-17 SCID o obniżonej odporności prowadzi do utraty wagi, dodatniego wyniku badania na krew utajoną w kale i rozwoju zmian skórnych. Objawy u tych myszy różnią się w zależności od kolonii. Ten model zapalenia jelita grubego/łuszczycy wykazuje pewne podobieństwa do ludzkiej choroby Crohna i łuszczycy, i był szeroko stosowany do badania skuteczności środków terapeutycznych na te choroby u ludzi. [0111] W innym modelu zapalenia jelita grubego stosuje się sól sodową siarczanu dekstranu (DSS), która indukuje ostre zapalenie jelita grubego manifestujące się krwawą biegunką, utratą wagi, skróceniem okrężnicy i owrzodzeniem błony śluzowej z naciekiem neutrofilów. Zapalenie jelita grubego indukowane przez DSS charakteryzuje się histologicznie naciekiem komórek zapalnych do blaszki właściwej, z hiperplazją limfatyczną, ogniskowym uszkodzeniem krypt i owrzodzeniem nabłonka. Uważa się, że zmiany te rozwijają się ze względu na toksyczne działanie DSS na nabłonek i na drodze fagocytozy komórek blaszki właściwej i wytwarzania TNF-alfa i IFN-gamma. Pomimo jego powszechnego stosowania, kilka kwestii dotyczących mechanizmów choroby indukowanej przez DSS i jej znaczenia dla choroby u ludzi pozostaje nierozwiązanych. DSS jest uważany za model niezależny od limfocytów T, ponieważ jest on obserwowany u zwierząt z niedoborem limfocytów T, takich jak myszy SCID. [0112] Podawanie przeciwciał anty-il-21 w tych modelach TNBS, DSS lub z transferem populacji CD4+ limfocytów T można stosować do oceny zastosowania antagonistów IL-21 w łagodzeniu objawów i modyfikacji przebiegu choroby przewodu pokarmowego. IL-21 może odgrywać rolę w 31

33 odpowiedzi zapalnej w zapaleniu jelita grubego, a neutralizacja aktywności IL-21 przez podawanie antagonistów IL-21 stanowi potencjalne podejście terapeutyczne do IBD. Łuszczyca [0113] Łuszczyca jest przewlekłym schorzeniem skóry, które dotyczy ponad siedmiu milionów Amerykanów. Łuszczyca pojawia się, kiedy nowe komórki skóry rosną nieprawidłowo, co powoduje powstawanie zapalnych, opuchniętych i łuskowatych plam na skórze, w których następują zmiany w końcowym różnicowaniu keratynocytów. Łuszczyca zwykła (plackowata), najczęstsza postać, charakteryzuje się zapalnymi plamami na skórze ( zmianami chorobowymi ) pokrytymi srebrzystobiałymi łuskami. Łuszczyca może być ograniczona do kilku placków lub obejmować umiarkowane do rozległych obszarów skóry, występując najczęściej na skórze głowy, kolanach, łokciach i tułowiu. Chociaż jest ona bardzo widoczna, łuszczyca nie jest chorobą zakaźną. Patogeneza tych chorób obejmuje aktywację limfocytów T, zmienioną prezentację antygenu i wytwarzanie cytokin przez zapalne komórki dendrytyczne oraz przewlekły stan zapalny dotkniętych tkanek. Przeciwciała anty-il- 21 według niniejszego wynalazku mogą służyć jako wartościowy środek terapeutyczny w celu ograniczenia stanu zapalnego i efektów patologicznych w łuszczycy, innych zapalnych chorobach skóry, alergiach skórnych i błon śluzowych oraz chorobach pokrewnych. [0114] Łuszczyca jest zaburzeniem zapalnym skóry, w których pośredniczą limfocyty T, które może powodować znaczny dyskomfort. Jest to choroba, na którą nie ma lekarstwa i która dotyka ludzi w każdym wieku. Łuszczyca dotyczy około dwóch procent populacji w Europie i Ameryce Północnej. Chociaż osoby z łagodną postacią łuszczycy mogą często kontrolować swoją chorobę za pomocą środków stosowanych miejscowo, ponad milion pacjentów na całym świecie wymaga terapii promieniowaniem ultrafioletowym lub ogólnoustrojowej terapii immunosupresyjnej. Niestety, niedogodności i ryzyko jakie niesie promieniowanie ultrafioletowe oraz toksyczność wielu terapii ogranicza ich długoterminowe stosowanie. Ponadto, u pacjentów występuje zazwyczaj nawrót łuszczycy, a w niektórych przypadkach efekt odbicia, krótko po zaprzestaniu terapii immunosupresyjnej. Przeciwciała anty-il-21 można testować wykorzystując opracowany niedawno model łuszczycy oparty na modelu przeniesienia CD4+CD4RB (Davenport i wsp., Internat. Immunopharmacol., 2:63-672, 02). [011] Dodatkowo, oprócz innych modeli choroby opisanych w niniejszym dokumencie, aktywność przeciwciał anty-il-21 wobec tkanki zapalnej pochodzącej z ludzkich zmian łuszczycowych można mierzyć in vivo stosując mysi model SCID (ang. severe combined immune deficient). Opracowano kilka modeli mysich, w których do organizmu myszy z niedoborem odporności wprowadzono komórki ludzkie lub przeszczepy tkanki (określane wspólnie jako modele ksenogeniczne); zob. na przykład, Cattan i Douglas, Leuk. Res. 18:13-22, 1994 i Flavell, Hematological Oncology 14:67-82, W ksenogenicznym modelu in vivo łuszczycy, ludzką skórną tkankę łuszczycową przeszczepia się do myszy SCID, a myszy poddaje się następnie prowokacji odpowiednim antagonistą. Ponadto, do oceny antagonistów IL-21 można wykorzystać inne modele zwierzęce łuszczycy znane w tej dziedzinie, takie jak przeszczepy ludzkiej skóry z łuszczycą wprowadzone do myszy w modelu AGR129, i poddane prowokacji odpowiednim antagonistą (np. zob. Boyman i wsp., J. Exp. Med. Publikacja on-line , 04). Podobnie, tkanki lub komórki pochodzące z ludzkiego zapalenia jelita grubego, IBD, 32

34 zapalenia stawów lub innych zmian chorobowych o charakterze zapalnym można stosować w modelu SCID do oceny właściwości przeciwzapalnych przeciwciał anty-il-21 opisanych w niniejszym dokumencie. [0116] Skuteczność terapii mierzy się i ocenia statystycznie jako wzrost efektu przeciwzapalnego w czasie w obrębie leczonej populacji, za pomocą metod dobrze znanych w tej dziedzinie. Niektóre przykładowe metody obejmują, ale nie ograniczają się one do wymienionych, pomiar, na przykład w modelu łuszczycy, grubości naskórka, liczby komórek zapalnych w górnej warstwie skóry właściwej oraz stopnia zaawansowania parakeratozy. Tego typu metody są znane w dziedzinie wynalazku i zostały opisane w niniejszym dokumencie. Na przykład, zob. Zeigler i wsp., Lab Invest 81:123, 01; Zollner i wsp., J. Clin. Invert. 9:671, 02; Yamanaka i wsp., Microbiol. Immunol. 4:07, 01; Raychaudhuri i wsp., Br. J. Dermatol. 144:931, 01; Boehncke i wsp., Arch. Dermatol. Res. 291:4, 1999; Boehncke i wsp., J. Invest. Dermatol. 116:96, 01; Nickoloff i wsp., Am. J. Pathol. 146:80, 199; Boehncke i wsp., J. Cutan. Pathol. 24:1, 1997; Sugai i wsp., J. Dermatol. Sci. 17:8, 1998; oraz Villadsen i wsp., J. Clin. Invest. 112:171, 03. Zapalenie można też monitorować w czasie stosując dobrze znane metody, takie jak cytometria przepływowa (lub PCR) w celu ilościowej oceny liczby komórek zapalnych lub chorobowo zmienionych obecnych w próbce, parametrów IBD (utrata wagi, biegunka, krwawienie z odbytu, długość okrężnicy), parametrów choroby w obrębie łapy i parametrów stanu zapalnego w modelu CIA RA. [0117] Podawanie przeciwciał anty-il-21 myszom w tym modelu łuszczycy stosuje się do oceny możliwości zastosowania przeciwciał anty-il-21 do łagodzenia objawów i modyfikacji przebiegu choroby. Toczeń rumieniowaty układowy [0118] Toczeń rumieniowaty układowy (SLE) jest zaburzeniem związanym z kompleksem immunologicznym, charakteryzującym się przewlekłą produkcją przeciwciał IgG skierowanych na powszechnie występujące własne antygeny (np. anty-dsdna). Efekty SLE są raczej ogólnoustrojowe, niż ograniczone do konkretnego narządu, chociaż w pewnych przypadkach może on prowadzić do kłębuszkowego zapalenia nerek (tj. nefropatii toczniowej). Wiele loci chromosomalnych jest łączonych z tą chorobą i mogą one mieć wpływ na różne aspekty choroby, takie jak przeciwciała anty-dsdna i kłębuszkowe zapalenie nerek. Wykazano, że populacja CD4+ limfocytów T odgrywa aktywną rolę w mysich modelach SLE (Horwitz, Lupus :319-3, 01; Yellin i Thienel, Curr. Rheumatol. Rep., 2:24-37, 00). Rola populacji CD8+ limfocytów T nie jest jasno zdefiniowana, ale istnieją dowody sugerujące, że funkcja supresorowa populacji CD8+ limfocytów T jest upośledzona u pacjentów z toczniem (Filaci i wsp., J. Immunol., 166: , 01; Sakane i wsp., J. Immunol., 137: , 1986). [0119] W sposób przekonujący wykazano, że IL-21 indukuje różnicowanie dziewiczych ludzkich limfocytów B w wydzielające przeciwciała komórki osocza (Ozaki i wsp., J. Immunol. 173:361, 04; Ettinger i wsp., J Immunol. 17: , 0; Ettinger i wsp., J Immunol. 178: , 07; Kuchen i wsp. J Immunol. 179:886-96, 07). Ozaki i wsp., (J. Immunol. 173:361, 04) również wykazali, że wyrażanie IL-21 jest podwyższone u podatnych na toczeń myszy BXSB-Yaa, organizmie modelowym dla SLE, w wieku, w którym wczesna charakterystyka procesów autoimmunologicznych 33

35 staje się po raz pierwszy widoczna. Leczenie tych myszy BXSB-Yaa przy użyciu mysiego antagonisty IL-21 częściowo hamuje różne parametry choroby, w tym kłębuszkowe zapalenie nerek (Bubier i wsp., Ann N Y Acad Sci. 11:90-601, 07). Wykazano również, że ten sam antagonista IL-21 jest skuteczny w innym przedklinicznym modelu choroby SLE, u myszy MRL/lpr (Herber i wsp. J. Immunol. 178: , 07). Ponadto, ponieważ IL-21 ogranicza rozwój komórek Treg, podawanie przeciwciał anty-il-21 może zapewnić bardziej odporną na zakłócenia funkcję tłumienia limfocytów T u pacjentów z toczniem, u których funkcja ta jest upośledzona (Lamprecht i wsp. Blood. 112(8): , 08). [01] Dane uzyskane u 24 pacjentów z SLE i 1 zdrowych pacjentów kontrolnych pokazały, że 1) ekspresja mrna IL-21 jest znacznie podwyższona w populacji CD4+ limfocytów T od pacjentów z toczniem w porównaniu z kontrolą, 2) poziomy IL-21 są znacząco podwyższone w surowicy od pacjentów z czynną chorobą w porównaniu z pacjentami z nieaktywnym SLE lub pacjentami kontrolnymi, co określono stosując handlowy zestaw ELISA do oznaczania IL-21 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 3) IL-21 wzmaga proliferację populacji CD4+ limfocytów T i populacji CD19+ limfocytów B u pacjentów i pacjentów kontrolnych w sposób zależny od dawki, 4) IL-21 wzmaga indukowane przez anty-cd40 różnicowanie komórek osocza u normalnych pacjentów kontrolnych i pacjentów z SLE, oraz ) podwyższone poziomy IL-21 mogą przyczyniać się do proliferacji autoreaktywnych limfocytów T CD4+ i różnicowania komórek osocza w SLE ( (Rus, V., prezentacja ACR nr 1760, spotkanie American College of Rheumatology 08, października 08). [0121] Przeciwciała anty-il-21 można podawać w kombinacji z innymi środkami stosowanymi już w zaburzeniach autoimmunologicznych, włączając w to modulatory układu odpornościowego takie jak IFNγ, NOVANTRONE, ENBREL, BETAFERON, REMICADE, LEUKINE i PROLEUKIN. Przeciwciała anty-il-21 można podawać w kombinacji z innymi środkami stosowanymi już w terapii nowotworowej szpiczaka mnogiego, chłoniaka Hodgkina lub ostrej białaczki limfoblastycznej T- komórkowej takimi jak THALOMID lub ze steroidami, takimi jak deksametazon lub prednizon. Ustalenie optymalnego poziomu dawki i schematu podawania przeciwciał anty-il-21 realizuje się na szereg sposobów, w tym przez zbadanie farmakokinetyki i farmakodynamiki przeciwciał anty-1l-21; wyznaczenie skutecznych dawek w modelach zwierzęcych i ocenę toksyczności przeciwciał anty-il- 21. Można wykorzystać bezpośrednie pomiary farmakokinetyczne prowadzone u naczelnych i badania kliniczne w celu przewidywania teoretycznych dawek u pacjentów, które pozwalają osiągnąć poziomy przeciwciała anty-il-21 w osoczu o wystarczającej wielkości i czasie trwania dla uzyskania odpowiedzi biologicznej u pacjentów. Odrzucenie przeszczepu [0122] U biorców przeszczepionych narządów litych może rozwinąć się ostre lub przewlekłe odrzucanie alloprzeszczepu z powodu niedopasowania układu zgodności tkankowej. Wytwarzanie przeciwciał skierowanych przeciwko cząsteczkom HLA (alloprzeciwciał) u tych pacjentów wynika z prezentacji obcego antygenu limfocytom T. Alloprzeciwciała mogą pośredniczyć w uszkodzeniu tkanki w przeszczepie przez tworzenie kompleksów immunologicznych, unieruchomienie dopełniacza i cytotoksyczność komórkową z udziałem przeciwciał kierowaną przez związane alloprzeciwciała. Kaskada dopełniacza uwalnia także lokalne czynniki, które aktywują komórki śródbłonka i powodują 34

36 waskulopatię (naczyniopatię) w obrębie przeszczepu. Produkt dopełniacza C4d stanowi wczesny marker zarówno w ostrym jak i przewlekłym odrzuceniu przeszczepu, i może być wykryty w przypadkach subklinicznych przed wystąpieniem jawnych zmian patologicznych (Racusen i Haas, Clin J Am Soc Nephrol 1: 41-4, 06; Moll i Pascual, Am J Transplantation : , 0; Tinkam i Chandraker, Clin J Am Soc Nephrol 1: , 06). Pacjenci poddawani są analizie przesiewowej pod kątem alloprzeciwciał anty-hla (wykrywanie panelu reaktywnych przeciwciał) przed przeszczepem. Pacjenci mogą być wysoko zimmunizowani wskutek wcześniejszego odrzucenia alloprzeszczepu, transfuzji krwi lub ciąż mnogich. Obecność alloprzeciwciał u wysoko zimmunizowanych pacjentów transplantacyjnych komplikuje opiekę nad nimi, ponieważ może być konieczne intensywne leczenie immunosupresyjne, a ryzyko ostrego odrzucenia jest wysokie (Baid i wsp., Curr Opin Immunol 13:77-81, 01). W niektórych przypadkach, stosuje się środki nacelowane na limfocyty B (kwas mykofenolowy lub rituksymab), chociaż ta strategia terapeutyczna nie jest bezpośrednio nacelowana na komórki osocza wydzielające przeciwciała. Stosuje się również plazmaferezę w celu ograniczenia ilości krążących immunoglobulin. W każdym przypadku, biorcom przeszczepu podaje się środki immunosupresyjne nacelowane na limfocyty T w celu zmniejszenia ryzyka odrzucenia, i mogą być one powoli odstawiane od tych schematów terapii w miarę ustalania się tolerancji na przeszczep (Seyfort-Margolis i Turka, J Clin Invest 118(8): , 08; Taylor i wsp., Crit Rev Oncol Hematol 6:23-46, 0; Amante i Ejercito, Transplant Proc 40: , 08). [0123] Rozwój komórek osocza, wydzielających przeciwciała wymaga pomocy pokrewnych limfocytów T CD4, oprócz wyspecjalizowanych mikrośrodowisk, które podtrzymują przeżycie komórek osocza (Tarlington i wsp., Curr Opin Immunol : , 08). Wydzielanie cytokin przez aktywowane limfocyty T jest konieczne dla różnicowania i przeżycia komórek osocza, i wiadomo, że wpływa na charakter odpowiedzi przeciwciał i izotyp Ig. Istnieją modele służące do monitorowania zależnej od limfocytów T odpowiedzi związanej z przeciwciałami w gatunkach gryzoni i naczelnych inny niż człowiek. Metody te są dobrze zrozumiałe dla osób biegłych w dziedzinie wynalazku. Kinetykę i wielkość pierwotnej lub wtórnej odpowiedzi przeciwciał przeciwko modelowym antygenom peptydowym, takim jak albumina jaja kurzego, anatoksyna tężcowa, owcze krwinki czerwone lub zmodyfikowana trinitrofenylem hemocyjanina skałoczepa monitoruje się stosując testy, które wykrywają całkowite lub antygenowo specyficzne przeciwciała, w tym podtypy IgG, IgM, IgE lub IgA w surowicy zwierząt, którym podano te antygeny. W niektórych modelach, można również monitorować dojrzewanie powinowactwa przeciwciał. Modele takie można stosować do badania efektów stosowanych w terapii leków, które modyfikują pomoc udzielaną limfocytom B przez limfocyty T i które blokują cytokiny uważane za ważne dla różnicowania i przeżycia komórek osocza. [0124] Badania procesu odrzucania przeszczepu allogenicznego prowadzi się na wielu gatunkach zwierząt. Na przykład, model przeszczepu nerki u makaków jawajskich może reprezentować skutki przewlekłego mediowanego przez alloprzeciwciała odrzucenia przeszczepu allogenicznego nerki u ludzi. W pewnych przypadkach, przed wykonaniem przeszczepu wdraża się schematy wywołujące tolerancję na alloprzeszczep. Obecność alloprzeciwciał specyficznych dla dawcy monitoruje się za pomocą analizy metodą cytometrii przepływowej surowicy biorcy o niedopasowanych leukocytach krwi 3

37 obwodowej, a odkładanie się produktu dopełniacza C4d wykrywa się w bioptatach z alloprzeszczepu nerki (Smith i wsp., Am J Transplant 6: , 06; Smith i wsp., Am J Transplant 8:1-11, 08). Modele ostrego i przewlekłego odrzucenia przeszczepu mogą być realizowane na gatunkach gryzoni przez osoby biegłe w dziedzinie wynalazku. [012] Podawanie przeciwciał anty-il-21 w modelu zależnej od limfocytów T odpowiedzi w postaci produkcji przeciwciał lub modelu odrzucenia przeszczepu allogenicznego wykorzystuje się do oceny możliwości zastosowania klinicznego przeciwciał anty-il-21 w celu ograniczenia odpowiedzi alloprzeciwciał i łagodzenia objawów odrzucenia przeszczepu allogenicznego, lub w ramach terapeutycznego postępowania przedtransplantacyjnego lub schematu wywoływania tolerancji u biorców przeszczepu, w tym wysoko zimmunizowanych pacjentów transplantacyjnych. [0126] Wynalazek został w dalszej części zilustrowany za pomocą następujących nieograniczających przykładów. PRZYKŁADY Przykład 1-Otrzymywanie białek i przeciwciał IL-21 A. Immunizacje i komórki hybrydoma [0127] Białko IL-21 zostało wytworzone w sposób opisany w dokumencie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr Rozpuszczalne białka receptorowe IL-21 wytworzono w sposób opisany w zgłoszeniu patentowym St. Zjedn. Ameryki i dokumencie patentowym St. Zjedn. Ameryki Przeciwciała monoklonalne anty-il-21 wyprodukowano u myszy typu dzikiego wytwarzających mysie przeciwciała oraz u myszy transgenicznych wytwarzających w pełni ludzkie przeciwciała (Medarex, Princeton, NJ). Myszy immunizowano ludzkim białkiem IL-21. W skrócie, myszy były najpierw immunizowane przez podskórne wstrzyknięcie µg oczyszczonego rekombinowanego IL-21 (wytworzonego w E.coli przez ZymoGenetics) skoniugowanego z BSA (Imject Pharmalink Immunogen Kit, Pierce) i podawanego w kombinacji z CpG (ligandem mysiego oligonukleotydu TLR9 i GM-CSF (czynnikiem stymulującym wzrost kolonii granulocytów i makrofagów, Granulocyte Macrophage Colony Stimulatory Factor, R&D, Minneapolis, MN) i adiuwantem Emulsigen -P (MVP Laboratories, INC, Omaha, NE), zgodnie z instrukcjami producenta. Po wstępnej immunizacji, każda mysz otrzymała dodatkowo trzykrotnie µg IL-21 w połączeniu z adiuwantem Emulsigen -P drogą podskórną w odstępach tygodniowych. Po siedmiu dniach od czwartej immunizacji, myszy zostały skrwawione przez splot zagałkowy, a następnie oddzielono surowicę od krwi w celu analizy jej zdolności wiązania się z IL-21. [0128] Z dwóch myszy BALB/c o wysokim mianie lub z myszy transgenicznych pobrano i połączono splenocyty, które poddano fuzji z mysimi komórkami szpiczaka P3- X63-Ag8.63, z wykorzystaniem PEG 140, w pojedynczej procedurze fuzji (przy stosunku splenocytów do komórek szpiczaka wynoszącym 2:1, Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow i D.Lane, Cold Spring Harbor Press). Po 9 dniach wzrostu od fuzji, pule komórek hybrydoma wytwarzających specyficzne przeciwciała zidentyfikowano z wykorzystaniem testu ELISA: bezpośredniego oraz wychwytującego testu ELISA (ang. capture ELISA), przy użyciu rekombinowanego białka IL-21, nieznakowanego i znakowanego ludzkim fragmentem Fc IgG, jako celem dla swoistych przeciwciał. Pozytywne pule komórek hybrydoma analizowano dalej pod kątem ich zdolności do blokowania wiązania ligandu z receptorem, 36

38 mierzonego jako poziom fosforylacji STAT3 w następstwie oddziaływania ligand-receptor ( test neutralizacji fosfo-stat3 ) oczyszczonego rekombinowanego białka IL-21 na komórkach BaF3 wykazujących ekspresję sekwencji receptora IL-21. Przeciwciała monoklonalne oczyszczone z pożywki do hodowli tkanek scharakteryzowano pod kątem ich zdolności do blokowania oddziaływania ligand-receptor ( test neutralizacji fosfo-stat3") oczyszczonego rekombinowanego białka IL-21 na komórkach BaF3 wykazujących ekspresję sekwencji receptora IL-21. W ten sposób zidentyfikowano neutralizujące przeciwciała monoklonalne. [0129] Pule komórek hybrydoma charakteryzujące się dodatnim wynikiem testu neutralizacji fosfo- STAT3 i testów ELISA sklonowano co najmniej dwukrotnie przez ograniczające rozcieńczenie. W tych testach próbki miareczkowano przy użyciu standardowego rozcieńczenia zapewniającego niskie stężenie (mniej niż jedna komórka na dołek) by określić, który klon będzie charakteryzował się największą wartością odczytu OD. Wykorzystując zarówno wyniki testu neutralizacji jak i miareczkowania, z każdego wyjściowego dołka do dalszych badań wybrano dwa swoiste klony. Zostały one poddane kolejnej turze klonowania, celem zapewnienia homogeniczności hodowli, a następnie poddano je analizie przesiewowej z wykorzystaniem bezpośredniego testu ELISA. Po jednym dodatkowym miareczkowaniu wybrano dwa końcowe klony IL-21. Klony komórek hybrydoma hodowano w pożywce hodowlanej zawierającej 90% pożywkę Iscove s Modified Dulbecco s, w której skład wchodziło 2 mm L-glutaminy, 0 µg/ml penicyliny i 0 µg/ml siarczanu streptomycyny, oraz % surowicy Fetal Clone 1 Serum (Hyclone Laboratories). Klony te zostały namnożone przez posiew hodowli o stężeniu 2 x komórek/ml i utrzymywanie w zakresie od 1 x do x komórek/ml w temperaturze 37 C i przy -6% CO 2. Komórki zostały przed dalszymi transferami przystosowane do środowiska niezawierającego surowicy. Komórki zamrożono w 90% surowicy i % DMSO, i przechowywano w fazie gazowej zamrażarki na ciekły azot. [01] Oczyszczone przeciwciała monoklonalne wytwarzane przez te klony komórek hybrydoma scharakteryzowano na szereg sposobów, w tym przez grupowanie (czyli określenie, czy każde poszczególne przeciwciało mogłoby hamować wiązanie jakiegokolwiek innego przeciwciała), mapowanie epitopu z wykorzystaniem peptydów, określenie względnego powinowactwa i neutralizacji. [0131] Sposoby wytwarzania heterologicznych przeciwciał z myszy transgenicznych są znane, zob. na przykład, Lonberg, Nat. Biotech. 23(9):1117-2, 0; Tomizuka i wsp. PNAS 97(2): , 00; i dokument patentowy St. Zjedn. Ameryki [0132] Następujące komórki hybrydoma, wytwarzające mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-21 zostały zdeponowane w American Type Culture Collection, Manassas, VA. klon nr ATCC (PTA-8317), klon nr ATCC (PTA-8314), klon nr ATCC (PTA-8313), klon nr ATCC (PTA-831), klon nr ATCC (PTA-8316), klon nr ATCC (PTA- 84), klon nr ATCC (PTA-8431), klon nr ATCC (PTA-8432), klon nr ATCC (PTA-8433), klon nr ATCC (PTA-8434). [0133] Następujące komórki hybrydoma, wytwarzające ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-21 zostały zdeponowane w American Type Culture Collection, Manassas, VA. Tabela I przedstawia kompletne sekwencje aminokwasów odpowiadające łańcuchom zmiennemu ciężkiemu (VH) i zmiennemu lekkiemu (VL) przeciwciał. Ponadto uwzględniono sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3 37

39 z regionami VH i VL dla każdego przeciwciała. Odpowiednie sekwencje nukleotydowe znajdują się w wykazie sekwencji. Komórki hybrydoma oznaczone jako , nr ATCC PTA-8788 także zdeponowano w kolekcji, ale nie znajdują się one w Tabeli 1. 38

40 39 Tabela 1 Numer klonu nr AT CC VH CDR 1 VH CDR 2 VH CDR 3 VL CDR 1 VL CDR 2 VL CDR 3 Pełna sekwencja PT A SRT YR WG SIYY RG STFY NP SLKS QSG YS GYD WF DP RAS QS VSS FLA DAS NR AT QQR SN WIT SEQ ID NO: 1 SEK W. NR: 17 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 27 SEKW. NR: 13 SEKW. NR: PT A SYG MH FIWY D GSD KY YAD SV KG DGD SS DWY GD YYF GM DV RAS QS VSS SYL A GAS SR AT QQY GS WT SEQ ID NO: 31 SEK W. NR: 33 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 43 SEKW. NR: 29 SEKW. NR: PT A TYG MH FIWY D GSD KY YAD SV KG DGD SS DWY GD YYF GM DV RAS QS VSS SYL A GAS SR AT QQY GS WT SEQ ID NO: SEK W. NR: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEKW. NR: 4

41 SEKW. NR: PT SYS SITS ERG RAS DAS QQF.63 A- MN GS WG QDI SLE NS 878 YYIH YYG DSA S YPY 9 Y MD LA T ADS V VK G SEQ SEK SEQ SEQ SEQ SEQ SEKW. NR: 61 ID W. ID ID ID ID NO: NR: NO: NO: NO: NO: SEKW. NR: PT SDF YISS SAG RAS VASS QQA A- WG RG VT QGI LQ NS 878 STN DFD SSW S FPLT 7 YN- F LA PSLK R SEQ SEK SEQ SEQ SEQ SEQ SEKW. NR:77 ID W. ID ID ID ID NO: NR: NO: NO: NO: NO: SEKW. NR:8 1B: Ekspresja genów kodujących łańcuch ciężki i lekki immunoglobulin w klonie ssaczej linii komórkowej, prowadząca do wytworzenia CHO [0134] Ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-21 (otrzymane z klonu komórek hybrydoma ) wyrażano w komórkach CHO z wykorzystaniem dwóch kaset ekspresyjnych. 40

42 Łańcuch VH został poddany fuzji ze zmodyfikowanym ludzkim regionem stałym IgG1. Zmodyfikowana IgG1, IgG1.1, zawierała pięć substytucji aminokwasowych w celu ograniczenia funkcji efektorowych. Ludzki łańcuch ciężki przeciwko ludzkiej IL- 21 był związany z markerem selekcyjnym reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) zawierającym sekwencje wewnętrznego rybosomalnego miejsca inicjacji translacji. Ekspresja ludzkiego łańcucha ciężkiego przeciwko ludzkiej IL-21 i markera selekcyjnego DHFR była kierowana przez konstytutywny syntetyczny promotor uzyskany w wyniku fuzji wzmacniacza ludzkiego cytomegalowirusa (CMV) i wzmacniacza/promotora wirusa mięsaka mieloproliferacyjnego (MPSV). Sygnał poliadenylacji wirusa simian 40 (SV40) został użyty do terminacji transkrypcji na końcu markera selekcyjnego DHFR. Łańcuch VL przyłączono do regionu stałego kappa ludzkiej immunoglobuliny. Ludzki łańcuch lekki przeciwko ludzkiej IL-21 był związany z markerem selekcyjnym odporności na puromycynę (puror) przez sekwencję IRES. Ekspresja ludzkiego łańcucha lekkiego przeciwko ludzkiej IL-21 i markera selekcyjnego puror była kierowana przez konstytutywny syntetyczny promotor uzyskany w wyniku fuzji wzmacniacza ludzkiego CMV i wzmacniacza/promotora MPSV. Sygnał poliadenylacji SV40 został użyty do terminacji transkrypcji na końcu markera selekcyjnego puror. Kasety ekspresyjne z ludzkim łańcuchem ciężkim i lekkim przeciwko ludzkiemu IL-21 zostały jednocześnie transfekowane do komórek nosicielskich CHO DXB- 11. W celu otrzymania wysokiego i stabilnego wyrażania ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciwko ludzkiej IL-21 zastosowano selekcję puromycyną a następnie selekcję metotreksatem. Wersja klonu mab IL-21 uzyskana w wyniku wyrażania w komórkach CHO w dalszych przykładach jest nazywana CHO. Przykład 2-Przeciwciała monoklonalne anty-il-21 wiążące ludzkie białka i peptydy IL-21 2A. Wiązanie i neutralizacja peptydów [013] Zdolność przeciwciał monoklonalnych przeciwko ludzkiej IL-21 do wiązania i neutralizacji ludzkiej IL-21, zmutowanego ludzkiego białka IL-21 a także syntetycznych peptydów wyprowadzonych z sekwencji ludzkiej IL-21 wykazano przez bezpośredni test ELISA. [0136] Wykorzystano następujące peptydy: Peptyd 1 ((SEKW. NR:3) pyroglu GQDRHM1RMRQLIDIVDQLKC; Peptyd 2 ((SEKW. NR: 4) NDLVPEFLPAPEDVETNC, Peptyd 3 ((SEKW. NR: ) NVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTC, Peptyd 4 ((SEKW. NR:6) CDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKM1HQHLS oraz [0137] Rekombinowaną ludzką IL-21 (SEKW. NR: 2), syntetyczne peptydy wyprowadzone z sekwencji ludzkiej IL-21 i rekombinowaną ludzką zmutowaną IL-21 (SEKW. NR: 7) unieruchomiono oddzielnie na powierzchni 96-dołkowych polistyrenowych płytek do testów ELISA w objętości 0 µl/dołek i stężeniu µg/ml w buforze opłaszczającym (0,1M Na 2 CO 3, ph 9,6). Płytki inkubowano przez noc w temperaturze 4 C, po czym niezwiązane białko odessano i płytki przemyto dwukrotnie objętością 0 µl/dołek buforu przemywającego (PBS-Tween określony jako 0,137M NaCl, 0,0022M KCl, 0,0067M Na 2 HPO 4, 0,00M KH 2 PO 4, 0,0% v/w polisorbatu, ph 7,2). Dołki zablokowano buforem blokującym o objętości 0 µl/dołek (PBS-Tween plus 1% wag./obj. albuminy surowicy bydlęcej (BSA)) przez 1 godzinę, po czym płytki przemyto dwukrotnie buforem przemywającym. Roztwory przeciwciał sporządzono w pożywce zawierającej % płodowej surowicy bydlęcej (FBS)/Iscove s 41

43 1 Modified Dulbecco s Media (IMDM) i doprowadzono do stężenia 1 µg/ml. Podwójne próbki każdego roztworu przeciwciał przeniesiono następnie na płytki, w objętości 0 µl/dołek, w celu związania białek przeciwko ludzkiej IL-21. Po 1 godzinie inkubacji w temperaturze otoczenia, zawartość dołków odessano, a płytki przemyto dwukrotnie w sposób opisany powyżej. Następnie do każdego dołka dodano, w objętości 0 µl/dołek, wyznakowane peroksydazą chrzanową (HRP) kozie i mysie IgG, Fc-specyficzne, lub kozie antyszczurze IgG, Fc-specyficzne, lub kozie antyludzkie IgG, Fc-specyficzne (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) w rozcieńczeniu 1:000 z % pożywką FBS/IMDM, i płytki inkubowano w temperaturze otoczenia przez 1 godzinę. Po usunięciu skoniugowanych przeciwciał niezwiązanych z HRP, płytki przemyto pięć razy, do każdego dołka dodano tetrametylobenzydynę (TMB) (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) w ilości 0 µl/dołek i płytki inkubowano przez 3 minuty w temperaturze otoczenia. Powstawanie koloru zatrzymano przez dodatek 0 µl/dołek reagenta 40nm TMB Stop Reagent (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD), a wartości absorbancji dołków odczytano w urządzeniu Molecular Devices Spectra MAX 340 przy 40nm. Tabela 2 Reaktywność monoklonalnego mysiego przeciwciała przeciwko ludzkiej IL-21 wobec ludzkiego białka IL-21, zmutowanego ludzkiego białka IL-21 i białek wyprowadzonych z sekwencji ludzkiej IL- 21 Mysie Ab Wiążące Nr serii IL-21 Peptyd Peptyd Peptyd Peptyd Zmutowana IL-21 przeciwko (B) oczyszczon ludzkiej IL- Neutralizujące ego Ab 21 (N) Numer klonu Izotyp B/N E274 +/ /- IgG B E IgG B E273 +/ IgG B E IgG1 42

44 B E IgG B E IgG1 Reaktywno Brak (0) Słab Umiark Silna ść: a (+) owana (+++) (++) Tabela 3 Reaktywność monoklonalnego ludzkiego przeciwciała przeciwko ludzkiej IL-21 wobec ludzkiego białka IL-21, zmutowanego ludzkiego białka IL-21 i białek wyprowadzonych z sekwencji ludzkiej IL- 21 Ludzkie Ab przeciwko ludzkiej IL- 21 Wiążące (B) Neutralizujące (N) Nr serii oczyszczon ego Ab IL-21 Peptyd N- koniec Peptyd 2 Peptyd 3 Peptyd 4 C- koniec Zmutowana IL-21 Numer klonu Izotyp B/N E IgG B/N E IgG B/N E IgG 43

45 B/N E IgG B E IgG B/N E IgG Reaktywność: Brak (0) Słaba (+) Umiarkowana (++) Silna (+++) 1 2B Pomiar powinowactwa wiązania przeciwciał monoklonalnych CHO przeciwko ludzkiej IL-21 z ludzką IL-21 i IL-21 makaka jawajskiego za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego (Biacore) [0138] Przeciwciało monoklonalne CHO przeciwko IL-21 poddano ocenie pod kątem jego powinowactwa wiązania z ludzką rekombinowaną IL-21 i rekombinowaną IL-21 makaka jawajskiego przy pomocy powierzchniowego rezonansu plazmonowego. [0139] Pomiar powinowactwa: Zmierzono stałe szybkości i stałe równowagi reakcji dysocjacji dla oddziaływań przeciwciał monoklonalnych CHO przeciwko ludzkiej IL-21 z ludzką IL-21 i IL-21 makaka jamajskiego wykorzystując powierzchniowy rezonans plazmonowy. Stała szybkości asocjacji (k a (M -1 s -1 )) stanowi wartość odzwierciedlającą szybkość powstawania kompleksu antygenprzeciwciało. Stała szybkości dysocjacji (k d (s -1 )) stanowi wartość odzwierciedlającą stabilność tego kompleksu. Dzieląc wartość stałej szybkości dysocjacji przez wartość stałej szybkości asocjacji (k d /k a ) otrzymuje się wartość stałej równowagi dysocjacji (K D (M)). Wartość ta charakteryzuje powinowactwo wiązania dla tego oddziaływania. Przeciwciała charakteryzujące się podobnymi wartościami K D mogą jednocześnie cechować się zmienną w szerokim zakresie wartością stałych szybkości asocjacji i dysocjacji. W konsekwencji, pomiar zarówno k a jak i k d dla przeciwciał umożliwia bardziej jednoznaczne opisanie powinowactwa oddziaływania przeciwciało-antygen. [0140] Materiały i metody: Badania kinetyki wiązania i powinowactwa wykonano z wykorzystaniem systemu Biacore T0 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Metody dla Biacore T0 zostały zaprogramowane przy użyciu oprogramowania BIACORE T0 Control Software, v W 44

46 eksperymentach tych przeciwciało CHO było albo wychwytywane na powierzchni mikroukładu czujnikowego CM4 za pośrednictwem koziego przeciwciała Fc-gamma przeciwko ludzkiej IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), lub było ono w niewielkim stopniu biotynylowane w stosunku wagowym 1:0 sulfo-nhs-lc-biotyną (Pierce, Rockford, IL) w buforze PBS o ph = 7,4, a następnie wychwytywane na mikroukładzie czujnikowym z streptawidyną (SA). Wszystkie eksperymenty dotyczące wiązania wykonywano w temperaturze 2 C w buforze zawierającym mm HEPES, 0 mm NaCl, mm CaCl2, 0,0% surfaktantu P (Biacore), 1 mg/ml albuminy z surowicy bydlęcej, ph 8,0. [0141] W przypadku eksperymentu z kozim przeciwciałem Fc-gamma przeciwko ludzkiemu IgG, wychwytujące przeciwciało rozcieńczono do stężenia 0 µg/ml w mm octanie sodu o ph,0, a następnie unieruchomiono kowalencyjnie na wszystkich czterech komórkach przepływowych mikroukładu czujnikowego CM4 z wykorzystaniem reakcji chemicznej sprzęgania amin (EDC:NHS). Po unieruchomieniu przeciwciała, pozostałe miejsca aktywne w komórkach przepływowych zostały zablokowane 1 M etanoloaminą. Otrzymano gęstość wychwytującego przeciwciała wynoszącą około 0 RU. Przeciwciała CHO przeciwko IL-21 były wychwytywane w komórkach przepływowych 2, 3, i 4 mikroukładu CM4 dla trzech różnych gęstości (w zakresie od 2 do RU). Wychwyt przeciwciała CHO na unieruchomionej powierzchni prowadzono przy szybkości przepływu równej µl/min. Urządzenie Biacore mierzy masę białka związanego z powierzchnią mikroukładu czujnikowego, co oznacza, że dla każdego cyklu zweryfikowano wychwytywanie badanego przeciwciała. Szereg rozcieńczeń ludzkiej rekombinowanej IL-21 lub rekombinowanej IL-21 makaka jawajskiego (ZymoGenetics) przygotowano w zakresie 40 nm 0,003 nm (seryjne rozcieńczenia 1:). Roztwory z szeregu rozcieńczeń wstrzyknięto na powierzchnię i umożliwiono specyficzne wiązanie z przeciwciałem CHO unieruchomionym na mikroukładzie czujnikowym. Podwójne wstrzyknięcia każdego ze stężeń roztworów antygenu IL-21 wykonywano dla czasu asocjacji 6, lub 7 minut i czasu dysocjacji, 1, lub 60 minut. Badania kinetyczne wiązania wykonywano przy szybkości przepływu 0 µl/min. Pomiędzy cyklami kuweta przepływowa była przemywana mm kwasem chlorowodorowym w celu regeneracji powierzchni. Etap przemywania powodował usunięcie zarówno wychwyconych przeciwciał testowych jak i jakichkolwiek związanych antygenów z powierzchni immobilizowanych przeciwciał. Przeciwciała CHO były następnie ponownie wychwytywane w kolejnym cyklu. [0142] W przypadku eksperymentów z zastosowaniem minimalnie biotynylowanych CHO, biotynylowane przeciwciała były wychwytywane w komórkach przepływowych 2, 3 i 4 mikroukładu SA przy trzech różnych gęstościach (w zakresie od do 10 RU). Wychwyt zbiotynolowanego przeciwciała CHO na powierzchni prowadzono przy szybkości przepływu równej µl/min. Szeregi rozcieńczeń ludzkiego rekombinowanego IL-21 lub rekombinowanego IL-21 makaka jawajskiego (ZymoGenetics) przygotowano albo w zakresie 0 nm - 0,001 nm (seryjne rozcieńczenia 1:4) lub w zakresie 40 nm nm (seryjne rozcieńczenia 1:). Roztwory z tych szeregu rozcieńczeń wstrzyknięto na powierzchnię i umożliwiono im specyficzne wiązanie z przeciwciałem CHO unieruchomionym na mikroukładzie czujnikowym. Podwójne wstrzyknięcia każdego ze stężeń roztworów antygenu IL-21 wykonywano dla czasu asocjacji 6, lub 7 minut i czasu dysocjacji 4

47 , 1, lub 60 minut. Badania kinetyczne wiązania wykonywano przy szybkości przepływu 0 µl/min. Pomiędzy cyklami kuweta przepływowa była przemywana mm kwasem chlorowodorowym w celu regeneracji powierzchni. Etap przemywania powodował usunięcie jakichkolwiek związanych antygenów z powierzchni immobilizowanych przeciwciał. Etap przemywania nie spowodował usunięcia z powierzchni czujnika biotynylowanych przeciwciał CHO, przez co przeciwciała mogły wiązać antygeny w kolejnej próbce. [0143] Dane zostały zestawione z wykorzystaniem oprogramowania analitycznego BIACORE T0 (wersja 1.1.1). Obróbka danych polegała na odjęciu wyników uzyskanych dla przepływowej komórki odniesienia i wartości ślepych prób. Stabilność linii bazowej została zweryfikowana w celu potwierdzenia, iż etap regeneracji umożliwia uzyskanie spójnych wyników dotyczących wiązania na powierzchni w całym zakresie sekwencji iniekcji. Podwójne krzywe iniekcji zostały sprawdzone pod kątem powtarzalności. Na podstawie wiązania monowalentnej IL-21 do biwalentnego przeciwciała, udowodniono iż model oddziaływania 1:1 jest poprawny. Krzywe wiązania po odjęciu odniesienia z trzech komórek przepływowych (FC2-1, FC3-1, FC4-1) dopasowano globalnie do modelu wiązania 1:1 z wieloma wartościami Rmax i z wartością RI ustawioną na zero. Uzyskano dobre dopasowanie danych do modelu wiązania 1:1 i dobrą zgodność pomiędzy eksperymentalnymi i teoretycznymi krzywymi wiązania. Wartość chi 2 i wartości błędów standardowych związanych z dopasowaniem były niskie. Wartości resztowe nie wykazywały trendu. [0144] Wyniki: Dla oddziaływania CHO z ludzką IL-21, dane zestawiono z czterech niezależnych eksperymentów. Wartość k a w przypadku wielu eksperymentów zawierała się w zakresieod 3E+07 do +07 (M -1 s -1 ), a wartość k d zawierała się w zakresie od 3E-06 do 3E-0 (s -1 ). Obliczona wartość K D zawierała się w zakresie od 0,9E-13 do 8E-13 (M). [014] Dla oddziaływania CHO z IL-21 makaka jamajskiego, dane zestawiono z trzech niezależnych eksperymentów. Wartość k a dla każdego eksperymentu wynosiła 3E+07 (M -1 s -1 ) a wartość k d zawierała się w zakresie od 2E-04 do E-04 (s -1 ). Obliczona wartość K D zawierała się w zakresie od 0,9E-11 do 2E-11 (M). Przykład 3-Badania międzygatunkowej reaktywności krzyżowej [0146] Wyznaczanie zdolności przeciwciał przeciwko ludzkiej IL-21 do reakcji krzyżowej i wiązania białek IL-21 mysich lub makaka jawajskiego lub syntetycznych peptydów wyprowadzonych z sekwencji ludzkiej IL-21. [0147] Badania międzygatunkowej reaktywności krzyżowej mogą być istotne by wykazać specyficzność dla strategii opracowywania antagonistów o znaczeniu terapeutycznym. W celu określenia, czy jednostki wiążące i neutralizujące, skierowane przeciwko ludzkiej IL-21, opisane w tym dokumencie, mogą ulegać reakcji krzyżowej i wiązać się z mysią IL-21 czy IL-21 makaka jawajskiego (uzasadniając tym samym wybór makaka jawajskiego lub myszy jako odpowiedniego gatunku do prowadzenia testów), niezbędne było wykazanie porównywalnego wiązania przeciwciał z rekombinowaną ludzką, myszą IL-21 i IL-21 makaka jawajskiego w różnych formatach testów. Jedną z metod badania wiązania przeciwciał monoklonalnych jest ich zachowanie w testach immunoblot (Western blot). Rekombinowaną ludzką IL-21 (SEKW. NR:2), rekombinowaną mysią IL-21 (SEKW. NR:11), rekombinowaną IL-21 makaka jawajskiego (SEKW. NR:9), syntetyczne peptydy 46

48 1 wyprowadzone z sekwencji ludzkiej IL-21: peptyd nr 1 pyr-k0 (Seq ID 3), peptyd nr 2 N4-C71 (SEKW. NR:4), peptyd nr 3 N97-C122 (SEKW. NR:), peptyd nr 4 C12-S13 (SEKW. NR:6), skoniugowane z albuminą białka kurzego, lub nieistotną cytokinę kontrolną, rekombinowany ludzki IFN-λ (ZymoGenetics) poddano elektroforezie żelowej w dodecylo siarczanie sodowympoliakrylamidzie (SDS-PAGE) z zastosowaniem 4-12% żelu poliakrylamidowego BisTris (Invitrogen, Inc.) i przeniesiono na membranę nitrocelulozową z wykorzystaniem standardowych metod i buforu zawierającego 2 mm Tris, 186 mm glicyny i 40% metanolu. [0148] W przypadku testów Western blot, miejsca niespecyficzne na membranie zostały zablokowane buforem zawierającym mm Tris, ph 7,4, 0, mm EDTA, 0,% IGEPAL CA-6, mm NaCl, 0,2% żelatyny i 1% roztworem blokującym z hydrolizatem kazeiny (Western Blocking Reagent, Roche Diagnostics, Inc., Basel Switerzerland) (bufor blokujący). Membrany były następnie inkubowane przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, w obecności oczyszczonego przeciwciała monoklonalnego (0 ng/ml lub 0 ng/ml) w buforze blokującym, a następnie inkubowane przez 2 godziny w obecności oślej anty-ludzkiej IgG skoniugowanej z peroksydazą (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). Membrany zostały -krotnie przemyte buforem blokującym Tris/EDTA/1GEPAL/NaCl/żelatyna nie zawierającym hydrolizatu kazeiny i wywołane w roztworze SUPERSIGNAL DuraWest Luminol/Wzmacniacz/Peroksydaza (Pierce, Rockford, IL) do detekcji chemoluminescencyjnej. Bloty zobrazowano z wykorzystaniem standardowej metody z zastosowaniem filmu rentgenowskiego. Tabela 4 Reaktywność przeciwciał monoklonalnych przeciwko ludzkiej IL-21 w analizie Western Blot Klon* Hu IL- Cyno Mu IL-21 +Hu IL- +Hu IL- +Hu IL- +Hu IL- 21 IL Peptyd Peptyd Peptyd Peptyd A1744 A170 A171 A / / /

49 Reaktywność: Brak (0) Brak (0) Słaba (+) Umiarkowana (++) Silna (+++) * Nie zaobserwowano żadnych sygnałów z IFN-λ + Peptydy były skoniugowane z albuminą białka kurzego 1 Przykład 4-Określenie zdolności przeciwciał przeciwko ludzkiej IL-21 do reakcji krzyżowej i wiązania ludzkich cytokin z rodzny γc IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-1 [0149] Kolejną istotną cechą specyficznego przeciwciała jest zdolność przeciwciała do wiązania i antagonizowania docelowego białka/białek, przy jednoczesnym braku wiązania w znaczącym stopniu do białek pokrewnych (niebędących celem). Zdolność przeciwciał przeciwko ludzkiemu IL-21 do wiązania pokrewnych cytokin została zbadana z wykorzystaniem testu Western blot. Otrzymano próbki wszystkich przedstawicieli rodziny γc cytokin, wykonano analizę SDS-PAGE i przeniesiono na membrany nitrocelulozowe w celu wykonania blotów. Rekombinowaną ludzką IL-2 (2-IL/CF), ludzką IL-4 (4-IL/CF), ludzką IL-7 (7-IL/CF), ludzką IL-9 (9-IL/CF), ludzką IL-1 (247- IL/CF) wszystkie z R&D Systems, Minneapolis MN), ludzką IL-21 (ZymoGenetics) oraz ludzki IFN-λ (Patenty St. Zjedn ; ) użyto w celu określenia specyficzności przeciwciał. Wszystkie przebadane przeciwciała wykazały brak wykrywalnego wiązania, powyżej poziomu tła, do rodziny γc cytokin, z wyjątkiem ludzkiej IL-21, w przypadku której zaobserwowano wyraźne wiązanie, w zgodzie z wcześniejszymi testami Western blot z wykorzystaniem tych przeciwciał (zobacz Przykład 3). Tabela Reaktywność przeciwciał monoklonalnych przeciwko ludzkiej IL-21 wobec cytokin z rodziny γc w analizie Western Blot Klon Hu IL-2 Hu IL-4 Hu IL-7 Hu IL-9 Hu IL- Hu IL-21 Hu IFNλ 1 kontrola negatywna

50 Reaktywność: Brak (0) Słaba (+) Umiarkowana (++) Silna (+++) Tabela 6: Reaktywność mysich i szczurzych przeciwciał monoklonalnych przeciwko ludzkiej IL-21 w analizie Western Blot Klon* Hu IL- 21 Cyno IL-21 Mu IL-21 +Hu IL- 21 Peptyd A1744 +Hu IL-21 Peptyd A170 +Hu IL- 21 Peptyd A1171 +Hu IL- 21 Peptyd A172 Klony mysie / / Klony szczurze Reaktywność: Brak (0) Słaba (+) Umiarkowana (++) Silna (+++) * Nie zaobserwowano żadnych sygnałów z IFNλ + Peptydy były skoniugowane z albuminą białka kurzego Przykład -Kompetycyjne badania z grupowaniem ze względu na epitop 49

51 [0] Eksperymenty z grupowaniem ze względu na epitop zostały przeprowadzone w celu określenia, które przeciwciała monoklonalne przeciwko IL-21 mogą jednocześnie wiązać się z ludzką IL-21. W badaniach reprezentowane były zarówno ludzkie jak i mysie przeciwciała. Przeciwciała monoklonalne przeciw IL-21, które współzawodniczą o to samo lub o nakładające się miejsce wiązania (epitop) na antygenie, nie mogą wiązać się jednocześnie, przez co mogą zostać zgrupowane do jednej rodziny lub grupy epitopowej. Przeciwciała monoklonalne przeciw IL-21, które nie współzawodniczą o to samo miejsce wiązania antygenu, mogą wiązać się jednocześnie, przez co mogą zostać zaklasyfikowane do różnych rodzin lub grup epitopowych. Badania wykonano z zastosowaniem urządzenia BIACORE T0. Eksperymenty z grupowaniem ze względu na epitop zostały przeprowadzone z wykorzystaniem rozpuszczalnej, (ZymoGenetics) ludzkiej IL-21 w roli antygenu. [011] Badania z grupowaniem ze względu na epitop wykonano z wykorzystaniem systemu BIACORE T0 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Metody zostały zaprogramowane przy użyciu oprogramowania BIACORE T0 Control Software, v Indywidualne przeciwciała monoklonalne przeciwko IL-21 zostały unieruchomione kowalencyjnie w oddzielnych komórkach przepływowych mikroukładu czujnikowego BIACORE CM4. Następnie wstrzyknięto antygen IL-21 i umożliwiono mu specyficzne związanie z przeciwciałem monoklonalnym unieruchomionym na mikroukładzie czujnikowym. Urządzenie BIACORE mierzy masę białka związanego z powierzchnią mikroukładu czujnikowego, dzięki czemu w każdym cyklu badawczym dokonano weryfikacji immobilizacji pierwszego przeciwciała z badanej pary, oraz specyficznego wiązania antygenu IL-21 z pierwszym badanym przeciwciałem. Po związaniu antygenu IL-21, wstrzyknięto drugie przeciwciało monoklonalne anty-il-21 i umożliwiono jego wiązanie. Jeśli drugie badane przeciwciało monoklonalne anty-il-21 wykazywało zdolność do wiązania antygenu jednocześnie z pierwszym badanym przeciwciałem monoklonalnym, objawiało się to jako wzrost masy na powierzchni mikroukładu, świadczący o wiązaniu. Jeśli jednak drugie badane przeciwciało monoklonalne anty-il-21 nie wykazywało zdolności do wiązania antygenu jednocześnie z pierwszym badanym przeciwciałem monoklonalnym, objawiało się to jako brak wzrostu masy, świadczący o braku wiązania. Każde przeciwciało monoklonalne anty IL-21 zostało zbadane względem samego sobie, co zostało potraktowane jako kontrolna próba negatywna i umożliwiło określenie wartości sygnału tła (odpowiadającego brakowi wiązania). [012] Przeprowadzono szereg eksperymentów w celu określenia właściwości wiązania oczyszczonych przeciwciał monoklonalnych anty IL-21 uzyskanych z fuzji komórek hybrydoma ze śledzion myszy odpornych na ludzką IL-21. Pierwsze przeciwciało monoklonalne anty-il-21 z badanej pary unieruchomiono kowalencyjnie z wykorzystaniem EDC:NHS do uzyskania gęstości ok. 00 RU. Antygen IL-21 rozcieńczono do 0 nm i umieszczono na powierzchni unieruchomionych przeciwciał. Następnie drugie przeciwciało z badanej pary rozcieńczono do µg/ml (w przybliżeniu 32,2 nm) i umożliwiono mu związanie się z wychwyconym antygenem IL-21. Podzbiór przeciwciał monoklonalnych anty-il-21 został przebadany jako pierwsze przeciwciało w połączeniu z kompletnym panelem drugich przeciwciał monoklonalnych anty-il-21. Eksperymenty dotyczące wiązania wykonywano z szybkością przepływu µl/min w temperaturze 2 C. Bufor w tych badaniach 0

52 zawierał mm Hepes, 0,3 M NaCl, 0,0% surfaktantu P, mm CaCl 2, 1 mg/ml albuminy z surowicy bydlęcej, ph 8,0. Pomiędzy cyklami przeciwciało na mikroukładzie było regenerowane mm kwasem chlorowodorowym. Dane zostały zestawione z wykorzystaniem oprogramowania analitycznego BIACORE T0 (wersja 1.1.1), a następnie wczytane do programu EXCEL w celu dodatkowej obróbki. [013] Oczyszczone przeciwciała monoklonalne anty-il-21 zostały scharakteryzowane i przypisane do grup epitopowych. Sygnał (RU, ang. response units, jednostki odpowiedzi) podawany przez BIACORE jest bezpośrednio skorelowany z masą na powierzchni mikroukładu czujnikowego. Po oznaczeniu sygnału tła (RU), związanego z próbką stanowiącą kontrolę negatywną (wykorzystano to samo przeciwciało monoklonalne anty-il-21 jako przeciwciało pierwszorzędowe i drugorzędowe), wyniki grupowania zostały odnotowane jako wiązanie pozytywne lub negatywne. Wiązanie pozytywne oznacza, że dwa różne przeciwciała monoklonalne przeciwko IL-21 są zdolne do jednoczesnego wiązania antygenu. Wiązanie negatywne oznacza, że dwa różne przeciwciała monoklonalne przeciwko IL-21 nie są zdolne do jednoczesnego wiązania antygenu. Różnica pomiędzy wartościami odpowiedzi pozytywnych i negatywnych w tym eksperymencie była znacząca i pozwoliła na jednoznaczne przypisanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko IL-21 do sześciu różnych rodzin lub grup epitopowych. Pierwsza grupa epitopowa była reprezentowana przez przeciwciała monoklonalne anty-il-21, na przykład z klonów ; i Druga grupa epitopowa była reprezentowana przez przeciwciała monoklonalne przeciwko IL-21, na przykład z klonów ; ,1 i Wykazano także, że w przypadku dodatkowej trzeciej grupy wystąpiło nakładanie się epitopów wiążących dla przeciwciał z grupy 1 i grupy 2. Była ona reprezentowana przez przeciwciała monoklonalne na przykład z klonu Przeciwciała neutralizujące IL-21 występowały w każdej z tych trzech grup. [014] Zidentyfikowano także trzy dodatkowe grupy epitopowe. Każda z grup była reprezentowana przez przeciwciała monoklonalne, na przykład z klonów komórek hybrydoma (grupa nr 4), (grupa nr ) i (grupa nr 6). Przeciwciała zidentyfikowane w tych trzech grupach nie neutralizują aktywności biologicznej ludzkiej IL-21. Przykład 6-Badania kompetycyjne receptorów rozpuszczalnych [01] Eksperymenty kompetycyjne przeprowadzono w celu określenia, które przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-21 jest zdolne do wiązania IL-21 jednocześnie z rozpuszczalnym receptorem IL-21. Przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-21, które współzawodniczą z rozpuszczalnym receptorem o to samo lub nakładające się miejsce wiązania (epitop) antygenu, nie mogą wiązać się jednocześnie. Przeciwciała monoklonalne przeciwko IL-21, które nie współzawodniczą z rozpuszczalnym receptorem o to samo miejsce wiązania antygenu, mogą wiązać się jednocześnie. Eksperymenty kompetycyjne zostały przeprowadzone z wykorzystaniem rozpuszczalnej, rekombinowanej ludzkiej IL-21 w roli antygenu. Przed badaniem współzawodnictwa z rozpuszczalnym receptorem IL-21 umożliwiono antygenowi IL-21 związanie przeciwciała monoklonalnego. W badaniach tych zastosowano dwa warianty rozpuszczalnego receptora IL-21 (oba wyprodukowane przez ZymoGenetics) do analizy przeciwciał monoklonalnych: Pierwszy wariant receptora zawierał homodimeryczny receptor (IL-21R-Fc) składający się z domeny pozakomórkowej 1

53 receptora IL-21 połączonej z cząsteczką Fc pochodzącą z ludzkiej immunoglobuliny. Druga postać receptora rozpuszczalnego to receptor heterodimeryczny (IL-21 R/γc-Fc) składający się z jednej podjednostki zawierającej domenę pozakomórkową receptora IL-21 połączoną z cząsteczką Fc pochodzącą z ludzkiej immunoglobuliny i drugiej podjednostki zawierającej domenę pozakomórkową wspólnego łańcucha γ połączoną z cząsteczką Fc pochodzącą z ludzkiej immunoglobuliny, jak opisano we wspólnie posiadanym patencie St. Zjedn. nr [016] Eksperymenty kompetycyjne przeprowadzono z wykorzystaniem systemu BIACORE T0 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Metody zostały zaprogramowane przy użyciu oprogramowania BIACORE T0 Control Software, v Indywidualne przeciwciała monoklonalne przeciwko IL-21 zostały unieruchomione kowalencyjnie w oddzielnych komórkach przepływowych mikroukładu czujnikowego BIACORE CM4. Następnie wstrzyknięto antygen IL-21 (SEKW. NR: 2) i umożliwiono mu specyficzne związanie z przeciwciałem monoklonalnym unieruchomionym na mikroukładzie czujnikowym. Urządzenie Biacore mierzy masę białka związanego z powierzchnią mikroukładu czujnikowego, dzięki czemu w każdym cyklu badawczym dokonano weryfikacji immobilizacji pierwszego przeciwciała, oraz specyficznego wiązania antygenu IL-21 z pierwszym badanym przeciwciałem. Po związaniu antygenu IL-21, wstrzyknięto rozpuszczalny receptor i umożliwiono jego wiązanie. Jeśli rozpuszczalny receptor wykazywał zdolność do wiązania antygenu jednocześnie z pierwszym badanym przeciwciałem monoklonalnym, objawiało się to jako wzrost masy na powierzchni mikroukładu, świadczący o wiązaniu. Jeśli jednak rozpuszczalny receptor nie wykazywał zdolności do wiązania antygenu jednocześnie z pierwszym badanym przeciwciałem monoklonalnym, objawiało się to jako brak wzrostu masy, świadczący o braku wiązania. Każde przeciwciało monoklonalne anty IL-21 zostało zbadane względem samego sobie, co zostało potraktowane jako kontrolna próbka negatywna i umożliwiło określenie wartości sygnału tła (odpowiadającego brakowi wiązania). Jako pozytywna próba kontrolna każde z przeciwciał monoklonalnych anty-il-21 było testowane względem przeciwciała anty-il-21 z innej grupy epitopowej w celu określenia poziomu sygnału pozytywnego (odpowiadającego wiązaniu). [017] Przeprowadzono szereg eksperymentów w celu określenia właściwości wiązania oczyszczonych przeciwciał monoklonalnych anty-il-21 (z klonów komórek hybrydoma , , , , i ) wiążących ludzką IL-21. Pierwsze przeciwciało monoklonalne anty-il-21 z badanej pary zostało unieruchomione kowalencyjnie z wykorzystaniem mieszaniny zawierającej 0,4 M EDC [N-etylo-N -(3-dietyloaminopropylo)karbodiimidu] i 0,1 M NHS (N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego) do uzyskania gęstości ok. 00 RU. Po unieruchomieniu przeciwciała, miejsca aktywne w komórkach przepływowych zostały zablokowane 1 M etanoloaminą. Antygen IL-21 rozcieńczono do 0 nm i umieszczono na powierzchni unieruchomionych przeciwciał. Następnie rozpuszczalny receptor rozcieńczono do µg/ml i umożliwiono mu związanie się z wychwyconym antygenem IL-21. Eksperymenty dotyczące wiązania wykonywano przy szybkości przepływu µl/min, w temperaturze 2 C. Bufor w tych badaniach składał się z mm Hepes, 0,3 M NaCl, 0,0% surfaktantu P, mm CaCl 2, 1 mg/ml albuminy z surowicy bydlęcej, ph 8,0. Pomiędzy cyklami kuweta przepływowa była przemywana mm kwasem chlorowodorowym w celu regeneracji powierzchni. Etap przemywania powodował 2

54 usunięcie antygenu IL-21 oraz jakiegokolwiek związanego rozpuszczalnego receptora z powierzchni immobilizowanych przeciwciał i umożliwiał przeprowadzenie wiązania kolejnej badanej próbki. Dane zostały zestawione z wykorzystaniem oprogramowania analitycznego BIACORE T0 (wersja 1.1.1). [018] Oczyszczone przeciwciała monoklonalne anty- IL-21 scharakteryzowano pod kątem ich zdolności do współzawodniczenia z rozpuszczalnym receptorem ludzkiego IL-21 o wiązanie do antygenu IL-21. Sygnał (RU, ang. response units, jednostki odpowiedzi) podawany przez BIACORE jest bezpośrednio skorelowany z masą na powierzchni mikroukładu czujnikowego. Po oznaczeniu poziomu tła (RU), związanego z próbką stanowiącą kontrolę negatywną (wykorzystano takie samo przeciwciało monoklonalne anty-il-21 jako przeciwciało pierwszorzędowe i drugorzędowe), wyniki dotyczące współzawodnictwa odnotowano jako wiązanie pozytywne lub negatywne. Wiązanie pozytywne oznacza, że przeciwciało monoklonalne anty-il-21 i rozpuszczalny receptor IL-21 są zdolne do jednoczesnego wiązania antygenu. Wiązanie negatywne oznacza, że przeciwciało monoklonalne anty-il-21 i rozpuszczalny receptor IL-21 nie są zdolne do jednoczesnego wiązania antygenu. Różnica pomiędzy wartościami odpowiedzi pozytywnych i negatywnych w tym eksperymencie była znacząca i pozwoliła na jednoznaczne określenie współzawodnictwa pomiędzy przeciwciałami monoklonalnymi anty-il-21 i rozpuszczalnym receptorem IL-21. [019] Przeciwciała monoklonalne uzyskane z klonów komórek hybrydoma i współzawodniczyły z obiema wersjami rozpuszczalnego receptora IL-21 (homodimeryczną IL-21R-Fc i heterodimeryczną IL-21R/γc-Fc) o wiązanie do ludzkiego antygenu IL-21. Przeciwciała monoklonalne uzyskane z klonów komórek hybrydoma i nie współzawodniczyły z żadną z wersji rozpuszczalnego receptora IL-21 o wiązanie do antygenu. Przeciwciała monoklonalne uzyskane z klonu komórek hybrydoma wykazywały częściowe współzawodnictwo o wiązanie z każdą z wersji rozpuszczalnego receptora. Badania te przeprowadzono z wykorzystaniem antygenu IL-21 uprzednio związanego z przeciwciałem monoklonalnym. Wykazano, że trzy spośród tych przeciwciał ( , , ) neutralizują ludzką IL-21, podczas gdy przeciwciała monoklonalne uzyskane z klonów komórek hybrydoma i wykazują, w zależności od testu, bardzo słabe lub brak neutralizowania aktywności biologicznej ludzkiej IL-21. Przykład 7 Test aktywności biologicznej IL-21 Baf3/huIL-21R STAT3 [0160] Następujący test biologiczny z ufosforylowanym STAT3 wykorzystano do wstępnej selekcji i pomiaru miana neutralizacji anty-il-21 w surowicy krwi mysiej oraz względnych poziomów neutralizacji IL-21 przez supernatant komórek hybrydoma i oczyszczone przeciwciała anty-il-21. Aktywność IL-21 została wyznaczona jako stopień fosforylacji STAT3 po wystąpieniu oddziaływania ligand-receptor w komórkach Baf3/KZ134/huIL-21R (zobacz Spolski i Leonard, Annu Rev Immunol. 8 listopada 07). Względny poziom aktywności neutralizacyjnej wyznaczono na podstawie spadku poziomu ufosforylowanego STAT3 wykorzystując stężenie EC 0 IL-21 i wyznaczenie miana antagonisty. [0161] Komórki Baf3/KZ134/huIL-21R przemyto dwukrotnie pożywką testową (RPMI 1640 zawierającą % płodową surowicą bydlęcą, 1x Glutamax, 1% pirogronianu sodu i 2 µm β-merkaptoetanol; wszystkie produkcji Invitrogen, Carlsbad, CA) przed wysianiem w ilości komórek/dołek w 96- dołkowych okrągłodennych płytkach do hodowli tkankowej (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). 3

55 Komórki umieszczono w inkubatorze do hodowli tkankowej w temperaturze 37 C na czas przygotowywania roztworów testowych. W celu oznaczenia stężeń EC 0 i EC 90 IL-21 w tym teście, sporządzono szereg rozcieńczeń rekombinowanej ludzkiej IL-21 w pożywce testowej i wysiano w oddzielnej płytce 96-dołkowej z dnem U-kształtnym. Alternatywnie, jako test na neutralizację IL-21, IL- 21 w stężeniu EC 0 (określonym jako 33 pm) preinkubowano wraz z serią rozcieńczeń surowicy myszy immunizowanych IL-21, wykorzystaną pożywką komórek hybrydoma, oczyszczonym rozpuszczalnym ludzkim IL-21R/γc-Fc lub oczyszczonymi przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko IL-21. Zarówno płytka z komórkami jak i płytka z roztworem zostały poddane inkubacji w nawilżonej komorze do hodowli tkankowej przez pozostawienie do ustabilizowania na minut w temperaturze 37 C i przy % CO 2. Po upływie minut zapoczątkowano przebieg reakcji przenosząc roztwory IL-21 na płytkę z komórkami, a następnie inkubowano przez minut w temperaturze 37 C i przy % CO 2. [0162] Po -minutowej inkubacji reakcje zatrzymano przez umieszczenie płytki na lodzie i dodanie do każdego dołka 12 µl lodowatego buforu do przemywania komórek (BIO-PLEX Cell Lysis Kit, BIO- RAD Laboratories, Hercules, CA). Następnie komórki odwirowano przy 0 obr./min w temperaturze 4 C przez minut, po czym pożywkę odessano. Aby spowodować lizę komórek, do każdego dołka dodano 0 µl buforu buforu do lizy (przygotowanego zgodnie z instrukcjami producenta, BIO-RAD Labs). Lizaty komórkowe, wciąż umieszczone na lodzie, zostały wymieszane przez pięciokrotne zassanie i wypuszczenie pipetą a następnie poddane wytrząsaniu na wytrząsarce do mikropłytek przez minut przy szybkości 600 obr./min i w temperaturze 4 C. Następnie płytki odwirowano przy 00 obr./min w temperaturze 4 C i w czasie minut. Supernatanty zostały zebrane i przeniesione na nową płytę do mikromiareczkowania a następnie zmieszane w stosunku 1:1 z buforem testowym (BIO-RAD) do przechowania w temperaturze - C. [0163] Kulki wychwytujące (BIO-PLEX Phospho-STAT3 Assay, BIO-RAD Laboratories) zostały rozcieńczone i umieszczone na płytce filtrującej 96-dołkowej (Millipore Corporation, Irlandia) zgodnie z instrukcjami producenta. Płytki przemyto buforem przemywającym (Wash Buffer, BIO-RAD) i 0 µl mieszaniny lizatu komórkowego przeniesiono do każdego dołka. Każdą z płytek owinięto następnie folią aluminiową i wytrząsano przez noc w temperaturze pokojowej i przy 0 obr./min. Kolejnego dnia płytkę przeniesiono do mikrotitratora próżnowego i przemyto dwukrotnie buforem przemywającym. Po dodaniu do każdego dołka po 2 µl roztworu przeciwciał wykrywających (BIO-RAD), przykrytą folią płytkę inkubowano w temperaturze pokojowej w czasie minut wytrząsając przy 0 obr./min. Płytkę odfiltrowano i przemyto dwukrotnie buforem przemywającym. Dodano streptawidynę-pe (Streptavidin- PE, BIO-RAD; 0 µl/dołek) i przykrytą folią płytkę inkubowano w temperaturze pokojowej w czasie 1 minut wytrząsając przy 0 obr./min. Płytkę odfiltrowano i przemyto dwukrotnie, po czym ponownie zawieszono w 12 µl/dołek buforu do ponownego zawieszania kulek (Bead Resuspension Buffer, BIO- RAD). Poziom ufosforylowanego STAT3 został następnie wyznaczony z wykorzystaniem czytnika macierzowego (BIO-PLEX, BIO-RAD Laboratories) zgodnie z instrukcjami producenta. Analizę danych przeprowadzono z wykorzystaniem oprogramowania analitycznego (BIO-PLEX MANAGER 3.0, BIO- RAD Laboratories). Wzrost poziomu czynnika transkrypcji ufosforylowanego STAT3, obecnego w lizatach, świadczył o oddziaływaniu receptora IL-21 z ligandem. W przypadku testów neutralizacji spadek poziomu czynnika transkrypcji ufosforylowanego STAT3, obecnego w lizatach, świadczył o 4

56 neutralizacji oddziaływaniu receptora IL-21 z ligandem. Wartości IC 0 (stężenie antagonisty skutkujące 0-procentowym zablokowaniem aktywności ligandu) zostały obliczone z wykorzystaniem oprogramowamia GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, Inc., San Diego CA) i wyrażone jako stężenia molowe dla każdego reagenta w teście neutralizacji. [0164] Ludzka IL-21 indukowała fosforylację STAT3 w stopniu zależnym od dawki, z wartością stężenia EC 0, wyznaczoną na poziomie około 33 pm. W Tabeli 7 zebrano wartości IC 0 dla kontroli pozytywnej (rozpuszczalne ludzkie białko fuzyjne IL-21R/γc- Fc) i czynników neutralizujących IL-21 opisanych w tym dokumencie. Dane te wskazują, że przeciwciała neutralizujące IL-21 były aktywne i takie same, lub przewyższające kontrolę pozytywną w redukcji fosforylacji STAT3 wywołanej IL-21. Tabela 7: Wartości IC0 w teście fosforylacji STAT3 IC0 (pm) IC0 (pm) IC0 (pm) Eksperyment 1 Eksperyment 2 Eksperyment 3* Rozpuszczalny hil ,2 R/γc-Fc Nr klonu mab IL Brak neutr , CHO (A2162F) 42, Słaba * - Eksperyment 3 przeprowadzono przy użyciu 96 pm IL Przykład 8 Oznaczenie aktywności biologicznej IL-21 Baf3/huIL-21R STAT-lucyferaza [016] To 24-godzinne oznaczenie służy do pomiaru aktywności STAT-lucyferazy indukowanej IL-21 w komórkach transfekowanych Baf3/KZ134/huIL-21R. Komórki transfekowane Baf3/KZ134/huIL-21R przemyto dwukrotnie pożywką testową (wolną od czerwieni fenolowej RPMI 1640 zawierającą % płodową surowicę bydlęcą, 1x Glutamax, 1% pirogronian sodu i 2 µm β-merkaptoetanol; wszystkie produkcji Invitrogen, Carlsbad, CA) przed wysianiem w ilości komórek/dołek na 96-dołkowe płaskodenne nieprzeźroczyste białe płytki do hodowli tkankowej (Corning/Costar, Lowell, MA). Komórki następnie umieszczono w inkubatorze do hodowli tkankowej na czas przygotowywania roztworów testowych. Na osobnej płytce, zmieszano ludzką IL-21 albo z pożywką, albo z zestawem antagonistów IL-21 (albo przeciwciał monoklonalnych albo rozpuszczalnym receptorem ludzkiej IL- 21/γc-Fc). Płytka ta, po zmieszaniu, także została umieszczona w nawilżonym inkubatorze do hodowli tkankowej w temperaturze 37 C. Po upływie minut roztwory testowe zostały przeniesione na płytkę komórkową i zmieszane. Płytkę tę następnie umieszczono w inkubatorze na okres 24 godzin. Po upływie 24 godzin komórki zostały usunięte z inkubatora i pozostawione do wystudzenia w

57 temperaturze pokojowej. Zawartość każdego dołka rozcieńczono w stosunku 1:1 0 µl roztworu odczynnika Steady-Glo Luciferase (Promega, Madison, WI) i dokładnie zmieszano. Płytkę przykryto i wytrząsano w temperaturze pokojowej w czasie minut, po czym określono wartość względnych jednostek lucyferazy (RLU) z wykorzystaniem luminometru. [0166] W celu oznaczenia stężeń EC 0 i EC 90 IL-21 w tym teście przebadano szereg rozcieńczeń w zakresie od 0 do 0 ng/ml rekombinowanej ludzkiej IL- 21. Do kolejnych eksperymentów neutralizacji stosowano stężenie EC 90 IL-21,-1 ng/ml (961 pm). W tych eksperymentach klony (i jego podklony i wyrażane w CHO odpowiedniki, CHO; zobacz Przykład 1) oraz wykazywały największą aktywność anty-il-21, z wartościami stężeń IC 0 w zakresie 0-80 pm, podczas gdy wartości IC 0 dla rozpuszczalnego receptora ludzkiej IL-21 / kontroli γc-fc zawierały się w zakresie pm. Względne aktywności czynników neutralizujących opisanych w tym dokumencie zostały zebrane w Tabeli 8. Tabela 8: Wartości IC 0 w 24-godzinnym oznaczeniu STAT-lucyferazy IC0 (pm) Eksperyment 1 IC0 (pm) Eksperyment 2 IC0 (pm) Eksperyment 3* Rozpuszczalny hil- 21R/γc-Fc Nr klonu mab IL Brak neutr CHO (A2162F) Przykład 9-Aktywność w reakcji krzyżowej wobec IL-21 makaka jawajskiego, myszy i szczurów [0167] Międzygatunkowe badania reakcji krzyżowej (zwłaszcza w przypadku reakcji krzyżowych pomiędzy naczelnymi niebędącymi ludźmi) należy wykonać przed farmakologicznymi/toksykologicznymi badaniami przedklinicznymi, gdy opracowuje się antagonistę o znaczeniu terapeutycznym. W celu określenia, czy jednostki neutralizujące, skierowane przeciwko ludzkiej IL-21, opisane w tym dokumencie, mogą ulegać reakcji krzyżowej i neutralizować aktywność wywołaną przez IL-21 makaka jawajskiego, mysią IL-21 czy szczurzą IL-21 (uzasadniając tym samym wybór makaków jawajskich, myszy i/lub szczurów jako odpowiedniego gatunku do prowadzenia testów), niezbędne było wykazanie aktywności biologicznej rekombinowanej IL-21 makaka jawajskiego oraz mysiej i szczurzej IL-21. Metody wyznaczania aktywności STAT-lucyferazy indukowanej przez IL-21, opisane w Przykładzie 8, zostały zastosowane w celu wyznaczenia wartości 6

58 1 EC 0 i EC 90 w przypadku rekombinowanej ludzkiej IL-21, IL-21 makaka jawajskiego, mysiej IL-21 i szczurzej IL-21 (wszystkie wyprodukowane w ZymoGenetics). Wyniki wskazują na duże różnice wyznaczonych w tym teście poziomach aktywności STAT-lucyferazy wywołanej przez ludzką, mysią IL-21 czy IL-21 makaka jawajskiego. Wyznaczone wartości EC 90 wykorzystane w kolejnych eksperymentach są następujące: 961 pm w przypadku ludzkiej IL-21; 2 pm w przypadku IL-21 makaka jawajskiego; 6,41 nm w przypadku mysiej IL-21 i 1,08 nm w przypadku szczurzej IL-21. Rozpuszczalny receptor IL-21 (hil-21r/γc-fc) neutralizuje efekt makaka jawajskiego, mysiej i szczurzej. [0168] IL-21. Dodatek oczyszczonych przeciwciał monoklonalnych anty-il-21 podanych w Tabeli 9 powodował neutralizację IL-21 makaka jawajskiego w zmiennym stopniu, lecz nie powodował neutralizacji mysiej lub szczurzej IL-21 (należy mieć na uwadze, że wyłącznie CHO i zostały przetestowane przeciwko szczurzej IL-21). Wartości IC 0 dla neutralizacji IL-21 makaka jawajskiego przez czynniki neutralizujące opisane w tym dokumencie zawierały się w zakresie od 0 pm do 431 pm i zostały zebrane w Tabeli 9. Należy zauważyć, że najlepsze przeciwciała neutralizujące ludzką IL-21 mogły także skutecznie neutralizować IL-21 makaka jawajskiego, lecz nie mysią IL-21 czy szczurzą IL-21. Dodatkowo, wytworzone przez komórki CHO mab IL-21 ( CHO) przetestowano w niezależnym eksperymencie stosując stężenie IL-21 makaka jawajskiego równe 800 pm. Tabela 9: Reakcja krzyżowa antagonistów hil-21 wobec IL-21 makaka jawajskiego, myszy i szczurów w oznaczeniu STAT-lucyferazy. Cyno IL-21 IC0 ([cil-21] Murine IL-21 IC0 ([mil- Rat IL-21 ICso [ril-21] = = 0 pm) 21] = 6,41 nm) 1,08 nm) ng/ml Stęż. ng/ml Stęż. ng/ml Stęż. molowe molowe molowe Rozpuszczalny 38 pm 42,8 8,06 nm 707, 13,4 nm hil-21r/γc-fc Klon mab [anty-]il-21: słaba -- brak brak N/T N/T pm brak brak N/T N/T CHO 2 1,7 nm brak brak brak brak (A2162F)* pm brak brak N/T N/T pm brak brak brak brak pm brak brak N/T N/T * - Uwaga: Klon CHO (Przykład 1b) zbadano stosując stężenie 800 pm cil-21 zamiast stężenia 0 pm stosowanego w innych eksperymentach. N/T = nie badano. 7

59 Przykład -Test komórkowy oceniający potencjalną reakcję krzyżową wobec IL-4 [0169] Przy opracowywaniu antagonisty cytokiny o znaczeniu terapeutycznym istotne jest stwierdzenie, czy będzie on ulegać reakcji krzyżowej i neutralizować cytokiny zbliżone strukturalnie. Ten test proliferacji pierwotnych limfocytów B został opracowany w celu przebadania czynników neutralizujących IL-21 opisanych w tym dokumencie, pod kątem reakcji krzyżowej i neutralizacji ludzkiej IL-4. [0170] Izolacja pierwotnych limfocytów B: W celu uzyskania pierwotnych limfocytów B, pobrano 0 ml krwi obwodowej od zdrowych ludzkich ochotników (ZymoGenetics). Krew rozcieńczono do 400 ml, dodając PBS o temperaturze pokojowej i sporządzono porcje po 3 ml w probówkach stożkowych 0 ml. Pod spód wlano czternaście ml roztworu Ficoll/Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) o temperaturze pokojowej i probówki wirowano przez minut z szybkością 00 obr./min. Odciągnięto warstwę graniczną PBMC i przemyto dwukrotnie buforem MACS (PBS, HEPES ml, i 1% BSA; Invitrogen, Carlsbad, CA). Komórki zliczono, a limfocyty B zostały poddane negatywnej selekcji z wykorzystaniem zestawu do izolacji limfocytów B (ang. B Cell Isolation Kit) produkcji Miltenyi Biotec (Auburn, CA) postępując zgodnie z protokołem przedstawionym przez producenta. Niewielką próbkę oczyszczonych limfocytów B przetestowano pod kątem czystości wykonując analizę FACS, we wszystkich eksperymentach znajdowało się >97% czystych limfocytów B CD19+. [0171] Oznaczenie proliferacji: Limfocyty B ulegają proliferacji w odpowiedzi na hodowlę IL-4 w obecności unieruchomionych przeciwciał anty-igm. W celu stwierdzenia potencjalnej reakcji krzyżowej i neutralizacji IL-4 przez przeciwciała monoklonalne (mab) przeciwko IL-21, uprzednio wyizolowane limfocyty B zostały najpierw wysiane w ilości komórek/dołek w 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowych z dnem U-kształtnym (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) opłaszczonej wcześniej 1,0 µg/ml anty-igm (Southern Biotech, Birmingham, AL). Komórki potraktowano następnie rekombinowaną ludzką IL-4 w stężeniu ng/ml (R&D Systems; Minneapolis, MN) i serią do miareczkowania antagonistą IL-21 (przeciwciała testowe lub roztwór kontrolny). Komórki inkubowano następnie przez 3 dni w temperaturze 37 C i przy % CO 2 w nawilżonym inkubatorze do hodowli tkankowych. Po upływie trzech dni komórki poddano impulsowi 1 µci/dołek [ 3 H]-tymidyny (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Po upływie 16 godzin, komórki zebrano na filtrze z włókna szklanego i określono ilość włączonego [ 3 H] wykorzystując licznik cząstek beta (Topcount NXT, Packard). Żadne z trzech testowanych przeciwciał monoklonalnych przeciwko IL-21 ( , i ) nie wykazywało jakiejkolwiek neutralizacji proliferacji indukowanej przez IL-4 aż do -krotnego nadmiaru molowego. Przykład 11 11A. Test komórkowy oceniający potencjalną reakcję krzyżową wobec IL-2 i IL-1 [0172] Przy opracowywaniu antagonisty cytokiny o znaczeniu terapeutycznym istotne jest stwierdzenie, czy będzie on ulegać reakcji krzyżowej i neutralizować cytokiny zbliżone strukturalnie. W mysiej linii limfocytów T można indukować proliferację CTLL-2 w odpowiedzi na ludzką IL-2 lub IL-1. Z tego powodu wybrano ten test w celu przebadania czynników neutralizujących IL-21 opisanych w niniejszym dokumencie, pod kątem reakcji krzyżowej oraz neutralizacji ludzkich IL-2 i IL-1. 8

60 [0173] Komórki CTLL-2 przemyto trzykrotnie w pożywce do testu biologicznego proliferacji (RPMI 1640, 2x Glutamax, % FBS, 2x NaPyr, 1x β-merkaptoetanol i mm Hepes; Invitrogen, Carlsbad, CA), i wysiano w ilości 0000 komórek na dołek w 96-dołkowej okrągłodennej płytce do hodowli tkankowych (Becton Dickinson, Franklin Falls, NJ). Do komórek tych dodano określoną uprzednio dawkę EC 90 albo IL-2 (3,0 ng/ml) lub IL-1 (0, ng/ml), w połączeniu z seryjnymi rozcieńczeniami czynników neutralizujących IL-21. Stosunek cytokiny do przeciwciała zawierał się w zakresie od - krotnego nadmiaru molowego do 1:1. Przeciwciała neutralizujące anty-il-21 lub anty-il-1 (oba z R&D Systems, Minneapolis, MN) zastosowano jako kontrolę pozytywną. Komórki inkubowano następnie w czasie 24 godzin w temperaturze 37 C i przy % CO 2 w nawilżonym inkubatorze do hodowli tkankowych. Po upływie 24 godzin komórki poddano pulsowi 1 µci/dołek [ 3 H]-Tymidyny (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Szesnaście godzin później komórki zebrano na filtrze z włókna szklanego i określono ilość włączonego [ 3 H] wykorzystując licznik cząstek beta (Topcount NXT, Packard). [0174] Wyniki: Żadne z trzech testowanych przeciwciał monoklonalnych anty-il-21 ( , i ) nie wykazywało neutralizacji proliferacji indukowanej przez IL-2 lub IL B.-Potwierdzenie z wykorzystaniem powierzchniowego rezonansu plazmonowego (Biacore), że mab CHO IL-21 nie wiąże ludzkich cytokin IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 lub IL-1 spokrewnionych z IL- 21. [017] Przebadano mab CHO anty-il-21 z wykorzystaniem powierzchniowego rezonansu plazmonowego pod kątem potencjalnej reakcji krzyżowej z ludzką IL-2, ludzką IL-4, ludzką IL-7, ludzką IL-9 i ludzką IL-1. [0176] Materiały i metody: Wykonano eksperymenty w celu zbadania reakcji krzyżowej przeciwciała monoklonalnego CHO anty-il-21, dla ludzkiej IL-2, ludzkiej IL-4, ludzkiej IL-7, ludzkiej IL-9 i ludzkiej IL-1. Badania wiązania wykonano z wykorzystaniem BIACORE T0 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Metody zostały zaprogramowane przy użyciu oprogramowania BIACORE T0 Control Software, v 2.0. Kozie przeciwciało specyficzne przeciwko fragmentowi Fc-gamma ludzkiej IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) unieruchomiono kowalencyjnie w komórkach przepływowych 1 i 2 mikroukładu czujnikowego CM4 wykorzystując reakcję chemiczną sprzęgania amin (EDC:NHS). Oczyszczone przeciwciało monoklonalne CHO przeciwko IL-21 zostało następnie wychwycone w komórce przepływowej 2 mikroukładu czujnikowego przy gęstości ok. 240 RU. Kuweta przepływowa 1 została wykorzystana jako powierzchnia odniesienia. [0177] IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 i IL-1 (wszystkie nabyte od R&D Systems, Minneapolis, MN) wstrzyknięto nad powierzchnią wychwyconego przeciwciała (kuweta przepływowa nr 2) i komórką przepływową odniesienia (kuweta przepływowa 1) dla stężenia 0, i 4 nm. Jako kontrola pozytywna dla tego zbioru eksperymentów, została także wstrzyknięta IL-21 (wyprodukowana przez ZymoGenetics) w takim samym stężeniu. Badania wiązania wykonano przy szybkości przepływu 2 µl/min, dla czasu asocjacji 2 minuty i czasu dysocjacji 3 minuty. Wszystkie eksperymenty dotyczące wiązania wykonywano w temperaturze 2 C, w buforze zawierającym mm HEPES, 0 mm NaCl, mm CaCl 2, 0,0% surfaktantu P (Biacore), 1 mg/ml albuminy z surowicy bydlęcej, ph 8,0. Pomiędzy 9

61 1 cyklami kuweta przepływowa była przemywana mm kwasem chlorowodorowym w celu regeneracji powierzchni. Etap przemywania powodował usunięcie zarówno wychwyconych przeciwciał CHO jak i jakichkolwiek związanych antygenów z powierzchni mikroukładu. Dane zestawiono przy pomocy oprogramowania analitycznego BIACORE T0 (wersja 2.0). Obróbka danych polegała na odjęciu wyników uzyskanych dla przepływowej komórki odniesienia i wartości ślepych prób. Stabilność linii bazowej została zweryfikowana w celu potwierdzenia, iż krok regeneracji umożliwia uzyskanie powtarzalnych wyników dotyczących wiązania na powierzchni podczas całej sekwencji wstrzykiwań. [0178] Wyniki: Nie zaobserwowano wiązania IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 lub IL-1 do przeciwciała CHO. W odróżnieniu od tego, kontrola pozytywna IL-21 wykazała wiązanie zależne od dawki, w zgodzie w poprzednimi badaniami. [0179] Zaobserwowany brak reaktywności krzyżowej wyjaśniono później badaniami z mapowaniem epitopów klonu (zobacz Przykład 17). Aminokwasy zlokalizowane w pobliżu D-helisy IL-21 wykazane jako wiązane przez klon (EKKPPKEFLERFKSLL; SEKW. NR: 2 z reszt 129 do 144)) nie są dobrze zachowane pomiędzy spokrewnionymi ludzkimi cytokinami łańcucha gamma, ani także w mysiej IL-21, jak pokazano poniżej w Tabeli. Tabela IL21_LUDZKA TCPSCDSYEKK--PPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSTHGSEDS IL21_MYSIA KCPSCDSYEKR--TPKEFLERLKWLLQKMIHQHLS IL1_ LUDZKA CKECEELEEK--NIKEFLQSFVHIVQMFINTS IL2_ LUDZKA TTFMCEYADET-ATIVEFLNRWITFCQSIISTLT IL4_ LUDZKA ---GLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSS IL7_ LUDZKA ----SLEENKSLKEQKK-LNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH IL9_ LUDZKA CEQPCNQTTAG--NALTFLKSLLEIFQKEKMRGMRGKI 2 [0180] Ludzka IL-21 została przedstawiona jako SEKW. NR:2; mysia IL-21 została przedstawiona jako SEKW. NR:11; ludzka IL-1 została przedstawiona jako SEKW. NR:92; ludzka IL-2 została przedstawiona jako SEKW. NR:93; ludzka IL-4 została przedstawiona jako SEKW. NR:94; ludzka IL-7 została przedstawiona jako SEKW. NR:9; ludzka IL-9 została przedstawiona jako SEKW. NR:96. Przykład 12-Testy proliferacji limfocytów B Testy pierwotnych limfocytów B [0181] Opracowano dwa testy dla pierwotnych limfocytów B w celu dalszego zbadania aktywności czynników neutralizujących IL-21. Test proliferacji limfocytów B został wykorzystany w celu wykazania neutralizacji indukowanej przez IL-21 proliferacji w ciągu 4 dni, a test różnicowania limfocytów B wykazał neutralizację indukowanego przez IL-21 różnicowania komórek osocza w ciągu 8 dni. Eksperymenty te wykazały neutralizację IL-21 w długoterminowych oznaczeniach w warunkach odpowiadających warunkom biologicznym. [0182] Izolacja pierwotnych ludzkich limfocytów B: W celu uzyskania pierwotnych limfocytów B, pobrano 0 ml krwi obwodowej od zdrowych ludzkich ochotników (ZymoGenetics). Krew została rozcieńczona 0 ml PBS o temperaturze pokojowej i sporządzono porcje po 3 ml w probówkach stożkowych 0 ml. Pod spód wlano czternaście ml roztworu Ficoll/Hypaque (Pharmacia, Uppsala, 60

62 1 Szwecja) o temperaturze pokojowej i probówki wirowano przez minut z szybkością 00 obr./min. Odciągnięto warstwę graniczną PBMC i przemyto dwukrotnie buforem MACS (PBS, HEPES ml, i 1% BSA; Invitrogen, Carlsbad, CA). Komórki zliczono, a limfocyty B zostały poddane negatywnej selekcji z wykorzystaniem zestawu do izolacji limfocytów B (ang. B Cell Isolation Kit) produkcji Miltenyi Biotec (Auburn, CA) postępując zgodnie z protokołem przedstawionym przez producenta. Niewielką próbkę oczyszczonych limfocytów B przetestowano pod kątem czystości wykorzystując analizę FACS, otrzymując we wszystkich eksperymentach czystość >97%. [0183] Oznaczenie proliferacji: Limfocyty B ulegają proliferacji w odpowiedzi na hodowlę z przeciwciałami anty-cd40 i IL-21. W celu określenia aktywności neutralizacji przeciwciał monoklonalnych (mab) anty-il-21, limfocyty B zostały wysiane do dołków w ilości komórek/dołek na 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowych z dnem U-kształtnym (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Komórki potraktowano następnie 0,1 µg/ml anty-cd40 (kozim przeciwciałem poliklonalnym przeciwko ludzkiemu CD40; R&D Systems, Minneapolis, MN), 0 ng/ml (3,21 nm) rekombinowanej IL-21 (ZymoGenetics, A17F) i miareczkowano antagonistą IL-21 (testowe przeciwciała mab lub roztwór kontrolny). Płytkę z komórkami inkubowano następnie przez 3 dni w temperaturze 37 C i przy % CO 2 w nawilżonym inkubatorze. Po upływie trzech dni komórki poddano impulsowi 1 µci/dołek [ 3 H]-tymidyny (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Po upływie 16 godzin, komórki zebrano na filtrze z włókna szklanego i określono ilość włączonego [ 3 H] wykorzystując licznik cząstek beta (Topcount NXT, Packard). Obliczono krzywe IC 0 stanowiące miarę skutecznej neutralizacji proliferacji indukowanej przez IL-21 i wyrażono jako stężenie molowe. Wartości IC 0 dla najskuteczniejszych neutralizujących przeciwciał monoklonalnych (mab) opisanych w niniejszym dokumencie zawierały się w zakresie od 0,71 nm do 6, nm i zostały zestawione w Tabeli 11: Tabela 11: Neutralizacja IL-21 teście proliferacji limfocytów B Antagonista IL-21 IC0 (nm) Rozpuszczalny hil-21r/γc-fc 3, Brak neutralizacji , , , , 2 [0184] Test różnicowania limfocytów B: Różnicowanie dziewiczych limfocytów B w komórki osocza wytwarzające przeciwciała jest znacznie ułatwione in vitro, gdy IL-21 łączy się z przeciwciałem anty- CD40 i IL-4 (Ettinger i wsp., J Immunol. 17: , 0; Ettinger i wsp., J Immunol. 178: , 07; Kuchen i wsp. J Immunol. 179:886-96, 07). W celu wykazania aktywności w teście w dłuższym terminie niż w dwóch testach przesiewowych opartych o Baf3, opisanych w Przykładach 7 i 8, wykorzystano czynniki neutralizujące opisane w niniejszym dokumencie do neutralizacji IL-21 i hamowania różnicowania ludzkich komórek osocza. Aby to osiągnąć, pierwotne ludzkie limfocyty B wysiano w ilości 000 komórek/dołek w 96-dołkowej płaskodennej poddanej obróbce płytce do hodowli tkankowych (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Komórki potraktowano następnie 0,1 61

63 µg/ml anty-cd40 (kozim przeciwciałem poliklonalnym przeciwko ludzkiemu CD40; R&D Systems, Minneapolis, MN), ng/ml rekombinowanej ludzkiej IL-4 (R&D Systems) i 2 ng/ml (1,6 nm) rekombinowanej ludzkiej IL-21 (ZymoGenetics). Następnie dodano antagonistów IL-21 (testowe 1 2 przeciwciała mab lub roztwór kontrolny) i komórki inkubowano w temperaturze 37 C i przy % CO 2 przez osiem dni w nawilżonym inkubatorze. Po zakończeniu ośmiu dni, kondycjonowane pożywki zebrano (dla oznaczenia mian przeciwciał) a komórki osadzano (ang. pelleted) na potrzeby dalszej analizy metodą cytometrii przepływowej. [018] Analiza limfocytów B z wykorzystaniem cytometrii przepływowej: Komórki zawieszono ponownie w buforze do analizy FACS ludzkich komórek (HBSS, mm HEPES, 1% BSA (wszystkie z Invitrogen) i 2% ludzkiej surowicy typu AB (Gemini Bio-Products, Woodland, CA)) przez pięć minut w celu zablokowania receptorów Fc. Komórki następnie wirowano ( minut przy 10 obr./min) i zassano. Barwienie uzyskano przez rozcieńczenie przeciwciał 1:0 w buforze do analizy FACS ludzkich komórek i rozdzielenie w ilości 0 µl na próbkę. Pojedyncze barwienie (w celu regulacji ustawienia kompensacji cytometru) i mieszaninę wielobarwną (ang. multi-stain) wykonywano, stosując następujące przeciwciała: anty-cd138-fitc, anty-igd-pe, anty-cd38-pe-cy. i anty-cd19-apc. Komórki osocza zdefiniowano jako duże (oszacowane na podstawie rozproszenia światła na wprost) komórki CD19 +, IgD lo, CD38 + i CD Odsetek komórek osocza w stosunku do całkowitych limfocytów B wykorzystano do określenia skuteczności czynników neutralizujących opisanych w niniejszym dokumencie. [0186] Wyniki: W przypadku gdy IL-21 skojarzono z IL-4 i anty-cd40, w przybliżeniu 0% żywych, dużych limfocytów B w dniu 8 stanowiły komórki osocza IgD low, CD Bez IL-21, odsetek komórek osocza stanowił ~8% dużych limfocytów B. Dodanie różnych antagonistów IL-21 do hodowli zawierających IL-21 spowodowało zmniejszenie odsetka komórek osocza w sposób zależny od dawki. Klon był najskuteczniejszym czynnikiem zobojętniającym i niemal całkowicie neutralizował aktywność IL-21 przy proporcjach antagonista:ligand wynoszących :1 i 2.:1. Inne badane przeciwciała, klony i , były niemal tak samo skuteczne w neutralizacji różnicowania kierowanego przez IL-21. Dane te zestawiono w Tabeli 12. Tabela 12: Hamowanie różnicowania ludzkich komórek osocza przez neutralizujące przeciwciała monoklonalne (mab) anty-hil-21 Proporcja antagonista : ligand :1 2,:1 0,6:1 0,16:1 Antagonista IL-21 % komórek osocza IgD-low, CD ,7 1, 34,1 42, ,4,2 41,4 2, * 1,4 26,4 44,8 0,3 Receptor IL-21 23,4 41,7 4,2 66,7 *Należy zwrócić uwagę na to, że faktyczne proporcje antagonista:ligand dla klonu wynosiły 14,4, 3,6, 0,9 i 0,22:1 62

64 Przykład 13-Mysi model DTH [0187] Reakcje DTH stanowią klasyczne reakcje immunologiczne, które są inicjowane przez populację CD4+ limfocytów T i mediowane przez limfocyty T, neutrofile i makrofagi. Reakcja DTH jest dobrym wskaźnikiem odpowiedzi, w której pośredniczy populacja CD4+ limfocytów T. Myszy immunizowano podskórnie białkiem albuminy jaja kurzego (OVA) w jednym z 2 adiuwantów, kompletnym adiuwancie Freunda (CFA; Sigma) lub adiuwancie Ribi (Sigma; znanym również jako adiuwant MPL + TDM + CWS). Fazę tę określa się fazą uczulania (dni 0-6). Pomiary ucha wykonano siedem dni później. Myszom wstrzyknięto następnie do ucha kontrolny PBS (lewe ucho) lub OVA (prawe ucho). Fazę tę określa się fazą prowokacji (dni 7-8). Odpowiedzi immunologiczne wytworzone przeciwko OVA indukują stan zapalny w uchu, którego wynikiem jest zwiększenie w ciągu 24 godzin grubości ucha, do którego padano OVA, ale nie ucha, do którego podano PBS. Pomiar prowadzony jest przy użyciu suwmiarki. [0188] Myszy C7BL/6 (n=8/grupę) immunizuje się na grzbiecie 0 µg albuminy jaja kurzego (OVA) zemulgowanej w CFA, w całkowitej objętości 0 µl. Jeżeli zamiast CFA stosuje się Ribi, 0, mg/ml albuminy jaja kurzego dodaje się do pojedynczej fiolki RIBI i energicznie wytrząsa na worteksie przez 2 minuty do uzyskania emulsji, którą wstrzykuje się myszom. Siedem dni po immunizacji, myszom wstrzykuje się µl PBS w lewe ucho (kontrola) i µg OVA w PBS w prawe ucho w objętości µl. Grubość ucha u wszystkich myszy mierzy się przed wstrzyknięciem do ucha (pomiar 0). Grubość ucha mierzy się 24 godziny po prowokacji. Oblicza się różnicę grubości ucha pomiędzy pomiarem 0 a pomiarem po 24 godzinach i odzwierciedla ona stan zapalny w uchu. Grupom myszy wstrzykuje się dootrzewnowo PBS lub różne stężenia przeciwciała anty-il-21 albo od dni 0-6 (faza uczulania), albo od dni 7-8 (faza prowokacji). Wstrzyknięcie w dniu 7 i 8 wykonuje się 2 godziny przed pomiarem grubości ucha w punktach czasowych 0 i 24 godziny. Na koniec 24-godzinnego okresu, po zmierzeniu grubości ucha, uszy odcięto i umieszczono w formalinie do analizy histologicznej. Przykład 14-Mysi model stwardnienia rozsianego [0189] W celu sprawdzenia, czy przeciwciało anty-il-21 ma jakikolwiek wpływ na stwardnienie rozsiane, badana jest zdolność przeciwciał anty-il-21 do hamowania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE-MS), mysiego modelu MS. Stosowany jest dobrze scharakteryzowany zależny od limfocytów T model immunizacji myszy C7BL/6 peptydem 3- glikoproteiny mieliny oligodendrocytów (MOG). Eksperyment prowadzi się w celu określenia, czy przeciwciało anty-il-21 może opóźniać i/lub hamować wskaźniki choroby w EAE, czy to przez hamowanie prezentacji antygenu za pośrednictwem DC, czy przez wzmacnianie odpowiedzi populacji CD8 limfocytów T. Brak efektywnej odpowiedzi populacji CD8 limfocytów T w tym modelu zaostrza EAE (Malipiero i in., Eur. J. Immunol., 27: , 1997). Opóźnione wystąpienie choroby w modelu EAE w stopniu zależnym od dawki wskazuje na to, że stosowanie przeciwciała anty-il-21 może być korzystne w MS. [0190] EAE stanowi mysi model MS. W jednym takim modelu, myszy C7BL/6 immunizuje się 0 µg peptydu MOG (MOG3-) lub 0 µg rekombinowanego białka MOG w postaci emulsji w adiuwancie CFA. Dwa mililitry 0, mg/ml preparatu MOG3- w PBS dodaje się do fiolki CFA i energicznie wytrząsa do uzyskania emulsji lub przygotowywany jest roztwór w stosunku 1:1 rekombinowanego 63

65 MOG w CFA. Grzbiety myszy są golone i wstrzykuje się 0 µg MOG/CFA s.c. w grzbiet. Myszy są ważone 2 dni przed i codziennie po immunizacji. Myszom wstrzykuje się następnie w dniu 2 i.v. 0 µl toksyny krztuśca (PT), w końcowym stężeniu 0 ng/mysz. Myszy monitoruje się codziennie pod kątem wskaźników klinicznych. Grupom myszy wstrzykuje się i.p. 0 µl PBS, 0 µg BSA, µg-0 µg przeciwciała anty-il-21 w 0 µl objętości od dni 0-, lub 3x w tygodniu przez 3 tygodnie. Ocenia się masy ciała myszy, wskaźniki kliniczne i zapadalność i wykreśla w celu analizy. Przykład 1: Przeciwciało anty-mll-21 zmniejsza częstość występowania i postęp choroby w mysim modelu zapalenia jelita grubego i łuszczycy z adoptywnym transferem limfocytów T [0191] Adoptywny transfer dziewiczych limfocytów T do myszy z nieznacznym niedopasowaniem zgodności tkankowej lub syngenicznych myszy o obniżonej odporności prowadzi do rozwoju zapalenia jelita grubego (Leach MW i wsp. 1996, Powrie F i wsp., 1997) a także zmian skórnych przypominających łuszczycę (Schon MP i wsp., Nat Med. 2:183-8, 1997; Davenport CM i wsp., Int Immunopharmacol. :63-72, 02). Transplantacja jedynie 0,2 miliona limfocytów T CD4+CD2- od myszy BALB/C lub B.D2 do myszy SCID C.B-17 o obniżonej odporności daje w efekcie utratę wagi, dodatni wynik badania na krew utajoną w kale i rozwój zmian skórnych. Objawy u tych myszy różnią się w zależności od kolonii. [0192] Ten model zapalenia jelita grubego/łuszczycy wykazuje pewne podobieństwa do ludzkiej choroby Crohna i łuszczycy, i jest szeroko stosowany do badania skuteczności środków terapeutycznych na te choroby u ludzi. Na potrzeby tego eksperymentu, myszy (samice myszy dawców 8 B.D2; samice biorców 0 C.B-17 SCID) otrzymano odpowiednio z Jackson Laboratories lub Charles River Laboratories. Pobrano śledziony od 8 myszy B.D2. Limfocyty T CD4+ CD2- wyizolowano z połączonych śledzion korzystając ze standardowej metodologii znanej ze stanu techniki. Czystość populacji limfocytów T oceniono za pomocą cytometrii przepływowej. [0193] Naiwne myszy SCID C.B-17 otrzymały x limfocytów T CD4+ CD2- (wyizolowanych ze śledziony myszy B.D2) w iniekcji dożylnej w dniu 0. Wszystkie myszy ważono co najmniej pięciokrotnie na tydzień i uważnie obserwowano pod kątem utraty wagi, którą można wiązać z zapaleniem jelita grubego. Ponadto, uzyskiwano kliniczny wskaźnik zapalenia jelita grubego [konsystencja stolca i krew w kale] co najmniej jeden dzień w tygodniu. Myszy były również uważnie monitorowane co najmniej pięć dni w tygodniu i była im przypisywana ocena związana z objawami łuszczycy (wypadanie włosów, drapanie, łysienie plackowate itd.). [0194] Szczurze przeciwciało przeciwko mysiej IL-21 (mil-21), szczurze przeciwciało kontroli izotopowej lub nośnik (PBS) podano grupom myszy począwszy od dnia 0. Środki terapeutyczne dostarczano w postaci iniekcji dootrzewnowych, dwa razy w tygodniu, przy czym przeciwciała podawano w ilości 0,2 lub 0,8 mg na mysz na dawkę. Mogły być one również dostarczane z wykorzystaniem podobnego schematu dawkowania lub innej drogi podawania. Grupy liczyły 9 - myszy w grupach otrzymujących przeciwciała anty-il21, 6-7 myszy na grupę w grupach otrzymujących przeciwciała kontroli izotypowej oraz myszy na grupę w grupie otrzymującej PBS. Ten schemat dawkowania jest określany jako dawkowanie profilaktyczne. [019] W oddzielnym eksperymencie, w grupach myszy, u których stosowano takie same przeciwciała i dawki opisane powyżej ( myszy na grupę) rozpoczęto terapię w dniu 12 po transferze komórek, co 64

66 stanowi w przybliżeniu dzień, w którym u myszy zaczęły pojawiać się oznaki łuszczycy i/lub zapalenia jelita grubego. Ten schemat dawkowania jest określany jako dawkowanie terapeutyczne. [0196] Na koniec badania (dzień 4), tkankę okrężnicy poddano analizie histologicznej w poszukiwaniu oznak zapalenia jelita grubego, a surowicę analizie poziomów cytokin i chemokin. [0197] Wyniki dawkowania profilaktycznego: Myszy przyjmujące przeciwciało anty-mil-21 zarówno w dawce 0,2 jak i 0,8 mg charakteryzowały się znaczną (wartość p co najmniej < 0,0 lub lepsza) redukcją utraty masy ciała i znacznym ograniczeniem łuszczycowych zmian skórnych i objawów zapalenia jelita grubego w trakcie całego okresu eksperymentalnego w porównaniu z myszami, którym podawano PBS lub 0,2 mg przeciwciała monoklonalnego kontroli izotypowej. Na koniec badania (dzień 4), myszy którym podawano jedną z dawek przeciwciała anty-mil-21 miały w przybliżeniu 0% swojej początkowej masy ciała, podczas gdy myszy, którym podawano PBS straciły średnio 16% swojej początkowej masy ciała, a myszy którym podawano przeciwciało kontroli izotypowej straciły - 1% swojej początkowej masy ciała. W dniu 4, myszy, którym podawano jedną z dawek przeciwciała anty-mil-21 wykazywały w przybliżeniu 6, - 7-krotnie niższe średnie wskaźniki kliniczne zapalenia jelita grubego i w przybliżeniu - 7-krotnie niższe średnie wskaźniki łuszczycowych zmian skórnych. Jedynie u % myszy, którym podawano 0,2 mg przeciwciała anti-mll-21 rozwinęła się łuszczyca, która miała postać łagodną, przy czym u żadnej z myszy, którym podawano dawkę 0,8 mg nie rozwinęły się żadne objawy łuszczycowych zmian skórnych. Z drugiej strony, u 0% myszy, którym podawano PBS rozwinęła się łuszczyca, przy czym w przybliżeniu u 0% tych myszy rozwinęły się poważne objawy. Na koniec badania, nastąpiło również znaczne ograniczenie histologicznych wskaźników zapalenia jelita grubego (wskaźnik zapalenia jelit, zmian chorobowych i architektury) u myszy, którym podawano przeciwciało anty-mil-21 w porównaniu z myszami, którym podawano PBS i 0,2 mg kontroli izotypowej. [0198] Myszy, którym podawano przeciwciało anty-mil-21, wykazywały znacząco niższe poziomy w surowicy IL-6, RANTES, TNF-α i MIP-1β w porównaniu z myszami, którym podawano PBS, co dodatkowo potwierdza przeciwzapalną rolę przeciwciała anty-mil-21. [0199] Wyniki dawkowania terapeutycznego: Myszy przyjmujące przeciwciało anty-mil-21 zarówno w dawce 0,2 jak i 0,8 mg, rozpoczynając od dnia 12 po transferze limfocytów T, charakteryzowały się redukcją utraty masy ciała i znacznym ograniczeniem objawów zapalenia jelita grubego w trakcie całego okresu eksperymentalnego w porównaniu z myszami, którym podawano przeciwciało monoklonalne kontroli izotypowej. W dniu 4, myszy, którym podawano jedną z dawek przeciwciała anty-mil-21 wykazywały w przybliżeniu 3, - 4- krotnie niższe średnie wskaźniki kliniczne zapalenia jelita grubego w porównaniu z myszami, którym podawano przeciwciało kontroli izotypowej. Myszy, którym podawano 0,8 mg dawkę przeciwciała anty-mil-21 wykazywały niższe wskaźniki łuszczycy niż myszy, którym podawano przeciwciało kontroli izotypowej lub PBS. [00] Podsumowanie: Wyniki te, rozpatrywane łącznie, wskazują na to, że podawanie in vivo przeciwciała anty-mil-21 skutecznie ograniczało występowanie i nasilenie zapalenia jelita grubego i łuszczycy w mysim modelu przeniesienia limfocytów T, i sugerują, że przeciwciała anty-il-21 mogą być skuteczne w leczeniu nieswoistego zapalenia jelit i/lub łuszczycy u ludzi. Przykład 16-Mysi model nadwrażliwości kontaktowej 6

67 [01] Nadwrażliwość kontaktową można indukować u myszy za pomocą różnego rodzaju alergenów kontaktowych, w tym dinitrofluorobenzenu (DNFB) i oksazolonu. Myszy uczula się miejscowo alergenem w nośniku składającym się z acetonu i oliwy z oliwek a następnie prowokuje w uchu alergenem w samej oliwie z oliwek. Zmiana grubości ucha stanowi miarę odpowiedzi immunologicznej przeciwko alergenowi. Przeciwciała anty-il-21 podaje się albo w fazie uczulania (dni 0-), albo podczas fazy prowokacji (dni -6). Hamowanie wzrostu grubości ucha przez antagonizowanie IL-21 wskazuje na rolę IL-21 w indukowaniu nadwrażliwości kontaktowej. [02] Grzbiet myszy C7BI/6 smaruje się w dniu 0 0,% DNFB w mieszaninie aceton:oliwa z oliwek (4:1) lub samą mieszaniną aceton:oliwa z oliwek. W dniu, mierzy się grubość ucha myszy przy użyciu suwmiarki i myszy prowokuje się w uszach samą oliwą z oliwek (kontrola) lub 0,2% DNFB w oliwie z oliwek, zapuszczając 2 µl roztworu na ucho. Zmianę grubości ucha mierzy się w dniu 6, a stan zapalny oblicza się jako różnicę w grubości ucha pomiędzy dniem a dniem 6. Grupom myszy wstrzykuje się i.p. PBS lub -0 µg przeciwciał anty-il-21 albo w dniach 0-, albo w dniach -6. [03] Hamowanie wzrostu grubości ucha przez przeciwciała anty-il-21 pokazuje, że przeciwciała anty-il-21 mogą być użyteczne w hamowaniu nadwrażliwości kontaktowej. Przykład 17-Mapowanie epitopów A. Eksperyment z wymianą izotopową wodór-deuter (HDx) [04] W celu identyfikacji regionów epitopowych IL-21 rozpoznawanych przez przeciwciała (mab) neutralizujące anty-il , , , i rozpuszczalny hil- 21R/γc-Fc, zastosowano metodę wymiany izotopowej wodór-deuter na podstawie powinowactwa immunologicznego (HDx) wraz z dalszą analizą metodą spektrometrii mas. W szczególności, oczyszczone przeciwciała (mab) unieruchomiono na kulkach sefarozowych aktywowanych CNBr i bufor zamieniono na bufor deuterowany. Deuterowaną IL-21 związano z kulkami do immunopowinowactwa przez inkubację i w celu usunięcia niezwiązanych białek kulki przemyto deuterowanym buforem. Kompleks antygen-przeciwciało poddano następnie działaniu roztworu PBS w celu zainicjowania powrotnej wymiany do wodoru amidowego na niezwiązanych regionach IL-21. Wymianę izotopowa deuter-wodór następnie przerwano, a IL-21 wymyto w buforze o niskim ph, i poddano następnie trawieniu proteolitycznemu przez unieruchomioną pepsynę. Utworzono następnie mapy mas peptydów za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF i porównano z mapami dla próbki kontrolnej, utworzonymi z IL-21 w stanie wolnym, która uległa powrotnej wymianie do wodoru amidowego z deuterowanej IL-21 przez rozcieńczenie roztworem PBS. Fig. 3 przedstawia rozszerzone widma masowe peptydów trawionych pepsyną uzyskanych zarówno z IL-21 w staniem wolnym (Fig. 3A i 3C) jak i z IL-21 związanej z przeciwciałem (Fig. 3B i 3D). Jak wskazano na Fig. 3A, zachodzące na siebie peptydowe izotopowe przypisano do odpowiednich peptydów EKKPPKEF (SEKW. NR: 2 od reszty 129 do 136) (m/z, 02,619 Da) i LERFKSLL (SEKW. NR: 2 od reszty 137 do 144) (m/z, 0,6091 Da) z IL-21 w stanie wolnym z teoretycznymi masami peptydów w zakresie ppm dokładności masowej. Zaobserwowano niewielką ilość resztkowego deuterowanego peptydu w okolicach m/z, 02,619 Da, z powodu niepełnej wymiany wodoru amidowego. [0] Fig. 3B przedstawia widmo tego samego zakresu masowego jak na Fig. 3A pokazujące dwie zachodzące na siebie peptydowe obwiednie izotopowe zawierające jony monoizotopowe przy 14,49 66

68 m/z i 1,00 m/z. Ponieważ dwa jony peptydowe były skupione wokół tego samego zakresu masowego, trudno było zidentyfikować każdy z tych peptydów pośród tych dwóch jonów. Jednakże dane z tandemowej spektrometrii mas dla jonów peptydowych z Fig. 3A i B pokazały, że wykazują one identyczne schematy fragmentacji peptydów (dane niepokazane). Chociaż występował niewielki odsetek niedeuterowanego peptydu wykrywanego z próbki uzyskanej z kompleksu antygenprzeciwciało, większość jonów peptydowych zachowała deuter i uległa przesunięciu do wyższego regionu masowego dzięki ograniczonej dostępności rozpuszczalnika do przeciwciała/ regionów wiążących antygen, co wskazuje na to, że miejsce wiązania mab obejmuje prawdopodobnie region EKKPPKEFLERFKSLL (SEKW. NR: 2 od reszty 129 do 144). [06] Zaobserwowano inny trawiony pepsyną peptyd zarówno z IL-21 w stanie wolnym jak i kompleksu antygen-przeciwciało, jako przedstawiono na Fig. 3C i D i został on zidentyfikowany jako KSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS (SEKW. NR: 2 od reszty 141 do 162) (m/z, 219,241) na podstawie teoretycznej masy strawionego pepsyną fragmentu peptydowego IL-21. Jak pokazano na Fig. 3D, porównanie przesunięcia masy tego peptydu o 22 resztach aminokwasowych (Amass = 9,0 Da) z przesunięciem masy tych dwóch wcześniejszych (upstream) reszt (Fig. 2B, EKKPPKEF (SEKW. NR: 2 od reszty 129 do 136) i LERFKSLL (SEKW. NR: 2 od reszty ), wskazuje na to, że region ten był jedynie marginalnie chroniony po związaniu mab, co wskazuje na to, że jedynie część tego peptydu może brać udział w wiązaniu z mab. W rzeczywistości ta sekwencja peptydu stanowi ogon C- końcowy i zawiera ona cztery zachodzące na siebie reszty aminokwasowe z peptydem (LERFKSLL (SEKW. NR: 2 od reszty 137 do 144), które wydają się być w sposób znaczący chronione przez mab. Na podstawie tych pomiarów metodą spektrometrii mas retencji deuteru, ustaliliśmy epitop IL-21 wiążący mab EKKPPKEFLERFKSLL (SEKW. NR: 2 od reszty 129 do 144) i wcześniejszą (ang. upstream) sekwencję KSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS (SEKW. NR: 2 od reszty 141 do 162). B. Eksperyment z zabezpieczeniem lizyny przed znakowaniem [07] Stosując oznaczenie HDx, ustalono wstępnie region epitopowy IL-21 wiążący mab i zaobserwowano, że pięć reszt lizyny (spośród ogółem 12 reszt lizyny w IL-21) znajduje się w przypuszczalnym wiążącym regionie epitopowym. Ponieważ reszty lizyny będą najprawdopodobniej obecne w dostępnych dla rozpuszczalnika regionach białek ze względu na ich charakterystykę ładunku, wydaje się, że lizyna będzie idealnym wyborem dla selektywnej modyfikacji chemicznej do równoległego wyznaczenia regionu epitopowego antygenu. Koncepcja, która stoi u podstaw strategii modyfikacji chemicznej polega na tym, że modyfikacja w postaci zabezpieczenia lizyny w antygenie w obecności i nieobecności przeciwciała koreluje z jego epitopem wiążącym (Scholten i wsp., J. Amer. Soc. Mass Spectr. 17: , 06). Dlatego też, w celu dalszego scharakteryzowania regionu epitopu i określenia tych reszt lizyny zaangażowanych w wiązanie mab, wykonano selektywne acetylowanie na resztach lizyny zarówno w stanie związanym reakcją powinowactwa jak i w stanie wolnym IL-21. Miejsce modyfikacji/zabezpieczenia lizyny określono za pomocą analiz całej masy i mapowania peptydów przy użyciu MALDI-TOF oraz spektrometrii mas z jonizacją metodą elektrorozpylania (ESI). [08] Scholten i wsp., (Scholten i wsp., J. Amer. Soc. Mass Spectr. 17: , 06) zbadali stosunek molowy pomiędzy odczynnikiem acetylującym (octan NHS) a antygenem w przypadku 67

69 pełnego acetylowania dostępnych dla rozpuszczalnika reszt lizyny i odkryli, że znakowanie było skuteczne przy -krotnym nadmiarze molowym odczynnika w ciągu 3-minutowej reakcji. W celu określenia epitopu wiążącego, zastosowano takie same warunki reakcji znakowania zarówno dla IL-21 w stanie wolnym jak i IL-21 w stanie związanym reakcją powinowactwa z kilkoma neutralizującymi przeciwciałami IL-21, a także heterodimerycznym białkiem receptorowym dla IL-21 (1L-21R/γc-Fc). Przy podanych warunkach reakcji znakowania, różna dostępność dla rozpuszczalnika reszt lizyny samej IL-21 oraz związanej reakcją powinowactwa IL-21 przyczyniały się do dystrybucji acetylowania lizyny (obsadzenia grupami acetylowymi) na cząsteczce IL-21. Liczbę zabezpieczonych reszt lizyny na związanej reakcją powinowactwa IL-21 porównano z samą IL-21 na podstawie jonu o największej intensywności. Dopasowanie widmowe na podstawie jonów o największej intensywności wyraźnie pokazało, że liczba acetylowań lizyny na antygenach wyizolowanych z różnych kompleksów immunologicznych jest zróżnicowana. Było oczywiste, że odczynnik znakujący lizynę był mniej dostępny na związanej reakcją powinowactwa IL-21. Dlatego też, acetylowanie zostało ograniczone przez związanie antygenu z przeciwciałem. [09] Zabezpieczone za pomocą acetylowania lizyny, które mogą być zaangażowane w wiązanie mab, zostały następnie zbadane przez trawienie proteazą, a następnie przez analizę mapowania masy peptydu z wykorzystaniem chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas. Ponieważ zmodyfikowane kowalencyjnie reszty lizyny są odporne na trawienie trypsyną, zastosowano enzym proteolityczny pepsynę w celu wytworzenia większej ilości peptydów wykrywalnych za pomocą spektrometrii mas, w celu bardziej szczegółowego zbadania modyfikacji lizyny. Zbadano modyfikację indywidualnych peptydów za pomocą chromatografii jonowymiennej pojedynczego peptydu. Jak pokazano na Fig. 4, wybrane chromatogramy jonowymienne uzyskano zarówno z próbki kontrolnej (sama IL-21) jak i z próbek badanych (związane reakcją powinowactwa cząsteczki IL-21) w celu oznaczenia acetylowanych i nieacetylowanych reszt lizyny. Fig. 4A przedstawia wybrany chromatogram jonowymienny peptydu proteolitycznego ulegający wymyciu w czasie 6,22 min w podanych warunkach chromatograficznych, a masa monoizotopowego jonu peptydowego wynosiła 662,9 Da, która, jak się wydaje reprezentuje stan o potrójnym ładunku (Δm = 0,3 Da), jak wskazano w osadzonym widmie masowym. Dokonano identyfikacji tego peptydu w stanie o potrójnym ładunku jako trawiony pepsyną fragment peptydowy z acetylowaną lizyną, TCPSCDSYEKKPPKEF (SEKW. NR: 2 od reszty 119 do 136) (m/z, 1986 Da), przy czym masa nieacetylowanego peptydu wynosi 1860 Da (m/z). Różnica mas (acetylowany peptyd / nieacetylowany peptyd) wynosiła 126 Da, co wskazuje na to, że wszystkie trzy reszty lizyny w tym peptydzie zostały acetylowane w IL-21 w stanie wolnym. Jednakże, wybrany chromatogram jonowymienny związanej reakcją powinowactwa IL-21 nie wykazał żadnych śladów peptydu (Fig. 4B) co wskazuje na to, że trzy reszty lizyny zostały całkowicie zabezpieczone przez związanie z przeciwciałem IL-21. [02] Okazało się, że dodatkowy trawiony pepsyną peptyd (KSLLQKMI (SEKW. NR: 2 od reszty 141 do 148) jest zabezpieczony w wyniku związania mab IL-21 (Fig. 4C i 4D). Jego monoizotopowy jon pojawił się przy 09 Da (m/z) jako jon podwójnie naładowany (Δm = 0, Da), a różnica mas (acetylowany peptyd / nieacetylowany peptyd) wynosiła 42 Da, co wskazuje na to, że jedynie jedna z dwóch reszt lizyny w tym peptydzie była zabezpieczona. Wcześniejsze eksperymenty z wymianą H/D 68

70 1 wskazywały na to, że lizyna przed (ang. upstream) C-końcowym ogonem sekwencji polipeptydowej, KSLLQKM1HQHLSSRTHGSEDS (SEKW. NR: 2 od reszty 141 do 162), była najprawdopodobniej zabezpieczona przez związanie z przeciwciałem. Zatem najbardziej prawdopodobne jest to, że w wiązaniu przeciwciała bierze udział K113 zamiast K119. [0211] Cztery reszty lizyny (K2, K3, K6 i K113) były zabezpieczone przed acetylowaniem przez związanie klonów i i były one zlokalizowane w obrębie przypuszczalnego regionu epitopowego wiążącego mab IL-21, jest stwierdzono na podstawie analizy HDx. Łącznie, test zabezpieczenia przed acetylowaniem dowiódł udziału określonych reszt lizyny w oddziaływaniu antygen-przeciwciało a ponadto potwierdził sekwencję epitopu uzyskaną z analizy HDx. 17C.- Porównanie sekwencji aminokwasowych IL-21 z różnych gatunków [0212] Dla lepszego zrozumienia wyników reaktywności krzyżowej pomiędzy gatunkami w Przykładach 3 i 9, w kontekście wiązania określonych epitopów na IL-21 przez przeciwciała IL-21 (Przykład 17A i B), otrzymano i porównano sekwencje aminokwasowe dla IL-21 pomiędzy wieloma gatunkami (Tabela 13). Całkowita ludzka sekwencja była w ponad 96% identyczna z sekwencjami makaka jawajskiego i rezusa, natomiast była jedynie w 61-6% identyczna z sekwencjami IL-21 gryzoni. Co warto odnotować, nieciągły epitop wiązany przez klony i , jak opisano w Przykładzie 17 (podkreślony w Tabeli 13), jest identyczny w IL-21 ludzkiej, makaka jawajskiego i rezusa, podczas gdy sekwencja IL-21 szczura różni się od ludzkiej IL-21 6 resztami w tych regionach, a sekwencja IL-21 myszy różni się 7 resztami. [0213] Tabela 13: Dopasowanie sekwencji aminokwasowych IL-21 dla IL-21 ludzi (Hu), makaka jawajskiego (Cyno), małpy rezus (Rh, Rhesus), szczura (Rat) i myszy (Mu). Hu IL-21 MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSS QGQDRHMIRHMRQLIDIVDQLKNYVNDLV CynoIL-21 MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSS QGQDRHMIRIMRQLIDIVDQLKNYVNDLD RhesusIL-21 MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSS QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKQLYVNDLD Rat IL-21 MERTLVCLILIFLGTVAHKSSP QRPDHLLIRLRHLMDIVEQLKIYENDLD MuIL-21 MERTLVCLVVIFLGTVAHKSSP QGPDRLLIRLRHLIDIVEQLKIYENDLD Hu Cyno Rh Rat Mu PEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPP PEFLPAPEDVETNCEWSAISCFQKAQLKSANTGNNERIINLSIKKLKRKSP PEFLPAPEDVETNCEWSAISCFQKAQLKSANTGNNERIINLSIKKLKRKSP PELLTAPQDVKGQCEHEAFACFQKAKLKPSNTGNNKTFINDLLAQLRRRLP PELLSAPQDVKGHCEHAAFACFQKAKLKPSNPGNNKTFIIDLVAQLRRRLP Hu Cyno Rh STNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS STGAERRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS STGAERRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS 69

71 Rat Mu AKRTGNKQRHMAKCPSCDLYEKKTPKEFLERLKWLLQKMIHQHLS ARRGGKKQKHIAKCPSCDSYEKRTPKEFLERLKWLLQKMIHQHLS [0214] IL-21 człowieka przedstawiono jako SEKW. NR:2; IL-21; myszy przedstawiono jako SEKW. NR:11; IL-21 makaka jawajskiego przedstawiono jako SEKW. NR:9; IL-21 rezusa przedstawiono jako SEKW. NR:9; IL-21 szczura przedstawiono jako SEKW. NR:97. [021] Nieciągły epitop wyznaczony dla dwóch wysoce spokrewnionych przeciwciał anty-hil i jest podkreślony powyżej. Przykład 18-Anty-idiotypowe przeciwciała monoklonalne wobec CHO do stosowania w przedklinicznych i klinicznych testach immunologicznych. [0216] Wytworzono anty-idiotypowe przeciwciała monoklonalne (mab) specyficzne dla CHO, do zastosowania w przedklinicznych i klinicznych testach immunologicznych, takich w których można specyficznie zmierzyć potencjalne odpowiedzi przeciwciał anty cho u osób leczonych tym terapeutycznym mab anty-il-21. [0217] W celu rozróżnienia pomiędzy immunogenem ( CHO), który sam z siebie jest przeciwciałem, a anty-idiotypowymi przeciwciałami w tym Przykładzie, immunogen będzie oznaczony jako Ab1, a przeciwciało anty-idiotypowe będzie oznaczone jako Ab2. Przeciwciało antyidiotypowe powinno hamować (neutralizować) wiązanie Ab1 do jego antygenu (IL-21). Jednakże należy zauważyć, że w tym procesie będą wytwarzane przeciwciała anty-ab1, które nie są antyidiotypowe. Z definicji, będą one przeciwciałami wiążącymi anty cho, a nie przeciwciałami neutralizującymi i mogą być również użyteczne w przedklinicznych i klinicznych testach immunologicznych. [0218] Sposoby: W celu immunizacji myszy CHO, pięć myszy BALB/c w wieku 6 do 8 tygodni (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) immunizowano CHO. Myszy te immunizowano początkowo przez podskórne wstrzyknięcie 0 µg oczyszczonego CHO (Lot# A212F) w kombinacji z adiuwantem Emulsigen -P (MVP Laboratories INC, Omaha, NE), zgodnie z instrukcjami producenta. Po wstępnej immunizacji, każda z myszy otrzymywała dodatkowe 0 µg CHO w adiuwancie Emulsigen -P drogą podskórną co dwa tygodnie w okresie sześciu tygodni. Siedem dni po immunizacjach trzeciej i czwartej myszy skrwawiono przez splot zagałkowy, a surowicę oddzielono od krwi w celu analizy jej zdolności do wiązania z CHO. [0219] Wybór zwierzęcia do fuzji przy użyciu zarówno testu wychwytywania jak i testu neutralizacji: [02] Test wychwytywania: Zdolność mysich przeciwciał anty cho (Ab2, anty-idiotypowe) w surowicach odpornościowych do wiązania CHO (Ab1, wytwarzane w komórkach CHO, nr serii E69) oceniono przy użyciu testu ELISA typu wychwytywania. W teście tym, dołki 96-dołkowych polistyrenowych płytek ELISA opłaszczono najpierw 0 µl/dołek koziego przeciwciała swoistego dla Fc przeciwko ludzkiej IgG, (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) w stężeniu of 1 µg/ml, w buforze opłaszczającym (0,1 M Na 2 CO 3, ph 9,6). Płytki inkubowano przez noc w temperaturze 4 C, po czym niezwiązane przeciwciało odessano, a płytki przemyto dwukrotnie 0 µl/dołek buforem do przemywania (PBS-Tween określony jako 0,137 M NaCl, 0,0022 M KCI, 0,0067 M Na 2 HPO 4, 0,00 M KH 2 PO 4, 0,0% obj./wag. polisorbatu, ph 7,2). Dołki zablokowano 0 µl/dołek buforu blokującego (PBS-Tween plus 1% wag./obj. albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez 70

72 minut w temperaturze pokojowej (RT), odessano i płytki przemyto dwukrotnie 0 µl/dołek PBS- Tween. Dołki inkubowano z CHO (Ab1, ZGI wytworzone w komórkach CHO, nr serii E69) w stężeniu 1 µg/ml (w 1% BSA w PBS-Tween). Po 1 godzinie inkubacji w temperaturze pokojowej, dołki aspirowano, a płytki przemyto dwukrotnie w sposób opisany powyżej. Przygotowano serię - krotnych rozcieńczeń (w 1% BSA w PBS-Tween) surowic odpornościowych (Ab2) rozpoczynając od wstępnego rozcieńczenia 1:00 i dochodząc do 1: Podwójne próbki każdego rozcieńczenia przeniesiono następnie do płytki do oznaczeń, 0 µl/dołek. Normalne mysie surowice służyły jako kontrola negatywna. Po 1 godzinie inkubacji w temperaturze pokojowej, dołki aspirowano, a płytki przemyto dwukrotnie w sposób opisany powyżej. Do dołków dodano następnie kozie przeciwciało swoiste dla Fc przeciwko ludzkiej IgG, skoniugowane z HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories) w rozcieńczeniu 1:000, 0 µl/dołek. Po 1 godzinie inkubacji w temperaturze pokojowej, niezwiązane przeciwciało do detekcji odessano z dołków, a płytki przemyto dwukrotnie. Po aspiracji, do każdego dołka dodano 0 µl/dołek tetrametylobenzydyny (TMB) (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) i płytki inkubowano przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Reakcję barwną zatrzymano przez dodanie 0 µl/dołek odczynnika zatrzymującego (ang. Stop Reagent) (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD), a wartości absorbancji dołków odczytano na urządzeniu Molecular Devices Spectra MAX 340 przy 40 nm. [0221] Test neutralizacji: Zdolność mysich przeciwciał anty-idiotypowych (Ab2) anty cho w surowicach odpornościowych do hamowania (neutralizacji) aktywności wiązania CHO (Ab1) oceniono przy pomocy płytkowego testu neutralizacji. W teście tym, dołki 96-dołkowych polistyrenowych płytek ELISA opłaszczono najpierw 0 µl/dołek ludzkiego ligandu IL-21 (nr serii A17F), w stężeniu 1 µg/ml, w buforze opłaszczającym (0,1 M Na 2 CO 3, ph 9,6). Płytki inkubowano przez noc w temperaturze 4 C, po czym niezwiązany ligand odessano, a płytki przemyto dwukrotnie 0 µl/dołek buforu do przemywania (PBS-Tween określony jako 0,137 M NaCl, 0,0022 M KCI, 0,0067 M Na 2 HPO 4, 0,00 M KH 2 PO 4, 0,0% obj./wag. polisorbatu, ph 7,2). Dołki zablokowano 0 µl/dołek buforu blokującego (PBS-Tween plus 1% wag./obj. albuminy surowicy bydlęcej (BSA)) przez 1 godzinę, po czym płytki przemyto dwukrotnie buforem do przemywania. Przygotowano serię -krotnych rozcieńczeń (w 1% BSA w PBS-Tween) surowic odpornościowych (Ab2) rozpoczynając od wstępnego rozcieńczenia 1:0 i dochodząc do 1: Normalne mysie surowice służyły jako kontrola negatywna. Podwójne próbki każdego rozcieńczenia przeniesiono następnie do 96-dołkowej płytki do rozcieńczania, 0 µl/dołek. Dodano Ab1 jako roztwór 2x, 0 µl/dołek. Po 4-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej, 0 µl/dołek przeniesiono na płytkę do oznaczeń po odessaniu buforu blokującego. Po 1 godzinie inkubacji w temperaturze pokojowej, dołki aspirowano, a płytki przemyto dwukrotnie w sposób opisany powyżej. Do każdego dołka dodano następnie znakowane peroksydazą chrzanową kozie przeciwciało swoiste dla Fc przeciwko ludzkiej IgG, skoniugowane z HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) w rozcieńczeniu 1:000, 0 µl/dołek, a płytki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po usunięciu niezwiązanego przeciwciała do detekcji, płytki przemyto dwukrotnie, do każdego dołka dodano 0 µl/dołek tetrametylobenzydyny (TMB) (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) i płytki inkubowano przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Reakcję barwną zatrzymano przez dodanie 0 µl/dołek 71

73 odczynnika zatrzymującego (Stop Reagent) (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD), a wartości absorbancji dołków odczytano na urządzeniu Molecular Devices Spectra MAX 340 przy 40 nm. [0222] Fuzja: Dwie myszy o najwyższych mianach neutralizacji anty cho immunizowano po raz ostatni w przybliżeniu 0 µg CHO (Ab1) w PBS bez adiuwanta przez iniekcję podskórną. Cztery dni później, pobrano śledzionę i węzły chłonne tych myszy. Wykonano elektrofuzję z zastosowaniem standardowych metod znanych ze stanu techniki w celu fuzji limfocytów z mysimi komórkami szpiczaka P3-X63-Ag8.63 (American Type Culture Collection, CRL 180) przy stosunku 1:1 limfocyt-szpiczak, przy użyciu urządzenia Cyto-pulse CEEF-0 (Cyto Pulse Sciences Inc., Glen Burnie, MD). Mieszaninę fuzyjną rozdzielono do 96-dołkowych płaskodennych płytek. Dołki płytek do fuzji zasilono trzykrotnie 70% zastępczą pożywką do hodowli hybrydoma (IMDM z 1x L-glutaminą (0x), 1x penicylina-streptomycyna (0x), wszystkie z Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA, % surowicy Fetalclonel, nie inaktywowanej ciepłem (HyClone,Logan, UT), % czynnika do klonowania hybrydoma (ang. Hybridoma Cloning Factor) (BM Condimed H1 Roche Diagnostic, Indianapolis, IN), 1x supplement HAT (0x,Gibco Invitrogen). Dołki zbadano dziesięć dni po wysianiu komórek fuzyjnych. [0223] Wybór oryginalnych dołków (ang. master well): 96-dołkowe płytki do fuzji poddano przeszukiwaniu na obecność mysich przeciwciał idiotypowych anty CHO za pomocą testu ELISA typu wychwytywania, tak jak opisano powyżej, za wyjątkiem tego, że supernatanty hybrydoma zbadano w postaci nierozcieńczonej z płytek hodowlanych. Komórki hybrydoma z dodatnich dołków namnożono z powodzeniem do hodowli w płytkach 24-dołkowych. Gdy gęstość hodowli 24-dołkowych wynosiła około 4-6 x komórek/ml, nadsącz (w przybliżeniu 1, ml) indywidualnie zebrano i przechowywano dla każdego dołka, a komórki z każdego dołka poddano kriokonserwacji. Ośrodek do zamrażania składał się z 90% surowicy Fetalclone 1 i % DMSO. Każdy z supernatantów z płytek 24-dołkowych przeanalizowano ponownie zarówno za pomocą wychwytującego testu ELISA jak i płytkowego neutralizacyjnego testu ELISA opisanego powyżej. Wyniki wskazywały na to, że po namnożeniu, wszystkie z supernatantów z oryginalnych dołków zachowały zdolność do rozpoznawania przeciwciała (Ab1) CHO w roztworze. Siedem z supernatantów z oryginalnych dołków zachowało zdolność do neutralizacji wiązania Ab1 z ludzkim ligandem IL-21. [0224] Klonowanie: Komórki z oryginalnych dołków wybrano zgodnie z ich aktywnością neutralizującą i sklonowano w pożywce do hodowli hybrydoma wzbogaconej w 1x HT (0x, Gibco Invitrogen) w celu wyizolowania klonalnej hybrydomy wytwarzającej neutralizujące mab będące przedmiotem zainteresowania. Komórki sklonowano w 96-dołkowych mikrotitracyjnych płytkach do hodowli komórkowej z wykorzystaniem standardowego podejścia polegającego na rozcieńczeniu do niskiej gęstości (mniej niż komórka na dołek), a monoklonalność oceniono przez obserwację mikroskopową dołków dla pojedynczego ogniska wzrostu przed oznaczeniem. Sześć dni po wysianiu, wszystkie płytki poddano przeszukaniu za pomocą neutralizacyjnego testu ELISA pod kątem antyidiotypowych przeciwciał hamujących anty cho. Komórki hybrydoma z dodatnich dołków namnożono z powodzeniem na płytkach 24-dołkowych. [022] Wybór pierwszej rundy klonów: Nadsącza z około 6 dołków każdej sklonowanej linii hybrydoma, które były pozytywne ze względu na określone mab i wywodziły się z dołków z jedynie 72

74 pojedynczą kolonią wzrostu hybrydoma zebrano z każdego zestawu do klonowania i poddano ponownie przesiewowi przy różnych rozcieńczeniach w neutralizacyjnym teście ELISA w celu zidentyfikowania najlepszego klonu wytwarzającego neutralizujące mab. Gdy gęstość najlepszego klonu z hodowli 24-dołkowych wynosiła około 4-6 x komórek/ml, nadsącz indywidualnie zebrano i przechowywano dla każdego dołka, a komórki z każdego dołka poddano kriokonserwacji. [0226] Podsumowanie: uzyskano mysie przeciwciała monoklonalne (Ab2) reaktywne wobec wyrażanego rekombinacyjnie przeciwciała (Ab1) CHO i wykazują one aktywność neutralizującą zdolną do blokowania wiązania przeciwciała CHO z ludzką IL-21. Przeciwciała te można stosować jako odczynniki w przedklinicznych i klinicznych testach immunologicznych. Przykładowe wiązanie natywnej wewnątrzkomórkowej ludzkiej IL-21 i IL-21 makaka jawajskiego (ale nie mysiej lub szczurzej IL-21) przez mab IL-21 [0227] Neutralizujące przeciwciała monoklonalne anty-il-21 opisane w niniejszym dokumencie uzyskano z myszy transgenicznych wykazujących ekspresję ludzkich genów immunoglobulin i immunizowanych rekombinowaną ludzką IL-21 (zob. Przykład 1). Ważne było upewnienie się, że klon mab IL-21 może wiązać i neutralizować natywną ludzką IL-21 oprócz rekombinowanej formy IL-21. Dodatkowo, w celu wsparcia przedklinicznych badań toksykologicznych, przydatne jest zrozumienie zdolności wiązania klonu mab IL-21 względem natywnej IL-21 w rozmaitych gatunkach. Aby to zbadać, jedno podejście polega na oznakowaniu klonu mab IL barwnikiem fluorescencyjnym i jego wykorzystanie do wykrycia wewnątrzkomórkowej IL-21 w aktywowanych limfocytach T za pomocą cytometrii przepływowej. W badaniu tym, świeżo wyizolowane leukocyty krwi obwodowej ludzkie i makaka jawajskiego, a także szczurze i mysie splenocyty aktywowano in vitro przy użyciu PMA i jonomycyny przez 24 godziny w celu indukowania wytwarzania IL-21. Komórki zebrano, utrwalono, permeabilizowano i barwiono pod kątem wyrażania CD3 lub CD4 (w celu określenia populacji limfocytów T pomocniczych) i IL-21 przy użyciu klonu mab IL-21 znakowanego ALEXA FLUOR-647 (AF-647), i porównano z intensywnością barwienia indukowaną przez przeciwciało kontrolne o dopasowanym izotypie. Dodatni sygnał w tym teście, powyżej obserwowanej dla mab kontroli izotypowej, pokazuje swoiste wiązanie klonu mab IL-21 z endogenną IL-21 w badanych gatunkach, chociaż nie jest to wskaźnikiem aktywności neutralizującej IL-21. Konieczne są dalsze badania aby wykazać neutralizację IL-21 u gatunków wykazujących dodatni wynik testów na wiązanie IL-21 z klonem mab przeciwko ludzkiej IL-21 (zob. Przykład ). [0228] Izolacja ludzkich PBMC: 0 ml krwi obwodowej pobrano od zdrowych ludzkich ochotników (ZymoGenetics) do probówek Vacutainer z heparyną, z zielonym korkiem (Becton Dickinson, San Jose, CA). Krew rozcieńczono 0 ml PBS o temperaturze pokojowej, a 3 ml porcje rozdzielono do 0 ml probówek stożkowych. Pod spód wlano 14 ml roztworu Ficoll/Paque PLUS (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) o temperaturze pokojowej i probówki wirowano przez minut z szybkością 00 obr./min. Warstwę graniczną PBMC usunięto i przemyto dwukrotnie ośrodkiem do oznaczeń (RPMI 1640 z dodatkiem penicyliny/streptomycyny, % płodowej surowicy bydlęcej, pirogronianu sodu, 2 µm β-merkaptoetanolu, wszystko z Invitrogen, Carlsbad, CA). Żywotne komórki zliczono stosując błękit trypanu z wykorzystaniem standardowych technik. 73

75 [0229] Izolacja PBMC makaka jawajskiego: 40 ml krwi obwodowej pobrano do probówek do pobierania krwi Vacutainer z heparyną, z zielonym korkiem (BD Biosciences) od makaka jawajskiego żyjącego na University of Washington w Seattle. Krew rozcieńczono 40 ml PBS o temperaturze pokojowej, a 3 ml porcje rodzielono do 0 ml probówek stożkowych. Pod spód wlano czternaści ml roztworu Ficoll/Paque PLUS (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) o temperaturze pokojowej i probówki wirowano przez 2 minut z szybkością 00 rpm. Warstwę graniczną PBMC usunięto i przemyto dwukrotnie ośrodkiem do oznaczeń (RPMI 1640 z dodatkiem penicyliny/streptomycyny, % płodowej surowicy bydlęcej, pirogronianu sodu, 2 µm β-merkaptoetanolu). Żywotne komórki zliczono stosując błękit trypanu z wykorzystaniem standardowych technik. [02] Izolacja mysich i szczurzych splenocytów: szczurze i mysie splenocyty przygotowano zgodnie z następującym protokołem. Świeżo pobraną śledzionę delikatnie rozdrobniono do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, za pomocą końców dwóch szkiełek z matowym polem. Komórki przepuszczono następnie przez filtr z siatki nylonowej 70-µM w celu usunięcia grudek. Krwinki czerwone poddano lizie przez ponowne zawieszenie osadu komórek w 2 ml buforu do lizy ACK na minut w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymano przez dodanie ośrodka do oznaczeń, komórki następnie zwirowano (10 obr./min. przez minut), zawieszone ponownie i przepuszczono przez inny filtr z siatki nylonowej w celu usunięcia stałych zanieczyszczeń. Żywotne komórki zliczono stosując błękit trypanu z wykorzystaniem standardowych technik. [0231] Aktywacja przez noc komórek przy użyciu PMA i jonomycyny: Komórki ze wszystkich gatunków zawieszono ponownie w ilości 2,0 x e6 komórek na ml. Jeden ml komórek wysiano następnie wraz z dodatkiem lub bez dodatku ng/ml PMA i 0 ng/ml jonomycyny do płytki 24-dołkowej i inkubowano w temperaturze 37 C przez godzin w nawilżonym inkubatorze do hodowli tkankowych z % CO 2. Po godzinach, do każdego dołka dodano 1,0 µl GolgiPlug (BD Pharmingen) i komórki inkubowano przez dodatkowe cztery godziny. [0232] Zebranie komórek i barwienie powierzchni: Po 24-godzinnej inkubacji opisanej powyżej, komórki zebrano, przemyto zimnym buforem FACS i wysiano w ilości 2,0 x,0 x e komórek na dołek w 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowych (Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ). Komórki barwiono następnie 1 µg/ml jednego lub większej liczby następujących przeciwciał, odpowiednio: przeciwko mysiemu CD4-PE, przeciwko szczurzemu CD3-PE, przeciwko szczurzemu B2-PE, lub przeciwko małpiemu CD4-PE lub przeciwko ludzkiemu CD4-PE przez minut na lodzie. Komórki przemyto następnie dwukrotnie w PBS przygotowując do utrwalania. [0233] Utrwalenie komórek i permeabilizacja: W celu utrwalenia komórek, każdy osad komórek ponownie zawieszono w 0 µl 2% paraformaldehydu i inkubowano w temperaturze pokojowej przez minut. Komórki następnie zwirowano ( minut z szybkością 10 obr./min) i supernatanty aspirowano, a komórki zawieszono ponownie w buforze permeabilizującym [PBS z dodatkiem 0,1% saponiny (Calbiochem) i 0,% BSA (Sigma)] przez minut w temperaturze pokojowej. [0234] Barwienie wewnątrzkomórkowe: Po utrwaleniu i permeabilizacji, komórki wybarwiano z użyciem ~1 µg/ml jednego z następujących znakowanych przeciwciał: przeciwko mysiej IL-21-AF647, przeciwko ludzkiej IL-21 klon AF647 (oba wytwarzane w ZymoGenetics) lub służącym do porównania przeciwciałem przeciwko ludzkiej IL-21-AF647 z BD Pharmingen. Komórki następnie 74

76 inkubowano w temperaturze pokojowej w ciemności przez 40 minut. Po 40 minutach, komórki przemyto dwukrotnie buforem FACS (HBSS z dodatkiem 1% BSA, 2% ludzkiej surowicy AB i 0,0% HEPES) [023] Zbieranie i analiza danych: Po zakończeniu barwienia i przemywania, komórki zawieszono ponownie w 400 µl buforu FACS i zebrano dane za pomocą urządzenia FACS Calibur (BD Pharmingen) pracującym pod kontrolą oprogramowania CellQuest. Dane przeanalizowano wykorzystując oprogramowanie do analizy danych FCS Express (De Novo Software, Los Angeles, CA). [0236] Wyniki: Detekcja ludzkiej IL-21 w stymulowanych PMA+jonomycyną ludzkich limfocytach T: Chociaż jedynie 0,01% populacji CD3+ limfocytów T barwiło się pozytywnie przy wykorzystaniu kontroli izotypowej, w przybliżeniu 9% populacji CD4+ limfocytów T barwiło się pozytywnie dla IL-21 przy wykorzystaniu klonu mab IL-21 wyznakowanego AF-647. Tę samą frakcję IL-21+ komórki wykryto stosując dostępne na rynku mab IL-21 z ebiosciences. Świadczy to o tym, że mab IL-21 może wiązać wytwarzaną endogennie IL-21 w ludzkiej populacji CD4+ limfocytów T. [0237] Detekcja IL-21 makaka jawajskiego w stymulowanych PMA+jonomycyną komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej: Około 3,6% populacji CD3+ limfocytów T makaka barwiło się pozytywnie dla IL-21 przy wykorzystaniu klonu mab IL-21 wyznakowanego AF-647, w porównaniu z 0,1% barwionych pozytywnie przy wykorzystaniu kontroli izotypowej. Liczba ta jest wyższa niż wykryta przy użyciu dostępnego na rynku mab przeciwko ludzkiej IL-21 z ebiosciences. Ta różnica może wynikać ze słabszego powinowactwa wiązania przeciwciała firmy ebiosciences do IL-21 makaka jawajskiego. Wyniki te pokazują, że klon mab przeciwko ludzkiej IL-21 może wiązać endogennie wytwarzaną IL-21 w populacji CD3+ limfocytów T makaka jawajskiego. [0238] Detekcja mysiej IL-21 w stymulowanych PMA+jonomycyną splenocytach: Przy wykorzystaniu szczurzego przeciwciała monoklonalnego przeciwko mysiej IL-21 wytwarzanego w ZymoGenetics jako kontroli pozytywnej, w przybliżeniu 13,% aktywowanej mysiej populacji CD4+ limfocytów T było pozytywne względem IL-21. Jednakże, jak można przewidywać na podstawie analiz Western blot i testów neutralizującej aktywności biologiczna pokazujących, że klon mab przeciwko ludzkiej IL-21 nie wiąże ani nie neutralizuje mysiej IL-21 (zob. Przykłady 3 i 9), klon mab przeciwko ludzkiej IL-21 wyznakowany AF647 nie wykrywał jakichkolwiek komórek IL-21-dodatnich. Pokazuje to dodatkowo, że klon mab przeciwko ludzkiej IL-21 nie wiąże się z mysią IL-21. [0239] Detekcja szczurzej IL-21 w stymulowanych PMA+jonomycyną splenocytach: Szczurze splenocyty stymulowano przez noc w obecności PMA i jonomycyny. Takie warunki stymulacji były wystarczające dla wytworzenia IL-21-dodatnich limfocytów T w ludzkich, makaka jawajskiego i mysich limfocytach T. W tym eksperymencie, ani mab przeciwko mysiej IL-21 ani klon mab przeciwko ludzkiej IL-21 nie wykrywały żadnych komórek, które były pozytywne dla IL-21. Jednakże, ponieważ w tym eksperymencie nie było kontroli pozytywnej, ten negatywny wynik nie wyklucza definitywnie możliwości, że klon mab przeciwko ludzkiej IL-21 może wiązać się ze szczurzą IL-21. Jednakże, dane te, rozważane wraz z brakiem neutralizacji aktywności biologicznej szczurzej IL-21 przez klon mab przeciwko ludzkiej IL-21 w innych testach (zob. Przykład 9), nie stanowi silnej sugestii, że to mab prawdopodobnie nie wiąże szczurzej IL-21. 7

77 1 [0240] Wniosek: Klon mab IL-21 opisany w niniejszym dokumencie w wyraźny sposób wiąże się z natywnymi formami ludzką i makaka jawajskiego białka IL-21, ale nie wiąże się z mysią lub szczurzą IL-21. Tabela 14 Gatunki Kontrola izotypu mab przeciwko ludzkiej IL-21 (klon Kontrola pozytywna anty-il-21 78) Człowiek 0,01% populacji CD3+ limfocytów T barwiło się pozytywnie z kontrolą higg4-9% populacji CD3+ limfocytów T stanowiły IL-21+ % populacji CD3+ limfocytów T stanowiły IL-21+ (ebiosciences αil-21 mab*) AF647 Makak jawajski 0,1% populacji CD3+ limfocytów T barwiło się pozytywnie z 3,6% populacji CD3+ limfocytów T stanowiły IL-21+ 0,2% populacji CD3+ limfocytów T stanowiły IL-21+* kontrolą higg4-af647 Mysz Nie zastosowano kontroli izotypu Nie wykryto 13,% populacji CD4+ limfocytów T stanowiły IL-21+ Szczur Nie zastosowano kontroli izotypu Nie wykryto Nie dostępna *(to mab może nie wiązać się silnie z IL-21 makaka) Przykładowe wiązanie i neutralizacja aktywności biologicznej natywnej ludzkiej IL-21 przez klon [0241] Neutralizujące przeciwciała monoklonalne anty-il-21 (IL-21 mab) opisane w niniejszym dokumencie zostały uzyskane z myszy transgenicznych, u których zachodzi ekspresja ludzkich genów immunoglobulin i immunizowanych rekombinowaną ludzką IL-21 (zob. Przykład 1). Ważne było upewnienie się, że klon mab IL-21 może wiązać i neutralizować natywną ludzką IL-21 oprócz rekombinowanej formy IL-21. W celu wykazania neutralizacji natywnej IL-21, wykorzystano opisany wcześniej test na komórkach Baf3/IL-21R pstat (zob. Przykład 7), a próbki pożywki kondycjonowanej z aktywowaną populacją CD4+ limfocytów T wykorzystano jako źródło natywnej IL- 21. W tym eksperymencie, próbki pożywki kondycjonowanej z limfocytami T były wstępnie inkubowane z różnymi ilościami klonu mab IL-21, a następnie zmierzono poziom indukowanej przez IL-21 fosforylacji STAT3 (pstat3) w transfektantach Baf3/hIL-21R. Neutralizację natywnej IL-21 wykazano stosując próbki pożywki kondycjonowanej z aktywowanymi limfocytami T od czterech oddzielnych zdrowych ludzkich dawców. [0242] Izolacja ludzkich PBMC i wytwarzanie próbek pożywki kondycjonowanej z limfocytami T: 0 ml krwi obwodowej pobrano od 4 zdrowych ludzkich ochotników (ZymoGenetics) do probówek Vacutainer z heparyną, z zielonym korkiem (Becton Dickinson, San Jose, CA). Krew następnie 76

78 1 2 3 rozcieńczono 0 ml PBS o temperaturze pokojowej i 3 ml porcje rozdzielono do 0 ml probówek stożkowych. Pod spód wlano 14 ml roztworu Ficoll/Paque PLUS (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) o temperaturze pokojowej i probówki wirowano przez minut z szybkością 00 obr./min. Warstwę graniczną PBMC usunięto i przemyto dwukrotnie ośrodkiem do oznaczeń (RPMI 1640 z dodatkiem penicyliny/streptomycyny, % płodowej surowicy bydlęcej, pirogronianu sodu, 2 µm β- merkaptoetanolu, wszystko z Invitrogen, Carlsbad, CA). Żywotne komórki zliczono stosując błękit trypanu z wykorzystaniem standardowych technik. Limfocyty T zostały poddane negatywnej selekcji przy użyciu zestawu do selekcji populacji CD4+ ludzkich limfocytów T (Human CD4+ T Cell Selection Kit) firmy Miltenyi Biotec (Auburn, CA), postępując zgodnie z protokołem określonym przez producenta. Wykorzystując standardowe techniki immunofenotypowania, określono następnie za pomocą cytometrii przepływowej, że populacja CD4+ limfocytów T ma czystość >9%. Limfocyty T inkubowano następnie przez trzy dni w ilości xe komórek na dołek w 24-dołkowej płytce opłaszczonej wcześniej,0 µg/ml przeciwciała anty-cd3 w pożywce ukierunkowanej na Th1 (ang. skewing media), zawierającej,0 µg/ml anti-ifnγ, 1,0 µg/ml anty-cd28 (wszystkie z Becton Dickinson) i ng/ml rekombinowanej IL-12 (R&D Systems, Minneapolis, MN). Po trzech dniach, komórki przemyto, wysiano ponownie w pożywce zawierającej 2 ng/ml PMA i 00 ng/ml jonomycyny i inkubowano przez pięć godzin w temperaturze 37 C. Po pięciu godzinach, próbki kondycjonowanej pożywki zebrano i zamrożony i przechowywano w temperaturze -80 C do dnia eksperymentu. [0243] W celu oszacowania przybliżonego stężenia IL-21 w próbkach pożywki kondycjonowanej z limfocytami T, przygotowano seryjne rozcieńczenia 1:4 i zbadano pod kątem indukowania fosforylacji STAT3 w transfektantach Baf3/hIL-21R. Postępując zgodnie z -minutowym protokołem testu biologicznego pstat3 określonym w Przykładzie 7, oszacowano względne stężenie IL-21 w każdej próbce kondycjonowanej pożywki przez porównanie poziomu pstat3 z tym uzyskanym za pomocą mianowania rekombinowanej IL-21. Wykorzystując te dane, wyznaczono stężenie IL-21 w każdej z czterej próbek kondycjonowanej pożywki na poziomie pomiędzy,0 a,0 ng/ml. [0244] W celu wykazania neutralizacji fosforylacji STAT3 indukowanej przez natywną IL-21, rozcieńczenia 1: (końcowe stężenia IL-21 pomiędzy 0, a 1,0 ng/ml) z czterech próbek pożywki kondycjonowanej z limfocytami T inkubowano wstępnie przez minut w temperaturze 37 C z seryjnymi rozcieńczeniami 1:4 klonu mab IL Stężenie klonu mieściło się w zakresie od 0,4 do 400 ng/ml. Po minutach, próbki kondycjonowanej pożywki + mab IL-21 przeniesiono do płytki do hodowli komórek Baf3/hIL-21 R i inkubowano przez dodatkowe minut w temperaturze 37 C. Po minutach, reakcje zostały zatrzymane zimnym buforem do przemywania, komórki zlizowano, a ilość pstat3 zmierzono za pomocą metody opisanej w Przykładzie 7. [024] We wszystkich czterech próbkach kondycjonowanej pożywki, klon mab IL-21 skutecznie neutralizował aktywność IL-21 (dane zestawione w Tabeli 1). Dane te jasno dowodzą skutecznego wiązania i neutralizacji natywnej ludzkiej IL-21 przez klon Tabela 1: Neutralizacja natywnej IL-21 przez klon mab IL-21 Indukcja pstat3 (krotność ponad tło) Stęż. mab IL-21 (ng/ml) Dawca 1 Dawca 2 Dawca 3 Dawca 4 0,4 69,49 6,32 61,11 62,73 77

79 1,6 70,84 61,73 68,24 6,41 6,2 70,76,46 7,1 60,6 2 2,16 1,62 1,70 2, ,43 1,1 1, ,9 1, 1,14 1,1 1 2 Przykład 21 21A. Pilotażowe badanie toksyczności z użyciem mab CHO IL-21 u makaków jawajskich [0246] Specyficzność epitopowa mab CHO IL-21 jest wspólna dla ludzi, małp rezus i makaków jawajskich (zob. Przykłady 17 i 17b), dlatego też zbadano tolerancję i toksyczność mab IL-21 u makaków jawajskich, gatunku odpowiedniego do oceny bezpieczeństwa stosowania. [0247] Makakom jawajskim podano przy pomocy pojedynczej iniekcji mab CHO IL-21 i monitorowano pod kątem objawów klinicznych przez 4 do 8 tygodni po zastosowaniu leczenia. mab IL-21 dostarczano za pomocą iniekcji podskórnej lub dożylnej w dawkach lub 0 mg/kg. Nie zaobserwowano żadnych objawów klinicznych. Nie zaobserwowano znaczących zmian masy ciała lub koagulacji. Nie zaobserwowano zmian w składzie chemicznym surowicy lub hematologii, które można by przypisywać toksyczności leku. Pojedyncze podanie mab CHO IL-21 w ilości lub 0 mg/kg było dobrze tolerowane przez wszystkie zwierzęta. [0248] Przeprowadzono sekcję zwłok u zwierząt, które otrzymały wysoką dawkę (0 mg/kg). Nie zaobserwowano większych zmian anatomicznych. Analiza histopatologiczna zwierząt, które otrzymały wysoką dawkę wykazała minimalną hiperplazję limfatyczną w obrębie tkanek limfatycznych. Analiza immunohistochemiczna tkanek limfatycznych wykazała umiarkowane powiększenie grudek chłonnych i związanych z grudkami chłonnymi typów komórek. Zmiany te mogą być związane z aktywnością farmakologiczną mab CHO IL-21, ponieważ wiadomo, że IL-21 bezpośrednio wpływa na rozwój i uwalnianie limfocytów B z grudek chłonnych i wspiera przełączanie klas, dojrzewanie powinowactwa i rozwój komórek osocza. [0249] Zachowanie farmakokinetyczne i dostępność biologiczną mab CHO IL-21 monitorowano w badaniu z pojedynczą dawką u makaków jawajskich. Ośmiu samcom makaków jawajskich podano mab CHO IL-21. Trzy otrzymały zastrzyk podskórny mg/kg, a trzem podano zastrzyk dożylny mg/kg. U dwóch zastosowano zastrzyk dożylny 0 mg/kg. Pobrano próbki surowicy do analizy poziomów mab CHO IL-21 podczas czterech tygodni po zastosowaniu terapii w przypadku grupy, która otrzymała dawkę 0 mg/kg i podczas ośmiu tygodni po zastosowaniu leczenia dla dwóch grup, które otrzymały dawkę mg/kg. Analiza niekompartmentowa profili farmakokinetycznych pokazała, że ekspozycja ulegała zwiększeniu w sposób proporcjonalny do dawki przy podaniu dożylnym lub 0 mg/kg mab IL-21. Biodostępność mab CHO IL-21 wynosiła około 0% po podaniu podskórnym. Szacunkowy terminalny okres półtrwania dla mab IL-21 wynosił -14 dni. Szacunkowy terminalny okres półtrwania IL-21 mab *wstawka: CHO u makaków jawajskich wynosił -14 dni. 21B. Pilotażowe badanie farmakologii z użyciem CHO u makaków jawajskich 78

80 [0] Specyficzność epitopowa mab CHO IL-21 jest wspólna dla ludzi, małp rezus i makaków jawajskich (zob. Przykłady 17 i 17b), dlatego też zbadano farmakologię in vivo mab IL-21 u makaków jawajskich, gatunku odpowiedniego do oceny farmakodynamiki. [021] Makakom jawajskim podano przy pomocy pojedynczej iniekcji mab CHO IL-21 i monitorowano pod kątem objawów klinicznych przez 4 do 8 tygodni po zastosowaniu leczenia. mab CHO IL-21 dostarczano za pomocą iniekcji podskórnej lub dożylnej w dawkach lub 0 mg/kg. Wszystkie zwierzęta monitorowano pod kątem zmian w składzie leukocytowym krwi obwodowej za pomocą cytometrii przepływowej. Nie zaobserwowano zmian w stężeniu monocytów lub limfocytów B, związanych z leczeniem, i nie zaobserwowano zmian w subpopulacji CD4 i CD8 limfocytów T ani w proporcjach komórek CD4 do CD8. Zaobserwowano zmniejszenie stężenia komórek NK po podaniu mab CHO IL-21. We wszystkich grupach terapeutycznych, ilość komórek NK we krwi obwodowej uległa zmniejszeniu w czasie 24 h po okresie terapii, względem wartości bazowej. U pięciu z ośmiu zwierząt, poziomy NK pozostawały poniżej 60% wartości bazowej przez co najmniej dwa tygodnie. Konieczne będzie badanie potwierdzające z odpowiednimi osobnikami kontrolnymi w celu uwzględnienia stresu i innych źródeł zmienności stężenia komórek NK we krwi obwodowej dla potwierdzenia tej obserwacji. Przykład 22-Przeciwciało anty-mil-21 zmniejsza częstość występowania i postęp choroby w mysim modelu zapalenia stawów indukowanego kolagenem (CIA) Mysi model zapalenia stawów indukowanego kolagenem (CIA): [022] Istnieje kilka modeli zwierzęcych reumatoidalnego zapalenia stawów znanych w dziedzinie wynalazku. Na przykład, w modelu indukowanego kolagenem zapalenia stawów (CIA), u myszy rozwija się przewlekłe zapalenie stawów, które bardzo przypomina ludzkie reumatoidalne zapalenie stawów. Ponieważ CIA charakteryzuje się podobnymi cechami immunologicznymi i patologicznymi co RA, stanowi ono idealny model do poszukiwania potencjalnych związków przeciwzapalnych dla ludzi. Model CIA jest dobrze znanym modelem u myszy, którego wystąpienie zależy zarówno od odpowiedzi immunologicznej jak i odpowiedzi zapalnej. Odpowiedź immunologiczna obejmuje oddziaływanie limfocytów B i populacji CD4+ limfocytów T w odpowiedzi na kolagen, który podaje się jako antygen, i prowadzi do wytwarzania przeciwciał przeciwko kolagenowi. Faza zapalna jest wynikiem tkankowych odpowiedzi mediatorów stanu zapalnego, w konsekwencji reakcji krzyżowej niektórych z tych przeciwciał z natywnym kolagenem myszy i aktywacji kaskady dopełniacza. Zaletą stosowania modelu CIA jest to, że znane są podstawowe mechanizmy patogenezy. Zidentyfikowano odpowiednie epitopy limfocytów T i limfocytów B na kolagenie typu II i określono różne parametry immunologiczne (np. nadwrażliwość typu późnego i przeciwciało przeciwko kolagenowi) i zapalne (np. cytokiny, chemokiny i enzymy degradujące macierz) związane z zapaleniem stawów o podłożu immunologicznym, i mogą być więc użyte do oceny skuteczności badanego związku w modelu CIA (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-, 1999; Williams i wsp., Immunol. 89: , 1992; Myers i wsp., Life Sci. 61: , 1997; oraz Wang i wsp., Immunol. 92:89-99, 199). Potencjalną skuteczność szczurzego mab przeciwko mysiej IL-21, wytwarzanego w ZymoGenetics, zbadano w modelu CIA, jak opisano poniżej. [023] Dziesięciotygodniowe samce myszy DBA/IJ (Jackson Labs) wykorzystano do dawkowania terapeutycznego (tj. po ustaleniu się stanu chorobowego u myszy). W dniu -21, wszystkim zwierzętom 79

81 podano śródskórnie w ogon zastrzyk 0 mikrolitrów 1 mg/ml kurzego kolagenu typu II sformułowanego w kompletnym adiuwancie Freunda (wytworzony przez Chondrex, Redmond, WA), a trzy tygodnie później w dniu 0 podano im ten sam zastrzyk, za wyjątkiem tego, że był przygotowany w niekompletnym adiuwancie Freunda. Podano przeciwciało anty-il-21 lub nośnik (PBS) w postaci iniekcji dootrzewnowej co drugi dzień, w całkowitej liczbie 6 dawek, gdy tylko u myszy rozwinął się ustalony stan chorobowy. Myszy (n = 7 na terapię) otrzymywały albo 0,1 mg przeciwciała anty-il-21 na zwierzę na dawkę, albo kontrolny nośnik leku, PBS (Life Technologies, Rockville, MD). Zwierzęta zaczęły przejawiać objawy zapalenia stawów po drugim wstrzyknięciu kolagenu, przy czym u większości zwierząt rozwinął się stan zapalny w ciągu 1-2 tygodni. Postęp choroby oceniono w każdej łapie za pomocą suwmiarki przez pomiar grubości łapy, i przypisując każdej łapie wynik kliniczny (0-3) (zob. poniżej). Monitorowanie choroby: [024] Zwierzęta mogą zacząć wykazywać oznaki zapalenia łapy wkrótce po drugim wstrzyknięciu kolagenu, a u niektórych zwierząt objawy mogą nawet rozpocząć się od zapalenia palców przed drugim wstrzyknięciem kolagenu. U większości zwierząt zapalenie stawów rozwija się w ciągu 1-2 tygodni od wstrzyknięcia dawki przypominającej, ale niektóre z nich mogą wymagać dłuższego okresu czasu. Częstość występowania choroby w tym modelu wynosi zwykle 90-0%, a w badaniu z użyciem 60 zwierząt obserwuje się zazwyczaj 0- zwierząt, u których występuje brak reakcji (stwierdzony po 6 tygodniach obserwacji). Ponieważ w badaniu tym uwzględniono jedynie myszy z ustalonym stanem chorobowym, dlatego myszy, u których nie rozwinęło się zapalenie stawów, nie wykorzystywano. Należy zauważyć, że gdy rozpoczyna się stan zapalny, może często wystąpić przejściowo zmienny łagodny stan zapalny łapy lub palca. Z tego powodu, nie uznawano, że u zwierzęcia występuje ustalony stan chorobowy do czasu aż rozwinął się wyraźny, trwały obrzęk łapy. [02] Codziennie obserwowano wszystkie zwierzęta, aby dokonać oceny stanu choroby w ich łapach, co realizuje się przypisując jakościowo punktację kliniczną do każdej z łap. Każdego dnia, dla każdego zwierzęcia określa się punktację dla każdej z 4 łap zgodnie ze stanem klinicznym choroby w jej obrębie. W celu określenia wyniku klinicznego, można wyobrazić sobie, że łapa składa się z 3 stref, palców, właściwej łapy (dłoń lub stopa), oraz stawu nadgarstkowego lub skokowego (kostki). Uwzględniono zasięg i stopień nasilenia stanu zapalnego w odniesieniu do tych stref, w tym: obserwację każdego palca pod kątem obrzęku; poszarpanych paznokci lub zaczerwienionych palców; wszelkie zauważone oznaki obrzęku lub zaczerwienienia w obrębie dowolnej z łap; zauważoną jakąkolwiek utratę drobnych granic anatomicznych ścięgien lub kości; ocenę nadgarstka lub kostki pod kątem wszelkiego rodzaju obrzęku lub zaczerwienienia; oraz spostrzeżenie, czy stan zapalny biegnie proksymalne w górę nogi. Wynik dla łapy wynoszący 1, 2 lub 3 oparty był po pierwsze na ogólnym wrażeniu stopnia nasilenia, a po drugie na liczbie zajętych stref. Skalę stosowaną przy określaniu punktacji klinicznej przedstawiono poniżej. Punktacja kliniczna: [026] 0 = Wygląd normalny 0, = Zajęty jeden lub więcej palców, lecz stan zapalny dotyka jedynie palców 80

82 = łagodny stan zapalny obejmujący łapę (1 strefa), i może obejmować palec lub palce 2 = umiarkowany stan zapalny w łapie i może obejmować część palców i/lub nadgarstek/kostkę (2 strefy) 3 = poważny stan zapalny w łapie, nadgarstku/kostce i w niektórych lub wszystkich palcach (3 strefy) [027] Ustalony stan chorobowy zdefiniowano jako jakościowy wynik zapalenia łapy wynoszący 1 lub więcej, który utrzymywał się przez dwa dni pod rząd. Po wystąpieniu ustalonego stanu chorobowego, odnotowano datę i oznaczono jako pierwszy dzień zwierzęcia z ustalonym stanem chorobowym. [028] Myszy przyjmujące przeciwciało anty-mil-21 charakteryzowały się ograniczeniem obrzęku łapy w trakcie trwania eksperymentu i wykazywały w przybliżeniu 2% niższy średni wynik zapalenia stawów w porównaniu z myszami przyjmującymi PBS. Uzyskane wyniki wskazują na to, że przeciwciało anty-mil-21 ogranicza obrzęk łapy i postęp choroby związanej z tym modelem zapalenia stawów i sugerują, że przeciwciało anty-il-21 może być skuteczne w leczeniu zapalenia stawów u ludzi. Przykład 23-Wyrażanie IL-21R w ludzkich próbkach łuszczycowych zmian skórnych [029] Wyrażanie IL-21R ogranicza się na ogół do komórek pochodzenia krwiotwórczego. Jednakże, w warunkach choroby zapalnej, wyrażanie IL-21R na komórkach niekrwiotwórczych może dostarczać bezpośredniego bodźca dla typów komórek, które pośredniczą w zmianach funkcjonalnych w dotkniętych tkankach. W łuszczycy ulega rozregulowaniu wzrost keratynocytów, z łuszczycopodobnym rozrostem naskórka, nieprawidłowym końcowym różnicowaniem i niekompletnym rozwojem warstwy rogowej naskórka. IL-21 wytwarzana przez naciekające limfocyty Th1 i Th17 w łuszczycowych zmianach skórnych może pobudzać zmiany funkcjonalne w keratynocytach, w tym proliferację komórek, wytwarzanie chemokin i zmienione różnicowanie. Zbadano zatem obecność IL-21R na keratynocytach w łuszczycowych zmianach skórnych. [0260] Metody: Wykonano analizę immunohistochemiczną 18 próbek biopsji skóry od 4 normalnych ludzkich dawców i 9 pacjentów z łuszczycą, przy użyciu mysiego przeciwciała IgG1 przeciwko ludzkiej IL-21R wytwarzanego w ZymoGenetics. W przypadku pacjentów z łuszczycą, podzbiór () dostarczonych próbek zarówno ze zmian chorobowych jak i niezmienionej skóry. Odnotowano wysoki stopień rozrostu naskórka w badaniu histopatologicznym zmienionej chorobowo skóry od wszystkich dawców. Immunoreaktywność (barwienie) IL-21R na określonych rodzajach komórek oceniono punktowo na podstawie częstości komórek pozytywnych i intensywności barwienia. [0261] Wyniki: W przypadku normalnej skóry oraz skóry bez zmian chorobowych pacjentów z łuszczycą, barwienie pod względem IL-21R dało wynik pozytywny na sporadycznych wewnątrznaskórkowych komórkach jednojądrzastych (MNC), rozproszonych makrofagach i komórkach fibroblastopodobnych. Pozytywne barwienie ze względu na IL-21R występowało na dużej liczbie komórek MNC we wszystkich próbkach ze zmianami chorobowymi od pacjentów z łuszczycą. Próbki barwione mysim przeciwciałem kontroli izotypowej były negatywne. Występowało minimalne lub brak zabarwienia pod względem IL-21R na keratynocytach naskórka z normalnej skóry. W biopsjach skóry bez zmian chorobowych od pacjentów z łuszczycą zaobserwowano łagodne barwienie w keratynocytach naskórka w 4 próbkach, a umiarkowane barwienie obserwowano w warstwie 81

83 kolczystej w piątej próbce. Występowało łagodne do silnego barwienie obszarów ogniskowych keratynocytów w próbkach ze zmianami chorobowymi od 8 z 9 pacjentów z łuszczycą. [0262] Wniosek: W łuszczycowych zmianach skórnych, wyrażanie IL-21R nie ogranicza się do naciekających leukocytów, ale jest także pozytywnie regulowane na keratynocytach naskórka. Obecność zwiększonego barwienia pod względem IL-21R na keratynocytach naskórka w skórze bez zmian chorobowych od pacjentów z łuszczycą, w porównaniu z normalnymi osobnikami kontrolnymi, wskazuje na to, że nawet w skórze nie objętej procesem chorobowym, keratynocyty mogą reagować nieprawidłowo na stymulację IL-21. W obecności zapalenia, odnotowano zwiększoną ilość IL-21 R na naciekających MNC i w hiperplastycznej warstwie naskórka. Terapia łuszczycy z zastosowaniem przeciwciała blokującego IL-21 może zatem hamować stan zapalny przez blokowanie sygnałów IL-21 przekazywanych zarówno do komórek zapalnych jak i keratynocytów naskórka. Tabela 16. Immunoreaktywność 1 IL-21R w skórze normalnej, bez zmian chorobowych i ze zmianami chorobowymi w przebiegu łuszczycy Rodzaj skóry (N) Naskórek 2 MNC 2 Normalna (4) 0 1 Łuszczyca, bez zmian 1 1 chorobowych () Łuszczyca, ze zmianami chorobowymi 3 (9) Skala: 0 = brak, 1 = łagodna, 2 = umiarkowana i 3 = silna dla ekspresji IL-21 R 2 Średni wynik z wszystkich przebadanych próbek 3 Pięć z próbek zawierało biopsje skóry pasujące do dawcy, bez zmian chorobowych 1 2 WYKAZ SEKWENCJI [0263] <1> ZymoGenetics, Inc. Jaspers, Stephen R. Rixon, Mark W. Dillon, Stacey R. Ramsdell, Frederick J. Krejsa, Cecile M. Yi, Eugene C. <1> PRZECIWCIAŁA MONOKLONALNE PRZECIWKO LUDZKIEJ IL-21 <1> 07-16PC <> 61/012,329 <11> <160> 97 <170> FastSEQ for Windows Version

84 <2> 1 <211> 642 <212> DNA <400> 1 <2> 2 <211> 162 <212> PRT <400> 2 1 <2> 3 83

85 <211> 21 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <2> <223> Peptyd nr 1 <400> 3 1 <2> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <2> <223> Peptyd nr 2 <400> 4 2 <2> <211> 26 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <2> <223> Peptyd nr 3 <400> <2> 6 <211> 29 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <2> 84

86 <223> Peptyd nr 4 <400> 6 <2> 7 <211> 162 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <2> <223> Zmutowana rekombinowana IL-21 aa <400> 7 1 <2> 8 <211> 4 <212> DNA <213> Cynomylous <400> 8 8

87 <2> 9 <211> 162 <212> PRT <213> Cynomylous <400> 9 1 <2> <211> 72 <212> DNA <213> Mysi <400> 86

88 87

89 88

90 <2> 11 <211> 146 <212> PRT <213> Mysi <400> 11 1 <2> 12 <211> 423 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(423) <400> 12 89

91 <2> 13 <211> 141 <212> PRT <400> 13 90

92 <2> 14 <211> 21 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(21) <400> <2> 1 <211> 7 <212> PRT <400> 1 Ser Arg Thr Tyr Arg Trp Gly 1 <2> 16 <211> 48 <212> DNA <2> <221> CDS 91

93 <222> (1)...(48) <400> 16 <2> 17 <211> 16 <212> PRT <400> 17 1 <2> 18 <211> 36 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(36) <400> 18 2 <2> 19 <211> 12 <212> PRT <400> 19 3 <2> <211> 378 <212> DNA 92

94 <2> <221> CDS <222> (1)...(378) <400> <2> 21 <211> 126 <212> PRT <400> 21 93

95 <2> 22 <211> 33 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(33) <400> 22 1 <2> 23 <211> 11 <212> PRT <400> 23 2 <2> 24 <211> 21 <212> DNA <2> <221> CDS 94

96 <222> (1)...(21) <400> 24 <2> 2 <211> 7 <212> PRT <400> 2 1 <2> 26 <211> 24 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(24) <400> 26 2 <2> 27 <211> 8 <212> PRT <400> 27 3 <2> 28 <211> 43 <212> DNA 9

97 <2> <221> CDS <222> (1)...(43) <400> 28 1 <2> 29 <211> 14 <212> PRT <400> 29 96

98 <2> <211> 16 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(16) <400> 1 <2> 31 <211> <212> PRT <400> 31 <2> 32 <211> 1 <212> DNA 97

99 <2> <221> CDS <222> (1)...(1) <400> 32 <2> 33 <211> 17 <212> PRT <400> 33 1 <2> 34 <211> 1 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(1) <400> 34 2 <2> 3 <211> 17 <212> PRT <400> 3 98

100 <2> 36 <211> 378 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(378) <400> 36 1 <2> 37 <211> 126 <212> PRT <400> 37 99

101 <2> 38 <211> 36 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(36) <400> 38 1 <2> 39 <211> 12 <212> PRT <400> 39 2 <2> 40 <211> 21 <212> DNA 0

102 <2> <221> CDS <222> (1)...(21) <400> 40 <2> 41 <211> 7 <212> PRT <400> 41 1 <2> 42 <211> 21 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(21) <400> 42 2 <2> 43 <211> 7 <212> PRT <400> 43 3 <2> 44 <211> 43 <212> DNA 1

103 <2> <221> CDS <222> (1)...(43) <400> 44 1 <2> 4 <211> 14 <212> PRT <400> 4 2

104 <2> 46 <211> 1 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(1) <400> 46 1 <2> 47 <211> <212> PRT <400> 47 <2> 48 <211> 1 <212> DNA 3

105 <2> <221> CDS <222> (1)...(1) <400> 48 <2> 49 <211> 17 <212> PRT <400> <2> 0 <211> 1 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(1) <400> 0 <2> 1 <211> 17 <212> PRT <400> 1 4

106 <2> 2 <211> 378 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(378) <400> 2 1 <2> 3 <211> 126 <212> PRT

107 <400> 3 1 <2> 4 <211> 36 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(36) <400> 4 <2> <211> 12 <212> PRT <400> 2 <2> 6 <211> 21 <212> DNA 6

108 <2> <221> CDS <222> (1)...(21) <400> 6 <2> 7 <211> 7 <212> PRT <400> <2> 8 <211> 21 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(21) <400> 8 <2> 9 <211> 7 <212> PRT <400> 9 3 <2> 60 <211> 417 7

109 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(417) <400> 60 1 <2> 61 <211> 139 <212> PRT <400> 61 8

110 <2> 62 <211> 1 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(1) <400> 62 1 <2> 63 <211> <212> PRT <400> 63 2 <2> 64 <211> 1 <212> DNA <2> 9

111 <221> CDS <222> (1)...(1) <400> 64 <2> 6 <211> 17 <212> PRT <400> 6 1 <2> 66 <211> 33 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(33) <400> 66 2 <2> 67 <211> 11 <212> PRT <400> 67 <2> 68 1

112 <211> 387 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(387) <400> 68 1 <2> 69 <211> 129 <212> PRT <400>

113 <2> 70 <211> 33 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(33) <400> 70 1 <2> 71 <211> 11 <212> PRT <400> 71 2 <2> 72 <211> 21 <212> DNA 112

114 <2> <221> CDS <222> (1)...(21) <400> 72 <2> 73 <211> 7 <212> PRT <400> 73 1 <2> 74 <211> 27 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(27) <400> 74 2 <2> 7 <211> 9 <212> PRT <400> 7 3 <2> 76 <211> 408 <212> DNA 113

115 <2> <221> CDS <222> (1)...(408) <400> 76 1 <2> 77 <211> 136 <212> PRT <400>

116 <2> 78 <211> 1 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(1) <400> 78 1 <2> 79 <211> <212> PRT <400> 79 2 <2> 80 <211> 49 <212> DNA <2> 11

117 <221> CDS <222> (1)...(99) <400> 80 <2> 81 <211> 16 <212> PRT <400> 81 1 <2> 82 <211> 27 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(27) <400> 82 2 <2> 83 <211> 9 <212> PRT <400> 83 3 <2> 84 <211>

118 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(387) <400> 84 1 <2> 8 <211> 129 <212> PRT <400> 8 117

119 <2> 86 <211> 33 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(33) <400> 86 1 <2> 87 <211> 11 <212> PRT <400> 87 2 <2> 88 <211> 21 <212> DNA <2> 118

120 <221> CDS <222> (1)...(21) <400> 88 <2> 89 <211> 7 <212> PRT <400> 89 1 <2> 90 <211> 27 <212> DNA <2> <221> CDS <222> (1)...(27) <400> 90 2 <2> 91 <211> 9 <212> PRT <400> 91 3 <2> 92 <211> 13 <212> PRT 119

121 <400> 92 <2> 93 <211> 13 <212> PRT <400> 93 1

122 <2> 94 <211> 162 <212> PRT <400> 94 1 <2> 9 <211> 177 <212> PRT <400> 9 121

123 <2> 96 <211> 144 <212> PRT <400>

124 <2> 97 <211> 146 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400>

125 1 2 3 Zastrzeżenia patentowe 1. Przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-21 lub jego fragment, które to przeciwciało monoklonalne lub fragment tego przeciwciała obejmuje: (a) region łańcucha ciężkiego, obejmujący: (i) region zmienny łańcucha ciężkiego CDR1 obejmujący SEKW. NR: 31; (ii) region zmienny łańcucha ciężkiego CDR2 obejmujący SEKW. NR: 33; i (iii) region zmienny łańcucha ciężkiego CDR3 obejmujący SEKW. NR: 3; oraz (b) region łańcucha lekkiego, obejmujący: (i) region zmienny łańcucha lekkiego CDR1 obejmujący SEKW. NR: 39; (ii) region zmienny łańcucha lekkiego CDR2 obejmujący SEKW. NR: 41; i (iii) region zmienny łańcucha lekkiego CDR3 obejmujący SEKW. NR: Przeciwciało lub fragment przeciwciała według zastrz. 1, obejmujący reszty aminokwasowe od do 14 z SEKW. NR: 29 i reszty aminokwasowe od 21 do 126 z SEKW. NR: Przeciwciało wytwarzane przez hybrydomę oznaczoną , która to hybrydoma jest zdeponowana w American Type Culture Collection pod Numerem Depozytu Patentowego ATCC PTA Przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-21 lub jego fragment, które to przeciwciało monoklonalne lub fragment przeciwciała obejmuje: (a) region łańcucha ciężkiego, obejmujący: (i) region zmienny łańcucha ciężkiego CDR1 obejmujący SEKW. NR: 47; (ii) region zmienny łańcucha ciężkiego CDR2 obejmujący SEKW. NR: 49; i (iii) region zmienny łańcucha ciężkiego CDR3 obejmujący SEKW. NR: 1; oraz (b) region łańcucha lekkiego, obejmujący: (i) region zmienny łańcucha lekkiego CDR1 obejmujący SEKW. NR: ; (ii) region zmienny łańcucha lekkiego CDR2 obejmujący SEKW. NR: 7; i (iii) region zmienny łańcucha lekkiego CDR3 obejmujący SEKW. NR: 9.. Przeciwciało lub fragment przeciwciała według zastrz. 4, obejmujący reszty aminokwasowe -14 z SEKW. NR: 4 i reszty aminokwasowe z SEKW. NR: Przeciwciało lub fragment przeciwciała według zastrz. 4 albo, które to przeciwciało jest wytwarzane przez hybrydomę oznaczoną , która to hybrydoma jest zdeponowana w American Type Culture Collection Collection pod Numerem Depozytu Patentowego ATCC PTA Przeciwciało według któregokolwiek spośród wcześniejszych zastrz., które to przeciwciało zawiera fragment Fc. 8. Przeciwciało według zastrz. 7, w którym fragment Fc ma ograniczoną funkcję efektorową. 9. Przeciwciało według zastrz. 7, w którym fragment Fc jest wybrany z grupy składające się z IgG1, IgG2 i IgG4.. Hybrydoma oznaczona , która to hybrydoma jest zdeponowana w American Type Culture Collection pod Numerem Depozytu Patentowego ATCC PTA Przeciwciało lub fragment przeciwciała według któregokolwiek spośród zastrz. 1-9, do stosowania w medycynie. 12. Przeciwciało lub fragment przeciwciała według któregokolwiek spośród zastrz. 1-9, do stosowania w leczeniu nieswoistego zapalenia jelit (IBD), które to nieswoiste zapalenie jelit jest 124

126 wybrane z grupy składającej się z choroby Crohna, wrzodziejącego zapalenia jelita grubego i zespołu jelita drażliwego. 13. Przeciwciało lub fragment przeciwciała według któregokolwiek spośród zastrz. 1-9, do stosowania w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów. 14. Przeciwciało lub fragment przeciwciała według któregokolwiek spośród zastrz. 1-9, do stosowania w leczeniu stwardnienia rozsianego. 1. Przeciwciało lub fragment przeciwciała według któregokolwiek spośród zastrz. 1-9, do stosowania w leczeniu cukrzycy typu I (IDDM). 16. Przeciwciało lub fragment przeciwciała według któregokolwiek spośród zastrz. 1-9, do stosowania w leczeniu zespołu Sjögrena. 17. Przeciwciało lub fragment przeciwciała według któregokolwiek spośród zastrz. 1-9, do stosowania w leczeniu choroby autoimmunologicznej. 18. Przeciwciało lub fragment przeciwciała według któregokolwiek spośród zastrz. 1-9, do stosowania według zastrz. 17, w którym choroba autoimmunologiczna jest wybrana z grupy składającej się z: zapalenia trzustki, choroby zapalnej mięśni (zapalenia wielomięśniowego, zapalenia skórno-mięśniowego), mikroskopowego zapalenia naczyń, autoimmunologicznej niedokrwistości aplastycznej, autoimmunologicznego zapalenia tarczycy, autoimmunologicznego zapalenia wątroby, zespołu Wegenera, uchyłkowatości, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, sklerodermii, twardziny układowej, łuszczycowego zapalenia stawów, zapalenia kości i stawów, atopowego zapalenia skóry, bielactwa nabytego, choroby przeszczep przeciw gospodarzowi (GVHD), chłoniaka skórnego T-komórkowego (CTCL), kłębuszkowego zapalenia nerek, nefropatii IgA, wysoce zimmunizowanych pacjentów transplantacyjnych, zespołu antyfosfolipidowego, zapalenia błony naczyniowej i astmy. 19. Przeciwciało lub fragment przeciwciała według któregokolwiek spośród zastrz. 1-9, do stosowania w leczeniu tocznia rumieniowatego układowego (SLE) lub łuszczycy.. Przeciwciało lub fragment przeciwciała według któregokolwiek spośród zastrz. 1-9, do stosowania w leczeniu choroby, w której pośredniczą folikularne pomocnicze limfocyty T lub w której pośredniczą limfocyty B, wybranej z grupy składającej się z: tocznia rumieniowatego układowego, utraty słuchu na tle autoimmunologicznym, choroby Gravesa, pęcherzycy zwykłej, miastenii, zapalenia rdzenia i nerwów wzrokowych, zespołu Goodpasture'a, autoimmunologicznego zapalenia nerek, krioglobulinemii, zespołu Guillaina-Barrégo, przewlekłej zapalnej polineuropatii demielinizacyjnej (CIDP), autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej i idiopatycznej plamicy małopłytkowej (ITP). 21. Przeciwciało lub fragment przeciwciała według któregokolwiek spośród zastrz. 1-9, do stosowania w leczeniu pacjenta transplantacyjnego, w którym zostaje wytłumiona reakcja odrzucenia przeszczepu, zostaje ustalona tolerancja w przedtransplantacyjnym schemacie leczenia lub zostają ograniczone miana alloprzeciwciał u pacjenta. 22. Przeciwciało lub fragment przeciwciała według któregokolwiek spośród zastrz. 1-9, do stosowania w leczeniu choroby, w której pośredniczą limfocyty T H 1 lub w której pośredniczą limfocyty T H 17 u pacjenta, przy czym choroba, w której pośredniczą limfocyty T H 1 lub choroba, w której 12

127 pośredniczą limfocyty T H 17, jest wybrana z grupy składającej się z łuszczycy, spondyloartropatii, odczynowego zapalenia stawów, enteropatycznego zapalenia stawów, autoimmunologicznego zapalenia mięśnia sercowego, choroby Kawasakiego, choroby trzewnej, zapalenia błony naczyniowej, choroby Behceta, choroby wieńcowej, przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) i śródmiąższowej choroby płuc. 126

128 Fig 1 Dopasowanie łańcucha VH przeciwciała anty-il-21 Definicje CDR i numeracja regionu V zgodnie z Kabat - wskazuje identyczność sekwencji z 78 VH - wskazuje delecję wprowadzoną w celu maksymalizacji całkowitej homologii sekwencji 127

129 Fig. 2 Dopasowanie łańcucha VL przeciwciała anty-il-21 Sekwencja sygnałowa wskazana na czerwono Definicje CDR i numeracja regionu V zgodnie z Kabat - wskazuje identyczność sekwencji z 78 VL - wskazuje delecję wprowadzoną w celu maksymalizacji całkowitej homologii sekwencji 128

130 Fig

131 Fig. 4 1

132 ODNOŚNIKI CYTOWANE W OPISIE Niniejsza lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego podana jest tylko dla wygody czytelnika. Nie stanowi ona części europejskiego dokumentu patentowego. Nawet mimo dużej staranności przy zestawianiu odnośników nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń, i Europejski Urząd Patentowy zrzeka się wszelkiej odpowiedzialności w tym zakresie. Literatura patentowa cytowana w opisie Literatura niepatentowa cytowana w opisie 131

133 132

134 133

135 134