(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US01/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US01/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO02/02773 (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 15/13 ( ) G01N 33/68 ( ) A61K 51/10 ( ) A61P 37/06 ( ) C07K 16/24 ( ) Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Sposób uzyskiwania przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części wiążącej antygen (73) Uprawniony z patentu: Abbott Laboratories, Abbott Park, US (30) Pierwszeństwo: , US, 60/215,379 (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 18/04 (72) Twórca(y) wynalazku: ALBERT COLLINSON, Marlborough, US TARIQ GHAYUR, Holliston, US GEORGE AVGERINOS, Sudbury, US RICHARD DIXON, North Grafton, US ZEHRA KAYMAKCALAN, Westborough, US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 03/11 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Tykarski Wojciech SULIMA*GRABOWSKA*SIERZPUTOWSKA Biuro Patentów i Znaków Towarowych spółka jawna PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Wynalazek dotyczy sposobu uzyskiwania przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części wiążącej antygen, które specyficznie wiąże dwa różne, lecz strukturalnie pokrewne białka. System odpornościowy ssaków obejmuje limfocyty B, które wytwarzają repertuar przeciwciał składający się z setek miliardów różnych specyficzności przeciwciał. Prawidłowa odpowiedź immunologiczna wobec konkretnego antygenu obejmuje wybór ze wspomnianego repertuaru przeciwciał jednego lub więcej przeciwciał specyficznie wiążących antygen, i powodzenie odpowiedzi immunologicznej oparte jest, przynajmniej w części, na zdolności wspomnianych przeciwciał do specyficznego rozpoznawania (i ostatecznie eliminowania) stymulującego antygenu i ignorowania innych cząsteczek z otoczenia wspomnianych przeciwciał. Użyteczność przeciwciał specyficznie rozpoznających jeden konkretny docelowy antygen doprowadziła do rozwoju technologii przeciwciał monoklonalnych. Standardowa technologia hybrydomy umożliwia obecnie wytwarzanie przeciwciał o pojedynczej specyficzności wobec konkretnego antygenu. Niedawno rozwinięto technikę wytwarzania przeciwciał rekombinowanych, taką jak technika przeszukiwania bibliotek przeciwciał in vitro. Techniki te umożliwiają wytwarzanie przeciwciał z pojedynczą specyficznością względem konkretnego antygenu. Przeciwciała specyficzne wobec pojedynczego docelowego antygenu mogą, co najmniej w określonych warunkach, wykazywać niekorzystną, krzyżową reaktywność lub wiązanie niespecyficzne ( tło ) do innych antygenów. Wspomniana reaktywność krzyżowa lub wiązanie niespecyficzne jest jednak nieprzewidywalne (tzn. nie można przewidzieć z którym antygenem konkretne przeciwciało będzie reagować krzyżowo). Ponadto, wiązanie to daje się rozróżnić zazwyczaj od specyficznego wiązania antygenu przez przeciwciało, ponieważ reprezentuje jedynie niewielką część zdolności przeciwciała do wiązania antygenu (np. 1% lub mniej całkowitej siły wiązania przeciwciała) i zazwyczaj obserwowane jest przy dużych stężeniach przeciwciała (np krotnym lub wyższym, w porównaniu ze stężeniem niezbędnym do zaobserwowania zjawiska specyficznego wiązania antygenu). Jakkolwiek istnieją poszczególne antygeny, które należeć mogą do strukturalnie pokrewnej rodziny białek, odpowiedź wspomnianego przeciwciała względem konkretnego członka rodziny jest wysoce specyficzna. Ponadto istnieje szereg przykładów członków należących do konkretnej rodziny białek (np. członków rodzin IL-1 i TNF) które wiążą się z tym samym receptorem, składnikiem receptora czy ze strukturalnie pokrewnymi receptorami, jednak przeciwciała monoklonalne wytworzone przeciw jednemu członkowi takiej rodziny nie wykazują wysokiej reaktywności krzyżowej skierowanej wobec innych członków rodziny. Może być kilka przyczyn braku reaktywności krzyżowej przeciwciał monoklonalnych wobec różnych członków rodziny. Po pierwsze w standardowej procedurze hybrydomy poszukuje się jedynie nielicznych przeciwciał o wysokiej specyficzności/powinowactwie wobec docelowego antygenu i sprawdza się reaktywność krzyżową lub wiązanie niespecyficzne kilku wybranych przeciwciał. Po drugie choć białka w obrębie rodziny są strukturalnie pokrewne, mogą one posiadać właściwe sobie jedynie, nie pokrywające się immunodominujące epitopy. Zatem przeciwciała monoklonalne wytworzone z zastosowaniem białka pełnej długości nie muszą wykazywać reaktywności krzyżowej z innymi, strukturalnie pokrewnymi białkami. Znane są przykłady przeciwciał monoklonalnych wytworzonych przeciw antygenowi z jednego gatunku, które wiążą się specyficznie z funkcjonalnie takim samym antygenem, z innego gatunku. Na przykład przeciwciało X przeciw-mysie może łatwo reagować z ludzkim antygenem X. Dzieje się tak, ponieważ antygeny te łączą znaczące podobieństwa sekwencyjne i strukturalne, mimo że nie są identyczne. Jednakże wspomniana gatunkowa reaktywność krzyżowa przeciwciał nie stanowi podwójnej specyficzności przeciwciał, ponieważ wykazują one specyficzność wobec tego samego antygenu z różnych gatunków organizmów. Zatem istnieje zapotrzebowanie na przeciwciała monoklonalne posiadające przewidywalną podwójną lub wielokrotną specyficzność, to jest przeciwciała wykazujące prawdziwą specyficzność wobec dwu lub więcej antygenów. Podsumowanie wynalazku Wynalazek dotyczy sposobu uzyskiwania przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części wiążącej antygen, które specyficznie wiąże dwa różne, lecz strukturalnie pokrewne białka, charakteryzującego się tym, że otrzymuje się antygen przez składanie ze sobą zachodzących na siebie części dwu różnych, lecz strukturalnie pokrewnych białek dla utworzenia peptydu hybrydowego, który to peptyd ma strukturę X-Y-Z, gdzie Y przedstawia region identyczny lub bardzo podobny dla obu po-

3 PL B1 3 krewnych białek, X przedstawia region z jednego z pokrewnych białek, a Z przedstawia region z drugiego z pokrewnych białek; wystawia się repertuar przeciwciał na działanie tego antygenu; i przeprowadza się selekcję repertuaru przeciwciał, które specyficznie wiążą te dwie różne, lecz strukturalnie pokrewne białka, w celu otrzymania przeciwciała o podwójnej specyficzności. Korzystnie repertuar przeciwciał wystawia się na działanie antygenu in vivo poprzez immunizację nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem. Korzystniej sposób obejmuje ponadto przygotowanie panelu hybrydom z limfocytów zwierzęcia i wybieranie hybrydomy wydzielającej przeciwciało specyficznie wiążące dwa różne, lecz strukturalnie pokrewne białka cząsteczki. Korzystnie zwierzę wybiera się z grupy obejmującej myszy, szczury, króliki i kozy. Korzystnie jako zwierzę stosuje się mysz z wyłączonym genem pozbawioną endogennej wersji antygenu. Korzystnie stosuje się zwierzę będące myszą transgeniczną pod względem ludzkich genów immunoglobulin i wytwarzające w wyniku stymulacji antygenowej ludzkie przeciwciała. Korzystnie stosuje się zwierzę będące myszą z ostrym złożonym zespołem braku odporności odbudowanej za pomocą ludzkich obwodowych komórek jednojądrzastych lub komórek limfoidalnych, lub ich prekursorów. Korzystnie stosuje się zwierzę będące myszą poddaną naświetleniu śmiertelną dawką promieniowania, następnie poddaną ochronie radiologicznej przez przeszczep komórek szpiku kostnego od myszy z ostrym złożonym zespołem braku odporności, a następnie przeszczepieniu ludzkich, funkcjonalnych limfocytów. W korzystnej postaci repertuar przeciwciał wystawia się na działanie antygenu in vitro przez przeszukiwanie biblioteki rekombinowanych przeciwciał z wykorzystaniem tego antygenu. Korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni bakteriofaga. Także korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni komórki drożdżowej. Również korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni komórki bakterii. Korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana jako produkty fuzyjne RNA-białko. Także korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest biblioteką scfv lub biblioteką Fab. W korzystnej postaci repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu przez immunizację in vivo zwierzęcia tym antygenem, a następnie przeszukiwanie in vitro biblioteki rekombinowanych przeciwciał utworzonej z komórek limfoidalnych tego zwierzęcia z użyciem tego antygenu. W innej korzystnej postaci repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu in vivo poprzez immunizację zwierzęcia tym antygenem, a następnie dojrzewanie powinowactwa in vitro biblioteki rekombinowanych przeciwciał utworzonej z komórek limfoidalnych tego zwierzęcia. W kolejnej korzystnej postaci repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu przez immunizację in vivo zwierzęcia tym antygenem, a następnie wybieranie pojedynczych komórek wydzielających przeciwciało wiążące antygen, i odzyskiwanie cdna zmiennych regionów łańcucha lekkiego i ciężkiego z tych pojedynczych komórek. Korzystnie uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące w pełni ludzkim przeciwciałem. Także korzystnie uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące przeciwciałem chimerycznym. Korzystnie uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące przeciwciałem z przeszczepionym CDR. W korzystnej postaci dwoma różnymi, lecz strukturalnie pokrewnymi białkami są interleukina-1α i interleukina-1β. Korzystniej jako antygen stosuje się antygen obejmujący sekwencję aminokwasową TKGGQ- DITDFQILENQ (Sek Id Nr 3). Także korzystniej repertuar przeciwciał wystawia się na działanie antygenu in vivo, poprzez immunizowanie nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem. Korzystniej ponadto przygotowuje panel hybrydom z limfocytów zwierzęcia i wybiera się hybrydomę wydzielającą przeciwciało specyficznie wiążące IL-1α i IL-1β.

4 4 PL B1 Korzystniej stosuje się zwierzę wybrane się z grupy obejmującej mysz, szczura, królika i kozę. Także korzystniej stosuje się zwierzę będące myszą z wyłączonym genem, nie wytwarzającą IL-1α, IL-1β lub IL-1α i IL-1β. Korzystniej stosuje się zwierzę będące myszą transgeniczną pod względem ludzkich genów immunoglobulin i wytwarzające w wyniku stymulacji antygenowej ludzkie przeciwciała. Korzystniej stosuje się zwierzę będące myszą z ostrym złożonym zespołem braku odporności odbudowanej za pomocą ludzkich obwodowych komórek jednojądrzastych lub komórek limfoidalnych, lub ich prekursorów. Także korzystniej stosuje się zwierzę będące myszą poddaną naświetleniu śmiertelną dawką promieniowania, następnie poddaną ochronie radiologicznej przez przeszczep komórek szpiku kostnego od myszy z ostrym złożonym zespołem braku odporności, a następnie przeszczepieniu ludzkich, funkcjonalnych limfocytów lub ich prekursorów. W korzystnej postaci repertuar przeciwciał wystawia się na działanie antygenu in vitro przez przeszukiwanie biblioteki rekombinowanych przeciwciał z wykorzystaniem tego antygenu. Korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni bakteriofaga. Korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni komórki drożdżowej. Korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni komórki bakterii. Korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana jako produkty fuzyjne RNA-białko. Korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest biblioteką scfv lub biblioteką Fab. W korzystnym sposobie repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu przez immunizację in vivo nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem, a następnie przeszukiwanie in vitro biblioteki rekombinowanych przeciwciał utworzonej z komórek limfoidalnych tego zwierzęcia z użyciem tego antygenu. W innym korzystnym sposobie repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu in vivo poprzez immunizację nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem, a następnie dojrzewanie powinowactwa in vitro biblioteki rekombinowanych przeciwciał utworzonej z komórek limfoidalnych tego zwierzęcia. W kolejnym korzystnym sposobie repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu przez immunizację in vivo nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem, a następnie wybieranie pojedynczych komórek wydzielających przeciwciało wiążące antygen, i odzyskiwanie cdna zmiennych regionów łańcucha lekkiego i ciężkiego z tych pojedynczych komórek. Korzystnie uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące w pełni ludzkim przeciwciałem. Korzystnie uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące przeciwciałem chimerycznym. Korzystnie uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące przeciwciałem z przeszczepionym CDR. W warunkach klinicznych poszczególni członkowie tej samej rodziny białkowej mogą przyczyniać się do wystąpienia różnych objawów procesu chorobowego. Zatem, przeciwciało o podwójnej specyficzności może zostać wykorzystane do wiązania członków tej samej rodziny białkowej, w celu zablokowania funkcji więcej niż jednego członka rodziny, co może być korzystne przy usuwaniu objawów choroby lub przerywaniu samego procesu chorobowego. Ponadto przeciwciała o podwójnej specyficzności według wynalazku można wykorzystać do wykrywania strukturalnie pokrewnych antygenów, oczyszczania strukturalnie pokrewnych antygenów i w testach diagnostycznych obejmujących strukturalnie pokrewne antygeny. Antygen może być zaprojektowany w oparciu o wspólny topologicznie obszar identyczności pomiędzy dwoma różnymi, lecz strukturalnie pokrewnymi cząsteczkami. Na przykład dwie różne lecz strukturalnie pokrewne strukturalnie cząsteczki mogą być białkami i antygen może być peptydem obejmującym sekwencje aminokwasową wspólnego topologicznie obszaru identyczności pomiędzy dwoma białkami. Antygen może być także zaprojektowany w oparciu o strukturalne naśladowanie pętli wspólnego obszaru fałdowania dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych cząsteczek. Na przykład antygen

5 PL B1 5 może być peptydem cyklicznym naśladującym strukturę pętli wspólnego obszaru topologicznej identyczności dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych białek. Antygen może być także zaprojektowany w oparciu o połączone razem, ułożone na przemian lub pokrywające się części dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych cząsteczek, w celu wytworzenia cząsteczki hybrydowej. Na przykład antygen może być hybrydowym peptydem wytworzonym przez połączenie razem ułożonych na przemian lub pokrywających się sekwencji aminokwasowych dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych białek. Repertuar przeciwciała może być wystawiony na działanie konkretnego antygenu in vivo albo in vitro. Na przykład wystawienie repertuaru przeciwciała na antygen obejmuje immunizowanie zwierzęcia in vivo przy pomocy antygenu. Wspomniany sposób in vivo może dalej obejmować otrzymanie zestawu hybrydom z limfocytów zwierzęcia i selekcjonowanie hybrydom które wydzielają przeciwciało które specyficznie wiąże dwa różne lecz strukturalnie pokrewne cząsteczki. Immunizowane zwierzę może być na przykład myszą, szczurem, królikiem lub kozą, lub wersją transgeniczną wspomnianych zwierząt, takim jak myszą będącą transgenem ludzkiego genu immunoglobulinowego, takim że wspomniana mysz wytwarza ludzkie przeciwciała w odpowiedzi na stymulację antygenową. Immunizowane mogą być również inne rodzaje zwierząt, obejmujące transgeniczną mysz z SCID wytworzoną z użyciem ludzkich obwodowych komórek jednojądrowych (chimerowa mysz hu-pbmc-scid) lub komórek limfoidalnych lub ich prekursorów, i mysz poddaną działaniu letalnej dawki promieniowania jonizującego, traktowaną następnie komórkami szpiku myszy SCID, a następnie traktowaną ludzkimi limfocytami (system Trimera). Kolejny rodzaj immunizowanego zwierzęcia może obejmować np. nokautowaną mysz np. w wyniku rekombinacji homologicznej z endogennym genem lub genami, kodującymi antygen lub antygeny według wynalazku, gdzie po immunizacji antygen lub antygenami według wynalazku nokautowane zwierzę rozpoznaje antygen lub antygeny jako obce. Repertuar przeciwciała może być wystawiony na działanie antygenu in vitro poprzez przeszukiwanie rekombinowanej biblioteki przeciwciała przy pomocy antygenu. Wspomniana rekombinowana biblioteka przeciwciała może być na przykład eksprymowana w bakteriofagu lub w komórkach drożdżowych lub w komórkach bakterii. Rekombinowana biblioteka przeciwciała jest na przykład biblioteką scfv lub biblioteką Fab. Biblioteki przeciwciała mogą być eksprymowane w postaci cząsteczek fuzyjnych RNA-białko. Możliwe jest też połączenie wspomnianych sposobów in vivo oraz in vitro, takie jak wystawienie repertuaru przeciwciała na działanie antygenu poprzez immunizację zwierzęcia in vivo wspomnianym antygenem, a następnie przeszukiwanie in vitro rekombinowanej biblioteki przeciwciała uzyskanej z komórek limfoidalnych wspomnianego zwierzęcia przy pomocy antygenu. Możliwe jest eksponowanie repertuaru przeciwciała na działanie antygenu poprzez immunizację in vivo zwierzęcia przy pomocy antygenu, a następnie selekcję pojedynczej komórki wytwarzającej przeciwciało, następnie uzyskanie cdna regionu zmiennego łańcucha lekkiego i ciężkiego z wyselekcjonowanych komórek (np. techniką PCR) i ekspresję regionów zmiennych łańcucha lekkiego i ciężkiego w komórkach ssaczego gospodarza in vitro (określa się go jako sposób otrzymywania przeciwciała z selekcjonowanych limfocytów, SLAM, selected lymphocyte antibody method), umożliwiając tym samym dalszą selekcję i manipulowanie wybraną sekwencją genu kodującego przeciwciało. Kolejny sposób selekcjonowania przeciwciał monoklonalnych może obejmować ekspresję genów kodujących ciężki i lekki łańcuch przeciwciała w komórkach ssaczych i wybieranie komórek eksprymujących i wydzielających przeciwciało o pożądanej specyficzności. Sposoby według wynalazku umożliwiają otrzymanie wielu różnych typów przeciwciał o podwójnej specyficzności, włączając w to przeciwciała w pełni ludzkie, przeciwciała chimerowe i przeciwciała chimerowe-cdr, oraz fragmenty wiążące antygen. Przeciwciało o podwójnej specyficzności można wykorzystać w sposobach wykrywania IL-1α lub IL-1β obejmujących kontaktowanie IL-1α lub IL-1β z przeciwciałem o podwójnej specyficzności, lub częścią wiążącą antygen wspomnianego przeciwciała, tak by prowadziło to do wykrycia IL-1α lub IL-1β. Przeciwciało neutralizujące o podwójnej specyficzności można zastosować również w sposobie hamowania aktywności IL-1α lub IL-1β poprzez kontaktowanie IL-1α lub IL-1β z przeciwciałem o podwójnej specyficzności, lub częścią wiążącą antygen wspomnianego przeciwciała, tak by prowadziło to do hamowania aktywności IL-1α lub IL-1β. Wspomniane przeciwciała o podwójnej specyficzności można również stosować w sposobach leczenia choroby w której istnieje patologia interleukiny 1, obejmujących podawanie choremu przeciwciała o podwójnej specyficzności lub części wiążącej antygen wspomnianego przeciwciała.

6 6 PL B1 Szczegółowy opis wynalazku Wynalazek wiąże się z projektowaniem i zastosowaniem antygenów do wytwarzania przeciwciał o podwójnej specyficzności, to jest przeciwciał specyficznych wobec co najmniej dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych cząsteczek, jak również dostarcza sposobu wytwarzania przeciwciał o podwójnej specyficzności. Strukturalne pokrewieństwo antygenów może obejmować całą cząsteczkę antygenu (np. białka) lub jedynie pewne strukturalnie pokrewne regiony. Wynalazek dostarcza sposobu uzyskiwania przeciwciał o podwójnej specyficzności które specyficznie wiążą dwie różne lecz strukturalnie pokrewne cząsteczki, obejmującego: dostarczenie antygenu obejmującego wspólne cechy strukturalne dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych cząsteczek eksponowanie repertuaru przeciwciał na antygen selekcjonowanie z repertuaru przeciwciała specyficznie wiążącego dwie różne lecz strukturalnie pokrewne cząsteczki, w celu uzyskania przeciwciała o podwójnej specyficzności. Należy zwrócić uwagę, że choć wynalazek przedstawiony jest tu w terminach opisujących rozpoznawanie dwu różnych lecz pokrewnych antygenów, to termin przeciwciało o podwójnej specyficzności w zamierzeniu ma obejmować przeciwciała specyficznie rozpoznające nawet więcej niż dwa różne lecz pokrewne antygeny, takie jak przeciwciało rozpoznające trzy, cztery, pięć lub więcej strukturalnie pokrewnych lecz różnych antygenów. Ponadto termin różne lecz strukturalnie pokrewne antygeny w zamierzeniu obejmuje antygeny (np. białka) których ogólne struktury są pokrewne, jak również antygeny (np. białka) które łączy jeden lub więcej regionów strukturalnie pokrewnych, a które nie są pod innymi względami pokrewne. Zatem różne lecz strukturalnie pokrewne antygeny mogą być na przykład dwoma białkami należącymi do tej samej rodziny białek, charakteryzującymi się wspólną ogólną strukturą lub mogą być na przykład dwoma białkami których ogólna struktura nie jest do siebie podobna (nie jest pokrewna) lecz oba posiadają pokrewne strukturalnie domeny. Do wytworzenia przeciwciał według wynalazku można zastosować różne rodzaje antygenów i różne sposoby otrzymywania przeciwciał, w celu uzyskania przeciwciała o podwójnej specyficzności, tak jak przedyskutowano to w szczegółach poniżej. I. Przeciwciała o podwójnej specyficzności W celu wytworzenia przeciwciała o podwójnej specyficzności według wynalazku, wytwarza się przeciwciała skierowane przeciw antygenowi zdolnemu do wytworzenia przeciwciał o podwójnej specyficzności. Takie antygeny określa się dalej zasadniczo jako antygeny o podwójnej specyficzności. Można zastosować różne rodzaje antygenów o podwójnej specyficzności, a projektowanie różnych rodzajów antygenów o podwójnej specyficzności przedstawiono poniżej. A. Przylegające topologiczne obszary identyczności W konkretnej postaci antygen o podwójnej specyficzności obejmuje przylegający topologiczne obszar identyczności i/lub podobieństwa pomiędzy dwiema różnymi lecz strukturalnie pokrewnymi cząsteczkami, dla których powstaje przeciwciało o podwójnej specyficzności. Korzystnie wspomniany antygen obejmuje największy (np. najdłuższy) przylegający topologiczny obszar identyczności i/lub podobieństwa pomiędzy dwiema różnymi lecz strukturalnie pokrewnymi cząsteczkami. Korzystnie wspomniane dwie różne lecz strukturalnie pokrewne cząsteczki są białkami i antygen o podwójnej specyficzności obejmuje liniowy peptyd odpowiadający największemu (np. najdłuższemu) przylegającemu topologicznemu obszarowi identyczności i/lub podobieństwa obu wspomnianych białek. Użyteczny region identyczności/podobieństwa jest korzystnie regionem wiązania receptora lub ligandu, choć stosować można także inne regiony identyczności/podobieństwa. W celu określenia przylegających topologicznych obszarów identyczności pomiędzy dwiema cząsteczkami (np. białkami), te dwie cząsteczki są porównywane (np. poprzez modelowanie homologiczne, porównywanie informacji strukturalnych lub uliniowienie sekwencji) i w ten sposób identyfikowane są regiony identyczne lub podobne. W przypadku białek, można zastosować algorytm porównywania w celu stworzenia optymalnego uliniowienia i zidentyfikowania największego (np. najdłuższego) przylegającego topologicznego obszaru identyczności i/lub podobieństwa pomiędzy dwoma białkami. Korzystnym, nie ograniczającym przykładem algorytmu matematycznego stosowanego do porównywania dwu sekwencji jest algorytm podany przez Karlina i Altschula (1990) PNAS 87: , zmodyfikowany przez Karlina i Altschula (1993) PNAS 90: Algorytm taki stanowi część programów NBLAST i XBLAST Altschula i wsp (1990) J Mol Biol 215: W celu uzyskania uliniowienia sekwencji z lukami do celów porównawczych, można stosować program Gapped BLAST, tak jak opisał to Altschul i wsp (1997) NAR 25(17): Gdy stosuje się programy BLAST

7 PL B1 7 i Gapped BLAST można stosować domyślne parametry odpowiednich programów (np. XBLAST i NBLAST). Por: Alternatywnym algorytmem matematycznym który można zastosować w tym samym celu jest program ALIGN podany przez Myersa i Millera (1988) Comput Appl Biosci 4: Gdy użyteczny region identyczności/podobieństwa zostanie wybrany, można następnie zsyntezować chemicznie antygen o podwójnej specyficzności odpowiadający wybranemu obszarowi. Na przykład w przypadku antygenów peptydowych peptyd może być zsyntezowany standardowymi sposobami syntezy peptydów. Antygen peptydowy może obejmować L aminokwasy. W innej postaci antygen peptydowy może w całości lub części składać się z D aminokwasów. Przykład projektowania antygenu o podwójnej specyficzności opartego na przylegającym topologicznym obszarze identyczności i/lub podobieństwa pomiędzy dwoma różnymi lecz strukturalnie pokrewnymi białkami opisany jest w szczegółach w przykładzie 1. B. Peptydy cykliczne naśladujące pętlę strukturalną Antygen o podwójnej specyficzności według wynalazku może obejmować cząsteczkę cykliczną, korzystnie peptyd cykliczny, naśladujący strukturalnie kluczową pętlę obszaru fałdowania dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych cząsteczek (np. białek) dla którego wytwarzane jest specyficzne przeciwciało. W celu otrzymania wspomnianego antygenu porównywane są struktury dwu pokrewnych cząsteczek i wyszukiwana jest identyczna strukturalnie pętla fałdowania, obecna w obu cząsteczkach. W celu zidentyfikowania wspomnianych pętli i wspólnych strukturalnie obszarów fałdowania można stosować standardowe techniki modelowania i analizy krystalograficznej. Identyczne lub podobne regiony (np. sekwencje aminokwasowe wspólne dla obu cząsteczek) mogą zostać zidentyfikowane, a następnie można wyprowadzić sekwencję konsensusową dla regionów podobnych lecz nie identycznych. Cząsteczka liniowa (np. liniowy peptyd) projektowana jest w oparciu o wykryte podobieństwa i regiony identyczne a następnie wspomniana cząsteczka liniowa może być cyklizowana, w znany chemikom sposób, tak by stała się antygenem naśladującym tę kluczową pętlę. Na przykład na końcu liniowego peptydu można dodać prolinę i glicynę w celu umożliwienia cyklizacji peptydu. Przykład projektowania antygenu o podwójnej specyficzności w postaci peptydu cyklicznego naśladującego pętlę wspólną strukturalnie dla obu różnych lecz pokrewnych białek podaje Przykład 2. C. Cząsteczki hybrydowe Przeciwciało o podwójnej specyficzności według wynalazku może też obejmować cząsteczkę hybrydową, korzystnie peptyd hybrydowy, obejmujący ułożone na przemian lub pokrywające się części dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych cząsteczek (np. białek) dla których wytwarza się przeciwciała o podwójnej specyficzności. W celu wytworzenia tego typu antygenu, struktury dwu wspomnianych cząsteczek są najpierw porównywane, i identyfikowane są regiony pokrywające się (regiony identyczności), jak również regiony nieidentyczne obu cząsteczek. Następnie przygotowywana jest cząsteczka hybrydowa (np. peptyd hybrydowy, w przypadku gdy obie cząsteczki są białkami) korzystnie obejmująca regiony położone na przemian (np. sekwencje aminokwasowe) z każdej z dwu cząsteczek, jak również regiony pokrywające się, wspólne dla obu cząsteczek. Schematycznie wspomnianą cząsteczkę hybrydową można przedstawić następująco: X-Y-Z, gdzie Y przestawia region identyczności lub dużego podobieństwa dla obu pokrewnych cząsteczek (region pokrywający się), X przedstawia region z jednej z wspomnianych cząsteczek, a Z przedstawia region z drugiej z wspomnianych cząsteczek. Przykład projektowania antygenu o podwójnej specyficzności opartego na peptydzie hybrydowym obejmującym sekwencje dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych białek opisany jest szczegółowo w Przykładzie 3. Inny rodzaj cząsteczki hybrydowej jest cząsteczką, w której peptyd został wprowadzony do białka o pełnej długości (dalej określanego jako białko docelowe). Peptydy wybrane są tak, by odpowiadały regionom funkcjonalnym dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych białek, na przykład, regionom oddziałującym z receptorem. Takie peptydy określane są dalej jako peptydy funkcjonalne. Funkcjonalny peptyd z jednego z pokrewnych białek może być następnie wprowadzony do innego, pokrewnego białka o pełnej długości, lub alternatywnie, do białka niepokrewnego. Na przykład peptyd IL-1α odpowiadający regionowi oddziałującemu z receptorem IL-1α jest identyfikowany, i ten funkcjonalny peptyd IL-1α wprowadzany jest do białka o pełnej długości IL-1β, w celu stworzenia białka hybrydowego IL-1α/lL-1β. Podobnie peptyd IL-1β odpowiadający regionowi oddziałującemu z receptorem IL-1β jest identyfikowany, i ten funkcjonalny peptyd IL-1β wprowadzany jest do białka o pełnej długości IL-1α, w celu stworzenia białka hybrydowego IL-1α/IL-1β. Wspomniane wprowadzenie funkcjonalnego peptydu do pokrewnego białka pełnej długości ogranicza peptyd funkcjonalny z obu końców i zachowuje strukturę fałdowania funkcjonalnego peptydu.

8 8 PL B1 W przypadku cząsteczki hybrydowej IL-1α/lL-1β peptyd funkcjonalny wprowadzany jest (zastępuje naturalne aminokwasy) w regionie docelowym odpowiadającej wspólnej strukturze przestrzennej IL-1α i IL-1β. Wspomniane struktury można odszukać na całej długości białka (np. w regionie N-końcowym, w części środkowej i regionie C-końcowym). Ponadto funkcjonalne peptydy odpowiadające odpowiadającej wspólnej strukturze przestrzennej IL-1α/lL-1β można wprowadzić również do innych białek, takich jak albumina i niektórych innych naturalnie występujących białek. W takim przypadku korzystne miejsce wprowadzenia peptydu to region umożliwiający utrzymanie przez wprowadzany peptyd poprawnej struktury przestrzennej. Zatem miejsca wprowadzania peptydu mogą być regionem N-końcowym, regionem środkowym lub regionem C-końcowym białka. Miejsce wprowadzenia wspomnianych peptydów do naturalnie występującego białka docelowego dobrane jest tak, by naśladowało naturalne ograniczenia strukturalne, właściwe dla naturalnego białka z którego pochodzą wspomniane peptydy. Choć funkcjonalny peptyd może być po prostu wprowadzony do białka docelowego w taki sposób, że aminokwasy funkcjonalnego peptydu dodawane są do białka docelowego, to korzystnie aminokwasy funkcjonalnego peptydu zastępują część białka docelowego, do którego jest on wprowadzony. Cząsteczka hybrydowa stosowana jest jako antygen o podwójnej specyficzności w celu wytworzenia przeciwciała o podwójnej specyficzności wobec IL-1α i IL-1β, może być konstruowana tak, że funkcjonalny peptyd odpowiadający specyficznemu elementowi strukturalnemu albo IL-1α, albo IL-1β wprowadzany jest do pełnej długości IL-1β albo IL-1α w równoważnej pozycji strukturalnej. Wybrana cząsteczka hybrydowa zastępuje reszty IL-1β resztami IL-1α. Powstająca cząsteczka ma następującą sekwencję aminokwasową, w której zastąpiona sekwencja IL-1α (reszty ) jest podkreślona: APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMGAYKSSKD- DAKITVILGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYI STSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS (Sek Id Nr 4) Wspomnianą cząsteczkę można wytworzyć standardowymi metodami biologii molekularnej (np. klonowaniem, techniką PCR) stosując dostępne ogólnie sekwencje cdna IL-1α i IL-1β, i stosując techniki ekspresji rekombinowanego białka. Hybrydowy cdna można uzyskać, wprowadzając cdna do użytecznego wektora ekspresyjnego i eksprymując następnie polipeptyd przez wprowadzenie wektora ekspresyjnego do użytecznej komórki gospodarza. D. Peptydy oparte na technice wykresów hydrofobowości Antygen o podwójnej specyficzności można wybrać wybrany w oparciu o technikę wykresów hydrofobowości i wyboru peptydów z założenia wysoce antygenowych. Na przykład indeks antygenowości peptydów można wyliczyć posługując się programem przygotowanym przez Jamesona i Wolfa (CABIOS 4(1): , 1988). Regiony użyteczne do wiązania przeciwciał można wybrać maksymalizując tym samym prawdopodobieństwo antygenowości. E. Immunizacja z wykorzystaniem komórek transfekowanych antygenem Przeciwciało o podwójnej specyficzności może być otrzymywane przez immunizację komórkami transfekowanymi antygenem, (to jest antygeny o podwójnej specyficzności według wynalazku mogą być komórkami transfekowanymi antygenem). Można utworzyć linię komórkową która stabilnie eksprymuje dwa różne lecz strukturalnie pokrewne antygeny, lub cząsteczkę hybrydową. Można otrzymać na przykład linie komórkowe które stabilnie eksprymują IL-1α lub IL-1β lub cząsteczkę hybrydową IL-1α/lL-1β (np. Sek Id Nr 4). Pożądane cząsteczki mogą być wydzielane z wspomnianych komórek (w przypadku białek rozpuszczalnych) lub mogą być wyrażane na powierzchni komórek (w przypadku receptorów czy enzymów). Dostarczenie genu do komórki gospodarza w celu umożliwienia ekspresji antygenu przez komórkę gospodarza można osiągnąć na wiele sposobów, włączając w to w sposób nieograniczający transfekcję, elektroporację, fuzję komórkową, lipofekcję, technikę bombardowania cząsteczkowego, mikroiniekcję lub infekcję wirusową). Linie komórkowe stabilnie eksprymującą antygen można przeszczepić na różne sposoby (dootrzewnowo, podskórnie, domięśniowo, lub podobnie) do organizmu pożądanego zwierzęcia w celu wytworzenia przeciwciał. Komórki mogą stanowić źródło wolno uwalnianego antygenu. Korzystnie komórki eksprymują białko o pełnej długości. Można jednak także eksprymować antygenowe fragmenty. W przypadku białek rozpuszczalnych, białka korzystnie są wydzielane z komórek. W celu wytworzenia przeciwciał o podwójnej specyficzności wobec pozakomórkowych domen dwu blisko pokrewnych receptorów, receptory powinny preferencyjnie ulegać ekspresji na powierzchni komórki.

9 PL B1 9 F. Immunizacja jedną ze strukturalnie pokrewnych cząsteczek Antygen o podwójnej specyficzności może być po prostu jedną z dwu różnych, lecz strukturalnie pokrewnych cząsteczek, dla którego wytwarzane są przeciwciała o podwójnej specyficzności. Jedna z dwu pokrewnych cząsteczek stosowana jest jako czynnik immunizacyjny i następnie wytworzony repertuar przeciwciał przeszukiwany jest pod kątem przeciwciał wiążących, i bardziej korzystnie neutralizujących, oba z dwu różnych, lecz pokrewnych strukturalnie cząsteczek. Na przykład można immunizować albo IL-1α albo IL-1β i następnie poszukiwać przeciwciał wiążących α/β, i bardziej korzystnie, przeciwciał neutralizujących α/β. Termin immunizacja oznacza tu wystawienie repertuaru przeciwciał na antygen, taki jak IL-1α albo IL-1β, in vivo albo in vitro. Zatem postać ta obejmuje immunizowanie zwierzęcia albo IL-1α albo IL-1β i przeszukiwanie powstających przeciwciał w celu wyselekcjonowania przeciwciał wiążących zarówno IL-1α jak i IL-1β, jak również przeszukiwanie rekombinowanej biblioteki przeciwciał in vitro z pomocą IL-1α albo IL-1β i następnie selekcjonowanie rekombinowanych przeciwciał wiążących zarówno IL-1α jak i IL-1β. II. Sposoby tworzenia przeciwciał o podwójnej specyficzności W celu wytworzenia przeciwciała o podwójnej specyficzności według wynalazku repertuar przeciwciał (in vivo lub in vitro) eksponowany jest na antygen o podwójnej specyficzności, otrzymany jak podano powyżej, i użyteczne przeciwciało o podwójnej specyficzności wybierane jest z wspomnianego repertuaru. Rozpoznawanie antygenu składa się z dwu elementów: rozpoznawania strukturalnego i dojrzewania powinowactwa w oparciu o specyficzne oddziaływania cząsteczkowe. W czasie naturalnej odpowiedzi immunologicznej, przeciwciała o niskim powinowactwie rozpoznające motywy strukturalne (np. rozpoznawanie antygenu przez receptory rozpoznające określone wzory strukturalne) powstają łatwo i na wczesnych etapach odpowiedzi immunologicznej, a następnie w wyniku mutacji somatycznych następuje zwiększenie powinowactwa niektórych klonów. Zaprojektowano różnorodne procesy in vivo i in vitro naśladujące to naturalne zjawisko. Przeciwciała o podwójnej specyficzności i niskim powinowactwie można tworzyć zarówno in vivo, jak i in vitro sposobami opisanymi powyżej, a przeciwciała monoklonalne o podwójnej specyficzności i wysokim powinowactwie można otrzymać drogą opisanej tu mutagenezy somatycznej. Ponadto w celu optymalizowania monoklonalnych przeciwciał o podwójnej, wysokiej specyficzności/podwójnej specyficzności i wysokim powinowactwie, można analizować struktury wykrystalizowanych wspólnie przeciwciał monoklonalnych z użytecznymi antygenami. Uzyskana w ten sposób informacja strukturalna może zostać następnie wykorzystana do wzmocnienia powinowactwa w wyniku zmiany (zmutowania) reszt przeciwciał monoklonalnych oddziałujących specyficznie z antygenem w celu wzmocnienia specyficznych oddziaływań cząsteczek, w sposób opisany. Sposoby wytworzenia przeciwciał o podwójnej specyficzności z zastosowaniem sposobów in vivo, in vitro, lub połączenia obu sposobów, opisane są poniżej. A. Sposoby in vivo Standardowe sposoby in vivo otrzymywania przeciwciał obejmują immunizowanie użytecznego zwierzęcia antygenem i tym samym eksponowanie repertuaru przeciwciał in vivo na antygen, a następnie odzyskiwanie konkretnego przeciwciała lub przeciwciał z organizmu zwierzęcia. Sposób taki można zaadoptować do otrzymywania przeciwciał o podwójnej specyficzności, przez zastosowanie antygenu o podwójnej specyficzności a następnie selekcjonowanie przeciwciał pod kątem specyficznego rozpoznawania przez nie strukturalnie pokrewnych cząsteczek. Przeciwciała o podwójnej specyficzności można uzyskać immunizując użyteczne zwierzę (np. mysz, królika lub kozę lub innego ssaka, włączając w to ssaki transgeniczne lub nokautowane) immunogenną kompozycją antygenu o podwójnej specyficzności. Użyteczna immunogenna kompozycja może obejmować, na przykład, zsyntezowany chemicznie lub rekombinacyjnie eksprymowany antygen o podwójnej specyficzności. Kompozycja może ponadto obejmować adiuwant, taki jak kompletny lub niekompletny adiuwant Freunda, lub podobny składnik immunostymulujący. Ponadto, do wytworzenia przeciwciał, w szczególności techniką immunizacji in vivo stosuje się antygen o podwójnej specyficzności według wynalazku, osobno lub bardziej korzystnie jako koniugat z białkiem nośnikowym. Tego typu sposób stosowany do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej jest dobrze znany specjalistom. Przykłady użytecznych białek nośnikowych z którymi można połączyć antygen o podwójnej specyficzności obejmują hemocyjaninę KLH i albuminę. Komórki wytwarzające przeciwciało można uzyskać ze zwierzęcia i stosować następnie do otrzymania przeciwciał monoklonalnych standardowymi technikami, takimi jak technika hybrydom opisana pierwotnie przez Kohlera i Milsteina (1975, Nature, 256: ) (por. także Brown i wsp

10 10 PL B1 (1981) J Immunol 127: ; Brown i wsp (1980) J Biol Chem 255: ; Yeh i wsp (1976) PNAS 76: ; Yeh i wsp (1982) Int J Cancer 29: ). Technologia wytwarzania przeciwciał monoklonalnych z wykorzystaniem hybrydom jest dobrze znana (patrz: RH Kenneth, Monoclonal antibodies: A new dimension in biological analyses, Plenum Publ Corp, NY (1980); EA Lerner (1981) Yale J Biol Med 54: ; ML Grefter (1977) Somatic Cell Genet 3: ). W skrócie: unieśmiertelniona linia komórkowa (zazwyczaj komórek szpiczaka) poddawana jest fuzji z limfocytami (grasicowymi lub z węzłów chłonnych lub obwodowymi) ze zwierzęcia immunizowanego antygenem o podwójnej specyficzności, jak opisano to powyżej, a następnie supernatant z hodowli komórkowej wytworzonych hybrydom przeszukiwany jest pod kątem występowania przeciwciał o podwójnej specyficzności, do dwu różnych ale strukturalnie pokrewnych cząsteczek, w celu wykrycia produkujących je hybrydom. W celu połączenia limfocytów i unieśmiertelnionej linii komórkowej można zastosować dowolny protokół eksperymentalny, prowadzący do wytworzenia hybrydom produkujących przeciwciała monoklonalne o podwójnej specyficzności, (patrz np. G Galfre i wsp (1977) Nature 266: ; Gefter i wsp. Somatic Cell Genet, op. cit.; Lerner Yale J Biol Med op. cit.; Kenneth, Monoclonal Antibodies, op. cit.). Ponadto specjaliście znane są użyteczne odmiany opisanych wyżej sposobów. Zazwyczaj unieśmiertelniona linia komórkowa (np. linia komórek szpiczaka) pochodzi z tego samego rodzaju zwierzęcia, z którego pochodzą limfocyty. Na przykład mysie hybrydomy można wytworzyć poprzez fuzję limfocytów z myszy immunizowanych kompozycją według wynalazku, z unieśmiertelnioną linią komórek mysich. Korzystna unieśmiertelniona linia komórek mysich to mysie komórki szpiczaka, wrażliwe na obecność w podłożu hodowlanym hipoksantyny, aminopteryny i tymidyny (podłoże HAT). Można zastosować dowolną linię komórek szpiczaka w procesie fuzji z wykorzystaniem standardowych sposobów (np. z wykorzystaniem linii P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 lub Sp2/O-Ag14). Wspomniane linie komórek szpiczaka można uzyskać z American Type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD. Zazwyczaj mysie komórki szpiczaka wrażliwe na podłoże HAT poddawane są fuzji z mysimi komórkami grasicowymi z wykorzystaniem glikolu polietylenowego (PEG). Powstające hybrydomy selekcjonowane są na podłożu HAT, w którym giną komórki które nie uległy połączeniu lub uległy niewłaściwemu połączeniu komórki szpiczaka (komórki grasicowe giną po kilku dniach, ponieważ nie uległy transformacji). Komórki hybrydom wytwarzające przeciwciała monoklonalne specyficznie rozpoznające dwie strukturalnie pokrewne pożądane cząsteczki według wynalazku można zidentyfikować przeszukując supernatant z hodowli komórek hybrydom pod kątem wytwarzania takich przeciwciał stosując np. standardowy test ELISA, w celu wyselekcjonowania przeciwciał specyficznie wiążących dwie pokrewne cząsteczki. W zależności od rodzaju pożądanego przeciwciała do immunizacji in vivo można stosować różne organizmy zwierzęce. Można stosować organizm zwierzęcy, który sam z siebie wytwarza endogenną wersję pożądanego(-ych) antygenu(-ów) lub alternatywnie, gospodarz może być pozbawiony zdolności wytwarzania endogennej wersji pożądanego(-ych) antygenu(-ów). Na przykład wykazano, że myszy nie wytwarzające niektórych endogennych białek (myszy nokautowane, np. w wyniku rekombinacji homologicznej wygaszającej aktywność genu endogennego) rozwijają odporność humoralną na wspomniane, po immunizacji wspomnianym białkiem i mogą być zatem wykorzystane do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych o wysokim powinowactwie skierowanych przeciw wspomnianemu białku (por. np. Roes J i wsp (1995) J Immunol Methods 183, ; Lunn MP i wsp (2000) J Neurochem 75, ). Dla wytwarzania przeciwciał innych niż ludzkie (np. skierowanych przeciw ludzkiemu antygenowi o podwójnej specyficzności), można stosować wiele różnych organizmów ssaków innych niż ludzie, jako użytecznych gospodarzy do wytwarzania przeciwciała, włączając w to w sposób nieograniczający myszy, szczury, króliki i kozy (lub wersje nokautowe wspomnianych organizmów), jakkolwiek myszy są organizmami preferowanymi w przypadku wytwarzania hybrydom. Ponadto dla wytwarzania całkowicie ludzkich przeciwciał skierowanych przeciw ludzkiemu antygenowi o podwójnej specyficzności można wykorzystać większość zwierząt, które eksprymują ludzki repertuar przeciwciał, włączając w to zwierzęta transgeniczne (np. myszy) transgenizowane ludzką immunoglobuliną, myszy chimerowe hu- PBMC-SCID oraz ludzko-mysie chimery radiacyjne, co zostanie przedyskutowane poniżej. Zatem w jednej postaci zwierzę immunizowane antygenem o podwójnej specyficzności, jest korzystnie myszą, transgeniczną pod względem genu kodującego ludzką immunoglobulinę, taką iż wytwarza ludzkie przeciwciała po stymulacji antygenem. Do takiego zwierzęcia, najczęściej, wprowadzone są ludzkie geny kodujące lekki i ciężki łańcuch immunoglobulin w konfiguracji płodowej, przy czym endogenne loci tego zwierzęcia kodujące lekki i ciężki łańcuch immunoglobuliny są nieaktywne. Po

11 PL B1 11 stymulacji antygenem (np. ludzkim antygenem) wytwarzane są przeciwciała pochodzące ze wspomnianych ludzkich sekwencji immunoglobuliny (tzn. ludzkie przeciwciała), i z limfocytów takiego zwierzęcia uzyskać można ludzkie przeciwciała monoklonalne standardowymi technikami otrzymywania hybrydom. Dalszy opis myszy transgenicznej z ludzkim transgenem immunoglobulinowym oraz zastosowanie wspomnianego zwierzęcia do wytwarzania ludzkich przeciwciał można znaleźć np. Patent US Nr 5,939,598, Publikacja PCT Nr WO 96/33735, Publikacja PCT Nr WO 96/34096, Publikacja PCT Nr WO 98/24893, Publikacja PCT Nr WO 99/53049 Abgenix Inc; Patent US Nr 5,545,806, Nr 5,569,825, Nr 5,625,126, Nr 5,633,425, Nr 5,661,016, Nr 5,770,429, Nr 5,814,318, Nr 5,877,397 i Publikacja PCT Nr WO 99/45962 Genopharm Inc, oraz MacQuitty JJ, Kay RM (1992) Science 257: 1188; Taylor LD i wsp (1992) NAR 20: ; Lonberg N i wsp (1994) Nature 368: ; Lonberg N i Huszar D (1995) Int Rev Immunol 13: 65-93; Harding FA i Lonberg N (1995) Ann NY Acad Sci 764: ; Fishwild DM i wsp (1996) Nature Biotechnol 14: ; Mendez MJ i wsp (1997) Nature Genet 15: ; Green LL I Jakobovits A (1998) J Exp Med 188: ; Green LL (1999) J Immunol Methods 231: 11-23; Yang XD i wsp (1999) J Leukoc Biol 66: ; Galio ML i wsp (2000) Eur J Immunol 30: , Zwierzę immunizowane antygenem o podwójnej specyficzności może być myszą z SCID, rekonstytuowaną z użyciem ludzkich obwodowych komórek jednojądrowych lub komórek limfoidalnych lub ich prekursorów. Wspomniana mysz chimerowa, określana jest skrótem hu-pbmc-scid, wytwarza ludzkie immunoglobuliny w odpowiedzi na stymulację antygenem. Dla dalszego opisu wspomnianej myszy i wytwarzania przeciwciała por. np.: Leader KA i wsp (1992) Immunology 76: ; Bombil F i wsp (1996) Immunobiol 195: ; Murphy WJ i wsp (1996) Semin Immunol 8: ; Herz U i wsp (1997) Int Arch Allergy Immunol 113: ; Albert SE i wsp. (1997) J Immunol 159: ; Nguyen H i wsp (1997) Microbiol Immunol 41: ; Arai K i wsp (1998) J Immunol Methods 217: 79-85; Yoshinari K i Arai K (1998) Hybridoma 17: 41-45; Hutchins WA i wsp (1999) Hybridoma 18: ; Murphy WJ i wsp (1999) Clin Immunol 90: 22-27; Smithson SL i wsp (1999) Mol Immunol 36: ; Charmat S i wsp (1999) J Infect Diseases 180: ; Heard C i wsp (1999) Molec Med 5: Zwierzę immunizowane przy pomocy antygenu o podwójnej specyficzności może być myszą traktowaną letalną dawką promieniowania, a następnie poddaną przeszczepowi komórek szpiku kostnego myszy z SCID, a następnie przeszczepieniu funkcjonalnych ludzkich limfocytów. Ten typ zwierzęcia chimerowego, określany mianem systemu Trimera, stosuje się do wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych przez immunizację wspomnianej myszy pożądanym antygenem a następnie otrzymanie przeciwciał monoklonalnych z zastosowaniem standardowych technik hybrydomy. Dalsze szczegóły można znaleźć np. w: Eren R i wsp (1998) Immunol 93: ; Reisner Y i Dagan S (1998) Trends Biotechnol 16: ; Ilan E i wsp (1999) Hepatology 29: ; Bocher WO i wsp (1999) Immunology 96: B. Sposoby in vitro Alternatywą do wytwarzania przeciwciał o podwójnej specyficzności w wyniku immunizacji in vivo oraz selekcji, jest przeszukiwanie rekombinowanych bibliotek kombinatoryjnych immunoglobuliny (np. bibliotek fagowych przeciwciał) z wykorzystaniem antygenu o podwójnej specyficzności, w celu wyizolowania składników biblioteki specyficznie wiążących dwie różne, lecz strukturalnie pokrewne pożądane cząsteczki. Zestawy odczynnikowe do tworzenia i przeszukiwania bibliotek fagowych dostępne są handlowo (np. Recombinant Phage Antibody System, Pharmacia Nr Kat ; SurfZAP(tm) Phage Display Kit, Stratagene Nr Kat ). W różnych postaciach biblioteka fagowa jest biblioteką scfv lub Fab. Technika fagowa do przeszukiwania bibliotek rekombinowanych przeciwciał opisana jest wyczerpująco w literaturze przedmiotu. Przykłady metod i związków szczególnie użytecznych do tworzenia i przeszukiwania bibliotek przeciwciał można znaleźć np. : McCafferty i wsp Publikacja Międzynarodowa Nr WO 92/01047, Patent US Nr 5,969,108 i EP 589,877 (w szczególności dla bibliotek scfv), Landner i wsp Patent US Nr 5,223,409, Nr 5,403,484, Nr 5,571,698, Nr 5,837,500 i EP 436,597 (przykładowo dla fuzji FpIII); Dower i wsp Publikacja Międzynarodowa Nr WO 91/17271, Patent US Nr 5,427,908, Patent US Nr 5,580,717 i EP 527,839 (w szczególności dla Fab); Winter i wsp Publikacja Międzynarodowa WO 92/20791 i EP 368,684 (w szczególności przedstawienie klonowania regionu zmiennego immunoglobuliny); Griffith i wsp Patent US Nr 5,885,793 i EP 589,877 (opisujące w szczególności izolowanie ludzkich przeciwciał przeciw ludzkim antygenom z wykorzystaniem rekombinowanych bibliotek); Garrard i wsp Publikacja Międzynarodowa Nr WO 92/09690 (opisująca w szczególności techniki ekspresji w fagach); Knappik i wsp Publikacja Międzynarodowa Nr WO

12 12 PL B1 97/08320 (opisująca bibliotekę ludzkich rekombinowanych przeciwciał HuCal); Salfeld i wsp Publikacja Międzynarodowa Nr WO 97/29131 (otrzymanie rekombinowanego ludzkiego przeciwciała skierowanego przeciw ludzkiemu antygenowi (ludzkiemu TNFα), jak również dojrzewanie in vitro powinowactwa rekombinowanego przeciwciała) i Salfeld i wsp US Zgłoszenie Tymczasowe Nr 60/126,603 (opisujące również wytworzenie ludzkiego rekombinowanego przeciwciała skierowanego przeciw ludzkiemu antygenowi (ludzkiej IL-12), jak również dojrzewanie in vitro powinowactwa rekombinowanego przeciwciała). Inne opisy przeszukiwania biblioteki rekombinowanych przeciwciał można znaleźć w publikacjach naukowych, takich jak: Fuch i wsp (1991) Bio/Technology 9: ; Hay i wsp (1992) Hum Antibod Hybridomas 3: 81-85; Huse i wsp (1992) Science 246: ; Griffith i wsp (1993) EMBO J 12: ; Hawkins i wsp (1992) J Mol Biol 226: ; Clarkson i wsp (1991) Nature 352: ; Gram i wsp (1992) PNAS 89: ; Garrad i wsp (1991) Bio/Technology 9: ; Hoogenboom i wsp (1991) NAR 19: ; Barbas i wsp (1991) PNAS 88: ; McCafferty i wsp (1990) Nature 348: ; Knappik i wsp (2000) J Mol Biol 296, Alternatywą w stosunku do systemu bakteriofagowego jest eksprymowanie biblioteki rekombinowanych przeciwciał na powierzchni komórki drożdżowej lub bakteryjnej. Sposoby uzyskania i przeszukiwania bibliotek przeciwciał eksprymowanych na powierzchni komórki drożdżowej opisane są w Publikacji PCT WO 99/ Sposoby uzyskania i przeszukiwania bibliotek przeciwciał eksprymowanych na powierzchni komórki bakteryjnej opisane są w Publikacji PCT WO 98/ Gdy pożądane przeciwciało zostanie zidentyfikowane w obrębie biblioteki kombinatoryjnej, DNA kodujące lekkie i ciężkie łańcuchy przeciwciała izolowane są standardowymi technikami biologii molekularnej, takimi jak amplifikacja techniką PCR z wybranego miejsca biblioteki (np. z faga). Sekwencje nukleotydowe genów lekkiego i ciężkiego łańcucha do których utworzyć można startery PCR są znane specjalistom. Na przykład wiele takich sekwencji zostało ujawnionych w: Kabat EA i wsp (1991) Sequences of proteins of immunological interest, Vth Ed US Dept of Health & Human Services, NIH Publ Nr oraz b bazie danych Vbase ludzkich sekwencji płodowych. Przeciwciało, lub część przeciwciała, według wynalazku może zostać otrzymana poprzez ekspresję rekombinowanych genów kodujących łańcuch lekki i ciężki immunoglobuliny w komórce gospodarza. W celu rekombinacyjnego eksprymowania przeciwciała, komórka gospodarza transfekowana jest jednym lub większą liczbą rekombinowanych wektorów ekspresyjnych niosących fragmenty DNA kodujące łańcuchy lekki i ciężki przeciwciała, takiego iż łańcuchy lekki i ciężki eksprymowane są w komórce gospodarza, korzystnie, wydzielane są do podłoża hodowlanego w którym wzrasta komórka gospodarza, z którego to podłoża można odzyskać wspomniane przeciwciało. Do otrzymania genów kodujących lekki i ciężki łańcuch przeciwciał, włączenia tych genów do wektora ekspresyjnego i wprowadzenia wspomnianych wektorów do komórki gospodarza można stosować standardowe techniki rekombinowania DNA, takiej jak podane w: Sambrook, Fritsch i Maniatis (wyd) Molecular cloning: a laboratory manual. 2 wyd CSH, NY (1989), Ausubel FM (wyd) Current protocols in molecular biology, Greene Publ Ass (1989) oraz Patent US Nr 4,816,397 (Bross i wsp). Gdy fragmenty DNA kodujące segmenty VH i VL pożądanego przeciwciała zostaną otrzymane, wspomnianymi fragmentami DNA można dalej manipulować stosując standardowe techniki rekombinowania DNA, na przykład przekształcając region zmienny genów w pełnej długości geny kodujące łańcuch przeciwciała, we fragment Fab czy gen scfv. Przy tych manipulacjach fragmenty DNA kodujące VL i VH są przyłączane w sposób umożliwiający działanie do innych fragmentów DNA kodujących inne białko, takiej jak stały region przeciwciała lub linker. Termin przyłączane w sposób umożliwiający działanie tu stosowany wskazuje iż dwa fragmenty DNA łączone są w taki sposób, iż sekwencje aminokwasowe kodowane przez wspomniane dwa fragmenty DNA tworzą ramkę odczytu. Wyizolowany DNA kodujący region VH może zostać przekształcony w gen kodujący pełnej długości łańcuch ciężki przez połączenie w sposób umożliwiający działanie DNA kodującego region VH, z inną cząsteczką DNA kodującą regiony stałe łańcucha ciężkiego (CH1, CH2 i CH3). Sekwencje genów kodujących ludzkie regiony stałe łańcucha ciężkiego są znane specjalistom (patrz np. Kabat EA (1991) Sequences of proteins of immunological interest, Vth Ed US Dept of Health & Human Services, NIH Publ Nr ) i fragmenty DNA obejmujące wspomniane regiony można otrzymać stosując standardową technikę PCR. Region stały łańcucha ciężkiego może pochodzić z regionu stałego IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM lub IgD, lecz korzystanie ze stałego regionu IgG1 lub IgG4. W przypadku fragmentu genu Fab łańcucha ciężkiego, DNA kodujący VH może zostać przyłączony w sposób umożliwiający działanie do innej cząsteczki DNA kodującej region stały CH1 łańcucha ciężkiego.