(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2016/21 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 16/28 ( ) A61K 39/395 ( ) A61P 35/02 ( ) A61P 37/00 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Przeciwciało cytotoksyczne skierowane przeciwko proliferacjom krwiotwórczych komórek limfatycznych typu B (30) Pierwszeństwo: FR (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2007/35 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2016/12 (73) Uprawniony z patentu: Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies, Les Ulis, FR (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 CHRISTOPHE DE ROMEUF, Lambersart, FR CHRISTINE GAUCHER, Sequedin, FR JEAN-LUC TEILLAUD, Paris, FR JEAN-FRANÇOIS PROST, Versailles, FR (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Pietrosiuk JWP RZECZNICY PATENTOWI DOROTA RZĄŻEWSKA SP. J. ul. Żelazna 28/30 Sienna Center Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 26930/16/ZWA/MP EP Opis Przeciwciało cytotoksyczne skierowane przeciwko proliferacjom krwiotwórczych komórek limfatycznych typu B [0001] Wynalazek dotyczy przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko antygenowi CD20, charakteryzującego się tym, że każdy z jego łańcuchów lekkich jest kodowany przez mysio-ludzką chimeryczną sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 27 i tym, że każdy z jego ciężkich łańcuchów jest kodowany przez chimeryczną mysio-ludzką sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 19, jak i zastosowania tego przeciwciała do aktywowania receptorów FcγRIII odpornościowych komórek efektorowych i do wytwarzania leku, zwłaszcza przeznaczonego do leczenia białaczki lub chłoniaka. Wprowadzenie i stan techniki [0002] Antygen CD20 jest hydrofobowym białkiem transbłonowym o masie cząsteczkowej kd obecnym na powierzchni dojrzałych limfocytów B (Valentine i in., 1987 Proc Natl Acad Sci USA. 84 (22): ; Valentine i in., 1989 J.Biol. Chem. 264 (19): ). Ulega on ekspresji w czasie rozwoju limfocytów B od wczesnego stadium pre-b aż do różnicowania do plazmocytu/stadium, w którym ta ekspresja znika. Antygen CD20 jest obecny zarówno na normalnych limfocytach B, jak i złośliwych komórkach B. Zwłaszcza, antygenem CD20 ulega ekspresji w większości chłoniaków fenotypu B (80% chłoniaków): ulega ekspresji na przykład w co najmniej 90% przypadków chłoniaków nieziarniczych (NHL) limfocytów B, i ponad 95% przewlekłych białaczek limfatycznych typu B (B-CLL). Antygen CD20 nie podlega ekspresji na macierzystych komórkach krwiotwórczych ani na plazmocytach. [0003] Funkcja CD20 nie jest jeszcze w pełni zrozumiała, ale może on pełnić rolę kanału wapniowego i interweniować w regulacji wczesnych etapów różnicowania (Golay i in., 1985 J Immunol.;135(6): ) i proliferacji (Tedder i in.,1986 Eur J Immunol Aug;16(8):881-7) limfocytów B. [0004] Chociaż więc nie ma pewności co do jego roli w aktywacji i proliferacji limfocytów B, antygen CD20 ze względu na swoją lokalizację, stanowi ważny cel leczenia patologii związanych z nowotworowymi limfocytami B, takimi jak NHL i B-CLL (fr.: LLC-B) przez przeciwciała swoiście rozpoznające CD20. Ponadto, antygen ten jest idealnym celem, ponieważ jest to białko błonowe, którego modulacja ekspresji lub polimorfizm nie są znane. [0005] Jedyne monoklonalne przeciwciała anty-cd20 nieznakowane radioaktywnie, Rituxan (Genentech), są obecnie dostępne na rynku do leczenia chłoniaków z limfocytów B. Wykazują u pacjentów z NHL zachęcające wyniki kliniczne, w połączeniu z chemioterapią. Jednak, jego skuteczność jest zmienna i często niewielka w przypadku stosowania w monoterapii (Teeling i in., 2004 Blood 104 (6): ). Ponadto Rituxan ma tylko niewielki wpływ na limfocyty B z B-CLL. Ta niska skuteczność jest związana z różnymi zjawiskami: z jednej strony, limfocyty B z B-CLL nie eksprymują

3 - 2 - CD20 w stosunkowo małych ilościach, z drugiej strony, Rituxan wywołuje tylko bardzo niską aktywność ADCC (Zależnej Od Przeciwciał Cytotoksyczności Komórkowej) w odniesieniu do komórek in vitro. Te dwie obserwacje mogą wyjaśnić stwierdzoną korelację między poziomem ekspresji CD20 na nowotwór (w ilościowej cytometrii przepływowej) i odpowiedzią na leczenie. Opisano klon YB2/0 o nazwie KM3065, wytwarzający wariant Rituxan mający te same sekwencje aminokwasów, ale zoptymalizowaną glikozylację. Ze względu na zoptymalizowaną glikozylację, przeciwciało wytwarzane przez klon ma silniejszą zdolność do indukcji odpowiedzi ADCC przez komórki efektorowe układu odpornościowego (Shinkawa i in., J Biol Chem Jan 31;278(5): ). [0006] B-CLL jest najczęstszą postacią białaczki w krajach zachodnich, wymagającą ingerujących i niekiedy niewystarczających zabiegów chemioterapeutycznych powodujących działania niepożądane, które prowadzą do aplazji komórek krwiotwórczych i niedoboru immunologicznego, zatem przeciwciała monoklonalne jawią się jako rozwiązanie innowacyjne. Dlatego zasadnicze znaczenie ma opracowanie przeciwciał zdolnych do swoistego celowania w antygen CD20 i do niszczenia komórek nowotworowych słabo eksprymujących ten antygen, jak B-CLL. [0007] Przeciwciała 2F2 i 7D8 proponowane przez Genmab (Teeling i in., 2004 Blood 104 (6) ) do leczenia B-CLL mają zdolność większej aktywacji dopełniacza niż powodowana przez Rituxan. Jednak te przeciwciała wykazują niską aktywność ADCC, podobną do Rituxan. Jednak, niektórzy klinicyści wskazują na to, że aktywność dopełniacza jest przyczyną szkodliwych skutków ubocznych, ponieważ przeciwciała następnie uruchamiają system aktywacyjny prowadzący do produkcji cząsteczek (zwłaszcza anafilatoksyn) o szerokim spektrum nieswoistych działań (reakcji zapalnych, alergicznych, naczyniowych, itp.). Ponadto, przeciwciała te są nadal w fazie badań, a ich skuteczność kliniczna nie została jeszcze oceniona. [0008] Zgłaszający w zgłoszeniu patentowym FR03/02713 (WO 2004/029092) ujawnia przeciwciała anty-cd20, które mogą być wytworzone w linii YB2/0, wybranej pod kątem zdolności do indukowania silnej odpowiedzi ADCC i wysokiego tempa produkcji IL-2 przez komórki Jurkat-CD16 w porównaniu do Rituxan. Istotnie, istnieje znaczące zapotrzebowanie na nowe przeciwciała anty-cd20 pozwalające na rozszerzenie zakresu leczenia chorób limfocytowych B za pomocą obecnie proponowanej immunoterapii, zwłaszcza w przypadku patologii limfocytów B, w których antygen CD20 jest słabo eksprymowany w populacjach implikowanych limfocytów B i dla których nie istnieje zadowalająca immunoterapia. [0009] W tym celu, Zgłaszający opracował nowe przeciwciało anty-cd20, mające szczególnie wysoką aktywność ADCC w porównaniu do Rituxan. Opis [0010] Pierwszy przedmiot wynalazku dotyczy więc przeciwciała monoklonalnego, skierowanego przeciwko antygenowi CD20, charakteryzującego się tym, że każdy z jego łańcuchów lekkich jest kodowany przez mysio-ludzką chimeryczną sekwencję kwasu

4 - 3 - nukleinowego SEQ ID NO: 27 i tym, że każdy z jego łańcuchów ciężkich jest kodowany przez mysio-ludzką chimeryczną sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 19. Przeciwciała składają się z ciężkich łańcuchów i lekkich łańcuchów połączonych ze sobą mostkami dwusiarczkowymi. Każdy z łańcuchów składa się, w pozycji N-końca z regionu (lub domeny) zmiennego (kodowanego przez przegrupowane geny VJ dla lekkich łańcuchów i V-D-J dla ciężkich łańcuchów) swoistego dla antygenu, przeciwko któremu skierowane jest przeciwciało, i w pozycji C-końca z regionu stałego składającego się z jednej domeny CL dla łańcuchów lekkich lub więcej domen dla łańcuchów ciężkich. [0011] Dla celów wynalazku, wyrażenia przeciwciało monoklonalne lub kompozycja przeciwciał monoklonalnych odnoszą się do preparatu cząsteczek przeciwciał mających identyczną i unikalną specyficzność. [0012] Przeciwciało według wynalazku, którego regiony zmienne łańcuchów lekkich i ciężkich należą do różnych gatunków regionów stałych łańcuchów lekkich i łańcuchów ciężkich, określa się jako przeciwciało chimeryczne. [0013] Ten opis ujawnia ponadto przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw antygenowi CD20, którego region zmienny każdego łańcucha lekkiego jest kodowany przez sekwencję mającą co najmniej 70% identyczności z mysią sekwencją kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 5, region zmienny każdego łańcucha ciężkiego kodowany przez sekwencję mającą co najmniej 70% identyczności z mysią sekwencją kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 7, i którego stałe regiony łańcuchów lekkich i łańcuchów ciężkich są regionami stałymi pochodzącymi z nie-mysich gatunków. [0014] Mysie sekwencje kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 7 kodujące odpowiednio domenę zmienną każdego z lekkich łańcuchów i domenę zmienną każdego z ciężkich łańcuchów przeciwciała wytwarzanego przez mysie hybrydomy, CAT 13.6E12, są dostępne w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) pod numerem ACC 474. Ta hybrydoma wytwarza mysie przeciwciało monoklonalne typu IgG2a,κ, skierowane przeciwko CD20. [0015] Te mysie sekwencje zostały wybrane do wyprowadzania sekwencji regionów zmiennych przeciwciał tutaj opisanych, ze względu na specyficzność przeciwciała mysiego CAT-13.6E12 do antygenu CD20, antygenu rozpoznawanego również przez Rituxan. Regiony zmienne przeciwciał tutaj opisanych zawierają co najmniej 70% identyczności z sekwencjami SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 7, przy czym ta identyczność sekwencji nadaje specyficzność przeciwciałom tu opisanym z mysim przeciwciałem CAT 13.6E12. Korzystnie, ta identyczność sekwencji nadaje również identyczność powinowactwa do celu pomiędzy opisanym tu przeciwciałem i przeciwciałem mysim CAT-13.6E12. [0016] Ponadto Zgłaszający nieoczekiwanie wykazał, że mysie przeciwciało CAT 13.6E12 ma zdolność indukowania wydzielania IL-2 w obecności komórek Jurkat-CD16 eksprymujących ektodomeny receptora FcγRIIIA (jak pokazano na fig. 11), co wskazuje na silne wiązanie mysiego przeciwciała z ludzkim CD16 (FcγRIIIA), co dodatkowo utwierdziło Zgłaszającego w jego wyborze.

5 - 4 - [0017] Opisane tu przeciwciała również mają regiony stałe lekkich i ciężkich łańcuchów należących do gatunków innych niż mysi. Z tego względu mogą być wykorzystane wszystkie rodziny i gatunki ssaków nie-mysich, zwłaszcza ludzie, małpy, myszowate (z wyjątkiem myszy), świnie, bydło, konie, koty, psy, na przykład, jak również ptaki. Przeciwciało według wynalazku i przeciwciała tutaj opisane mogą być wytworzone przy użyciu standardowych technik rekombinacji DNA dobrze znanych specjalistom w tej dziedzinie, zwłaszcza przez stosowanie technik konstrukcyjnych przeciwciał chimerycznych opisanych na przykład w Morrison i in., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, str (1984), gdzie technologia rekombinacji DNA jest stosowana do zastąpienia regionu stałego łańcucha ciężkiego i/lub regionu stałego łańcucha lekkiego przeciwciała pochodzącego od nie-ludzkiego ssaka za pomocą odpowiednich regionów ludzkiej immunoglobuliny. Szczególny przykład wykonania zostanie przedstawiony poniżej. [0018] Korzystnie, region zmienny każdego z łańcuchów lekkich przeciwciał tutaj opisanych jest kodowany przez sekwencję o co najmniej 80% identyczności z mysią sekwencją kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 5, i region zmienny każdego z łańcuchów ciężkich przeciwciał tutaj opisanych jest kodowany przez sekwencję o co najmniej 80% identyczności z mysią sekwencją kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 7. [0019] Korzystnie, region zmienny każdego z łańcuchów lekkich przeciwciał tutaj opisanych jest kodowany przez sekwencję o co najmniej 90% identyczności z mysią sekwencją kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 5, a region zmienny każdego z łańcuchów ciężkich przeciwciał tutaj opisanych jest kodowany przez sekwencję o co najmniej 90% identyczności z mysią sekwencją kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 7. [0020] Korzystnie, region zmienny każdego z łańcuchów lekkich przeciwciał tutaj opisanych jest kodowany przez sekwencję o co najmniej 95% identyczności z mysią sekwencją kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 5, a region zmienny każdego z łańcuchów ciężkich przeciwciał tutaj opisanych jest kodowany przez sekwencję o co najmniej 95% identyczności z mysią sekwencją kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 7. [0021] Korzystnie, region zmienny każdego z łańcuchów lekkich przeciwciał tutaj opisanych jest kodowany przez sekwencję o co najmniej 99% identyczności z mysią sekwencją kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 5, a region zmienny każdego z łańcuchów ciężkich przeciwciał tutaj opisanych jest kodowany przez sekwencję o co najmniej 99% identyczności z mysią sekwencją kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 7. [0022] Korzystnie, powyższy opis obejmuje także dowolne przeciwciało mające regiony zmienne ciężkich i lekkich łańcuchów, mające jedną lub więcej substytucję (e), insercję (e) lub delecję (e) jednego lub większej ilości kwasów nukleinowych, przy czym te zmiany sekwencji odpowiadają procentowi identyczności sekwencji, jak zdefiniowano powyżej, i nie zmieniają swoistości przeciwciała do celu ani jego powinowactwa do celu. [0023] Opisane tu przeciwciała obejmują dowolne przeciwciało mające regiony CDR (Regiony Determinujące Dopasowanie) przeciwciała CAT-13.6E12, w połączeniu z regionami FR (ramy (org.: framework), regiony wysoce konserwatywne regionów

6 - 5 - zmiennych, zwane także szkieletem ). Przeciwciała te mają bardzo porównywalne powinowactwo i specyficzność, korzystnie identyczne, z mysim przeciwciałem CAT 13.6E12. [0024] Korzystnie, region zmienny każdego z łańcuchów lekkich przeciwciał tutaj opisanych jest kodowany przez mysią sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 5 lub mysią sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 25, i region zmienny każdego z łańcuchów ciężkich przeciwciał tutaj opisanych jest kodowany przez mysią sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 7. [0025] Przeciwciało tutaj opisane jest zatem przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko antygenowi CD20, którego region zmienny każdego łańcucha lekkiego jest kodowany przez mysią sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 5, region zmienny każdego łańcucha ciężkiego jest kodowany przez mysią sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 7, i regiony stałe łańcuchów lekkich i łańcuchów ciężkich są regionami stałymi pochodzącymi z nie-mysich gatunków. Inne przeciwciało tutaj opisane jest przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko antygenowi CD20, którego region zmienny każdego łańcucha lekkiego jest kodowany przez mysią sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 25, region zmienny każdego łańcucha ciężkiego jest kodowany przez mysią sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 7, i regiony stałe łańcuchów lekkich i łańcuchów ciężkich są regionami stałymi pochodzącymi z nie-mysich gatunków. [0026] Te dwa przeciwciała różnią się w sekwencjach nukleotydowych jednym nukleotydem: nukleotyd położony w pozycji 318 sekwencji SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 25, który odpowiednio odpowiada cytozynie i adeninie. [0027] Oba te przeciwciała mają podobną specyficzność, korzystnie identyczną w stosunku do docelowego antygenu, CD20, jak również porównywalne powinowactwa, korzystnie identyczne w stosunku CD20. [0028] Korzystnie regiony stałe każdego łańcucha lekkiego i każdego łańcucha ciężkiego przeciwciała tutaj opisanego są ludzkimi regionami stałymi. Pozwala to zmniejszyć immunogenność przeciwciała u człowieka i tym samym poprawić wydajność podczas jego podawania terapeutycznego u ludzi. [0029] Korzystnie, region stały każdego z łańcuchów lekkich przeciwciała tutaj opisanego jest typu κ. Dowolny allotyp jest odpowiedni, na przykład Km(1), Km(1, 2), Km(1, 2, 3) lub Km(3), ale korzystny jest allotyp Km(3). [0030] W sposób komplementarny, region stały dla każdego z łańcuchów lekkich przeciwciała opisanego tutaj jest typu λ. [0031] W szczególnym aspekcie, zwłaszcza, gdy stałe regiony każdego łańcucha lekkiego i każdego łańcucha ciężkiego przeciwciała są regionami ludzkimi, region stały każdego z ciężkich łańcuchów przeciwciała tutaj opisanego jest typu γ. W tym wariancie, stały region każdego ciężkiego łańcucha przeciwciała tutaj opisanego może być typu γ1, typu γ2, typu γ3, te trzy typy regionów stałych prezentują charakterystykę wiązania dopełniacza ludzkiego lub

7 - 6 - nawet typu γ4. Przeciwciała mające region stały każdego z ciężkich łańcuchów typu γ należą do klasy IgG. Immunoglobuliny typu G (IgG) są heterodimerami złożonymi z dwóch łańcuchów ciężkich i dwóch łańcuchów lekkich, połączonych między sobą mostkami dwusiarczkowymi. Każdy z łańcuchów składa się w pozycji N-końca, z regionu lub domeny zmiennej (kodowanej przez przegrupowane geny VJ dla łańcucha lekkiego i V-D-J dla łańcucha ciężkiego) specyficznej dla antygenu, przeciwko któremu skierowane jest przeciwciało, i w pozycji C-końca, z regionu stałego, składającego się z jednej domeny CL dla łańcucha lekkiego lub 3 domen (CH1, CH2 i CH3) dla ciężkiego łańcucha. Połączenie domen zmiennych i domen CH1 i CL ciężkich i lekkich łańcuchów tworzy części Fab, które są połączone z regionem Fc przez bardzo elastyczny region zawiasowy pozwalając każdej Fab na wiązanie do celu antygenowego, podczas gdy obszar Fc, który pośredniczy we właściwościach efektorowych przeciwciał, pozostaje dostępny dla cząsteczek efektorowych, takich jak receptory FcγR i CIq. Region Fc, utworzony przez 2 kuliste domeny CH2 i CH3, jest glikozylowany na poziomie domeny CH2, w obecności w każdym z 2 kanałów, wiązania N-glikanów typu laktozaminowego, związanego z Asn 297. [0032] Korzystnie, stały region każdego ciężkiego łańcucha przeciwciała tutaj opisanego jest typu γ1, ponieważ takie przeciwciała wykazują zdolność do wytwarzania aktywności ADCC u największej liczby osobników (ludzi). W związku z tym, każdy allotyp jest odpowiedni, na przykład G1m(3), G1m (1, 2, 17), G1m(1I, 17) lub G1m(1, 3). Korzystnie, allotyp jest G1m(1, 17). [0033] W szczególnym aspekcie, region stały każdego z ciężkich łańcuchów przeciwciała tutaj opisanego jest typu γ1 i jest kodowany przez ludzką sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 23, region stały każdego z łańcuchów lekkich jest kodowany przez ludzką sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 21. A zatem, takie przeciwciała obejmują mysi region zmienny i ludzki region stały, z ciężkimi łańcuchami typu γ1. To przeciwciało należy do podklasy IgG. [0034] Przeciwciało według wynalazku zawiera dwa łańcuchy lekkie, których domena zmienna jest kodowana przez mysią sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 25 i ludzki region stały, który jest kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 21, i dwa łańcuchy ciężkie, których zmienna domena jest kodowana przez mysią sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 7 i region stały, który jest kodowany przez ludzką sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 23. [0035] Każdy z łańcuchów lekkich przeciwciała według wynalazku jest kodowany przez chimeryczną mysio-ludzką sekwencję kwasu nukleinowego SEK. ID NO: 27, i każdy łańcuch ciężki jest kodowany przez chimeryczną mysio-ludzką sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 19. [0036] Chimeryczną mysio-ludzką sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 27 kodującą każdy z łańcuchów lekkich przeciwciała, uzyskuje się przez fuzję mysiej sekwencji kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 25 kodującej domenę zmienną każdego z łańcuchów lekkich

8 - 7 - przeciwciała i ludzkiej sekwencji kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 21 kodującej region stały każdego z łańcuchów lekkich przeciwciała. [0037] Chimeryczną mysio-ludzką sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 19 kodującą każdy z łańcuchów ciężkich przeciwciała, uzyskuje się przez fuzję mysiej sekwencji kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 7 kodującej domenę zmienną każdego z łańcuchów ciężkich przeciwciała i ludzkiej sekwencji kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 23 kodującej region stały każdego z łańcuchów ciężkich przeciwciała. [0038] Inne przeciwciało tutaj opisane ma dwa łańcuchy lekkie, których zmienna domena jest kodowana przez mysią sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 5 i ludzki region stały, który jest kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 21, i dwa łańcuchy ciężkie, których zmienna domena jest kodowana przez mysią sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 7, i region stały, który jest kodowany przez ludzką sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 23. [0039] Każdy z łańcuchów lekkich przeciwciała jest kodowany przez chimeryczną mysioludzką sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 13, i każdy z łańcuchów ciężkich jest kodowany przez chimeryczną mysio-ludzką sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 19. Chimeryczną mysio-ludzką sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 13 kodującą każdy z łańcuchów lekkich przeciwciała uzyskuje się przez fuzję mysiej sekwencji kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 5 kodującej domenę zmienną każdego z łańcuchów lekkich przeciwciała i ludzkiej sekwencji kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 21 kodującej region stały każdego z łańcuchów lekkich przeciwciała. [0040] Gdy każdy z łańcuchów lekkich przeciwciała jest kodowany przez chimeryczną mysio-ludzką sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 13, i każdy z łańcuchów ciężkich jest kodowany przez chimeryczną mysio-ludzką sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 19, sekwencja peptydowa każdego z łańcuchów lekkich, wyprowadzona z sekwencji kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 13, jest sekwencją SEQ ID NO: 14, i sekwencja peptydowa każdego z łańcuchów ciężkich wyprowadzona z sekwencji kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 19, jest sekwencją SEQ ID NO: 20. [0041] W przeciwciele według wynalazku, każdy z łańcuchów lekkich przeciwciała jest kodowany przez chimeryczną mysio-ludzką sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 27, i każdy z łańcuchów ciężkich jest kodowany przez chimeryczną mysio-ludzką sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 19, i sekwencja peptydowa każdego z łańcuchów lekkich, wyprowadzona z sekwencji kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 27, jest sekwencją SEQ ID NO: 28, i sekwencja peptydowa każdego z łańcuchów ciężkich wyprowadzona z sekwencji kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 19, jest sekwencją SBQ ID NO: 20. [0042] Sekwencje peptydowe SEQ ID NO: 14 i SEQ ID NO: 28 różnią się tylko aminokwasem obecnym w pozycji 106 w każdej z tych dwóch sekwencji. Aminokwasem położonym w pozycji 106 jest lizyna (K), w sekwencji SEQ ID NO: 28; jest asparagina (N) w sekwencji SEQ ID NO: 14.

9 - 8 - [0043] Ten opis odnosi się również do przeciwciała, którego każdy łańcuch lekki jest kodowany przez chimeryczną mysio-ludzką sekwencję kwasu nukleinowego wykazującą co najmniej 70% homologii lub identyczności z chimeryczną mysio-ludzką sekwencją kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 13, i każdy łańcuch ciężki jest kodowany przez chimeryczną mysio-ludzką sekwencję kwasu nukleinowego wykazującą co najmniej 70% homologii lub identyczności z chimeryczną mysio-ludzką sekwencją kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 19, przy czym takie zmiany nie wpływają ani na specyficzność przeciwciała, ani jego aktywność efektorową, taką jak ADCC (Zależna Od Przeciwciał Cytotoksyczność Komórkowa). [0044] Szczególnie korzystnie, przeciwciało według wynalazku jest wytwarzane przez linię komórkową hybrydomy szczura. Linia wytwarzania przeciwciała według wynalazku stanowi ważną charakterystykę, ponieważ nadaje przeciwciałom pewne szczególne właściwości. W istocie, ekspresja przeciwciał powoduje modyfikacje potranslacyjne, zwłaszcza modyfikacje glikozylacji, które mogą zmieniać się od jednej linii komórkowej do drugiej, i w ten sposób nadawać różne właściwości funkcjonalne przeciwciałom mającym jednak identyczne struktury pierwotne. [0045] W korzystnym przykładzie wykonania, przeciwciało jest wytwarzane w hybrydomie szczura YB2/0 (komórka YB2/3HL.P2.GIl.16Ag.20, zdeponowana w American Type Culture Collection pod numerem ATCC CRL-1662). Ta linia została wybrana ze względu na zdolność do wytwarzania przeciwciał o ulepszonej aktywności ADCC w porównaniu z przeciwciałami o tej samej podstawowej strukturze wytwarzanymi na przykład w CHO. [0046] Przeciwciałem tutaj opisanym jest EMAB6, wytwarzanym przez klon R509 zdeponowany 8 listopada 2004 pod numerem CNCM I-3314 w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Instytut Pasteura, 25 ul. Docteur Roux, Paryż Cedex 15). Każdy z łańcuchów lekkich przeciwciała EMAB6 jest kodowany przez mysioludzką chimeryczną sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 13, i każdy z łańcuchów ciężkich jest kodowany przez mysio-ludzką chimeryczną sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 19. Chimeryczne przeciwciało współzawodniczy z przeciwciałem mysim CAT- 13.6E12 pod względem wiązania się z CD20 i wykazuje znacznie większą aktywność cytotoksyczną niż Rituxan, którą można częściowo przypisać konkretnej glikozylacji N- glikanu łańcucha ciężkiego tego przeciwciała (por. przykład 4). Rzeczywiście, klon R509 ma cechę wytwarzania kompozycji przeciwciał EMAB6 o stosunku fukozy/stosunku galaktozy mniejszym niż 0,6, który został wykazany w zgłoszeniu patentowym FR , że jest optymalny dla nadania przeciwciałom silnej aktywności ADCC. Przeciwciało to jest zatem szczególnie użyteczne jako narzędzie terapeutyczne do leczenia patologii, w których zachodzi ekspresja CD20 w komórkach docelowych. [0047] W korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, korzystne przeciwciało według wynalazku jest przeciwciałem EMAB603 wytwarzanym przez klon R603 zdeponowanym w dniu 29 listopada 2005 pod numerem akcesyjnym CNCM I-3529 w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Instytut Pasteura, 25 ul. Docteur Roux, Paryż Cedex 15). Każdy z łańcuchów lekkich przeciwciała EMAB603 jest kodowany przez mysioludzką chimeryczną sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 27, i każdy z łańcuchów

10 - 9 - ciężkich jest kodowany przez mysio-ludzką chimeryczną sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 19. Chimeryczne przeciwciało współzawodniczy z przeciwciałem mysim CAT- 13.6E12 pod względem wiązania się z CD20 i ma znacznie większą aktywność cytotoksyczną niż Rituxan, którą można częściowo przypisać konkretnej glikozylacji N-glikanu łańcucha ciężkiego tych przeciwciał (por. przykład 3). Rzeczywiście, klon R603 ma cechę wytwarzania kompozycji przeciwciał EMAB603 o stosunku fukozy/stosunku galaktozy mniejszym niż 0,6 (patrz przykład 4), który został wykazany w zgłoszeniu patentowym FR , że jest optymalny dla nadania przeciwciałom silnej aktywności ADCC. Przeciwciało to jest zatem szczególnie użyteczne jako narzędzie terapeutyczne do leczenia patologii, w których zachodzi ekspresja CD20 w komórkach docelowych. [0048] Inny przedmiot wynalazku tutaj opisany odnosi się do wektora pef-emab6-k ekspresji łańcucha lekkiego przeciwciała tutaj opisanego, sekwencji SEQ ID NO: 12. Ten wektor jest wektorem pozwalającym na ekspresję przeciwciała tutaj opisanego, którego łańcuch lekki jest kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego SED ID NO: 13, którego wyprowadzona sekwencja peptydowa jest sekwencją SEQ ID NO: 14. Ten wektor to cząsteczka kwasu nukleinowego, w której mysia sekwencja kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 5 kodująca domenę zmienną każdego z łańcuchów lekkich przeciwciała i sekwencja kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 21 kodująca region stały każdego z łańcuchów lekkich przeciwciała, została wstawiona dla wprowadzenia i utrzymania w komórce gospodarza. Pozwala to na ekspresję fragmentów tych obcych kwasów nukleinowych w komórce gospodarza, ponieważ mają sekwencje niezbędne (promotor, sekwencja poliadenylacji, gen selekcyjny) do tej ekspresji. Takie wektory są dobrze znane w dziedzinie i mogą być adenowirusem, retrowirusem, plazmidem, bakteriofagiem, lista ta nie jest wyczerpująca. Ponadto, każda komórka ssacza może być wykorzystana jako komórka gospodarza, to znaczy, jako komórka eksprymująca przeciwciało tutaj opisane, na przykład YB2/0, CHO, CHO dhfr- (na przykład CHO DX B11, CHO DG44), CHO Lec13, SP2/0, NSO, 293, BHK lub COS. [0049] Innym przedmiotem tutaj opisanym jest wektor pef- EMAB6-H ekspresji łańcucha ciężkiego przeciwciała według wynalazku, sekwencji SEQ ID NO: 18. Ten wektor jest wektorem umożliwiającym ekspresję przeciwciała według wynalazku, którego łańcuch ciężki jest kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego SED ID NO: 19, którego wyprowadzona sekwencja peptydowa jest sekwencją SEQ ID NO: 20. Ten wektor to cząsteczka kwasu nukleinowego, w której mysia sekwencja kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 7 kodująca domenę zmienną każdego z ciężkich łańcuchów przeciwciała, i ludzka sekwencja kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 23 kodująca region stały każdego z ciężkich łańcuchów przeciwciała, została wstawiona, dla wprowadzenia i utrzymania w komórce gospodarza. Pozwala to na ekspresję fragmentów tych obcych kwasów nukleinowych w komórce gospodarza, ponieważ mają sekwencje niezbędne (promotor, sekwencja poliadenylacji, gen selekcyjny) do tej ekspresji. Jak wskazano powyżej, wektor może być, na przykład plazmidem, adenowirusem, retrowirusem lub bakteriofagiem, a komórka gospodarza może być dowolną komórką ssaczą, na przykład YB2/0, CHO, CHO dhfr- (CHO DX B11, CHO DG44), CHO Lecl3, SP2/0, NS0, 293, BHK lub COS.

11 [0050] Przeciwciało wytworzone przez ko-ekspresję wektorów pef-emab6-k i pef- EMAB6-H w komórce YB2/0 jest ilustrowane przez przeciwciało anty-cd20 EMAB6, wytwarzane przez klon R509 (zdeponowany pod numerem akcesyjnym CNCM I-3314 w CNCM). Przeciwciało to powoduje wyższą cytotoksyczność niż indukowanie przez Rituxan, zarówno w komórkach pacjentów cierpiących na B-CLL (w których antygen CD20 ulega słabszej ekspresji) jak i komórkach Raji, zastosowanych jako matryca i eksprymujących CD20 w dużej gęstości w stosunku do komórek pochodzących od komórek pacjentów z B- CLL. Ponadto, przeciwciało EMAB6 indukuje wydzielanie IL-2 (interleukina 2) przez komórki Jurkat~CD16 znacznie silniej niż przeciwciało Rituxan. Przeciwciało EMAB6 można wytwarzać przez hodowanie klonów R509 w pożywce hodowlanej i w warunkach pozwalających na ekspresję wektorów opisanych powyżej, jest więc bardzo interesującym narzędziem zdolnym do poprawy terapii i diagnozowania chorób związanych z CD20, a szczególnie B-CLL, a także badań w tej dziedzinie. [0051] Szczególnym przedmiotem wynalazku jest stabilna linia komórkowa eksprymująca przeciwciało według wynalazku. Korzystnie stabilna linia komórkowa eksprymująca przeciwciało według wynalazku jest wybrana z grupy składającej się z: SP2/0, YB2/0, ludzki szpiczak jak Namalwa i wszelkie inne komórki pochodzenia ludzkiego jak PERC6, linie CHO, zwłaszcza CHO-K-1, CHO-Lec10, CHO-Lec1, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr- (CHO DX B11, CHO DG44), lub inne linie wybrane spośród Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NS0, SP2/0-Ag 14 i P3X63Ag [0052] Korzystnie, stosowana jest linia hybrydomy szczura YB2/0. Ta linia została wybrana ze względu na zdolności do wytwarzania przeciwciał o ulepszonej aktywności ADCC w porównaniu z przeciwciałami o tej samej podstawowej strukturze, wytwarzanymi na przykład w CHO. [0053] W szczególnym aspekcie opisanym tutaj, w stabilną linię komórkową eksprymującą przeciwciała opisane tutaj, zwłaszcza wybrane z grupy opisanej powyżej, wprowadza się dwa wektory ekspresyjne pef-emab6-k i pef-emab6-h, jak opisano powyżej. [0054] Szczególny aspekt opisany tutaj odnosi się do klonu R509 zdeponowanego pod numerem CNCM I w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM). Szczególny aspekt wynalazku dotyczy klonu R603 zdeponowanego pod numerem CNCM I w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM). [0055] Inny przedmiot wynalazku opisany tutaj odnosi się do fragmentu DNA sekwencji SEQ ID NO: 19 kodującej łańcuch ciężki przeciwciała według wynalazku. Chimeryczna mysioludzka sekwencja kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 19 koduje każdy z ciężkich łańcuchów przeciwciała. Uzyskuje się ją poprzez fuzję mysiej sekwencji kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 7 kodującej domenę zmienną każdego z ciężkich łańcuchów przeciwciała i ludzkiej sekwencji kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 23 kodującej region stały każdego z ciężkich łańcuchów przeciwciała. [0056] Inny szczególny przedmiot opisany tutaj odnosi się do fragmentu DNA sekwencji SEQ ID NO: 13 kodującej łańcuch lekki przeciwciała opisanego tutaj. Chimeryczna mysio-

12 ludzka sekwencja kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 13 koduje każdy z ciężkich łańcuchów przeciwciała. Uzyskuje się ją poprzez fuzję mysiej sekwencji kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 5 kodującej domenę zmienną każdego z ciężkich łańcuchów przeciwciała i ludzkiej sekwencji kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 21 kodującej region stały każdego z ciężkich łańcuchów przeciwciała. [0057] Inny szczególny przedmiot opisany tutaj odnosi się do fragmentu DNA sekwencji SEQ ID NO: 27 kodującej łańcuch lekki przeciwciała opisanego tutaj. Chimeryczna mysioludzka sekwencja kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 27 koduje każdy z lekkich łańcuchów przeciwciała. Uzyskuje się ją poprzez fuzję mysiej sekwencji kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 25 kodującej domenę zmienną każdego z lekkich łańcuchów przeciwciała i ludzkiej sekwencji kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 21 kodującej region stały każdego z lekkich łańcuchów przeciwciała. [0058] Szczególny przedmiot wynalazku dotyczy zastosowania przeciwciała według wynalazku do aktywowania in vitro receptora FcγRIIIA immunologicznych komórek efektorowych. W rzeczywistości, przeciwciała według wynalazku i przeciwciała opisane tutaj mają szczególną zaletę, ponieważ są cytotoksyczne. Jako takie, mają zdolność do aktywacji przez region Fc receptora FcγRIIIA. Jest to bardzo interesujące, gdyż receptor jest eksprymowany na powierzchni komórki zwanej komórką efektorową : wiązanie się regionu Fc przeciwciała do jego receptora niesionego przez komórkę efektorową powoduje aktywację FcγRIIIA i zniszczenie komórek docelowych. Komórki efektorowe są na przykład komórkami NK (Natural Killer), makrofagami, neutrofilami, limfocytami CD8, limfocytami Tγδ, komórkami NKT, eozynofilami, bazofilami lub komórkami tucznymi. [0059] W szczególnym aspekcie, przeciwciało według wynalazku stosuje się jako lek. Korzystnie, taki lek jest przeznaczony do leczenia chorób, w których komórki docelowe są komórkami eksprymującymi CD20, takimi jak chłoniaki złośliwe komórek B. [0060] W korzystnym aspekcie, przeciwciało według wynalazku jest stosowane do wytwarzania leku do leczenia białaczki lub chłoniaka. [0061] Szczególnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia patologii wybranej spośród ostrych białaczek limfoblastycznych B, chłoniaków limfoblastycznych B-komórkowych, chłoniaków dojrzałych limfocytów B, w tym przewlekłej białaczki limfatycznej typu B (B-CLL), chłoniaka limfocytowego małych limfocytów B, białaczki prolimfocytowej B, chłoniaka limfoplazmocytowego, chłoniaka z komórek płaszcza, chłoniaka grudkowego, chłoniaka strefy brzeżnej typu MALT, węzłowego chłoniaka strefy brzeżnej z lub bez komórek monocytoidowych B, chłoniaka śledziony strefy brzeżnej (z lub bez limfocytów kosmków), białaczki tricholeukocytowej, rozlanego chłoniaka dużych komórek B, chłoniaka Burkitta, jak również wszelkich patologii zaburzeń immunologicznych z udziałem komórek z linii limfoidalnej B w tym chorób autoimmunologicznych. [0062] Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia białaczki limfoblastycznej.

13 [0063] Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia przewlekłej białaczki limfoblastycznej typu B (B-CLL). Ponadto, przeciwciało według wynalazku jest szczególnie odpowiednie do leczenia patologii, w których CD20 jest zbyt słabo eksprymowane na limfocytach B, a najkorzystniej B-CLL (Przewlekła Białaczka Limfatyczna Typu B). W związku z tym, przeciwciało według wynalazku może być stosowane w połączeniu z jednym lub więcej innych przeciwciał, na przykład przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciw jednemu lub więcej innych antygenów, eksprymowanych na komórkach limfoidalnych, takich jak antygeny HLA-DR, CD19, CD23, CD22, CD80, CD32 i CD52, dla wytwarzania leku do leczenia białaczki lub chłoniaka. Humanizowane przeciwciała Campath-1H (alentuzumab, MabCampathR ), które jest skierowane na cząsteczki mocno eksprymowane na komórkach limfoidalnych, antygenu CD52, i pozwala na indukowanie lizy komórkowej w trakcie uruchamiania mechanizmów efektorowych gospodarza (wiązanie dopełniacza, cytotoksyczność zależna od przeciwciał) stosuje się zatem w leczeniu LLC (Moreton P, Hillmen P 2003 Semin. Oncol., 30(4): ; Rawstron AC i in., 2004 Blood, 103(6): ; Robak T 2004 Leuk. Lymphoma, 45(2): ; Stanglmaier M i in., 2004 Ann Hematol., 83(10): ). Badania kliniczne są również prowadzone dla oceny przeciwciał lub immunotoksyn skierunkowanych przeciwko antygenom HLA-DR, CD22, CD23, CD80 u pacjentów z LLC (Mavromatis BH, Cheson BD 2004 Blood Rev. 18 (2): ; Mavromatis B, Cheson BD 2003 J Clin. Oncol. 21(9): , Coleman M i in., 2003 Clin. Cancer Res. 9:3991S-3994S; Salvatore G i in., 2002 Clin. Cancer Res. 8: ). [0064] W innym przykładzie wykonania, przeciwciało według wynalazku może być stosowane w połączeniu z komórkami eksprymującymi FcγR, takimi jak komórki NK, komórki NKT (Natural Killers T), limfocyty Tγδ, makrofagi, monocyty lub komórki dendrytyczne, to znaczy w połączeniu z terapią komórkową (Peller S, Kaufman S Blood 1991, 78:1569, Platsoucas CD i in., J Immunol 1982, 129:2305; Kimby E i in., 1989 Leukemia 3 (7): ; Soorskaar D i in., 1988 Int Arch Allery Appl Immunol 87(2) ; Ziegler HW i in., 1981 Int J Cancer 27(3) ; Chaperot L i in., 2000 Leukaemia 14 (9): , Vuillier F, Dighiero G 2003 Bull Cancer. 90(8-9):744-50). [0065] Ponadto, przeciwciało według wynalazku korzystnie pozwala na zmniejszenie dawek podawanych pacjentom: korzystnie, dawka przeciwciała podawana pacjentowi jest 2-krotnie, 5-krotnie lub 10-krotnie, 25-krotnie, 50-krotnie i szczególnie korzystnie 100-krotnie mniejsza od dawki Rituxan. Korzystnie, dawka przeciwciała podawana pacjentowi jest między 2 a 5 razy, między 5 a 10 razy, między 5 a 25 razy, miedzy 5 a 50 razy, lub jeszcze między 5 a 100 razy mniejsza od dawki Rituxan. Zatem, przeciwciało według wynalazku, na przykład EMAB6 można korzystnie podawać w dawce poniżej 187,5 mg/m 2, 75 mg/m 2, 37,5 mg/m 2, 15 mg/m 2, 7,5 mg/m 2 lub szczególnie korzystnie poniżej 3,75 mg/m 2. Podawana dawka wynosi korzystnie między 187,5 mg/m 2 a 75 mg/m 2, lub między 75 mg/m 2 a 37,5 mg/m 2, między 75 mg/m 2 a 15 mg/m 2, między 75 mg/m 2 a 7,5 mg/m 2 lub jeszcze między 75 mg/m 2 a 3,75 mg/m 2.

14 [0066] Opis obejmuje także sposób leczenia chorób, w których komórki docelowe są komórkami eksprymującymi CD20, jak chłoniaki złośliwe komórki B, obejmujący podawanie pacjentowi skutecznej dawki kompozycji zawierającej przeciwciało według wynalazku. Bardziej korzystnie, sposób leczenia jest szczególnie przydatny w leczeniu białaczki lub chłoniaka. Jeszcze bardziej szczegółowo, jest to sposób leczenia patologii wybranej spośród ostrych białaczek limfoblastycznych B, chłoniaków limfoblastycznych B, chłoniaków dojrzałych komórek B, w tym przewlekłej białaczki limfatycznej typu B (B-CLL), chłoniaka limfocytowego małych limfocytów B, białaczki prolimfocytowej B, chłoniaka limfoplazmocytowego, chłoniaka z komórek płaszcza, chłoniaka grudkowego, chłoniaka strefy brzeżnej typu MALT, węzłowego chłoniaka strefy brzeżnej z lub bez komórek monocytoidowych B, chłoniaka śledziony strefy brzeżnej (z lub bez limfocytów kosmków), białaczki tricholeukocytowej, rozlanego chłoniaka dużych komórek B, chłoniaka Burkitta, jak również wszelkich patologii zaburzeń immunologicznych z udziałem komórek lonii linii limfoidalnej B w tym chorób autoimmunologicznych, obejmujący podawanie skutecznej dawki przeciwciała lub kompozycji zawierającej przeciwciało według wynalazku. [0067] Szczególnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała według wynalazku do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia przewlekłej choroby przeszczepu przeciw gospodarzowi dla leczenia zdarzeń z udziałem limfocytów B biorcy. Wreszcie ostatnim przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia odrzucenia przeszczepionych narządów, zwłaszcza nerki. [0068] Rzeczywiście, ostatnie badania (Ratanatharathorn i in., 2003 Biol Blood Marrow Transplant Aug;9 (8):505-11; Becker i in., 2004 Am J Transplant Jun;4 (6): ) wykazały zainteresowanie przeciwciałami anty-cd20 w leczeniu tych patologii. [0069] Inne aspekty i zalety wynalazku zostaną opisane w następujących przykładach wykonania, które należy uważać za ilustracyjne. Opis figur [0070] Fig. 1: Schematyczne przedstawienie wektora CKHu stosowanego do chimeryzacji łańcucha lekkiego kappa przeciwciał EMAB6 i EMAB603. Fig. 2: Schematyczne przedstawienie wektora ekspresji łańcucha lekkiego pef- EMABG-K stosowanego do wytwarzania przeciwciała EMAB6. Fig. 3: Schematyczne przedstawienie wektora GlHu stosowanego do chimeryzacji łańcucha ciężkiego przeciwciał EMAB6 i EMAB603. Fig. 4: Schematyczne przedstawienie wektora ekspresji łańcucha ciężkiego pef- EMAB6-H stosowanego do wytwarzania przeciwciała EMAB6. Fig. 5: Współzawodniczenie chimerycznego przeciwciała EMAB6 dla wiązania oryginalnego przeciwciała mysiego CAT-13.6E12 (CAT13) z CD20 eksprymowanym na komórkach Raji.

15 Przykłady Fig. 6: Aktywność cytotoksyczna zależna od dopełniacza anty-cd20 na komórkach Raji. (A) Rituxan pusty trójkąt, EMAB6 pełny diament. Lizę komórek oceniano przez pomiar wewnątrzkomórkowego LDH uwalnianego w supernatancie. Wyniki wyrażono jako procent liy, 100% jest wartością otrzymaną z Rituxan (5000ng/ml przeciwciała anty-cd20). Średnia z 5 prób. (B) Porównanie aktywności cytotoksycznej zależnej od dopełniacza przeciwciał EMAB6 (pełny diament) i EMAB603 (pusty diament). Fig. 7: ADCC indukowana przez anty-cd20 wobec komórek Raji. (A) Rituxan pusty trójkąt, EMAB6 pełny diament. Lizę komórek oceniano przez pomiar wewnątrzkomórkowego LDH uwalnianego w supernatancie. Wyniki wyrażono jako procent lizy, 100% jest wartością otrzymaną z Rituxan (250ng/ml przeciwciała anty- CD20). Średnia z 3 prób. (B) Porównanie ADCC indukowanej przez przeciwciało EMAB6 (pełny diament) i EMAB603 (pusty diament). Fig. 8: ADCC indukowana przez przeciwciało anty-cd20 w obecności limfocytów B pochodzących od pacjentów z B-CLL. Rituxan pusty trójkąt, EMAB6 pełny diament. Stosunek E/T = 15. Lizę komórek oceniano przez pomiar kalceiny uwalnianej w supernatancie. Wyniki wyrażono w procentach, 100% jest wartością otrzymaną z Rituxan (500ng/ml przeciwciała anty-cd20). Średnia z 4 doświadczeń odpowiadających 4 różnym pacjentom. Fig. 9: Aktywacja CD16 (FcγRIIIA) indukowana przez przeciwciało anty-cd20 w obecności komórek Raji. (A) Rituxan pusty trójkąt, EMAB6 pełny diament. Wyniki wyrażono w procentach IL-2, te ostatnie są mierzone w supernatantach przez ELISA; 100% jest wartością otrzymaną z Rituxan (2500ng/ml anty-cd20). Średnia z 4 prób. (B) Porównanie aktywacji CD16 (FcγRIIIA) indukowanej przeciwciałem EMAB6 (pełny diament) i EMAB603 (pusty diament). Fig. 10: Aktywacja CD16 (FcγRIIIA) indukowana przez anty-cd20 w obecności limfocytów B pacjentów z B-CLL. Rituxan pusty trójkąt, EMAB6 pełny diament. Wyniki wyrażono w procentach IL-2, te ostatnie są mierzone w supernatantach przez ELISA; 100% jest wartością otrzymaną z Rituxan (2500ng/ml przeciwciała anty- CD20). Średnia od 12 pacjentów. Fig. 11: wytwarzanie IL-2 indukowana przez mysie przeciwciało CAT-13.6E12 w obecności komórek Jurkat-CD16 (FcγRIIIA). Fig. 12: Schematyczne przedstawienie wektora ekspresji łańcuchów ciężkich i lekkich prsv-hl-emab603 stosowanego do wytwarzania przeciwciała EMAB603. Przykład 1: Konstrukcja wektorów ekspresyjnych chimerycznych przeciwciał anty- CD20 EMAB6 i EMAB603 A. Określenie sekwencji regionów zmiennych mysiego przeciwciała CAT-13.6E12

16 [0071] Całkowite RNA mysiej hybrydomy CAT-13.6E12 (dostawca: DSMZ, ref. ACC 474) wytwarzające immunoglobulinę typu IgG2a,κ zostało wyizolowane (zestaw RNAeasy, Qiagen ref ). Po odwrotnej transkrypcji, domeny zmienne łańcuchów lekkich (VK) i ciężkich (VH) przeciwciała CAT-13.6E12 namnożono techniką 5 RACE (Rapid Amplification of cdna Ends) (zestaw GeneRacer, Invitrogen ref. L ). Startery zastosowane dla tych dwóch etapów są następujące: 1. startery odwrotnej transkrypcji a. Swoisty mysi antysensowny starter Kappa (SEQ ID NO: 1) 5 -ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT GAC-3 b. Swoisty mysi antysensowny starter G2a (SEQ ID NO: 2) 5 -CTG AGG GTG TAG AGG TCA GAC TG-3 2. startery PCR 5 RACE a. Swoisty mysi antysensowny starter Kappa (SEQ ID NO: 3) 5 -TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC-3 b. Swoisty mysi antysensowny starter G2a (SEQ ID NO: 4) 5 -GAGTTCCAGGTCAAGGTCACTGGCTCAG-3 [0072] Produkty PCR VH i Vκ otrzymane w ten sposób klonowano w wektorze pcr4blunt- TOPO (Zestaw do klonowania Zéro blunt TOPO PCR, Invitrogen, ref. K ), a następnie sekwencjonowano. [0073] Sekwencja nukleotydowa regionu VA: mysiego przeciwciała CAT-13.6E12 została podana w sekwencji SEQ ID NO: 5, i wyprowadzona sekwencja peptydowa jest sekwencją SEQ ID NO: 6. Gen Vκ należy do rodziny Vκ4 [Kabat i in., Séquences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication, (1991)]. [0074] Sekwencja nukleotydowa regionu VH CAT-13.6E12 jest sekwencją SEQ ID NO: 7, i wyprowadzona sekwencja peptydowa jest sekwencją SEQ ID NO: 8. Gen VH należy do rodziny VH1 [Kabat i in., Séquences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication, (1991)]. B. Konstrukcja wektorów ekspresyjnych łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego przeciwciał chimerycznych EMAB6 i EMAB Wektor lekkiego łańcucha Kappa 1.1 Wektor lekkiego łańcucha przeciwciała EMAB6. [0075] Sekwencję Vκ sklonowaną w wektorze do sekwencjonowania pcr4blunt-topo amplifikowano przy zastosowaniu następujących starterów klonowania: a) starter sensowny Vκ (SEQ ID NO: 9)

17 CTCAGTACTAGTGCCGCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG-3 Podkreślona sekwencja odpowiada miejscu restrykcyjnemu Spe I, sekwencja pogrubiona odpowiada sekwencji consensus Kozak, inicjator ATG jest kursywą. b) starter antysensowny VA: (SEQ ID NO: 10) 5 -TGAAGACACTTGGTGCAGCCACAGTCCGGTTTATTTCCAGCCTGGT-3 Starter ten łączy sekwencje mysie Vκ (kursywą) i region stały (Cκ) ludzki (pogrubiony) Podkreślona sekwencja odpowiada miejscu restrykcyjnemu DraIII. [0076] Produkt PCR Vκ; otrzymany w ten sposób zawiera sekwencję kodującą natywny peptyd sygnałowy mysiego przeciwciała CAT-13.6E12. PCR Vκ następnie sklonowano między miejscami Spe I i Dra III wektora chimeryzacji łańcucha lekkiego (Fig. 1), który odpowiada sekwencji SEQ ID NO: 11, w 5 ludzkim regionie stałym Cκ, którego sekwencja nukleinowa jest sekwencją SEQ ID NO: 21, i wyprowadzona sekwencja peptydowa jest sekwencją SEQ ID NO: 22. Ludzka sekwencja Cκ tego wektora chimeryzacji została wcześniej zmodyfikowana za pomocą cichej mutagenezy, by utworzyć miejsce restrykcyjne Dra III umożliwiające klonowanie sekwencji mysich Vκ. Ten wektor chimeryzacji zawiera promotor RSV i sekwencję poliadenylacji bgh (Bydlęcy hormon wzrostu), jak również gen selekcyjny dhfr (reduktazy dihydrofolianowej). [0077] Sekwencja łańcucha lekkiego chimerycznego przeciwciała EMAB6 kodowanego przez ten wektor jest przedstawiona w SEQ ID NO: 13 dla sekwencji nukleotydów i odpowiada wyprowadzonej sekwencji peptydu SEQ ID NO: Wektor łańcucha lekkiego przeciwciała EMAB603 [0078] Protokół ten jest taki sam jak dla wektora lekkiego łańcucha przeciwciała EMAB6 (por. przykład 1, B-I.1) poza starterem antysensownym Vκ, który jest: b ) starter antysensowny VK (SEQ ID NO: 29) Starter ten łączy mysią sekwencję VK (kursywą) i region stały (CK) ludzki (pogrubiony) Podkreślona sekwencja odpowiada miejscu restrykcyjnemu Dra III. Starter ten wprowadza również mutację AAC -> AAA (nukleotyd zawarty w sekwencji startera antysensownego SEQ ID NO: 29), która odpowiada mutacji N106K (por. sekwencja nukleotydowa i wyprowadzona sekwencja peptydu SEQ ID NO: 25 i SEQ ID NO: 26) w porównaniu z natywną sekwencją Vκ CAT-13.6E12 (por. SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 6). [0079] Sekwencja łańcucha lekkiego chimerycznego przeciwciała EMAB603 kodowana przez ten wektor jest przedstawiona w SEQ ID NO: 27 dla sekwencji nukleotydów i odpowiada wyprowadzonej sekwencji peptydu SEQ ID NO: Wektor łańcucha ciężkiego

18 [0080] Podobne podejście zastosowano do chimeryzacji łańcucha ciężkiego przeciwciała EMAB6 i EMAB603. [0081] Sekwencję VH sklonowaną do wektora pcr4blunt-t0p0 najpierw amplifikowano z użyciem następujących starterów do klonowania: a) starter sensowny VH (SEQ ID NO: 15) 5 -CTCAGTACTAGTGCCGCCACCATGGGATTCAGCAGGATCTTTCTC -3 Podkreślona sekwencja odpowiada miejscu restrykcyjnemu Spe I, sekwencja pogrubiona odpowiada sekwencji consensus Kozak, inicjator ATG jest kursywą. b) starter antysensowny VH: (SEQ ID NO: 16) 5 - GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCC-3 Starter ten łączy sekwencje mysie VH (kursywą) i region stały G1 ludzki (pogrubiony) Podkreślona sekwencja odpowiada miejscu restrykcyjnemu Apa I. [0082] Powielony fragment VH zawiera sekwencję kodującą peptyd sygnałowy natywny mysiego przeciwciała CAT-13.6E12. To PCR VH następnie sklonowano między miejscami Spe I i Apa I wektora chimeryzacji łańcucha ciężkiego (Fig. 3), który odpowiada sekwencji SEQ ID NO: 17, w 5 ludzkiego regionu stałego γ1, którego sekwencja nukleinowa jest sekwencją SEQ ID NO: 23, i wyprowadzona sekwencja peptydowa jest sekwencją SEQ ID NO: 24. Ten wektor chimeryzacji zawiera promotor RSV i sekwencję poliadenylacji bgh (Bydlęcy hormon wzrostu), jak również gen wyboru neo. [0083] Sekwencja łańcucha ciężkiego chimerycznego przeciwciała EMAB6 i EMAB603 kodowana przez ten wektor jest przedstawiona w SEQ ID NO: 19 dla sekwencji nukleotydowej i sekwencji SEQ ID NO: 20 dla wyprowadzonej sekwencji peptydu. 3. Wektory ekspresyjne końcowe 3.1 Wektory ekspresyjne przeciwciał EMAB6 [0084] Dla ekspresji przeciwciała EMAB6, promotor RSV wektora chimeryzacji łańcucha lekkiego kappa (por. przykłady 1, B-1.1) zastąpiono promotorem ludzkim EF-1 alfa. Wektor ekspresyjny końcowy łańcucha lekkiego pef-emab6-k jest przedstawiony na fig. 2 i odpowiada sekwencji SEQ ID NO: 12. [0085] Sekwencja łańcucha lekkiego chimerycznego przeciwciała EMAB6 kodowanego przez ten wektor jest przedstawiona w SEQ ID NO: 13 dla sekwencji nukleotydowej i odpowiada wyprowadzonej sekwencji peptydu SEQ ID NO: 14. [0086] Dla ekspresji przeciwciała EMAB6, promotor RSV wektora chimeryzacji łańcucha ciężkiego (por. przykłady 1, B-2) zastąpiono promotorem ludzkim EF-1 alfa. Wektor ekspresyjny końcowy łańcucha ciężkiego pef-emab6-h otrzymany w ten sposób jest przedstawiony na Fig. 4 i odpowiada sekwencji SEQ ID NO: Wektor ekspresyjny przeciwciała EMAB603

19 [0087] Pojedynczy wektor ekspresyjny zawierający dwie jednostki transkrypcyjne łańcucha ciężkiego jak i lekkiego łańcucha przeciwciała anty-cd20 EMAB-603 został skonstruowany z dwóch wektorów chimeryzacji łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego (por. odpowiednio przykład 1, B-1.2 i przykład 1-B2) przez subklonowanie, w miejscu Xho I wektora łańcucha ciężkiego, przy czym fragment BgI II-Pvu II wektora łańcucha lekkiego zawiera jednostkę transkrypcji łańcucha lekkiego i gen dhfr. Ten wektor ekspresyjny prsv-hl-emab-603 ma dwa geny selekcji neo (neo-fosfotransferaza II) i dhfr (reduktaza dihydrofolianowa), a także dwie jednostki transkrypcyjne łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego, pod kontrolą promotora RSV (fig. 12). Przykład 2: Utworzenie linii komórkowych pochodzących z linii YB2/0 wytworzenia chimerycznego przeciwciała anty-cd20 EMAB6 i chimerycznego przeciwciała anty- CD20 EMAB603 [0088] Linię szczurzą YB2/0 (ATCC # CRL-1662) hodowano w pożywce EMS (Invitrogen, ref M) zawierającej 5% płodowej surowicy cielęcej (JRH Biosciences, ref ). Dla transfekcji, 5 milionów komórek poddano elektroforezie (elektroporator Biorad, model ) w pożywce Optimix (Equibio, ref. EKITE 1) z 25 µg wektora łańcucha lekkiego, pef-emab6-k (Fig. 2), linearyzowanego Aat II i 27 µg wektora łańcucha ciężkiego, pef- EMAB6-H (Fig. 4), linearyzowanego Sca I, dla ekspresji przeciwciała EMAB6, lub wektora prsv-hl-emab-603 dla ekspresji przeciwciała EMAB603. Stosowane warunki elektroporacji były następujące 230 V i 960 mikrofarada na kuwetę 0,5 ml. Każda kuweta do elektroporacji została następnie rozmieszczona na 5 płytkach P96 z gęstością 5000 komórek/studzienkę. [0089] Wprowadzenie selektywnej pożywki RPMI (Invitrogen, ref ) zawierającej 5% dializowanej surowicy (Invitrogen, ref ), 500 µg/ml G418 (Invitrogen, ref ) i 25 nm metotreksatu (Sigma, ref. M8407), przeprowadzono po 3 dniach od transfekcji. [0090] Supernatanty ze studzienek odpornych na transfekcję ukierunkowano na obecność immunoglobulin chimerycznego (Ig) poprzez swoiste dozowanie ELISA, sekwencji ludzkich Ig. [0091] 10 transfektantów produkujących najwięcej przeciwciał powielono w płytkach P24 i supernatant ponownie oznaczono za pomocą ELISA dla oszacowania wydajności i wybrania 3 najlepszych producentów do klonowania, za pomocą ograniczonego rozcieńczenia (40 komórek/płytkę). [0092] Po klonowaniu, klon R509.6A4 (R /046-6H1(1) 6A4, produktywność: 17 µg/10 6 komórek), zwany R509 i klon R603, wybrano odpowiednio do wytworzenia przeciwciała chimerycznego EMAB6 i przeciwciała EMAB603 i stopniowo dostosowywano do środowiska produkcyjnego CD Hybridoma (Invitrogen, ref ). [0093] Produkcja przeciwciał chimerycznych EMAB6 i EMAB603 została przeprowadzona przez ekspansję kultury przystosowanej w pożywce CD Hybridoma, otrzymanej przez rozcieńczenie 3x10 5 komórek/ml w kolbach 75 cm 2 i 175 cm 2 i następnie rozcieńczenie

20 - 19-4,5x10 5 komórek/ml w kolbach walcowanych. Po osiągnięciu maksymalnej objetości (1 1), hodowlę kontynuowano aż żywotność komórek nie przekraczała 20%. Po wytworzeniu, chimeryczne przeciwciała EMAB6 i EMAB603 oczyszczono metodą chromatografii powinowactwa na białku A (czystość szacowana przez HPLC < 95 %) i sprawdzano za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Przykład 3: Charakterystyka aktywności funkcjonalnej chimerycznego przeciwciała EMAB6 i EMAB603 A. Specyficzność [0094] Specyficzność rozpoznawania antygenów przeciwciała chimerycznego EMAB6 oceniano w badaniu konkurencji z mysim przeciwciałem pochodzenia CAT-13.6E12, pod względem wiązania się z antygenem CD20 eksprymowanym w komórkach Raji. W tym celu, przeciwciało EMAB6 (10 µl 0,5 do 50 µg/ml) inkubowano w temperaturze 4 C przy stałej ilości mysiego przeciwciała CAT-13.6E12 (10 µl 5 µg/ml) przez 20 minut w obecności komórek Raji (50 µl 4x10 6 /ml). Po przemyciu, mysie przeciwciało anty-igg sprzężone z fikoerytryną (PE) dodano do komórek Raji w taki sposób, by umożliwić swoiste wykrywanie wiązanie przeciwciała mysiego CAT 13.6E12. MFI otrzymane w obecności różnych stężeń EMAB6 są przeliczane na procenty, 100% odpowiada wiązaniu komórek CAT-13.6E12 w nieobecności przeciwciała EMAB6. Otrzymuje się w ten sposób krzywą hamowania wiązania przeciwciała CAT-13.6E12 (CAT13) na komórkach Raji przy wzrastających stężeniach EMAB6 (Fig. 5). [0095] Badanie to pokazuje, że proces chimeryzacji nie zmienia swoistości przeciwciała EMAB6, które również konkuruje z prenatalnym mysim przeciwciałem CAT 13.6E12 pod względem wiązania CD20 eksprymowanego na powierzchni komórek Raji. Specyficzności rozpoznawania antygenu przez przeciwciało EMAB603 jest porównywalna do przeciwciała EMAB6. B. Aktywność Cytotoksyczna Zależna Od Dopełniacza [0096] Aktywność cytotoksyczną zależną od dopełniacza przeciwciał EMAB6 i EMAB603 badano z komórkami Raji, w obecności surowicy młodego królika jako źródła dopełniacza; chimeryczne przeciwciało anty-cd20 Rituxan zostało włączone do testu dla porównania. Do tego badania, komórki Raji zostały dostosowane do 6x10 5 komórek/ml w IMDM (Iscove s Modified Dulbecco s Medium) 5% SVF. Przeciwciała rozcieńczono w IMDM+0,5% SVF. Mieszanina reakcyjna składała się z 50 µl przeciwciała, 50 µl surowicy młodego królika (1/10 rozcieńczenie w IMDM 0,5% SVF odczynnika Cedarlane CL 3441), 50 µl docelowych komórek i 50 µl pożywki IMDM 0,5% SVF. Końcowe stężenia przeciwciał wynosiły 5 000, 1 250, 250 i 50 ng/ml. Kontrola bez przeciwciał została zawarta w teście. Po 1 godzinie inkubacji w 37 C w atmosferze wzbogaconej w 5% CO2, płytki odwirowano, a poziom wewnątrzkomórkowego LDH uwolnionego do supernatantu, określono przez swoisty odczynnik (Cytotoxicity Détection Kit ).

21 Procent lizy oszacowano stosując zakres kalibracji otrzymany z różnych rozcieńczeń komórek docelowych zlizowanych w Triton X100 (2%), co odpowiada odpowiednio 100, 50, 25 i 0% lizy. [0097] Wyniki przedstawione na Fig. 6 (A) wskazują, że przeciwciała EMAB6 i Rituxan indukują lizę komórek Raji zależną od dopełniacza. Niemniej jednak, aktywność dopełniacza przeciwciała EMAB6 będzie nieco mniejsza niż Rituxan. Różnica ta jest większa w przypadku niskich stężeń przeciwciał stosowanych w tym badaniu. Przy stężeniu od 50 do 250 ng/ml, aktywność przeciwciała EMAB6 jest rzędu 45% aktywności Rituxan. Różnica ta maleje, gdy stężenie przeciwciał zwiększa się, procent aktywności cytotoksycznej zależny od dopełniacza przeciwciała EMAB6 wynosi 92% aktywności Rituxan przy najwyższym testowanym stężeniu, to znaczy 5000 ng/ml. Ta zależna od dopełniacza przeciwciała EMAB6 aktywność cytotoksyczna, która jest niższa niż Rituxan może być uważana za zaletę, ponieważ ogranicza potencjalną toksyczność EMAB6 in vivo w porównaniu do Rituxan związanego z aktywacją klasycznego szlaku dopełniacza prowadzącego do wytwarzania różnych cząsteczek o aktywnościach zapalnych, alergicznych i niekorzystnych naczyniowych. Aktywność dopełniacza przeciwciała EMAB603 pojawia się na fig. 6 (B). C. Aktywność ADCC [0098] Cytotoksyczność chimerycznego przeciwciała EMAB6 oceniano w obecności komórek Raji lub limfocytów B pochodzących od pacjentów z CLL. Chimeryczne przeciwciało anty-cd20 Rituxan zostało uwzględnione w teście w celach porównawczych. Stosowana technika pomiarowa ADCC polegająca na znakowaniu kalceiną jest następująca: Komórki NK izolowano z PBMC z zastosowaniem techniki rozdzielania na kulkach magnetycznych (MACS) od Myltenyi. Komórki NK przemyto i zawieszono w IMDM+5% SVF (45x10 5 komórek/ml). Komórki efektorowe i komórki docelowe są stosowane w stosunku 15/1. Komórki Raji lub PBMC (Komorki Jednojadrzaste Krwi Obwodowej) pacjentów z B-CLL otrzymane po Ficoll (>95% limfocytów B) są wstępnie znakowane kalceiną (1ml komórek o 3x10 6 komórki/ml w IMDM +5% SVF + 20 µl kalceiny (20 µm) i inkubacji przez 20 min w 37 C, a następnie płukaniu w HBSS (Hank s Buffered Saline Solution)) i dostosowaniu do 3x10<5> komórek/ml w IMDM 5% SVF. Przeciwciała rozcieńczono w IMDM 0,5% SVF (stężenie końcowe 500; 50; 5; 0,5; 0,005 i 0,005 ng/ml). Mieszanina reakcyjna składała się z 50 µl przeciwciała, 50 µl komórek efektorowych, 50 µl komórek docelowych i 50 µl pożywki IMDM na płytce do mikromiareczkowania P96. Dwie negatywne kontrole zostały ustalone: - Liza bez NK: Komórki efektorowe NK zastąpiono IMDM + 5% SVF. - Liza bez przeciwciał (Ac): przeciwciała zastąpiono IMDM + 5% SVF. [0099] Po 4 godzinach inkubacji w 37 C w atmosferze wzbogaconej w 5% CO2, płytki odwirowano i zmierzono fluorescencję związaną z supernatantem w fluorymetrze

22 (wzbudzenie 485 nm/emisja 535 nm). Procent lizy oszacowano stosując zakres kalibracji otrzymany z różnymi rozcieńczeniami komórek docelowych poddanych lizie w Triton X-100 (2%), co odpowiada odpowiednio 100, 50, 25 i 0% lizy. [0100] Wyniki oblicza się po raz pierwszy za pomocą następującego wzoru: % lizy = (% lizy z Przeciwiciałem i NK) - (% lizy bez Przeciwiciała) - (% lizy bez NK), następnie wyrażono jako względne wartości procentowe, przy czym 100% jest wartością otrzymaną przy najwyższym stężeniu Rituxan. [0101] Wyniki uzyskane dla przeciwciała EMAB6 na komórkach linii Raji, pokazane na Fig. 7 (A) wskazują, że niezależnie od badanego stężenia, cytotoksyczność indukowana przez EMAB6 jest większa niż indukowana przez Rituxan. Różnica ta jest szczególnie ważna przy niskich stężeniach przeciwciała. Przy stężeniu 0,5 ng/ml, procent lizy wyniósł zatem 96 i 4% odpowiednio dla EMAB6 i Rituxan. Poprzez zwiększenie dawki 500-krotnie (250 ng/ml) różnica stała się jeszcze bardziej istotna, ponieważ procent ADCC wyniósł 164 i 100% odpowiednio dla EMAB6 i Rituxan. Przy obliczaniu EC50 (stężenie przeciwciał odpowiadające 50% E Max, maksymalna wydajność uzyskana przy najwyższym stężeniu przeciwciała i płytki) przez szacowanie graficzne (w ng/ml) i zakładając, że Rituxan i EMAB6 osiągają ten sam E Max, stosunek EC50 Rituxan /EC50 EMAB6 w tym teście jest wówczas równy 300. Cytotoksyczność przeciwciała chimerycznego EMAB603 oceniano w obecności komórek Raji zgodnie z tym samym sposobem jak przeciwciała EMAB6. Jego aktywność jest porównywalna do aktywności przeciwciała EM[Alfa]B6 (por. fig. 7 (B)). [0102] W limfocytach pacjentów z B-CLL, uzyskane wyniki, przedstawione na fig. 8, wskazują, że - bez względu na badane stężenia, cytotoksyczność indukowana przez EMAB6 jest większa niż indukowana przez Rituxan. Jak już zaobserwowano z komórkami Raji, różnica ta jest szczególnie ważna przy niskich stężeniach przeciwciała. Stężenie 0,5 ng/ml EMAB6 indukuje ten sam procent lizy jak 500 ng/ml Rituxan lub stosunek stężenia wynoszący Przy stężeniu 5 ng/ml, procent lizy wyniósł 269 i 9% odpowiednio dla EMAB6 i Rituxan. Przy najwyższej testowanej dawce (500 ng/ml), różnica jest jeszcze bardzo duża, ponieważ procent ADCC wyniósł 350 i 100% odpowiednio dla EMAB6 i Rituxan. Interesujący wynik odpowiada stężeniom, które dają 50% lizy. Stosunek EC50 Rituxan /EC50 EMAB6 w tym teście został oszacowany na (oszacowanie graficzne ng/ml EC50 przy założeniu, że Rituxan i EMAB6 osiągają ten sam E Max). [0103] W tych badaniach aktywności cytotoksyczne EMAB6 i EMAB603 są zatem znacznie większe niż Rituxan. D. Aktywacja CD16 (wydzielanie IL-2) [0104] Aktywacja CD16 (FcγRIIIA) indukowana przez chimeryczne przeciwciało EMAB6 została określona w obecności komórek Raji lub limfocytów B pochodzących od pacjentów z LLC. To badanie ocenia zdolność przeciwciał do wiązania się z receptorem CD16 (FcγRIIIA)

23 eksprymowanym na komórkach Jurkat-CD16 i wywołania wydzielania IL-2. Chimeryczne przeciwciało anty-cd20 Rituxan zostało włączone do testy w celach porównawczych. [0105] Pomiar aktywacji CD16 przeprowadzono w linii komórkowej Jurkat-CD16, w obecności komórek Raji lub limfocytów B od pacjentów z LLC następująco: Mieszanina w 96-studzienkowej płytce: 50 µl roztworu przeciwciał (rozcieńczenie , 1 000, 100 i 10 ng/ml w IMDM 5% SVF dla limfocytów B pacjentów z B-CLL i , 2 000, 1 000, 200, 100, 50 i 25 ng/ml dla komórek Raji), 50 µl PMA (Octan mirystynianu forbolu, rozcieńczenie 40ng/ml w IMDM 5% SVF), 50 µl komórek Raji lub PBMC od pacjentów z B-CLL otrzymanych po Ficoll (>95% limfocytów B) rozcieńczonych do 6x10 5 /ml w IMDM 5% SVF, i 50 µl komórek Jurkat-CD16 (20x10E6/ml w IMDM 5% SVF). Kontrole bez przeciwciał są zawarte we wszystkich testach. Po inkubacji przez noc w 37 C, płytki odwirowano i IL-2 zawarty w supernatantach oceniano z użyciem zestawu dostępnego w handlu (Quantikine od R/D). Odczyt DO dokonano w 450 nm. Wyniki wyrażono początkowo w poziomie IL-2, w zależności od stężenia przeciwciała (od 0 do 2500 ng/ml końcowego stężenia), następnie w procentach względnych, przy czym 100% jest wartością otrzymaną z Rituxan w najwyższym badanym stężeniu. [0106] Wyniki otrzymane z komórek linii Raji pokazane na Fig. 9 (A), wskazują, że w obecności przeciwciała EMAB6 i Rituxan, komórki Jurkat-CD16 wydzielają IL-2, wykazując aktywację komórkową przez wiązanie z częścią Fc przeciwciał na CD16. Przeciwciało EMAB6 wykazuje jednak znacznie silniejszą aktywność indukowania niż przeciwciało Rituxan. Przy stężeniu 6,25 ng/ml, procent IL-2 wynosi więc 112 i 21% odpowiednio dla EMAB6 i Rituxan. W 50ng/ml, różnica jest jeszcze znaczna, procent IL-2 wynosi odpowiednio 112 i 65%. Przy wyższych stężeniach, różnica ta maleje, ponieważ przy 2500 ng/ml, odpowiedni procent IL-2 pomiędzy EMAB6 i Rituxan wynosi 124 i 100%. Stosunek EC50 Rituxan /EC50 EMAB6 w tym teście jest szacowany na 15 (oszacowanie graficzne ng/ml EC50 przy założeniu, że Rituxan i EMAB6 osiągają ten sam E Max). [0107] Wyniki te potwierdzają wyniki ADCC, zarówno zależne od CD16. Wskazują, że po sprzężeniu CD16 (FcγRIIIA) przez część Fc przeciwciała EMAB6 następuje silna aktywacja komórkowa, prowadząca do indukcji funkcji efektorowych. Aktywacja CD16 (FcγRIIIA) indukowana przez chimeryczne przeciwciało EMAB603 w obecności komórek Raji jest porównywalna z indukowaną przez przeciwciała EMAB6. [0108] W przypadku limfocytów od pacjentów z B-CLL, wyniki przedstawione na Fig. 10, pokazują, że w obecności przeciwciała anty-cd20 Rituxan i EMAB6, komórki Jurkat-CD16 wydzielają IL-2, wykazując aktywację komórkową przez wiązanie z częścią Fc przeciwciała przez CD16. Jednak przeciwciało EMAB6 wykazuje znacznie silniejszą aktywność indukowania niż przeciwciało Rituxan. Rzeczywiście, aktywność indukcji wydzielania IL-2 Rituxan jest zbliżona do wartości wyjściowych dla stężeń 2,5 i 25 ng/ml, podczas gdy aktywność przeciwciała EMAB6 jest znacząca. Przy stężeniu wynoszącym 25ng/nl, procent IL-2 wynosi więc 132 i 34% odpowiednio dla EMAB6 i Rituxan. Przy najwyższym stężeniu

24 (2500 ng/ml), procent IL-2 wynosi odpowiednio 148 i 100%. Stosunek EC50 Rituxan /EC50 EMAB6 w tym teście jest większy niż 100: jest oszacowany na 300 (oszacowanie graficzne ng/ml EC50 przy założeniu, że Rituxan i EMAB6 osiągają ten sam E Max). Podsumowując, wszystkie testy na komórkach Raji pokazują, że EMAB6 i EMAB603, w odróżnieniu od Rituxan są wysoce cytotoksyczne i indukują aktywację komórek eksprymujących CD16 (Fc-γRIIIA) i to zwłaszcza w niskich stężeniach przeciwciała. Jednak, w tych samych warunkach, aktywność cytotoksyczna zależna od dopełniacza EMAB6 zmniejsza się o około 50% w porównaniu z Rituxan. [0109] Wyniki te są potwierdzane przez badania z komórek izolowanych od pacjentów z B- CLL, które wskazują, że przeciwciało EMAB6 jest znacznie bardziej cytotoksyczne niż Rituxan w stosunku do limfocytów B pochodzących od pacjentów z B-CLL. Różnice między tymi dwoma przeciwciałami są bardziej znaczące w przypadku komórek od pacjentów z B-CLL niż z komórek Raji, co wskazuje na duże zainteresowanie terapeutyczne EMAB6 w porównaniu z Rituxan, w przypadku tej patologii. [0110] Ta najważniejsza różnica może zwłaszcza być spowodowana niższą ekspresją antygenową CD20 na limfocyty B od pacjentów z B-CLL w porównaniu z komórkami Raji. Przez analogię z komórkami Raji, można zasugerować, że aktywność cytotoksyczna zależna od dopełniacza przeciwciał EMAB6 wobec limfocytów B pochodzących od pacjentów z CLL, powinna być mniejsza niż wywołana przez Rituxan, i mieć zatem tę zaletę, że jest mniej toksyczna in vivo, z powodu niekorzystnych efektów związanych z silną aktywacją klasycznego szlaku dopełniacza. Przykład 4: Analiza glikanów EMAB6 i EMAB603 przez HPCE-LIF [0111] Strukturę N-glikanów ciężkiego łańcucha przeciwciał EMAB6 i EMAB603 poddano analizie HPCELIF. Strukturę N-glikanów ciężkiego łańcucha Rituxan również poddano analizie dla porównania. W tym celu przeciwciała monoklonalne anty-cd20 odsolono w kolumnie Sephadex G-25 (HiTrap Desalting, Amersham Biosciences), wysuszono przez odparowanie i zawieszono w buforze hydrolizy PNGase F (Glyko) w obecności 50 mm β-merkaptoetanolu. Po 16 godzinach inkubacji w 37 C, frakcję białkową wytrącono przez dodanie absolutnego etanolu i supernatantu, zawierającą N-glikany, wysuszono przez odparowanie. Powstałe oligosacharydy bezpośrednio wyznakowano fluorochromem: APTS (1-amino-pireno-3,6,8- trisulfonian) poddano działaniu swoistej eksoglikozydazy przed wyznakowaniem APTS. W ten sposób oznakowane oligosacharydy wstrzykiwano na kapilarę N-CHO, oddzielono i oznaczono ilościowo za pomocą elektroforezy kapilarnej z detekcją fluorescencyjną indukowaną laserowo (HPCE-LIF). Ocenę poziomu fukozy wykonano przez dodanie wyizolowanych fukozylowanych form, lub bardziej konkretnie po jednoczesnym działaniu neuraminidazy, β-galaktozydazy i N- acetyloheksozoaminidazy, co umożliwiło otrzymanie na elektroferogramie 2 pików odpowiadających pentasacharydowi [GlcNac2-Man3], fukozylowanemu lub nie:

25 Tabela 1: analiza N-glikanów przeciwciał anty-cd20 EMAB603 i Rituxan Anty-CD20 % Fucozy % Galaktozy Fuk/Gal EMAB ,4 Rituxan ,63 [0112] Poziom fukozy, wyrażony w %, obliczano stosując następujący wzór: Poziom galaktozy, wyrażony w %, został obliczony poprzez dodanie procenta form oligosacharydowych zawierających galaktozę uzyskaną po działaniu neuraminidazy i fukozydazy. Wzór jest następujący: Stosunek poziomu fukozy/poziomu galaktozy otrzymuje się przez podzielenie poziomu fukozy przez poziom galaktozy, obliczonej w sposób opisany powyżej. [0113] Na podstawie tej analizy (por. Tabela 1), wydaje się, że przeciwciała EMAB6 i EMAB603 są słabo fukozylowane (% fukozy poniżej 25) w stosunku do Rituxan (% fukozy =, 93). Ponadto, stosunek Fuk/Gal (stosunek poziomu Fukozy/poziomu Galaktozy) EMAB6 i EMAB603 jest niski (stosunek Fuk/Gal poniżej 0,6) w odróżnieniu od przeciwciał eksprymowanych w CHO jak Rituxan (stosunek Fuk/Gal = 1,63). LISTA SEKWENCJI [0114] <110> Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies (LFB) <120> Monoklonalne przeciwciało skierowane przeciwko CD20 <130> Anty-CD20 <160> 29 <170> PatentIn wersja 3.1 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna

26 <220> <223> Primer <400> 1 actgccatca atcttccact tgac 24 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220> <223> Primer <400> 2 ctgagggtgt agaggtcaga ctg 23 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220> <223> Primer <400> 3 ttgttcaaga agcacacgac tgaggcac 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220> <223> Primer <400> 4 gagttccagg tcaaggtcac tggctcag 28 <210> 5 <211> 321 <212> DNA

27 <213> Mus musculus <400> 5 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 <210> 7 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 <210> 8

28 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 <210> 9 <211> 47 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220> <223> Primer <400> 9 ctcagtacta gtgccgccac catggatttt caagtgcaga ttttcag 47 <210> 10 <211> 46 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

29 <223> Primer <400> 10 tgaagacact tggtgcagcc acagtccggt ttatttccag cctggt 46 <210> 11 <211> 5289 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220> <223> Wector <400> 11

30 - 29 -

31 <210> 12 <211> 6275 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220> <223> Wector <400> 12

32 - 31 -

33 - 32 -

34 <210> 13 <211> 639

35 <212> DNA <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> Konstrukt Syntetyczny <400> 13 <210> 14 <211> 213 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> Konstrukt Syntetyczny <400> 14

36 <210> 15 <211> 45 <212> DNA <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> Primer <400> 15 ctcagtacta gtgccgccac catgggattc agcaggatct ttctc 45 <210> 16 <211> 48 <212> DNA <213> Sztuczna Sekwencja

37 <220> <223> Primer <400> 16 gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gacggtgact gaggttcc 48 <210> 17 <211> 5739 <212> DNA <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> Wektor <400> 17

38 - 37 -

39 - 38 -

40 <210> 18 <211> 6824 <212> DNA <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> Wektor <400> 18

41 - 40 -

42 - 41 -

43 <210> 19 <211> 1344 <212> DNA <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> Konstrukt Syntetyczny <400> 19

44 <210> 20 <211> 448 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> Konstrukt Syntetyczny <400> 20

45 - 44 -

46 <210> 21 <211> 318 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 <210> 22 <211> 106 <212> PRT

47 <213> Homo sapiens <400> 22 <210> 23 <211> 990 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23

48 <210> 24 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24

49 <210> 25 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 25 <210> 26 <211> 107

50 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 <210> 27 <211> 645 <212> DNA <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> Konstrukt Syntetyczny <400> 27 <210> 28

51 <211> 213 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> Konstrukt Syntetyczny <400> 28 <210> 29 <211> 46

52 <212> DNA <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> Primer <400> 29 tgaagacact tggtgcagcc acagtccgtt ttatttccag cctggt 46 Magdalena Pietrosiuk Rzecznik patentowy

53 Zastrzeżenia patentowe 1. Przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko antygenowi CD20, znamienne tym, że każdy z jego łańcuchów lekkich jest kodowany przez mysio-ludzką chimeryczną sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 27 i tym, że każdy z jego ciężkich łańcuchów jest kodowany przez mysio-ludzką chimeryczną sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że sekwencja peptydu wyprowadzona z sekwencji SEQ ID NO: 27 jest sekwencją SEQ ID NO: 28 i tym, że sekwencja peptydu wyprowadzona z sekwencji SEQ ID NO: 19 jest sekwencją SEQ ID NO: Przeciwciało według któregokolwiek z poprzednich zastrz., znamienne tym, że jest wytwarzane przez linię komórkową hybrydomy szczura. 4. Przeciwciało według zastrz. 3, znamienne tym, że jest wytwarzane z hybrydomy szczura YB2/0, która jest komórką YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20, zdeponowaną w American Type Culture Collection pod numerem ATCC CRL Przeciwciało według któregokolwiek z poprzednich zastrz., znamienne tym, że jest to przeciwciało EMAB603 wytwarzane przez klon R603 zdeponowany pod numerem akcesyjnym CNCM I-3529 w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM). 6. Stabilna linia komórkowa eksprymująca przeciwciała według dowolnego z poprzednich zastrz.. 7. Stabilna linia komórkowa według zastrz. 6, wybrana z grupy składającej się z: SP2/0, YB2/0, IR983F, szpiczaka ludzkiego Namalwa, PERC6, linii CHO, zwłaszcza CHO- K-1, CHO-Lec10, CHO-Lecl, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NS0, SP2/0-Ag 14 i P3X63Ag Klon R603 zdeponowany pod numerem akcesyjnym CNCM I-3529 w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM). 9. Zastosowanie przeciwciała według któregokolwiek z zastrz. 1 do 5, do aktywowania in vitro receptorów FcγRIII odpornościowych komórek efektorowych. 10. Przeciwciało według któregokolwiek z zastrz. 1 do 5 do zastosowania jako lek. 11. Zastosowanie przeciwciała według któregokolwiek z zastrz. 1 do 5, do wytwarzania leku do leczenia białaczki lub chłoniaka. 12. Zastosowanie przeciwciała według któregokolwiek z zastrz. 1 do 5, do wytwarzania leku do leczenia patologii wybranych spośród ostrych białaczek limfoblastycznych B, chłoniaków limfoblastycznych B-komórkowych, chłoniaków dojrzałych komórek B, w tym przewlekłej białaczki limfatycznej typu B (B-CLL), chłoniaka limfocytowego małych limfocytów B, białaczki prolimfocytowej B, chłoniaka limfoplazmocytowego,

54 chłoniaka z komórek płaszcza, chłoniaka grudkowego, chłoniaka strefy brzeżnej typu MALT, węzłowego chłoniaka strefy brzeżnej z lub bez komórek monocytoidowych B, chłoniaka śledziony strefy brzeżnej (z lub bez limfocytów kosmków), białaczki tricholeukocytowej, rozlanego chłoniaka dużych komórek B, chłoniaka Burkitta, jak również wszelkich patologii zaburzeń immunologicznych z udziałem komórek linii limfoidalnej B w tym chorób autoimmunologicznych. 13. Zastosowanie przeciwciała według któregokolwiek z zastrz. 1 do 5, do wytwarzania leku do leczenia białaczki limfocytowej. 14. Zastosowanie przeciwciała według któregokolwiek z zastrz. 1 do 5 do wytwarzania leku do leczenia przewlekłej białaczki limfocytowej typu B (B-CLL). 15. Zastosowanie przeciwciała według któregokolwiek z zastrz. 1 do 5, do wytwarzania leku do leczenia przewlekłej choroby przeszczepowej przeciw gospodarzowi. 16. Zastosowanie przeciwciała według któregokolwiek z zastrz. 1 do 5, do wytwarzania leku do leczenia odrzucenia przeszczepionych narządów, zwłaszcza nerki. 17. Zastosowanie przeciwciała według któregokolwiek z zastrz. 1 do 5 w kombinacji z jednym lub większą liczbą przeciwciał skierowanych przeciwko jednemu lub większej liczbie antygenów eksprymowanych na komórkach limfoidalnych, do wytwarzania leku do leczenia białaczki lub chłoniaka. 18. Zastosowanie przeciwciała według zastrz. 17, znamienne tym, że antygen eksprymowany na komórkach limfoidalnych jest wybrany spośród HLA-DR, CD19, CD23, CD80, CD22, CD32 i CD Zastosowanie przeciwciała według któregokolwiek z zastrz. 1 do 5, w połączeniu z komórkami eksprymującymi FcγR, takimi jak komórki NK (Natural Killer), komórki NKT (Natural Killers T), limfocyty Tγδ, makrofagi, monocyty lub komórki dendrytyczne, do wytwarzania leku do leczenia białaczki lub chłoniaka. Magdalena Pietrosiuk Rzecznik patentowy

55 - 54 -

56 - 55 -

57 - 56 -

58 - 57 -

59 - 58 -

60 - 59 -

61 - 60 -

62 - 61 -

63 - 62 -