(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2012/26 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C12N 15/09 ( ) A61K 35/76 ( ) A61K 38/00 ( ) A61K 48/00 ( ) A61P 13/08 ( ) A61P 13/10 ( ) A61P 35/00 ( ) A61P 35/02 ( ) C07K 7/06 ( ) C12Q 1/02 ( ) C07K 14/47 ( ) G01N 33/574 ( ) G01N 33/50 ( ) (54) Tytuł wynalazku: OGRANICZONY DO HLA-A*3303 PEPTYD WT1 I ZAWIERAJĄCA GO KOMPOZYCJA FARMACEUTYCZNA (30) Pierwszeństwo: JP (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/45 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2012/11 (73) Uprawniony z patentu: International Institute of Cancer Immunology, Inc., Suita, JP (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 HARUO SUGIYAMA, Minoo, JP (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Urszula Bartnik POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 2 Opis Dziedzina techniki [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy peptydu ograniczonego do HLA-A*3303, konkretniej peptydu zawierającego sekwencję aminokwasową złożoną z 9 ciągłych aminokwasów z białka WT1, przy czym aminokwas w pozycji 2 tej sekwencji aminokwasowej dobiera się z grupy składającej się z Ala, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr, Ser i Asp, a aminokwasem w pozycji 9 jest Arg. Ponadto niniejszy wynalazek dotyczy polinukleotydu kodującego peptyd i kompozycji farmaceutycznej zawierającej ten peptyd do leczenia lub profilaktyki nowotworu. Stan techniki [0002] Gen WT1 (gen guza 1 Wilmsa) zidentyfikowano jako gen odpowiedzialny za guz Wilmsa, który jest rakiem nerki u dzieci (dokumenty niepatentowe 1 i 2). WT1 jest czynnikiem transkrypcyjnym o strukturze palców cynkowych. Z początku gen WT1 uważano za gen supresorowy nowotworów. Późniejsze badania (dokumenty niepatentowe 3, 4, 5 i 6) wykazały jednak, że gen WT1 działa raczej jako onkogen w guzach z układu krwiotwórczego i guzach litych. [0003] Gen WT1 ulega ekspresji na wysokim poziomie w wielu typach nowotworów złośliwych. Badano, czy produkt genu WT1 wolny od mutacji, który jest białkiem autologicznym, jest immunogenny w żywym organizmie. Wyniki wykazały, że białko pochodzące z genu WT1, które ulega ekspresji na wysokim poziomie w komórkach nowotworowych, jest pofragmentowane poprzez obróbkę wewnątrzkomórkową, powstałe wskutek tego peptydy tworzą kompleksy z cząsteczkami MHC klasy I, a kompleksy te są prezentowane na powierzchni komórek, i że rozpoznwanie takich kompleksów przez CTL (cytotoksyczne limfocyty T) można indukować poprzez szczepienie peptydem (dokumenty niepatentowe 7, 8 i 9). Wykazano także, że u myszy immunizowanej peptydem WT1 lub cdna WT1

3 3 przeszczepione komórki nowotworowe wykazujące ekspresję genu WT1 są z dużym prawdopodobieństwem odrzucane (dokumenty niepatentowe 7 i 10), natomiast tkanki prawidłowe z fizjologiczną ekspresją genu WT1 nie są uszkadzane przez indukowaną CTL (dokument niepatentowy 7). W doświadczeniach in vitro z zastosowaniem komórek ludzkich wykazano, ze gdy peptyd Db126 lub peptyd WH187 (aminokwasy SEQ ID nr 1, SLGEQQYSV) o dużej zdolności do wiązania się z cząsteczką HLA-A*0201, która jest jedną z ludzkich cząsteczek MHC klasy I, stosuje się do stymulowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej zawierających HLA-A*0201, CTL swoiste względem WT1 ulegają indukcji, indukowane CTL wykazują aktywność cytotoksyczną swoistą wobec komórek nowotworowych z endogenną ekspresją genu WT1 na wysokim poziomie, a aktywność cytotoksyczna takich CTL jest ograniczona do HLA- A2 (dokument niepatentowy 11). W doświadczeniach in vitro w komórkach ludzkich z użyciem peptydu WT1, który pasuje do HLA-A*2402 (który jest stwierdzonym jako najczęstszy spośród alleli HLA-A występujących w populacji Japonii), (WT1 235 ; aminokwasy SEQ ID nr 1, CMTWN-QMNL) wykazano, że CTL swoiste względem WT1 (TAK-1) ulegają indukcji (dokument niepatentowy 12), a indukowane CTL nie hamują aktywności tworzenia kolonii przez prawidłowe krwiotwórcze komórki macierzyste, z fizjologiczną ekspresją genu WT1 (dokumenty niepatentowe 13 i 14). Doniesienia te wyraźnie sugerują, że nie tylko u myszy, lecz także u człowieka można indukować CTL swoiste względem WT1, takie CTL wykazują aktywność cytotoksyczną przeciwko komórkom nowotworowym z ekspresją genu WT1 na wysokim poziomie, lecz nie posiadają aktywności cytotoksycznej przeciwko komórkom prawidłowym z fizjologiczną ekspresję genu WT1 (dokumenty niepatentowe 7, 10, 11, 12, 13 i 14).

4 4 [0004] Produkt genu WT1 jest obecny jako białko jądrowe i ulega obróbce przez proteasomy w cytoplazmie, będąc pofragmentowanym na peptydy. Pofragmentowane peptydy są transportowane do światła siateczki endoplazmatycznej przez cząsteczki TAP (transporter związany z obróbką antygen), tworzą kompleksy z cząsteczkami MHC klasy I i są prezentowane na powierzchni komórek. CTL swoiste względem WT1 są indukowane w wyniku rozpoznawania kompleksów peptyd WT1-cząsteczka MHC klasy I przez komórki prekursorowe CTL poprzez TCR, wywierając przez to cytotoksyczne działanie na komórki nowotworowe prezentujące produkt genu WT1 poprzez cząsteczki MHC klasy I (dokumenty niepatentowe 7, 8 i 9). Następnie, niezbędne jest, aby co najmniej peptyd WT1 stosowany w immunoterapii nowotworów z ukierunkowaniem na produkt genu WT1 był obecny w postaci wiążącej się z cząsteczką MHC klasy I w żywym organizmie. Cząsteczki MHC klasy I są jednak rozmaite i sekwencje aminokwasowe peptydów WT1 wiążących się z odpowiednimi cząsteczkami MHC klasy I różnią się od siebie. Niezbędne jest zatem zapewnienie peptydu pasującego do każdego podtypu MHC klasy I. Jako ograniczone do cząsteczek HLA peptydy WT1 znane są jednak dotychczas tylko peptydy ograniczone do cząsteczek HLA-A*2402, HLA-A*0201 i HLA-A*2601 (odpowiednio, dokument patentowy 1, dokument niepatentowy 11 i dokument patentowy 2). HLA-A*3303 jest drugi co do częstości występowania u Japończyków po HLA-A*2402. Istnieje zatem potrzeba znalezienia peptydu WT1 ograniczonego do HLA-A*3303. Dokument patentowy 1: WO 2003/ dokument patentowy 2: WO 2005/095598; dokument niepatentowy 1: Daniel A. Haber i wsp., Cell Jun 29; 61(7): Dokument niepatentowy 2: Call KM i wsp., Cell Feb 9; 60(3): Dokument niepatentowy 3: Menke AL i wsp., Int Rev Cytol. 1998; 181: Przegląd. Dokument

5 5 niepatentowy 4: Yamagami T i wsp., Blood Apr 1; 87(7): Dokument niepatentowy 5: Inoue K i wsp., Blood Apr 15; 91(8): Dokument niepatentowy 6: Tsuboi A i wsp., Leuk Res May; 23(5): Dokument niepatentowy 7: Oka Y i wsp., J Immunol Feb 15; 164(4): Dokument niepatentowy 8: Melief CJ i wsp., Immunol Rev Jun; 145: Dokument niepatentowy 9: Ritz J, J Clin Oncol Feb; 12(2): Dokument niepatentowy 10: Tsuboi A i wsp., J Clin Immunol May; 20(3): Dokument niepatentowy 11: Oka Y i wsp., Immunogenetics Feb; 51(2): Dokument niepatentowy 12: Ohminami H i wsp., Blood Jan 1; 95(1): Dokument niepatentowy 13: Gao L i wsp., Blood Apr 1; 95(7): Dokument niepatentowy 14: Ohminami H i wsp., Blood Jan 1; 95(1): Opis wynalazku Problemy, które ma rozwiązać wynalazek [0005] Problemami, które ma rozwiązać niniejszy wynalazek, jest zapewnienie peptydu WT1 ograniczonego do HLA-A*3303 i kodującego go polinukleotydu, jak również zawierającej go kompozycji farmaceutycznej do leczenia/profilaktyki nowotworu. Sposoby rozwiązania problemów [0006] W wyniku intensywnych badań, po uwzględnieniu opisanej powyżej sytuacji, autor niniejszego wynalazku stwierdził, że peptyd zawierający sekwencję aminokwasową złożoną z 9 ciągłych aminokwasów z białka WT1, przy czym aminokwas w pozycji 2 sekwencji aminokwasowej dobiera się z grupy składającej się z Ala, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr, Ser i Asp, a aminokwasem w pozycji 9 sekwencji aminokwasowej jest Arg, może w dużym odsetku indukować CTL swoiste względem WT1. Ukończono zatem niniejszy wynalazek.

6 6 [0007] Niniejszy wynalazek zapewnia: (1) peptyd złożony z sekwencji aminokwasowej Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4); (2) kompozycję farmaceutyczną do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce nowotworu u osobnika HLA-A*3303- dodatniego, zawierającą peptyd złożony z sekwencji aminokwasowej Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4); (3) zastosowanie peptydu złożonego z sekwencji aminokwasowej Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4), do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki nowotworu u osobnika HLA-A*3303-dodatniego; (4) polinukleotyd kodujący peptyd według (1); (5) wektor ekspresyjny zawierający polinukleotyd według (4); (6) kompozycję farmaceutyczną do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce nowotworu u osobnika HLA-A*3303- dodatniego, zawierającą polinukleotyd kodujący peptyd złożony z sekwencji aminokwasowej Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4) lub wektor zawierający ten polinukleotyd; (7) zastosowanie polinukleotydu kodującego peptyd złożony z sekwencji aminokwasowej Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4) lub wektor zawierający ten polinukleotyd do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki nowotworu u osobnika HLA-A*3303-dodatniego; (8) CTL swoistą względem WT1, która jest indukowalna przez peptyd złożony z sekwencji aminokwasowej Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4); (9) sposób indukowania CTL swoistej względem WT1, obejmujący hodowanie komórki jednojądrzastej krwi obwodowej w obecności peptydu złożonego z sekwencji aminokwasowej Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4) celem

7 7 indukowania CTL swoistej względem WT1 z komórki jednojądrzastej krwi obwodowej; (10) zestaw do indukowania CTL swoistej względem WT1 lub do indukowania komórki prezentującej antygen, prezentującej peptyd WT1, przy czym ten zestaw zawiera jako zasadniczy składnik peptyd złożony z sekwencji aminokwasowej Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4); (11) komórkę prezentującą antygen, prezentującą peptyd WT1, która jest indukowalna przez peptyd złożony z sekwencji aminokwasowej Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4); (12) sposób indukowania komórki prezentującej antygen, prezentującej peptyd WT1, obejmujący hodowanie niedojrzałej komórki prezentującej antygen w obecności peptydu złożonego z sekwencji aminokwasowej Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4) celem indukowania komórki prezentującej antygen, prezentującej peptyd WT1 z niedojrzałej komórki prezentującej antygen; (13) sposób rozpoznawania nowotworu, obejmujący zastosowanie CTL według (8) lub komórki prezentującej antygen według (11); (14) sposób określania obecności lub ilości CTL swoistej względem WT1 u osobnika HLA-A*3303-dodatniego, obejmujący: (a) poddanie reakcji kompleksu peptydu WT1 zawierającego sekwencję aminokwasową Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4) i cząsteczki HLA-A*3303 z próbką od pacjenta; (b) i określenie obecności lub ilości CTL rozpoznającej kompleks zawarty w próbce; (15) sposób według (14), przy czym kompleks jest obecny w postaci tetrameru. Efekty wynalazku [0008] Przedmiotem niniejszego wynalazku jest peptyd WT1 ograniczony do HLA-A*3303 i kodujący go polinukleotyd, jak

8 8 również zawierająca go kompozycja farmaceutyczna do leczenia lub profilaktyki nowotworu. Możliwe jest zatem indukowanie in vivo i in vitro CTL swoistych względem WT1 u osobników posiadających HLA-A*3303. Ponieważ około 24% populacji japońskiej posiada co najmniej jedną cząsteczkę HLA-A*3303, CTL swoiste względem WT1 można indukować u bardzo wielu osobników. Krótki opis rysunków [0009] Fig. 1 przedstawia aktywność cytotoksyczną CTL indukowanej WT Fig. 2 przedstawia aktywność cytotoksyczną CTL indukowanej WT Fig. 3 przedstawia aktywność cytotoksyczną CTL indukowanej WT Fig. 4 przedstawia aktywność cytotoksyczną CTL indukowanej WT Fig. 5 przedstawia aktywność cytotoksyczną CTL indukowanej WT1 364 przeciwko komórce wykazującej endogenną ekspresję genu WT1. Fig. 6 przedstawia aktywność cytotoksyczną CTL indukowanej WT1 367 przeciwko komórce wykazującej endogenną ekspresję genu WT1. Fig. 7 przedstawia aktywność cytotoksyczną CTL indukowanej WT1 409 przeciwko komórce wykazującej endogenną ekspresję genu WT1. Fig. 8 przedstawia aktywność cytotoksyczną CTL indukowanej WT1 367 przeciwko komórce wykazującej ekspresję genu WT1. Najlepszy sposób wykonania wynalazku [0010] Sekwencję aminokwasową ludzkiego białka WT1 przedstawiono na SEQ ID nr 1. Gen WT1 ulega ekspresji w swej postaci natywnej na wysokim poziomie na przykład w nowotworach układu krwiotwórczego, takich jak białaczka, zespół mielodysplastyczny, szpiczak mnogi lub chłoniak złośliwy oraz w guzach litych, takich jak nowotwór żołądka, nowotwór okrężnicy, nowotwór płuca, nowotwór sutka,

9 9 nowotwór zarodkowy, nowotwór wątroby, nowotwór skóry, nowotwór pęcherza moczowego, nowotwór prostaty, nowotwór macicy, nowotwór szyjki macicy lub nowotwór jajnika. Ponadto, motyw kotwiczący HLA-A*3303 cechuje się tym, że aminokwasem w pozycji 2 jest dowolny spośród Ala, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr, Ser i Asp, a aminokwasem w pozycji 9 jest Arg. W jednym z aspektów przedmiotem niniejszego wynalazku jest zatem peptyd WT1 ograniczony do HLA-A*3303, zawierający sekwencję aminokwasową złożoną z 9 ciągłych aminokwasów z białka WT1, przy czym aminokwas w pozycji 2 sekwencji aminokwasowej korzystnie dobiera się z grupy obejmującej Ala, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr, Ser i Asp, a aminokwasem w pozycji 9 sekwencji aminokwasowej jest korzystnie Arg (peptyd ten w dalszym ciągu niniejszego opisu jest określany jako peptyd WT1). [0011] Peptyd według niniejszego wynalazku, złożony z sekwencji aminokwasowej Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4), zachowuje zdolność do wiązania się z cząsteczką HLA-A*3303. [0012] Jak opisano powyżej, celem niniejszego wynalazku jest uzyskanie peptydu WT1 ograniczonego do HLA-A*3303. Peptyd według niniejszego wynalazku składa się zatem z sekwencji aminokwasowej ukazanej w dowolnej z SEQ ID nr 4. Do końca N i(lub) do końca C peptydu według niniejszego wynalazku mogą być przyłączone różne substancje, na przykład aminokwas, peptyd lub jego analog. Jeżeli te substancje są przyłączone do peptydu według niniejszego wynalazku, mogą ulegać obróbce, na przykład przez enzym w żywym organizmie lub poprzez proces taki, jak obróbka wewnątrzkomórkowa, i wreszcie peptyd według niniejszego wynalazku może być wytwarzany i prezentowany jako kompleks z cząsteczką HLA-A*3303 na powierzchni komórki, zapewniając efekt indukcji CTL. Mogą to być substancje modulujące

10 10 rozpuszczalność peptydów według niniejszego wynalazku lub zwiększające ich stabilność (oporność na proteazę). Zamiast tego mogą to być substancje dostarczające peptydy według niniejszego wynalazku konkretnie, na przykład, do danej tkanki lub narządu, lub mogą one działać przez zwiększenie skuteczności wychwytu przez komórkę prezentującą antygen. Mogą to być substancje zwiększające zdolność do indukowania CTL, takie jak peptydy pomocnicze. [0013] Peptyd według niniejszego wynalazku można syntetyzować sposobami ogólnie znanymi w stanie techniki lub ich modyfikacjami. Takie metody opisano na przykład w Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, t. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide-Gosei, Maruzen Co., Ltd., 1975; Peptide-Gosei No Kiso To Jikken, Maruzen Co., Ltd., 1985; i Iyakuhin No Kaihatsu (Zoku), t. 14, Peptide-Gosei, Hirokawa - Book store, [0014] Peptyd według niniejszego wynalazku można również wytwarzać technikami inżynierii genetycznej na podstawie informacji o sekwencji nukleotydu, który koduje peptyd według niniejszego wynalazku. Takie techniki inżynierii genetycznej są dobrze znane specjaliście. [0015] W innym aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do leczenia lub profilaktyki nowotworu, zawierająca peptyd WT1 ograniczony do HLA- A*3303. Gen WT1 ulega ekspresji na wysokim poziomie w nowotworach z układu krwiotwórczego, takich jak białaczka, zespół mielodysplastyczny, szpiczak mnogi lub chłoniak złośliwy, i w guzach litych, takich jak nowotwór żołądka, nowotwór okrężnicy, nowotwór płuca, nowotwór sutka, nowotwór zarodkowy, nowotwór wątroby, nowotwór skóry, nowotwór pęcherza moczowego, nowotwór prostaty, nowotwór macicy, nowotwór szyjki macicy lub nowotwór jajnika.

11 11 Kompozycję farmaceutyczną według niniejszego wynalazku można zatem stosować do leczenia lub profilaktyki nowotworu. Gdy kompozycję farmaceutyczną według niniejszego wynalazku podaje się osobnikowi HLA-A*3303-dodatniemu, CTL swoiste względem WT1 ulegają indukcji przez peptyd WT1 ograniczony do HLA-A*3303, który znajduje się w kompozycji farmaceutycznej, i komórki nowotworowe u osobnika są uszkadzane przez takie CTL. [0016] Kompozycja farmaceutyczna według niniejszego wynalazku może zawierać, oprócz peptydu WT1 ograniczonego do HLA-A*3303 jako składnika czynnego, na przykład nośnik lub zaróbkę. Peptyd WT1 ograniczony do HLA-A*3303, wchodzący w skład kompozycji farmaceutycznej według niniejszego wynalazku, indukuje CTL swoiste względem WT1. Kompozycja farmaceutyczna według niniejszego wynalazku może zatem zawierać odpowiedni adiuwant lub można ją podawać wraz z odpowiednim adiuwantem w celu zwiększenia skuteczności indukcji. Do przykładów korzystnych adiuwantów należy kompletny lub niekompletny Freunda i wodorotlenek glinu. [0017] Sposób podawania kompozycji farmaceutycznej według niniejszego wynalazku można odpowiednio dobierać w zależności od warunków takich, jak typ choroby, stan osobnika lub miejsce docelowe. Przykłady takich metod obejmują podawanie śródskórne, podawanie podskórne, podawanie domięśniowe, podawanie dożylne, podawanie donosowe i podawanie doustne. Ilość peptydu znajdującego się w kompozycji farmaceutycznej według niniejszego wynalazku, jak również postać dawkową, liczbę podań kompozycji farmaceutycznej według niniejszego wynalazku, można dobierać odpowiednio, w zależności od takich warunków, jak typ choroby, stan osobnika lub miejsce

12 12 docelowe. Pojedyncza dawka peptydu wynosi zazwyczaj 0,0001 mg-1000 mg, korzystnie, 0,001 mg mg. [0018] W innym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób leczenia lub profilaktyki nowotworu, obejmujący podawanie skutecznej ilości kompozycji farmaceutycznej osobnikowi HLA-A*3303-dodatniemu. Nowotwór, który ma być leczony lub któremu ma się zapobiegać, może być dowolnym nowotworem; przykłady nowotworów obejmują nowotwory układu krwiotwórczego, takie jak białaczka, zespół mielodysplastyczny, szpiczak mnogi lub chłoniak złośliwy guzy lite, takie jak nowotwór żołądka, nowotwór okrężnicy, nowotwór płuca, nowotwór sutka, nowotwór zarodkowy, nowotwór wątroby, nowotwór skóry, nowotwór pęcherza moczowego, nowotwór prostaty, nowotwór macicy, nowotwór szyjki macicy lub nowotwór jajnika. [0019] W innym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie peptydu WT1 ograniczonego do HLA-A*3303 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej. [0020] W kolejnym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób określania obecności lub ilości CTL swoistej względem WT1 u osobnika HLA-A*3303-dodatniego, obejmujący: (a) poddanie reakcji kompleksu peptydu WT1 i cząsteczki HLA-A*3303 z próbką od osobnika; (b) i określenie obecności lub ilości CTL rozpoznającej kompleks zawarty w próbce. Próbką od osobnika może być dowolna próbka, pod warunkiem, że istnieje możliwość, że zawiera ona limfocyt. Do przykładów próbek należą płyny ustrojowe, takie jak krew lub chłonka, i tkanka. Kompleks peptydu WT1 i cząsteczki HLA-A*3303 można wytwarzać na przykład w postaci tetrameru lub pentameru sposobem znanym specjaliście, takim jak metoda biotynowo-streptawidynowa. Obecność lub ilość CTL rozpoznającej taki kompleks można

13 13 mierzyć sposobem znanym specjaliście. W tym aspekcie niniejszego wynalazku kompleks może być wyznakowany. Jako znacznik można stosować znany znacznik, taki jak znacznik fluorescencyjny lub znacznik radioaktywny. Znakowanie umożliwia łatwe i szybkie określanie obecności lub ilości CTL. Sposób według tego aspektu niniejszego wynalazku można wykorzystywać do rozpoznawania nowotworu lub określania rokowania w nowotworze. [0021] Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zatem także kompozycja do określania obecności lub ilości CTL swoistej względem WT1 u osobnika HLA-A*3303-dodatniego, obejmującego kompleks peptydu WT1 i cząsteczki HLA-A*3303. [0022] Ponadto przedmiotem niniejszego wynalazku jest zestaw do określania obecności lub ilości CTL swoistej względem WT1 u osobnika HLA-A*3303-dodatniego, zawierający kompleks peptydu WT1 i cząsteczki HLA-A*3303. [0023] W kolejnym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania CTL swoistej względem WT1 z zastosowaniem kompleksu peptydu WT1 i cząsteczka HLA- A*3303, obejmujący: (a) poddanie kompleksu reakcji z próbką; (b) uzyskanie CTL rozpoznającej kompleks zawarty w próbce. Kompleks peptydu WT1 i cząsteczki HLA-A*3303 opisano powyżej. Próbka może być dowolną próbką, pod warunkiem, że istnieje możliwość, że zawiera limfocyt. Przykłady próbek obejmują próbkę od osobnika, taką jak krew, i hodowlę komórkową. CTL rozpoznającą kompleks można uzyskać metodą znanym specjaliście, taką jak FACS lub MACS. Niniejszy wynalazek umożliwia hodowanie uzyskanego CTL swoistej względem WT1 i zastosowanie go do leczenia lub profilaktyki różnych nowotworów. [0024] Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zatem także CTL swoista względem WT1, którą można uzyskać sposobem

14 14 wytwarzania CTL swoistej względem WT1 z wykorzystaniem kompleksu peptydu WT1 i cząsteczki HLA-A*3303. [0025] Ponadto przedmiotem niniejszego wynalazku jest zestaw do wytwarzania CTL swoistej względem WT1, zawierający kompleks peptydu WT1 i cząsteczki HLA-A*3303. [0026] W innym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest polinukleotyd kodujący peptyd WT1 ograniczony do HLA- A*3303 (określany w dalszej części niniejszego opisu jako polinukleotyd WT1). Polinukleotyd według niniejszego wynalazku może być polinukleotydem DNA lub RNA. Sekwencję zasad polinukleotydu według niniejszego wynalazku można określać na podstawie sekwencji aminokwasowej peptydu WT1 ograniczonego do HLA-A*3303. Polinukleotyd można wytwarzać na przykład metodą syntezy DNA lub RNA, metodą PCR lub tym podobną. [0027] W innym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest wektor ekspresyjny, zawierający polinukleotyd (określany w dalszej części niniejszego opisu jako wektor ekspresyjny WT1). Typ wektora ekspresyjnego, znajdującą się w nim sekwencję inną niż sekwencja polinukleotydu, można odpowiednio dobierać w zależności od typu gospodarza, do którego wprowadza się wektor ekspresyjny według niniejszego wynalazku, lub w zależności od celu użycia. Możliwe jest leczenie lub profilaktyka nowotworów układu krwiotwórczego lub guzów litych przez podawanie wektora ekspresyjnego według niniejszego wynalazku osobnikowi HLA-A*3303- dodatniemu z wytworzeniem peptydu WT1 w żywym organizmie i wprowadzeniem CTL swoistej względem WT1, i uszkodzenie komórek nowotworu układu krwiotwórczego lub komórek guza litego u osobnika. [0028] W innym aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do leczenia lub profilaktyki nowotworu, zawierająca polinukleotyd WT1 lub wektor

15 15 ekspresyjny WT1. Kompozycję, sposób podawania itp. kompozycji farmaceutycznej według niniejszego wynalazku w tym aspekcie opisano powyżej. [0029] W innym aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie kompozycji farmaceutycznej, zawierającej peptyd WT1 lub wektor ekspresyjny WT1, do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki nowotworu u osobnika HLA- A*3303-dodatniego. Przykłady nowotworów, które się leczy lub którym się zapobiega, obejmują nowotwory układu krwiotwórczego, takie jak białaczka, zespół mielodysplastyczny, szpiczak mnogi lub chłoniak złośliwy i guzy lite, takie jak nowotwór żołądka, nowotwór okrężnicy, nowotwór płuca, nowotwór sutka, nowotwór zarodkowy, nowotwór wątroby, nowotwór skóry, nowotwór pęcherza moczowego, nowotwór prostaty, nowotwór macicy, nowotwór szyjki macicy lub nowotwór jajnika. [0030] W innym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie polinukleotydu WT1 lub wektora ekspresyjnego WT1 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej, zawierającej polinukleotyd WT1 lub wektor ekspresyjny WT1. [0031] W innym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest komórka zawierająca wektor ekspresyjny. Komórkę według niniejszego wynalazku można na przykład wytwarzać przez transformowanie komórki gospodarza, takiej jak E. coli, komórka drożdży, komórka owadów lub komórka zwierzęca, wektorem ekspresyjnym. Metodę wprowadzania wektora ekspresyjnego do komórki gospodarza można odpowiednio dobierać spośród różnych metod. Przez hodowanie transformowanej komórki, odzyskiwanie i oczyszczanie wytworzonego peptydu WT1, można wytwarzać peptyd według niniejszego wynalazku.

16 16 [0032] W kolejnym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest CTL swoista względem WT1, która jest indukowana przez peptyd WT1 ograniczony do HLA-A*3303. CTL według niniejszego wynalazku rozpoznaje kompleks peptydu WT1 i cząsteczkę HLA-A*3303. CTL według niniejszego wynalazku można zatem stosować do swoistego uszkadzania komórki nowotworowej dodatniej pod względem HLA-A*3303 i wykazującej WT1 na wysokim poziomie. [0033] W innym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie CTL swoistej względem WT1 do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki nowotworu u osobnika HLA- A*3303-dodatniego. Tryb podawania CTL swoistej względem WT1 można odpowiednio dobierać w zależności od warunków takich, jak typ choroby, stan osobnika lub miejsce docelowe. Do przykładów takich metod należą podawanie dożylne, podawanie śródskórne, podawanie podskórne, podawanie domięśniowe, podawanie donosowe i podawanie doustne. [0034] W innym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób indukowania CTL swoistej względem WT1, obejmujący hodowanie komórki jednojądrzastej krwi obwodowej w obecności peptydu WT1 ograniczonego do HLA-A*3303 celem indukowania CTL swoistej względem WT1 z komórki jednojądrzastej krwi obwodowej. Osobnik, od którego pochodzi komórka jednojądrzasta krwi obwodowej, może być dowolnym osobnikiem, pod warunkiem, że jest on dodatni pod względem HLA-A*3303. Poprzez hodowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w obecności peptydu WT1 ograniczonego do HLA-A*3303 indukuje się CTL swoistą względem WT1 z komórek prekursorowych CTL, znajdujących się w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Możliwe jest leczenie lub profilaktyka nowotworów układu krwiotwórczego lub guzów litych u osobnika HLA-A*3303-dodatniego przez

17 17 podawanie osobnikowi CTL swoistej względem WT1, uzyskanego według niniejszego wynalazku. [0035] W innym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest zestaw do indukowania CTL swoistej względem WT1, zawierający jako zasadniczy składnik peptyd WT1 ograniczony do HLA-A*3303. Korzystnie, zestaw stosuje się w sposobie indukowania CTL swoistej względem WT1. Zestaw według niniejszego wynalazku może zawierać, oprócz ograniczonego do HLA-A*3303 peptydu WT1, na przykład środki do uzyskiwania komórki jednojądrzastej krwi obwodowej, adiuwant, naczynie reakcyjne lub tym podobne. Na ogół do zestawu załączona jest instrukcja obsługi. Przez zastosowanie zestawu według niniejszego wynalazku można skutecznie indukować CTL swoiste względem WT1. [0036] W kolejnym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest komórka prezentująca antygen (taka jak komórka dendrytyczna), prezentująca peptyd WT1 przez cząsteczkę HLA-A*3303, indukowana przez peptyd WT1 ograniczony do HLA-A*3303. Przez zastosowanie komórki prezentującej antygen według niniejszego wynalazku dochodzi do skutecznego indukowania CTL swoistej względem WT1. [0037] W innym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie komórki prezentującej antygen, prezentującej peptyd WT1 przez cząsteczkę HLA-A*3303 do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki nowotworu u osobnika HLA-A*3303-dodatniego. Tryb podawania komórki prezentującej antygen można odpowiednio dobierać, w zależności od takich warunków, jak typ choroby, stan osobnika lub miejsce docelowe. Przykłady takich metod obejmują podawanie dożylne, podawanie śródskórne, podawanie podskórne, podawanie domięśniowe, podawanie donosowe i podawanie doustne.

18 18 [0038] W innym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób indukowania komórki prezentującej antygen, prezentującej peptyd WT1 przez cząsteczkę HLA-A*3303, obejmujący hodowanie niedojrzałej komórki prezentującej antygen w obecności peptydu WT1 ograniczonego do HLA-A*3303 celem indukowania komórki prezentującej antygen, prezentującej peptyd WT1 przez cząsteczkę HLA-A*3303 z niedojrzałej komórki prezentującej antygen. Określenie niedojrzała komórka prezentująca antygen odnosi się do komórki takiej, jak niedojrzała komórka dendrytyczna, która może dojrzewać do komórki prezentującej antygen. Osobnik, od którego pochodzi niedojrzała komórka prezentująca antygen, może być dowolnym osobnikiem, pod warunkiem, że jest dodatni pod względem HLA-A*3303. Ponieważ niedojrzałe komórki prezentujące antygen znajdują się na przykład pośród komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, takie komórki można hodować w obecności peptydu WT1. [0039] W innym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest zestaw do indukowania komórki prezentującej antygen, prezentującej peptyd WT1 przez cząsteczkę HLA-A*3303, zawierający jako zasadniczy składnik peptyd WT1 ograniczony do HLA-A*3303. Korzystnie, zestaw stosuje się w sposobie indukowania komórki prezentującej antygen. Inne składniki, które mają się znaleźć w zestawie według niniejszego wynalazku itp., opisano powyżej. Zestaw według niniejszego wynalazku można wykorzystywać do skutecznego indukowania komórki prezentującej antygen, prezentującej peptyd WT1 przez cząsteczkę HLA-A*3303. [0040] W innym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest przeciwciało przeciwko peptydowi WT1 ograniczonemu do HLA-A*3303 lub przeciwciało przeciwko polinukleotydowi kodującemu peptyd. Przeciwciało według niniejszego

19 19 wynalazku może być przeciwciałem poliklonalnym lub przeciwciałem monoklonalnym. [0041] W kolejnym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób rozpoznawania nowotworu, obejmujący zastosowanie CTL swoistej względem WT1, komórki prezentującej antygen, prezentującej peptyd WT1 przez cząsteczkę HLA-A*3303, przeciwciała przeciwko peptydowi WT1 ograniczonemu do HLA-A*3303 lub przeciwciała przeciwko polinukleotydowi kodującemu peptyd. Korzystnie, w sposobie rozpoznawania według niniejszego wynalazku stosuje się CTL swoistą względem WT1. Możliwe jest na przykład rozpoznawanie nowotworu przez inkubację CTL, komórki prezentującej antygen lub przeciwciała z próbką od osobnika HLA-A*3303-dodatniego, lub podawanie ich osobnikowi HLA- A*3303-dodatniemu i oznaczanie na przykład ich pozycji, lokalizacji lub ilości. CTL, komórka prezentująca antygen lub przeciwciało mogą być wyznakowane. Przez dołączenie znacznika można skutecznie stosować sposób rozpoznawania według niniejszego wynalazku. [0042] W innym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest zestaw do rozpoznawania nowotworu, zawierający jako zasadniczy składnik CTL swoistą względem WT1, komórkę prezentującą antygen, prezentującą peptyd WT1 przez cząsteczkę HLA-A*3303, przeciwciało przeciwko peptydowi WT1 ograniczonemu do HLA-A*3303 lub przeciwciało przeciwko polinukleotydowi kodującemu peptyd. [0043] Poniższe przykłady ilustrują niniejszy wynalazek bardziej szczegółowo. Zachowano przykłady wykonania niemieszczące się w zakresie zastrzeżeń, w celach ilustracyjnych. Przykłady Przykład 1 Dobór peptydu WT1

20 20 [0044] Do wybrania WT1 337, WT1 364, WT1 367 i WT1 409, które są hydrofilowymi peptydami złożonymi z 9 aminokwasów z motywem kotwiczącym odpowiednim dla HLA-A*3303 (drugim aminokwasem z końca N jest dowolny spośród: Ala, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr, Ser i Asp, a aminokwasem na końcu C jest Arg) zastosowano program NetMHC2.0 (Technical University of Denmark); oczekuje się, że peptydy będą wykazywały wysokie powinowactwo wiązania z cząsteczką HLA-A*3303 z peptydu WT1 z białka WT1 (SEQ ID nr 1). Sekwencje aminokwasów i powinowactwo wiązania z cząsteczką HLA-A*3303 tych peptydów przedstawiono w tabeli 1. [0045] [Tabela 1] Peptyd Nr aminokwasu w SEQ ID nr 1 Sekwencja aminokwasowa Powinowactwo wiązania z cząsteczką HLA- A*3303 WT1 337 (SEQ ID nr 2) LSHLQMHSR 18,827 WT1 364 (SEQ ID nr 3) FSRSDQLKR 15,143 WT1 367 (SEQ ID nr 4) SDQLKRHQR 14,496 WT1 409 (SEQ ID nr 5) TSEKPFSCR 15,310 Wytwarzanie komórki B-LCL [0046] Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) oddzielono metodą odwirowania w gradiencie gęstości Ficoll- Hypaque z krwi obwodowej, którą pobrano od HLA-A*3303- dodatniego zdrowego dawcy (HLA-A*3303/0207). Następnie PBMC wysiano na 24-studzienkową płytkę do hodowli komórkowej z gęstością około 1 x 10 7 w pożywce RPMI 1640, zawierającej 10% FCS, i dodano nadsącz z hodowli komórek B95-8 (komórki wytwarzające wirusa EB). Hodowano je w temperaturze 37 C z 5% CO 2 przez około 1 miesiąc. Uzyskano komórki B-LCL transformowane wirusem EB, które są komórkami nowotworowymi

21 21 z komórek B. Potwierdzono, że uzyskane komórki B-LCL nie wykazują ekspresji genu WT1. Komórki B-LCL poddano pulsacji przez ich inkubację z 20 g/ml WT1 337, WT1 364, WT1 367 lub WT1 409 przez 2 godziny, i napromieniano 80 Gy promieniowania. Uzyskane komórki B-LCL (zwane w dalszym ciągu niniejszego opisu komórkami B-LCL poddanymi pulsacji peptydem WT1) zastosowano jako komórki prezentujące antygen w poniższych doświadczeniach. Indukcja CTL-swoistych WT1 [0047] 3 x 10 6 PBMC (HLA-A*3303/1101) hodowano w 24- studzienkowej płytce do hodowli komórkowej w pożywce kompletnej (45% RPMI, 45% pożywki AMI-V i 10% ludzkiej surowicy AB), zawierającej 20 g/ml WT1 337, WT1 364, WT1 367 lub WT1 409 w temperaturze 37 C z 5% CO 2 przez 1 tydzień, uzyskując odpowiadające komórki. 2 x 10 6 uzyskanych odpowiadających komórek poddano współhodowli z 1 x 10 6 komórek B-LCL poddanych pulsacji tym samym peptydem WT1 w kompletnej pożywce przez 1 tydzień (pierwsza stymulacja). PBMC poddano współhodowli z komórkami B-LCL poddanymi pulsacji peptydem WT1 jeszcze trzy razy (stymulacje od drugiej do czwartej) w warunkach, w których dodano 20 IU/ml (stężenie ostateczne) IL-2 w następujący sposób: stymulacja druga dwa razy co drugi dzień, od dnia 3. po zapoczątkowaniu stymulacji; stymulacje trzecia i czwarta trzy razy w odstępach jednego dnia, od dnia po zapoczątkowaniu stymulacji. Uzyskane komórki zatężono, stosując zestaw Negative Selection Columns Gravity Feed Kit (StemSp), tak że odsetek CD8-dodatnich komórek T wyniósł około 80%, i poddano współhodowli z komórkami B-LCL poddanymi pulsacji peptydem WT1 (stymulacja piąta). CD8- dodatnie komórki T (CTL) uzyskane 5 dni po ostatniej stymulacji zastosowano do pomiarów aktywności cytotoksycznej.

22 22 Aktywność cytotoksyczna CTL [0048] Mierzono aktywność cytotoksyczną CTL, stosując test uwalniania 51 Cr. Komórki CTL (zwane w dalszym ciągu niniejszego opisu komórkami efektorowymi) miesza się w stosunku (stosunek E/T) 1:1, 5:1 lub 10:1 w 200 l pożywki z komórkami docelowymi, do których włączono 51 Cr, i hoduje w 96-studzienkowych płytkach do hodowli komórkowej w temperaturze 37 C z 5% CO 2 przez 4 godziny. Jako komórki docelowe zastosowano komórki B-LCL poddane pulsacji tym samym peptydem WT1, który zastosowano do indukcji CTL (BLCL-P), i komórki B-LCL bez pulsacji peptydem WT1 (BLCL- NP). Po hodowli nadsącz zebrano przez odwirowanie. Mierzono ilość 51 Cr uwolnionego do nadsączu, stosując licznik scyntylacyjny (scyntylacja ciekła). Aktywność cytotoksyczna (%) określano z zastosowaniem następującego wzoru: (uwalnianie 51 Cr w nadsączu próbki samoistne uwalnianie 51 Cr) / (maksymalne uwalnianie 51 Cr - samoistne uwalnianie 51 Cr) x 100 przy czym samoistne uwalnianie 51 Cr jest to uwalnianie 51 Cr obserwowane wtedy, gdy komórki docelowe, do których wprowadzano 51 Cr, hodowano same w tych samych warunkach, a maksymalne uwalnianie 51 Cr jest to uwalnianie 51 Cr obserwowano, gdy komórki docelowe, do których wprowadzono 51 Cr, poddano całkowitej lizie z użyciem 1% Triton X-100. Wyniki przedstawiono na Fig Na rysunkach osie podłużne odpowiadają lizie całkowitej (%), a osie poziome odpowiadają stosunkowi E/T. BLCL-P przedstawiono liniami ciągłymi, a BLCL-NP liniami przerywanymi. Potwierdzono, że CTL indukowane WT1 337, WT1 364, WT1 367 lub WT1 409 uszkadzają swoiście BLCL-P prezentujące peptyd WT1 jako kompleks z cząsteczką HLA-A*3303 w porównaniu z BLCL-NP. CTL indukowane WT1 364, WT1 367 lub WT1 409 zastosowano do dalszych doświadczeń, opisanych poniżej.

23 23 Aktywność cytotoksyczna CTL przeciwko komórce wykazującej endogenną ekspresję genu WT1 [0049] Określano aktywność cytotoksyczną CTL indukowanych WT1 364, WT1 367 lub WT1 409 przeciwko komórkom TF-1, które są komórkami nowotworowymi, wykazującymi ekspresję genu WT1 (HLA-A*3303-dodatnimi), stosując metodę opisaną powyżej. Jako kontroli użyto komórek K562, wykazujących ekspresję genu WT1 i ujemnych pod względem HLA-A*3303. Wyniki przedstawiono na Fig Na rysunkach osie podłużne odpowiadają lizie swoistej (%), a osie poziome odpowiadają stosunkowi E/T. TF-1 przedstawiono liniami ciągłymi, a K562 - liniami przerywanymi. Potwierdzono, że CTL indukowane WT1 364, WT1 367 lub WT1 409 wykazują również aktywność cytotoksyczną przeciwko komórce wykazującej endogenną ekspresję genu WT1. [0050] Określano aktywność cytotoksyczną CTL indukowanych WT1 367 przeciwko komórce B-LCL, wykazującej ekspresję WT1, metodą opisaną powyżej. Określenie B-LCL wykazująca ekspresję WT1 (B-LCL-WT1) odnosi się do komórki B-LCL, do której wprowadza się ludzki gen WT1 i która wykazuje ekspresję białka WT1 w komórce i prezentuje peptyd złożony z około 9 aminokwasów, powstały wskutek obróbki na cząsteczce HLA-A*3303. Jako kontrolę zastosowano komórkę B- LCL (B-LCL-CV), do której wprowadzano gen kontrolny, z wyjątkiem genu WT1. Wyniki przedstawiono na Fig. 8. Na rysunkach osie podłużne odpowiadają lizie swoistej (%), a osie poziome odpowiadają stosunkowi E/T. B-LCL-WT1 przedstawiono liniami ciągłymi, a B-LCL-CV - liniami przerywanymi. Potwierdzono, że CTL indukowana WT1 367 uszkadza tylko komórkę, która jest HLA-A*3303-dodatnia i wykazuje ekspresję WT1. Zastosowanie przemysłowe

24 24 [0051] Przedmiotem niniejszego wynalazku jest peptyd WT1 ograniczony do HLA-A*3303, polinukleotyd kodujący peptyd, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna i tym podobne. Niniejszy wynalazek można zatem wykorzystywać w dziedzinie medycyny i dziedzinach pokrewnych, na przykład w dziedzinie rozwoju i wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do profilaktyki lub leczenia różnych nowotworów układu krwiotwórczego i nowotworów litych, wykazujących ekspresję genu WT1 na wysokim poziomie. WYKAZ SEKWENCJI [0052] <110> International Institute of Cancer Immunology, Inc. <120> Ograniczony do HLA-A*3303 peptyd WT1 i zawierająca go kompozycja farmaceutyczna <130> <150> JP <151> <160> 5 <170> PatentIn wersja 3.2 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

25 25

26 26 <210>2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens

27 27 <400> 3 <210>4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

28 28 Zastrzeżenia patentowe 1. Peptyd składający się z sekwencji aminokwasowej Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4). 2. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce nowotworu u osobnika HLA-A*3303-dodatniego, zawierająca peptyd składający się z sekwencji aminokwasowej Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4). 3. Zastosowanie peptydu złożonego z sekwencji aminokwasowej Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4) do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki nowotworu u osobnika HLA-A*3303-dodatniego. 4. Polinukleotyd kodujący peptyd według zastrz Wektor ekspresyjny, zawierający polinukleotyd według zastrz Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce nowotworu u osobnika HLA-A*3303-dodatniego, zawierająca polinukleotyd kodujący peptyd składający się z sekwencji aminokwasowej Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4) lub wektor zawierający ten polinukleotyd. 7. Zastosowanie polinukleotydu kodującego peptyd składający się z sekwencji aminokwasowej Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4) lub wektora zawierającego ten polinukleotyd do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki nowotworu u osobnika HLA-A*3303-dodatniego. 8. CTL swoista względem WT1, która jest indukowalna przez peptyd składający się z sekwencji aminokwasowej Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4). 9. Sposób indukowania CTL swoistego względem WT1, obejmujący hodowanie komórki jednojądrzastej krwi obwodowej w obecności peptydu składającego się z sekwencji aminokwasowej Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4) celem indukowania CTL swoistej względem WT1 z komórki jednojądrzastej krwi obwodowej.

29 Zestaw do indukowania CTL swoistego względem WT1 lub do indukowania komórki prezentującej antygen, prezentującej peptyd WT1, przy czym ten zestaw zawiera jako zasadniczy składnik peptyd składający się z sekwencji aminokwasowej Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4). 11. Komórka prezentująca antygen, prezentująca peptyd WT1, który jest indukowalny przez peptyd składający się z sekwencji aminokwasowej Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4). 12. Sposób indukowania komórki prezentującej antygen, prezentującej peptyd WT1, obejmujący hodowanie niedojrzałej komórki prezentującej antygen w obecności peptydu składającego się z sekwencji aminokwasowej Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4) celem indukowania komórki prezentującej antygen, prezentującej peptyd WT1 z niedojrzałej komórki prezentującej antygen. 13. Sposób rozpoznawania nowotworu, obejmujący zastosowanie CTL według zastrz. 8 lub komórki prezentującej antygen według zastrz Sposób określania obecności lub ilości CTL swoistego względem WT1 u osobnika HLA-A*3303-dodatniego, obejmujący: (a) poddanie reakcji kompleksu peptydu WT1 zawierającego sekwencję aminokwasową Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID nr 4) i cząsteczki HLA-A*3303 z próbką od osobnika; (b) określenie obecności lub ilości CTL rozpoznającego kompleks zawarty w próbce. 15. Sposób według zastrz. 14, przy czym kompleks ma postać tetrameru. International Institute of Cancer Immunology, Inc. Zastępca:

30 30

31 31

32 32

33 33

34 34

35 35

36 36

37 37