(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 13/33 EP B1 (13) (1) T3 Int.Cl. A61K 39/00 (06.01) C07K 14/47 (06.01) C07K 14/74 (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Szczepionki peptydowe przeciwko rakom z ekspresją antygenów związanych z nowotworami () Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 09/48 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 14/01 (73) Uprawniony z patentu: Oncotherapy Science, Inc., Kawasaki, JP (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 TAKUYA TSUNODA, Kawasaki, JP RYUJI OHSAWA, Kawasaki, JP (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 3 17/P33314PL00 EP Opis Dziedzina wynalazku [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny nauk biologicznych, bardziej konkretnie dziedziny terapii raka. W szczególności niniejszy wynalazek dotyczy nowych peptydów immunogennych, które są niezwykle skuteczne jako szczepionki rakowe, oraz leków zawierających takie peptydy do leczenia i zapobiegania nowotworom. 1 2 Tło wynalazku [0002] Wykazano, że cytotoksyczne limfocyty T CD8 + (CTL, ang. cytotoxic T lymphocytes) rozpoznają peptydy epitopowe pochodzące z antygenów związanych z nowotworami (TAA, ang. tumor-associated antigens) prezentowanych na cząsteczkach MHC klasy I, i następnie lizują komórki nowotworowe. Od momentu odkrycia rodziny MAGE jako pierwszego przykładu TAA, przy użyciu metod immunologicznych odkryto wiele innych TAA (Boon T. (1993) Int J Cancer 4: ; Boon T. i wsp., (1996) J Exp Med 183: 72-9.; van der Bruggen P i wsp., (1991) Science 24: ; Brichard V i wsp., (1993) J Exp Med 178: ; Kawakami Y i wsp., (1994) J Exp Med 180: ). Niektóre z nich są obecnie w stadium badań klinicznych jako cele immunoterapii. TAA dotychczas odkryte obejmują MAGE (van der Bruggen P i wsp., (1991) Science 24: ), gp0 (Kawakami Y i wsp, (1994) J Exp Med 180: ), SART (Shichijo S i wsp., (1998) J Exp Med 187: ) oraz NY-ESO-1 (Chen Y.T. i wsp., (1997) Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 94:

3 ). Z drugiej strony pokazano, że pewne produkty genów ulegają w pewnym stopniu specyficznej nadekspresji w komórkach nowotworowych, aby zostać rozpoznanymi jako cele indukujące odpowiedzi immunologiczne typu komórkowego. Takie produkty genów obejmują p3 (Umano Y i wsp., (01) Br J Cancer, 84:2-7.), HER2/neu (Tanaka H i wsp., (01) Br J Cancer, 84: 94-9.), CEA (Nukaya I i wsp., (1999) Int. J. Cancer 80, 92-7.) i tym podobne. [0003] Pomimo znacznego postępu badań podstawowych i klinicznych dotyczących TAA (Rosenberg SA i wsp., (1998) Nature Med, 4: ; Mukherji B. i wsp., (199) Proc Natl Acad Sci USA, 92: : Hu X i wsp., (1996) Cancer Res, 6: ) obecnie dostępna jest tylko ograniczona liczba kandydatów TAA odpowiednich do leczenia raków. TAA, które ulegają wysokiej ekspresji w komórkach nowotworowych, i których ekspresja jest ograniczona do komórek rakowych, byłyby obiecującymi kandydatami jako cele w immunoterapii. [0004] Zarówno HLA-A24, jak i HLA-A01 są powszechnymi allelami HLA w populacji japońskiej i kaukaskiej (Date Y i wsp., (1996) Tissue Antigens 47: 93-1.; Kondo A i wsp., (199) J Immunol 1:47-12.; Kubo RT i wsp., (1994) J Immunol 12: ; Imanishi i wsp., Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference Oxford University Press, Oxford, 6 (1992); Williams F i wsp., (1997) Tissue Antigen 49: ). Zatem, peptydy antygenowe raków prezentowane przez te allele HLA mogą znaleźć konkretne zastosowanie w leczeniu raków u pacjentów japońskich i kaukaskich.

4 1 2 Dalej, wiadomo, że indukcja in vitro CTL o niskim powinowactwie zazwyczaj wynika z ekspozycji na wysokie stężenia peptydów, generujących wysoki poziom specyficznych kompleksów peptyd/mhc na komórkach prezentujących antygen (ACP, ang. antigen-presenting cells), które będą skutecznie aktywować te CTL (Alexander-Miller i wsp., (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 42-7.). [000] Od niedawna sekwencja peptydu wiążącego się do HLA klasy I może być przewidziana przy użyciu algorytmów (Jounal of Immunological Methods, (199), tom 18, str , J. Immunol., (1994), tom 12, str , protein science, (00), tom 9, str ). Jednakże trudno powiedzieć, czy przewidziany peptyd epitopowy może być przecięty do odpowiedniej wielkości i ulegać ekspresji na powierzchni docelowej komórki z cząsteczką HLA i być rozpoznany przez CTL. Ponadto algorytm, na przykład BIMAS ( bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform) (Parker KC, i wsp., (1994) J Immunol.;12(1):163-7.; Kuzushima K, i wsp., (01) Blood.;98(6): )), może zasugerować peptyd wiążący się do cząsteczki HLA, ale zasugerowany peptyd nie jest bardzo ścisły (Bachinsky MM, i wsp. Cancer Immun. 0 Mar 22;:6.). Tak więc, selekcja TAA nadal stawia dużo wyzwań i trudności. [0006] Niedawne osiągnięcia w technikach opartych na mikromacierzach cdna umożliwiły konstrukcję obszernych profili ekspresji genów w zezłośliwionych komórkach w porównaniu z komórkami prawidłowymi (Okabe, H. i wsp., (01) Cancer Res., 61, ; Lin YM. i wsp.,

5 6 1 2 (02) Oncogene, 21;41-8.; Hasegawa S. i wsp., (02) Cancer Res 62: ). To podejście umożliwia bardziej dogłębne zrozumienie złożonej natury komórek rakowych i mechanizmów powstawania raka oraz ułatwia identyfikację genów, których ekspresja jest niekontrolowana w nowotworach (Bienz M. i wsp., (00) Cell 3, 311-.). Pośród zidentyfikowanych transkryptów, które ulegają regulacji w górę w rakach, odkryto ostatnio CDH3 (Nr Dostępu GenBank NM_001793; NR ID. SEKW.: 1, 2), EPHA4 (Nr Dostępu GenBank L3664; NR ID. SEKW.: 3, 4), ECT2 (Nr Dostępu GenBank AY376439; NR ID. SEKW.:, 6), HIG2 (Nr Dostępu GenBank NM_013332; NR ID. SEKW.: 7,8) INHBB (Nr Dostępu GenBank NM_002193; NR ID. SEKW.: 9, ), KIFA (Nr Dostępu GenBank NM_00733; NR ID. SEKW.: 11, 12), KNTC2 (Nr Dostępu GenBank AF017790; NR ID. SEKW.: 13, 14), TTK (Nr Dostępu GenBank NM_003318; NR ID. SEKW.: 1, 16) oraz URLC (Nr Dostępu GenBank NM_01727; NR ID. SEKW.: 17, 18). Cała zawartość odniesień jest tutaj włączona poprzez cytowanie. Te geny budzą szczególne zainteresowanie twórców niniejszego wynalaku, gdyż są specyficznie regulowane w górę w komórkach nowotworowych różnych tkanek rakowych pochodzących z przeanalizowanych przypadków (zobacz poniżej). Tak więc, immunogenne peptydy pochodzące z CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK oraz URLC mogą znaleźć zastosowanie w selektywnym zabijaniu komórek nowotworowych wykazujących ekspresję takich antygenów. Niniejszy wynalazek zaspokaja te i inne potrzeby. [0007] Ze względu na to, że leki cytotoksyczne, takie jak M-VAC, często powodują silne reakcje

6 7 1 2 niepożądane, jasne jest, że uważna selekcja nowych cząsteczek docelowych na podstawie dobrze scharakteryzowanych mechanizmów działania powinna być bardzo pomocna w opracowaniu skutecznych leków przeciwrakowych posiadających zminimalizowane ryzyko wystąpienia skutków ubocznych. W tym celu wcześniej wykonano analizy profili ekspresji dla różnych raków i prawidłowej tkanki ludzkiej. Takie badania doprowadziły do odkrycia wielu genów, które ulegają specyficznej nadekspresji w raku (Lin YM, i wsp., Oncogene. 02 Jun 13;21:41-8.; Kitahara O, i wsp., Cancer Res. 01 May 1;61:344-9.; Suzuki C, i wsp., Cancer Res. 03 Nov 1;63: ; Ashida S, Cancer Res. 04 Sep 1;64: ; Ochi K, i wsp., Int J OncoL 04 Mar;24(3):647-.; Kaneta Y, i wsp., Int J Oncol. 03 Sep;23: ; Obama K, Hepatology. 0 Jun;41: ; Kato T, i wsp., Cancer Res. 0 Jul 1;6: ; Kitahara O, i wsp., Neoplasia. 02 Jul-Aug;4:29-3.; Saito-Hisaminato A i wsp., DNA Res 02, 9: 3-4.). Przykłady takich zidentyfikowanych genów ulegających nadekspresji w różnych rakach obejmują, ale bez ograniczenia do tego, CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i URLC. Nadekspresja CDH3 została wcześniej zidentyfikowana w raku pęcherza, raku szyjki macicy, raku komórek przewodów żółciowych (ang. cholangincellular carcinoma), raku jelita grubego (ang. colorectal cancer), endometriozie, raku żołądka, raku żołądka typu rozlanego, niedrobnokomórkowym raku płuca (NSCLC, ang. non-small cell lung cancer, NSCLC), raku trzustki, nowotworze tkanek miękkich oraz nowotworze jąder. EPHA4 został zidentyfikowany w raku pęcherza,

7 8 1 2 raku szyjki macicy, raku komórek przewodów żółciowych, endometriozie, raku żołądka typu rozlanego, raku jajnika, raku trzustki, raku prostaty oraz nowotworze tkanek miękkich. ECT2 został zidentyfikowany w raku pęcherza, raku piersi, raku szyjki macicy, raku komórek przewodów żółciowych, przewlekłej białaczce szpikowej (CML, ang. chronic myeloid leukemia), raku jelita grubego, raku przełyku, NSCLC, chłoniaku, raku prostaty, raku nerki, drobnokomórkowym raku płuca (SCLC, ang. small cell lung cancer). HIG2 został zidentyfikowany w raku nerki oraz SCLC. INHBB został zidentyfikowany w raku komórek przewodów żółciowych, raku przełyku, NSCLC, raku nerki, SCLC oraz nowotworze tkanek miękkich. KIFA został zidentyfikowany w raku pęcherza, raku piersi, raku komórek przewodów żółciowych, raku przełyku NSCLC, raku trzustki, raku prostaty, raku nerki oraz SCLC. KNTC2 został zidentyfikowany w raku pęcherza, raku piersi, raku szyjki macicy, raku komórek przewodów żółciowych, CML, raku jelita grubego, raku przełyku, NSCLC, chłoniaku, kostniakomięsaku, raku jajnika, raku trzustki, raku prostaty, raku nerki, SCLC oraz nowotworze tkanek miękkich. TTK został zidentyfikowany w raku pęcherza, raku piersi, raku szyjki macicy, raku komórek przewodów żółciowych, CML, raku jelita grubego, raku przełyku, raku wątroby, NSCLC, chłoniaku, kostniakomięsaku, raku prostaty, SCLC oraz nowotworze tkanek miękkich. URLC TTK został zidentyfikowany w raku pęcherza, raku szyjki macicy, raku komórek przewodów żółciowych, raku przełyku, raku żołądka, NSCLC, kostniokomięsaku, raku trzustki oraz SCLC.

8 9 1 Poprzednio secemina 1 została zidentyfikowana jako nowy cel w immunoterapii raka żołądka (Suda i wsp., (06) Cancer Science 97(): ). Ponadto, ujawniono peptydy pochodzące z białek z nadrodziny kinezyn ze zdolnością indukcji cytotoksycznych limfocytów T reagujących z glejakiem u pacjentów z glejakiem z ekspresją antygenu ludzkich leukocytów A24 + (Harada i wsp., (07) Oncology Reports, National Hellenic Research Foundation 17(3): ). Jako nowe cele dla immunoterapii zostały zidentyfikowane peptydy epitopowe podlegające restrykcji antygenu ludzkich leukocytów A24 pochodzące z produktów genów ulegających regulacji w górę w rakach płuc i przełyku (Suda i wsp., (07) Cancer Science 98(11): ). Ponadto, ujawniono locus K rakowo-jądrowego antygenu 6 kompleksu limfocytarnego, (LY6K) jako biomarker serologiczny i cel terapeutyczny dla raków płuc i przełyku (Ishikawa i wsp., (07) Cancer Research 67(24): ). Dodatkowo, WO02/ A2 ujawnia sposoby i kompozycje, które mogą być stosowane do rozpoznawania i leczenia raka płuc, jak również sposoby, które mogą być stosowane do identyfikacji modulatorów raka płuc. 2 Podsumowanie wynalazku [0008] Niniejszy wynalazek jest oparty częściowo na odkryciu celów możliwych do zastosowania w immunoterapii. Ze względu na to, że TAA często nie posiadają właściwości immunogennych, odkrycie odpowiednich celów ma szczególnie duże znaczenie. Jak zauważono powyżej, regulacja w górę CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK oraz URLC została

9 1 2 zidentyfikowana w różnych rodzajach raka. Bardziej konkretnie, geny te zidentyfikowano przy użyciu ustalania profili ekspresji genów z zastosowaniem mikromacierzy cdna obejmujących cały genom. Jak to dyskutowano powyżej, wykazano, że ekspresja CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK oraz URLC ulega specyficznej regulacji w górę w różnych komórkach nowotworowych, od komórek raka trzustki do komórek raka nerki. Jak opisano w Tabeli 1, ekspresja CDH3 jest znacząco podniesiona w 26 z 34 raków pęcherza, 17 z 19 raków szyjki macicy, wszystkich 19 rakach komórek przewodów żółciowych, z 34 raków jelita grubego, z 21 endometrioz, 13 z raków żołądka, 7 z 8 raków żołądka typu rozlanego, 36 z 37 NSCLC, wszystkich 16 rakach trzustki, wszystkich 21 nowotworach tkanek miękkich oraz wszystkich noworworach jądra. [0009] Ponadto Tabela 1 pokazuje, że: Ekspresja EPHA4 jest znacząco podwyższona w 14 z 34 raków pęcherza, 8 z 14 raków szyjki macicy, z 2 raków komórek przewodów żółciowych, z 1 endometrioz, z 8 raków żołądka typu rozlanego, wszystkich rakach jajnika, wszystkich 14 rakach trzustki, z 1 raków prostaty oraz 14 z 23 nowotworów tkanek miękkich. Ekspresja ECT2 jest znacząco podwyższona w 17 z 19 raków pęcherza, z 12 raków piersi, wszystkich 14 rakach szyjki macicy, wszystkich 13 rakach komórek przewodów żółciowych, wszystkich CML, 7 z 8 raków jelita grubego, 12 z 16 raków przełyku, 6 z 16 NSCLC, 8 z chłoniaków, 1 z 1 raka trzustki, z 13 raków prostaty, 3 z 6 raków nerki oraz 12 z 13 raków SCLC.

10 Ekspresja HIG2 jest znacząco podwyższona w 19 z raków nerek oraz 7 z 9 nowotworów tkanek miękkich. Ekspresja INHBB jest znacząco podwyższona w z 21 raków komórek przewodów żółciowych, wszystkich 12 rakach przełyku, z 13 NSCLC, 22 z 24 raków nerek, 8 z 14 raków SCLC oraz 4 z 49 nowotworów tkanek miękkich. Ekspresja KIFA jest znacząco podwyższona we wszystkich 31 rakach pęcherza, 38 z 61 raków piersi, z 11 raków komórek przewodów żółciowych, 7 z 19 raków przełyku, 21 z 22 NSCLC, wszystkich 6 rakach jajnika, 17 z 36 raków prostaty, 6 z 11 raków nerek oraz wszystkich 1 SCLC. Ekspresja KNTC2 jest znacząco podwyższona w z 32 raków pęcherza, 47 z 6 raków piersi, wszystkich rakach szyjki macicy, 16 z 22 raków komórek przewodów żółciowych, 17 z 37 CML, 3 z raków jelita grubego, 11 z 46 raków przełyku, 1 z 19 NSCLC, 7 z 8 chłoniaków, z 24 kostniakomięsaków, 3 z raków jajnika, wszystkich 2 rakach trzustki, 1 z 37 raków prostaty, 14 z 19 raków nerek, wszystkich 1 SCLC oraz 40 z 9 nowotworów tkanek miękkich. Ekspresja TTK jest znacząco podwyższona we wszystkich 27 rakach pęcherza, 2 z raków piersi, 1 z 16 raków szyjki macicy, wszystkich rakach komórek przewodów żółciowych, z 7 CML, 6 z raków jelita grubego, 24 z 44 raków przełyku, 8 z 1 raków wątroby, wszystkich 12 NSCLC, wszystkich 6 chłoniakach, 13 z 16 kostniaków zarodkowych, 12 z 17 raków prostaty, wszystkich 1 SCLC oraz 16 z 33 nowotworów tkanek miękkich. Ekspresja URLC jest znacząco podwyższona we

11 wszystkich 29 rakach pęcherza, 1 z 16 raków szyjki macicy, wszystkich 7 rakach komórek przewodów żółciowych, 7 z 19 raków przełyku, wszystkich 3 rakach żołądka, 24 z 27 NSCLC, 1 z 19 kostniakomięsaków, 4 z raków trzustki, 33 z 43 nowotworów tkanek miękkich. [00] Niniejszy wynalazek jest oparty, przynajmniej częściowo, na identyfikacji specyficznych peptydów epitopowych będących produktami tych genów (CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i URLC), które posiadają zdolność indukcji cytotoksycznych limfocytów T (CTL) specyficznych względem odpowiednich cząsteczek. Jak to szczegółowo przedyskutowano poniżej, jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC, ang. Peripheral Blood Mononuclear Cells) zdrowego dawcy stymulowano przy użyciu kandydujących peptydów wiążących HLA-A*2402 lub HLA-A*01 pochodzących z CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK lub URLC. Następnie wyprowadzono klony i/lub linie CTL o specyficznej cytotoksyczności wobec docelowych komórek dodatnich względem HLA-A24 lub HLA-A2, poddanych pulsowemu działaniu każdego z kandydujących peptydów. Te wyniki pokazują, że te peptydy są peptydami epitopowymi podlegającymi restrykcji HLA-A24 lub HLA-A2 mogącymi indukować silną i specyficzną odpowiedź immunologiczną przeciwko komórkom z ekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK lub URLC. Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy wykonań scharakteryzowanych w zastrzeżeniach. Tak więc, dotyczy on następujących punktów. 1. Wyizolowany peptyd o mniej niż 1 aminokwasach, posiadający zdolność indukcji cytotoksycznych komórek

12 T, który to peptyd jest wybrany z grupy składającej się z peptydów zawierających sekwencje aminokwasowe o NR ID. SEKW.:, 19, 22, 34 lub Peptyd o mniej niż 1 aminokwasach, posiadający zdolność indukcji cytotoksycznych komórek T, który to peptyd zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z NR ID. SEKW.:, 19, 22, 34 oraz 38, w której 1 lub 2 aminokwasy są podstawione, usunięte lub dodane, przy czym ten peptyd indukuje cytotoksyczne limfocyty T specyficzne dla komórki z ekspresją CDH3. 3. Peptyd posiadający zdolność do indukcji cytotoksycznych komórek T według punktu 2, który to peptyd składa się z sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.:, 19, 22, 34 oraz 38, w której 1 lub 2 aminokwasy są podstawione, usunięte lub dodane, przy czym ten peptyd indukuje cytotoksyczne limfocyty T specyficzne dla komórki z ekspresją CDH3. 4. Peptyd posiadający zdolność do indukcji cytotoksycznych komórek T według punktu 2, który to peptyd składa się z sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.:, 19, 22, 34 oraz 38, w której 1 lub 2 aminokwasy są podstawione lub dodane, przy czym ten peptyd indukuje cytotoksyczne limfocyty T specyficzne dla komórki z ekspresją CDH3.. Peptyd według dowolnego z punktów 2 do 4, w którym drugim aminokwasem od końca N jest fenyloalanina, tyrozyna, metionina lub tryptofan. 6. Peptyd według dowolnego z punktów 2 do, w którym C-końcowym aminokwasem jest fenyloalanina, leucyna,

13 izoleucyna, tryptofan lub metionina. 7. Wyizolowany peptyd składający się z sekwencji aminokwasowej o NR ID. SEKW.:, 19, 22, 34 lub Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu lub zapobieganiu raka, przy czym ta kompozycja zawiera przynajmniej jeden peptyd według dowolnego z punktów 1 do 7 lub polinukleotyd kodujący ten peptyd. 9. Zastosowanie przynajmniej jednego peptydu według dowolnego z punktów 1 do 7 lub polinukleotydu kodującego ten peptyd do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia lub zapobiegania raka.. Egzosom, który prezentuje na swojej powierzchni kompleks zawierający peptyd według dowolnego z punktów 1 do 7 oraz antygen HLA. 11. Egzosom według punktu, w którym antygenem HLA jest HLA-A Egzosom według punktu 11, w którym antygenem HLA jest HLA-A Sposób in vitro indukowania komórki prezentującej antygen, posiadającej dużą zdolność indukcji cytotoksycznej komórki T, obejmujący etap kontaktowania komórki prezentującej antygen z peptydem według dowolnego z punktów 1 do 7 lub obejmujący etap transferu genu zawierającego polinukleotyd kodujący peptyd według dowolnego punktu 1 do do komórki prezentującej antygen. 14. Sposób in vitro indukowania cytotoksycznej komórki T poprzez kontaktowanie komórki T z peptydem według dowolnego punktu 1 do Wyizolowana cytotoksyczna komórka T, która jest zaindukowana poprzez kontaktowanie komórki T z peptydem

14 1 1 2 według dowolnego z punktów 1 do 7 lub która jest poddana transdukcji kwasem nukleinowym kodującym polipeptydy podjednostki TCR wiążące się z peptydem według dowolnego z punktów 1 do 7 w kontekście HLA-A Komórka prezentująca antygen, która zawiera kompleks utworzony pomiędzy antygenem HLA i peptydem według dowolnego punktu 1 do 7, lub która jest zaindukowana sposobem według punktu Szczepionka do zastosowania w hamowaniu proliferacji komórki z ekspresją genu o NR ID. SEKW.: 1, która to szczepionka zawiera peptyd według dowolnego punktu 1 do 7 jako składnik aktywny. 18. Zastosowanie peptydu według dowolnego z punktów 1 do 7 jako składnika aktywnego do wytwarzania szczepionki do hamowania proliferacji komórki z ekspresją genu o NR ID. SEKW.: Szczepionka według punktu 17 lub zastosowanie według punktu 18, w których komórka z ekspresją genu o NR ID. SEKW.: 1 jest komórką rakową.. Szczepionka lub zastosowanie według punktu 19, przygotowane do podania osobnikowi, którego antygenem HLA jest HLA-A Szczepionka do zastosowania w leczeniu lub zapobieganiu rakowi, przy czym ta szczepionka zawiera przynajmniej jeden peptyd według dowolnego punktu 1 do 7, jego fragment aktywny immunologicznie lub polinukleotyd kodujący ten peptyd lub jego fragment aktywny immunologicznie. 22. Zastosowanie przynajmniej jednego peptydu według dowolnego punktu 1 do 7, jego fragmentu aktywnego immunologicznie lub polinukleotydu kodującego ten

15 peptyd lub jego fragment aktywny immunologicznie do wytwarzania szczepionki do leczenia lub zapobiegania rakowi. 23. Kompozycja farmaceutyczna według punktu 8, zastosowanie według punktu 9, 19 albo 22 lub szczepionka według punktu 19 albo 21, w których rak jest wybrany z grupy składającej się z raka pęcherza, raka piersi, raka szyjki macicy, raka komórek przewodów żółciowych, CML, raka jelita grubego, endometriozy, raka przełyku, raka żołądka, raka żołądka typu rozlanego, raka wątroby, NSCLC, chłoniaka, kostniakomięsaka, raka jajnika, raka trzustki, raka prostaty, raka nerki, SCLC, nowotworu tkanek miękkich i nowotworu jądra. 24. Sposób poszukiwania peptydu, w którym 1 lub 2 aminokwasy są podstawione, przy czym ten peptyd zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z NR ID. SEKW.:, 19, 22, 34 i 38, przy czym ten sposób obejmuje etapy: (a) potwierdzania braku znaczącej homologii sekwencji do całej sekwencji 1 lub 2 aminokwasowego substytutu; (b) mierzenia zdolności indukcji CTL kandydującego podstawionego peptydu; oraz (c) selekcji peptydu, którego zdolność indukcji CTL jest taka sama lub większa niż oryginalnego peptydu. [0011] Zatem, ujawnione są sposoby leczenia lub zapobiegania chorobie związanej z nadekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK lub URLC, np. raka. Takie sposoby obejmują etap podawania osobnikowi potrzebującemu tego ujawnionych tutaj polipeptydów CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA,

16 KNTC2, TTK i/lub URLC. Podawanie takiego peptydu(peptydów) skutkuje indukcją odporności przeciwnowotworowej, która jest indukowana przez podanie tych polipeptydów. Tak więc, ujawnione są sposoby indukcji odporności przeciwnowotworowej u osobnika, przy czym takie sposoby obejmują etap podawania osobnikowi polipeptydów CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, jak również kompozycji farmaceutycznych do leczenia lub zapobiegania chorobie związanej z nadekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np. rakowi, które zawierają polipeptydy CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK oraz URLC. Przykłady takich raków obejmują, ale bez ograniczenia, raka pęcherza, raka piersi, raka szyjki macicy, raka komórek przewodów żółciowych, CML, raka jelita grubego, endometriozę, raka przełyku, raka żołądka, raka żołądka typu rozlanego, raka wątroby, NSCLC, chłoniaka, kostniakomięsaka, raka jajnika, raka prostaty, raka nerek, SCLC, nowotworu tkanek miękkich oraz nowotworu jądra. [0012] Ponadto ujawniono sposoby zapobiegania pooperacyjnemu nawrotowi wspomnianej powyżej choroby. Zważywszy na określone dążenia i cele wymienione powyżej, specjaliści w tej dziedzinie zrozumieją, że jeden lub więcej aspektów tego wynalazku może zrealizować pewne cele, podczas gdy jeden lub więcej innych aspektów tego wynalazku może zrealizować pewne inne cele. Nie każdy cel musi odpowiadać w równym stopniu, pod wszystkimi jego względami, każdemu aspektowi tego wynalazku. Czyli, cele tutaj zawarte

17 mogą być rozpatrywane odrębnie w odniesieniu do dowolnego aspektu tego wynalazku. [0013] Dodatkowe cele i cechy wynalazku staną się bardziej oczywiste po przeczytaniu poniższego szczegółowego opisu w połączeniu z załączonymi rysunkami i przykładami. Należy jednakże rozumieć, że zarówno powyższe podsumowanie wynalazku, jak i poniższy szczegółowy opis przedstawiają korzystne wykonania i nie stanowią ograniczenia wynalazku lub innych alternatywnych wykonań wynalazku. W szczególności, podczas gdy wynalazek jest opisany tutaj w odniesieniu do pewnej liczby określonych wykonań, należy zdawać sobie sprawę, że opis ilustruje wynalazek i nie jest skonstruowany w celu ograniczenia wynalazku. Specjaliści w tej dziedzinie mogą odkryć różne modyfikacje i zastosowania, jak to opisano w załączonych zastrzeżeniach. Podobnie, inne cele, właściwości, korzyści i zalety niniejszego wynalazku będą oczywiste na podstawie niniejszego podsumowania i pewnych wykonań opisanych poniżej i będą one oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie. Te cele, właściwości, korzyści i zalety będą oczywiste na podstawie powyższego tekstu i w połączeniu z załączonymi przykładami, danymi, rysunkami i wszystkimi sensownymi wnioskami, które mogą wynikać z niego samego lub w połączeniu z odniesieniami tutaj załączonymi. Krótki opis rysunków [0014] Różne aspekty i zastosowania niniejszego wynalazku staną się oczywiste dla specjalisty w tej dziedzinie po rozważeniu krótkiego opisu rysunków i

18 szczegółowego opisu niniejszego wynalazku oraz jego korzystnych wykonań, które są następujące: [fig. 1-1] Fig. 1 przedstawia wyniki poszukiwania peptydów epitopowych, które z kolei demonstrują, że CDH3-A (NR ID. SEKW.: 34), CDH3-A (NR ID. SEKW.: 38), CDH3-A (NR ID. SEKW.: 19), CDH3-A (NR ID. SEKW.: 22), CDH3-A (NR ID. SEKW.: ) oraz CDH3-A24--6 (NR ID. SEKW.: 344) wykazują silne wytwarzanie IFN-gamma. a przedstawia przykład peptydów ujemnych, dla których nie wykryto zdolności indukcji CTL pomimo możliwego wiązania się z HLA-A*2402. b przedstawia zdolność CDH3-A (NR ID. SEKW.: 34) do indukcji CTL. CDH3-A (NR ID. SEKW.: 34) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia CTL, którą wyprowadzono z dodatniej studzienki #4 oznaczonej w studzienkach prostokątem, wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko docelowym komórkom, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. c przedstawia zdolność CDH3-A (NR ID. SEKW.: 38) do indukcji CTL. CDH3-A (NR ID. SEKW.: 38) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia CTL, którą wyprowadzono z dodatniej studzienki #4 oznaczonej w studzienkach prostokątem, wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko docelowym komórkom, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. d przedstawia zdolność CDH3-A (NR ID. SEKW.: 19) do indukcji CTL. CDH3-A (NR ID. SEKW.: 19) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT. Studzienka #6 w

19 1 2 studzienkach oznaczonych prostokątem na lewym panelu, wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. Ponadto, linia CTL, którą wyprowadzono z dodatniej studzienki # oznaczonej w studzienkach prostokątem na środkowym panelu, wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. e przedstawia zdolność CDH3-A (NR ID. SEKW.: 22) do indukcji CTL. CDH3-A (NR ID. SEKW.: 22) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia CTL, którą wyprowadzono z dodatniej studzienki #2 oznaczonej w studzienkach prostokątem, wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. [fig.1-2] Fig. 1 przedstawia wyniki poszukiwania peptydów epitopowych, które z kolei demonstrują, że CDH3-A (NR ID. SEKW.: 34), CDH3-A (NR ID. SEKW.: 38), CDH3-A (NR ID. SEKW.: 19), CDH3-A (NR ID. SEKW.: 22), CDH3-A (NR ID. SEKW.: ) oraz CDH3-A24--6 (NR ID. SEKW.: 344) wykazują silne wytwarzanie IFN-gamma. f przedstawia zdolność CDH3-A (NR ID. SEKW.: ) do indukcji CTL. CDH3-A (NR ID. SEKW.: ) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia i klon CTL wyprowadzono z dodatniej studzienki # oznaczonej w studzienkach prostokątem. Wyprowadzony klon CTL wzbudzony przeciwko peptydowi wykazywał specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 transfekowanym zarówno pełnej długości genem CDH3,

20 jak i cząsteczką HLA-A24 (dolny wykres po prawej). Z drugiej strony, COS7 transfekowane pełnej długości CDH3, ale nie HLA-A24, oraz COS7 transfekowane HLA-A24, ale nie pełnej długości CDH3, zostały przygotowane jako kontrola ujemna. Klon CTL wykazywał wysoką specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 transfekowanym zarówno CDH3, jak i HLA-A24. g przedstawia zdolność CDH3-A (NR ID. SEKW.: 344) do indukcji CTL. CDH3-A (NR ID. SEKW.: 344) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście w IFN-gamma ELISPOT, a linię i klon CTL wyprowadzono z dodatniej studzienki #1 oznaczonej w studzienkach prostokątem. Wyprowadzony klon CTL wzbudzony przeciwko peptydowi wykazywał specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 transfekowanym zarówno pełnej długości genem CDH3, jak i cząsteczką HLA-A24 (dolny wykres po prawej). Z drugiej strony, COS7 transfekowane pełnej długości CDH3, ale nie HLA-A24, oraz COS7 transfekowane HLA-A24, ale nie pełnej długości CDH3, przygotowano jako kontrolę ujemną. Klon CTL wykazywał wysoką specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7, które były transfekowane zarówno CDH3, jak i HLA-A24. [fig.2] Fig. 2 przedstawia wyniki poszukiwania peptydów epitopowych, które z kolei demonstrują, że Epha4-A (NR ID. SEKW.: 41), Epha4-A24-9- (NR ID. SEKW.: 44), Epha4-A (NR ID. SEKW.: 48), Epha4-A (NR ID. SEKW.: 46), Epha4-A (NR ID. SEKW.: 78), Epha4-A (NR ID. SEKW.: 376) oraz Epha4- A (NR ID. SEKW.: 379) wykazują silne wytwarzanie IFN-gamma. a przedstawia przykład ujemnych peptydów, dla których nie wykryto zdolności

21 indukcji CTL, pomimo możliwego wiązania się z HLA. b przedstawia zdolność Epha4-A (NR ID. SEKW.: 41) do indukcji CTL. Epha4-A (NR ID. SEKW.: 41) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia CTL, którą wyprowadzono z dodatniej studzienki #3 oznaczonej w studzienkach prostokątem, wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. c przedstawia zdolność Epha4-A24-9- (NR ID. SEKW.: 44) do indukcji CTL. Epha4-A24-9- (NR ID. SEKW.: 44) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia CTL, którą wyprowadzono z dodatniej studzienki #2 oznaczonej w studzienkach prostokątem wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko docelowym komórkom, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. d przedstawia zdolność Epha4-A (NR ID. SEKW.: 48) do indukcji CTL. Epha4-A (NR ID. SEKW.: 48) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT. Studzienka #6 oznaczona w studzienkach prostokątem w górnym panelu wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko docelowym komórkom, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. Ponadto, linia CTL, którą wyprowadzono z dodatniej studzienki #6 oznaczonej w studzienkach prostokątem w środkowym panelu, wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. e przedstawia zdolność Epha4-A (NR ID. SEKW.: 46) do indukcji CTL. Epha4-A (NR ID. SEKW.: 46)

22 wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia CTL, którą wyprowadzono z dodatniej studzienki # oznaczonej w studzienkach prostokątem wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. f przedstawia zdolność Epha4-A (NR ID. SEKW.: 78) do indukcji CTL. Epha4-A (NR ID. SEKW.: 78) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia CTL, którą wyprowadzono z dodatniej studzienki #4 oznaczonej w studzienkach prostokątem, wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. g przedstawia zdolność Epha4-A (NR ID. SEKW.: 376) do indukcji CTL. Epha4-A (NR ID. SEKW.: 376) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia CTL oraz klon został wyprowadzony z dodatniej studzienki #8 oznaczonej w studzienkach prostokątem. Aktywność cytotoksyczną wyprowadzonej linii CTL przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu, zmierzono w teście uwalniania Cr (CRA, ang. Cr-release assay) (dolny wykres), i linia CTL posiadała bardzo silną specyficzną aktywność cytotoksyczną przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. h przedstawia zdolność Epha4-A (NR ID. SEKW.: 379) do indukcji CTL. Epha4-A (NR ID. SEKW.: 379) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia CTL została wyprowadzona z

23 dodatniej studzienki #3 oznaczonej w studzienkach prostokątem. Aktywność cytotoksyczną wyprowadzonej linii CTL przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu, mierzono w teście uwalniania Cr (CRA) (wykres po prawej), i linia CTL posiadała bardzo silną specyficzną aktywność cytotoksyczną przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydów. [fig.3] Fig. 3 przedstawia wyniki poszukiwania peptydów epitopowych, które z kolei demonstrują, że ECT2-A (NR ID. SEKW.: 80), ECT2-A (NR ID. SEKW.: 0) oraz ECT2-A24--1 (NR ID. SEKW.: 1) wykazują silne wytwarzanie IFN-gamma. a przedstawia przykład ujemnych peptydów, dla których nie wykryto zdolności indukującej CTL, pomimo możliwego wiązania się z HLA. b przedstawia zdolność ECT2-A (NR ID. SEKW.: 80) do indukcji CTL. ECT2-A (NR ID. SEKW.: 80) wykazywał silne wytwarzanie CTL w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT. Studzienki # i #7 oznaczone w studzienkach prostokątami na lewym panelu przedstawiały specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. Ponadto, linia CTL, którą wyprowadzono z dodatniej studzienki #7 oznaczonej w studzienkach prostokątem na drugim panelu, wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. Aktywność cytotoksyczną linii CTL przeciwko linii komórek rakowych TE6 z endogenną ekspresją ECT2 i HLA-A24 mierzono w teście uwalniania Cr (CRA), i klon CTL posiadał bardzo silną aktywność cytotoksyczną przeciwko

24 2 1 2 TE6. Z drugiej strony, komórki efektorowe nie wykazywały aktywności cytotoksycznej linii CTL przeciwko rakowej linii komórkowej TE z ekspresją jedynie ECT2. c przedstawia zdolność ECT2-A (NR ID. SEKW.: 0) do indukcji CTL. ECT2-A (NR ID. SEKW.: 0) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia i klon CTL wyprowadzono z dodatniej studzienki #2 oznaczonej w studzienkach prostokątem. Wyprowadzony klon CTL wzbudzony przeciwko peptydowi wykazywał specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 transfekowanym zarówno pełnej długości genem ETC2, jak i cząsteczką HLA-A24. Z drugiej strony, jako kontrolę ujemną przygotowano COS7 transfekowane pełnej długości ETC2, ale nie HLA-A24, COS7 transfekowane COS7 HLA-A24 i genem URLC jako substytutem pełnej długości ETC2 oraz COS7 transfekowane HLA-A24 i poddane pulsowemu dzialaniu ECT2--1. Klon CTL wykazywał wysoką specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 transfekowanym zarówno ECT2, jak i HLA-A24. d przedstawia zdolność ECT2-A24--1 (NR ID. SEKW.: 1) do indukcji CTL. ECT2-A24--1 (NR ID. SEKW.: 1) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linię CTL wyprowadzono z dodatniej studzienki #1 oznaczonej w studzienkach prostokątem. Wyprowadzona linia CTL wzbudzona przeciwko peptydowi wykazywała specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 transfekowanym zarówno pełnej długości genem ECT2, jak i cząsteczką HLA-A24. Jako kontrolę ujemną przygotowano COS7 transfekowane pełnej długości ECT2, ale nie HLA- A24, COS7 transfekowane HLA-A24 i genem URLC jako

25 substytutem pełnej długości ECT2 oraz COS7 transfekowane HLA-A24, które poddano pulsowemu działaniu ECT Klon CTL wykazywał wysoką specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7, które transfekowano zarówno ECT2, jak i HLA-A24. [fig.4-1] Fig. 4 przedstawia wyniki poszukiwania peptydów epitopowych, które z kolei demonstrują, że HIG2-A (NR ID. SEKW.: 1), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 111), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 387), HIG2-A24--7 (NR ID. SEKW.: 112), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 394), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 116), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 117) oraz HIG2-A02--8 (NR ID. SEKW.: 121) wykazują silne wytwarzanie IFN-gamma. a przedstawia przykład ujemnych peptydów, dla których nie wykryto zdolności indukującej CTL pomimo możliwego wiązania się z HLA. b przedstawia zdolność HIG2-A (NR ID. SEKW.: 1) do indukcji CTL. HIG2-A (NR ID. SEKW.: 1) wykazywał silne wytwarzanie IFNgamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia CTL, którą wyprowadzono z dodatniej studzienki #6 oznaczonej w studzienkach prostokątem, wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko docelowym komórkom, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. c przedstawia zdolność HIG2-A (NR ID. SEKW.: 111) do indukcji CTL. HIG2-A (NR ID. SEKW.: 111) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia i klon CTL, które wyprowadzono z dodatniej studzienki #7 oznaczonej w studzienkach prostokątem, wykazywały specyficzną odpowiedź przeciwko docelowym komórkom, które poddano pulsowemu działaniu peptydu

26 epitopowego. d przedstawia zdolność HIG2-A (NR ID. SEKW.: 387) do indukcji CTL. HIG2-A (NR ID. SEKW.: 387) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia i klon CTL, które wyprowadzono z dodatniej studzienki # oznaczonej w studzienkach prostokątem, wykazywały specyficzną odpowiedź przeciwko docelowym komórkom, które poddano pulsowemu dzialaniu peptydu epitopowego. e przedstawia zdolność HIG2-A (NR ID. SEKW.: 114) do indukcji CTL. HIG2-A (NR ID. SEKW.: 114) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linię CTL wyprowadzono z dodatniej studzienki # oznaczonej w studzienkach prostokątem. Wyprowadzona linia CTL wzbudzona przeciwko peptydowi wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko 293T transfekowanym zarówno pełnej długości genem HIG2, jak i cząsteczką HLA-A02. Jako kontrolę ujemną przygotowano 293T transfekowane pełnej długości HIG2, ale nie HLA-A02, 293T transfekowane HLA-A02 i genem FoxP3 jako substytutem pełnej długości HIG2 oraz 293T transfekowane HLA-A02, które poddano pulsowemu działaniu HIG Linia CTL wykazywała wysoką specyficzną aktywność CTL przeciwko 293T, które transfekowano zarówno HIG2, jak i HLA-A02. [fig.4-2] Fig. 4 przedstawia wyniki poszukiwania peptydów epitopowych, które z kolei demonstrują, że HIG2-A (NR ID. SEKW.: 1), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 111), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 387), HIG2-A24--7 (NR ID. SEKW.: 112), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 394), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 116),

27 HIG2-A (NR ID. SEKW.: 117) oraz HIG2-A02--8 (NR ID. SEKW.: 121) wykazują silne wytwarzanie IFN-gamma. f przedstawia zdolność HIG2-A24--7 (NR ID. SEKW.: 112) do indukcji CTL. HIG2-A24--7 (NR ID. SEKW.: 112) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia CTL lub klon, które wyprowadzono z dodatnich studzienek #1 i #7 oznaczonych w studzienkach prostokątami wykazywały specyficzną odpowiedź przeciwko docelowym komórkom, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. g przedstawia zdolność HIG2-A (NR ID. SEKW.: 394) do indukcji CTL. HIG2-A (NR ID. SEKW.: 394) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia i klon CTL, które wyprowadzono z dodatniej studzienki #7 oznaczonej w studzienkach prostokątem, wykazywały specyficzną odpowiedź przeciwko docelowym komórkom, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. h przedstawia zdolność HIG2-A (NR ID. SEKW.: 116) do indukcji CTL. HIG2-A (NR ID. SEKW.: 116) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linię CTL wyprowadzono z dodatniej studzienki # oznaczonej w studzienkach prostokątem. Wyprowadzona linia CTL wzbudzona przeciwko peptydowi wykazywała specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 transfekowanym zarówno pełnej długości genem HIG2, jak i cząsteczką HLA-A02. Jako kontrolę ujemną przygotowano COS7 transfekowane pełnej długości HIG2, ale nie HLA-A02, oraz COS7 transfekowane HLA-02, i poddane pulsowemu działaniu peptydu HIG Linia CTL wykazywała silną

28 specyficzną aktywność przeciwko COS7, które transfekowano zarówno HIG2, jak i HLA-A02. [fig.4-3] Fig. 4 przedstawia wyniki poszukiwania peptydów epitopowych, które z kolei demonstrują, że HIG2-A (NR ID. SEKW.: 1), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 111), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 387), HIG2-A24--7 (NR ID. SEKW.: 112), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 394), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 116), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 117) oraz HIG2-A02--8 (NR ID. SEKW.: 121) wykazują silne wytwarzanie IFN-gamma. i przedstawia zdolność HIG2-A (NR ID. SEKW.: 117) do indukcji CTL. HIG2-A (NR ID. SEKW.: 117) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linię oraz klon CTL wyprowadzono z dodatniej studzienki # oznaczonej w studzienkach prostokątem. Wyprowadzona linia CTL wzbudzona przeciwko peptydowi wykazywała specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 transfekowanym zarówno pełnej długości genem HIG2, jak i cząsteczką HLA-A02 (środkowy wykres). Jako kontrolę ujemną przygotowano także COS7 transfekowane pełnej długości HIG2, ale nie HLA-A02, COS7 transfekowane HLA-02 i genem TTK jako substytutem pełnej długości HIG2 oraz COS7 transfekowane HLA-A02, i poddane pulsowemu działaniu peptydu HIG Aktywność cytotoksyczną klonu CTL przeciwko 293T, transfekowanym pełnej długości genem HIG2 i cząsteczką HLA-A02, oraz rakowej linii komórkowej Caki-1 z endogenną ekspresją HIG2 i HLA-A02 mierzono testem uwalniania Cr (CRA) (wykresy poniżej), i klon CTL posiadał bardzo silną aktywność cytotoksyczną przeciwko komórkom transfekowanym zarówno

29 1 2 genem HIG2, jak i HLA-A02, oraz Caki-1. Z drugiej strony komórki efektorowe nie wykazywały aktywności cytotoksycznej CTL przeciwko 293T transfekowanym tylko HIG2 lub tylko HLA-A02, oraz rakowej linii komórkowej A498 z ekspresją tylko HIG2. j przedstawia zdolność HIG2-A02--8 (NR ID. SEKW.: 121) do indukcji CTL. HIG2-A02--8 (NR ID. SEKW.: 121) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia CTL, którą wyprowadzono z dodatniej studzienki #9 oznaczonej w studzienkach prostokątem, wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko docelowym komórkom, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. [fig.-1] Fig. przedstawia wyniki poszukiwania peptydów epitopowych, które z kolei demonstrują, że INHBB-A (NR ID. SEKW.: 39), INHBB-A (NR ID. SEKW.: 133), INHBB-A24-- (NR ID. SEKW.: 13), INHBB-A24--7 (NR ID. SEKW.: 137) oraz INHBB- A (NR ID. SEKW.: 426) wykazują silne wytwarzanie IFN-gamma. a przedstawia przykład ujemnych peptydów, dla których nie wykryto zdolności indukującej CTL pomimo możliwego wiązania się z HLA. b przedstawia zdolność INHBB-A (NR ID. SEKW.: 39) do indukcji CTL. INHBB-A (NR ID. SEKW.: 39) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linię i klon CTL wyprowadzono z dodatniej studzienki #7 oznaczonej w studzienkach prostokątem. Aktywność cytotoksyczną wyprowadzonego klonu CTL przeciwko komórkom nowotworowym Miapaca2 z ekspresją zarówno INHBB, jak i HLA-A02, mierzono w teście uwalniania Cr (CRA), i

30 komórki efektorowe wykazywały wysoką specyficzną aktywność przeciwko Miapaca2. Z drugiej strony nie wykazywały znaczącej specyficznej aktywności cytotoksycznej przeciwko Caki-1 z ekspresją INHBB, ale nie HLA-A02. c przedstawia zdolność INHBB-A (NR ID. SEKW.: 133) do indukcji CTL. INHBB-A (NR ID. SEKW.: 133) wykazywał silne wytwarzanie IFNgamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linię wyprowadzono z dodatniej studzienki #3 oznaczonej w studzienkach prostokątem. Wyprowadzona linia CTL wzbudzona przeciwko peptydowi wykazywała wysoką specyficzną aktywność CTL przeciwko 293T transfekowanym zarówno pełnej długości genem INHBB, jak i cząsteczką HLA-A24. Jako kontrolę ujemną przygotowano także 293T transfekowane pełnej długości INHBB, ale nie HLA-A24, oraz 293T transfekowane HLA-A24, które poddano pulsowemu działaniu peptydu INHBB--. [fig.-2] Fig. przedstawia wyniki poszukiwania peptydów epitopowych, które z kolei demonstrują, że INHBB-A (NR ID. SEKW.: 39), INHBB-A (NR ID. SEKW.: 133), INHBB-A24-- (NR ID. SEKW.: 13), INHBB-A24--7 (NR ID. SEKW.: 137) oraz INHBB- A (NR ID. SEKW.: 426) wykazują silne wytwarzanie IFN-gamma. d przedstawia zdolność INHBB- A24-- (NR ID. SEKW.: 13) do indukcji CTL. INHBB- A24-- (NR ID. SEKW.: 13) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linię oraz klon CTL wyprowadzono z dodatniej studzienki #2 oznaczonej w studzienkach prostokątem. Wyprowadzony klon CTL wzbudzony przeciwko peptydowi wykazywał silną specyficzną aktywność CTL

31 przeciwko 293T transfekowanym zarówno pełnej długości genem INHBB, jak i cząsteczką HLA-A24. Jako kontrolę ujemną przygotowano także 293T transfekowane pełnej długości INHBB, ale nie HLA-A24, oraz 293T transfekowane HLA-A24, które poddano pulsowemu działaniu peptydu INHBB e przedstawia zdolność INHBB-A24--7 (NR ID. SEKW.: 137) do indukcji CTL. INHBB-A24--7 (NR ID. SEKW.: 137) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linie CTL wyprowadzono z dodatniej studzienki #8 oznaczonej prostokątem w studzienkach na górnym panelu oraz #2 oznaczonej prostokątem w studzienkach na dolnym panelu. Linia CTL wyprowadzona ze studzienki #8 wykazywała specyficzną aktywność CTL przeciwko 293T transfekowanym zarówno pełnej długości genem INHBB, jak i cząsteczką HLA-A24. Jako kontrolę ujemną przygotowano także 293T transfekowane pełnej długości INHBB, ale nie HLA-A24, oraz 293T transfekowane HLA-A24 i które poddano pulsowemu działaniu peptydu INHBB--40. f przedstawia zdolność INHBB-A (NR ID. SEKW.: 426) do indukcji CTL. INHBB-A (NR ID. SEKW.: 426) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia CTL, którą wyprowadzono z dodatniej studzienki #1 oznaczonej w studzienkach prostokątem, wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko docelowym komórkom, do których wprowadzono peptyd epitopowy. [fig.6-1] Fig. 6 przedstawia wyniki poszukiwania peptydów epitopowych, które z kolei demonstrują, że KIFA-A24--4 (NR ID. SEKW.: 186), KIFA-A

32 (NR ID. SEKW.: 178), KIFA-A (NR ID. SEKW.: 194) oraz KIFA-A24-9- (NR ID. SEKW.: 174) wykazują silne wytwarzanie IFN-gamma. a przedstawia przykład ujemnych peptydów, dla których nie wykryto zdolności indukującej CTL pomimo możliwego wiązania się z HLA. b przedstawia zdolność KIFA-A24--4 (NR ID. SEKW.: 186) do indukcji CTL. KIFA-A24--4 (NR ID. SEKW.: 186) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT. Studzienka # oznaczona prostokątem w studzienkach na dolnym prawym panelu wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. Ponadto, linia i klon CTL, które wyprowadzono z dodatniej studzienki # oznaczonej prostokątem w studzienkach na górnym lewym panelu, także wykazywały specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. Wyprowadzony klon CTL wzbudzony przeciwko peptydowi wykazywał także specyficzną aktywność CTL przeciwko 24-LCL transfekowanym pełnej długości genem KIFA. Jako kontrolę ujemną przygotowano także A24-LCL transfekowane pustym wektorem. Aktywność cytotoksyczną klonu CTL przeciwko komórkom nowotworowym Miapaca2 z ekspresją zarówno KIFA, jak i HLA-A24, mierzono w teście uwalniania Cr (CRA), i klon CTL wykazywał wysoką specyficzną aktywność przeciwko Miapaca2 (dolny prawy wykres). Z drugiej strony nie wykazywał znaczącej specyficznej aktywności cytotoksycznej przeciwko PK9 z ekspresją KIFA, ale nie HLA-A02. c przedstawia zdolność KIFA-A (NR ID. SEKW.: 178) do

33 indukcji CTL. KIFA-A (NR ID. SEKW.: 178) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT. Studzienki #3 i 4 oznaczone prostokątami w studzienkach na prawym panelu wykazywały specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. Ponadto, linia CTL, którą wyprowadzono z dodatniej studzienki #3 oznaczonej prostokątem w studzienkach na lewym panelu także wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. Wyprowadzona linia CTL wzbudzona przeciwko peptydowi wykazywała także wysoką specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 transfekowanym zarówno pełnej długości genem KIFA, jak i cząsteczką HLA-A24. Jako kontrolę ujemną przygotowano także COS7 transfekowane pełnej długości KIFA, ale nie HLA-A24, oraz COS7 transfekowane HLA-A24 i które poddano pulsowemu działaniu peptydu KIFA [fig.6-2] Fig. 6 przedstawia wyniki poszukiwania peptydów epitopowych, które z kolei demonstrują, że KIFA-A24--4 (NR ID. SEKW.: 186), KIFA-A (NR ID. SEKW.: 178), KIFA-A (NR ID. SEKW.: 194) oraz KIFA-A24-9- (NR ID. SEKW.: 174) wykazują silne wytwarzanie IFN-gamma. d przedstawia zdolność KIFA-A (NR ID. SEKW.: 194) do indukcji CTL. KIFA-A (NR ID. SEKW.: 194) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linie CTL, które wyprowadzono z dodatniej studzienki #6 oznaczonej prostokątem w studzienkach na górnym lewym panelu oraz #3 oznaczonej

34 3 1 2 prostokątem w studzienkach na dolnym środkowym panelu wykazywały specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. Ponadto, klon CTL, wyselekcjonowany z linii CTL ze studzienki #6 metodą granicznego rozcieńczenia, wykazywał specyficzną aktywność CTL przeciwko komórkom docelowym. Wyprowadzony klon CTL wykazywał specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 transfekowanym zarówno pełnej długości genem KIFA, jak i cząsteczką HLA-A24. Jako kontrolę ujemną przygotowano także COS7 transfekowane pełnej długości KIFA, ale nie HLA-A24, COS7 transfekowane HLA-A24 i genem URLC jako substytutem pełnej długości KIFA oraz COS7 transfekowane HLA-A24 i które poddano pulsowemu działaniu peptydu KIFA--8. e przedstawia zdolność KIFA-A24-9- (NR ID. SEKW.: 174) do indukcji CTL. KIFA-A24-9- (NR ID. SEKW.: 174) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linie CTL, które wyprowadzono z dodatniej studzienki #2 oznaczonej prostokątem w studzienkach na górnym lewym panelu oraz #6 oznaczonej prostokątem na dolnym środkowym panelu, wykazywały specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. Ponadto, klon CTL, wyselekcjonowany z linii CTL ze studzienki #2 metodą granicznego rozcieńczenia, wykazywał specyficzną aktywność CTL przeciwko komórkom docelowym. Aktywność cytotoksyczną klonu CTL przeciwko komórkom nowotworowym PK4P z ekspresją zarówno KIFA, jak i HLA-A24, mierzono w teście uwalniania Cr (CRA), i klon CTL wykazywał bardzo

35 wysoką aktywność cytotoksyczną przeciwko PK4P. Z drugiej strony nie wykazywał znaczącej specyficznej aktywności cytotoksycznej przeciwko PK9 z ekspresją KIFA, ale nie HLA-A02. [fig.7-1] Fig. 7 przedstawia wyniki poszukiwania peptydów epitopowych, które z kolei demonstrują, że KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 196), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 2), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 2), KNTC2-A24-9- (NR ID. SEKW.: 213), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 214), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 217) oraz KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 223) wykazują silne wytwarzanie IFN-gamma. a przedstawia przykład ujemnych peptydów, dla których nie wykryto zdolności indukującej CTL pomimo możliwego wiązania się z HLA. b przedstawia zdolność KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 196) do indukcji CTL. KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 196) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia CTL, którą wyprowadzono z dodatniej studzienki #8 oznaczonej w studzienkach prostokątem, wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, do których wprowadzono peptyd epitopowy. c przedstawia zdolność KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 2) do indukcji CTL. KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 2) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia CTL, którą wyprowadzono z dodatniej studzienki # oznaczonej w studzienkach prostokątem, wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. d przedstawia zdolność KIFA-A (NR ID. SEKW.:

36 ) do indukcji CTL. KIFA-A (NR ID. SEKW.: 2) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia i klon CTL, które wyprowadzono z dodatniej studzienki # oznaczonej w studzienkach prostokątem, wykazywały specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. e przedstawia zdolność KNTC2-A24-9- (NR ID. SEKW.: 213) do indukcji CTL. KNTC2-A24-9- (NR ID. SEKW.: 213) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia CTL, którą wyprowadzono z dodatniej studzienki #7 oznaczonej w studzienkach prostokątem wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. [fig.7-2] Fig. 7 przedstawia wyniki poszukiwania peptydów epitopowych, które z kolei demonstrują, że KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 196), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 2), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 2), KNTC2-A24-9- (NR ID. SEKW.: 213), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 214), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 217) oraz KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 223) wykazują silne wytwarzanie IFN-gamma. f przedstawia zdolność KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 214) do indukcji CTL. KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 214) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linie i klon CTL, które wyprowadzono z dodatniej studzienki #4 oznaczonej prostokątem w studzienkach na górnym lewym panelu oraz # oznaczonej prostokątem w studzienkach na środkowym panelu, wykazywały specyficzną odpowiedź

37 przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. Ponadto, klon CTL, wyselekcjonowany z linii CTL ze studzienki # metodą granicznego rozcieńczenia, wykazywał specyficzną aktywność CTL przeciwko komórkom docelowym. Linia CTL wyprowadzona ze studzienki #4 wykazywała specyficzną aktywność CTL przeciwko HEK293 transfekowanym zarówno pełnej długości genem KNTC2, jak i cząsteczką HLA-A24. Jako kontrolę ujemną przygotowano także HEK293 transfekowane pełnej długości KNTC2, ale nie HLA-A24, HEK293 transfekowane HLA-A24, ale nie pełnej długości KNTC22, oraz HEK293 transfekowane HLA-A24 i które poddano pulsowemu działaniu peptydu KNTC-9-9. g przedstawia zdolność KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 217) do indukcji CTL. KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 217) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia CTL, którą wyprowadzono z dodatniej studzienki # 1 oznaczonej w studzienkach prostokątem, wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. h przedstawia zdolność KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 223) do indukcji CTL. KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 223) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia CTL, którą wyprowadzono z dodatniej studzienki #8 oznaczonej w studzienkach prostokątem, wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. [fig.8-1] Fig. 8 przedstawia wyniki poszukiwania peptydów epitopowych, które z kolei demonstrują, że

38 TTK-A (NR ID. SEKW.: 227), TTK-A (NR ID. SEKW.: 233), TTK-A (NR ID. SEKW.: 228) oraz TTK-A (NR ID. SEKW.: 24) wykazują silne wytwarzanie IFN-gamma. a przedstawia przykład ujemnych peptydów, dla których nie wykryto zdolności indukującej CTL pomimo możliwego wiązania się z HLA. b przedstawia zdolność TTK-A (NR ID. SEKW.: 227) do indukcji CTL. TTK-A (NR ID. SEKW.: 227) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia i dwa klony CTL, które wyprowadzono z dodatniej studzienki #4 oznaczonej w studzienkach prostokątem, wykazywały specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. Wyprowadzony klon CTL, wykazywał wysoką specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 transfekowanym zarówno pełnej długości genem TTK, jak i cząsteczką HLA-A02. Jako kontrolę ujemną przygotowano także COS7 transfekowane pełnej długości TTK, ale nie HLA-A02, COS7 transfekowane HLA-A02, ale nie pełnej długości TTK, oraz COS7 transfekowane HLA-A02 i które poddano pulsowemu działaniu peptydu TTK c przedstawia zdolność TTK-A (NR ID. SEKW.: 233) do indukcji CTL. TTK-A (NR ID. SEKW.: 233) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linię i klony CTL wyprowadzono z dodatniej studzienki #1 oznaczonej w studzienkach prostokątem. Wyprowadzona linia CTL wykazywała wysoką specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 transfekowanym zarówno pełnej długości genem TTK, jak i cząsteczką HLA-A02. Jako kontrolę ujemną przygotowano także COS7

39 transfekowane pełnej długości TTK, ale nie HLA-A02, i COS7 transfekowane HLA-A02 oraz genem HIG2 jako substytutem pełnej długości TTK. [fig.8-2] Fig. 8 przedstawia wyniki poszukiwania peptydów epitopowych, które z kolei demonstrują, że TTK-A (NR ID. SEKW.: 227), TTK-A (NR ID. SEKW.: 233), TTK-A (NR ID. SEKW.: 228) oraz TTK-A (NR ID. SEKW.: 24) wykazują silne wytwarzanie IFN-gamma. d przedstawia zdolność TTK- A (NR ID. SEKW.: 228) do indukcji CTL. TTK-A (NR ID. SEKW.: 228) wykazywał silne wytwarzanie TFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linię i klony CTL wyprowadzono z dodatniej studzienki #2 oznaczonej w studzienkach prostokątem. Wyprowadzona linia CTL wykazywała specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 transfekowanym zarówno pełnej długości genem TTK, jak i cząsteczką HLA-A02. Jako kontrolę ujemną przygotowano także COS7 transfekowane pełnej długości TTK, ale nie HLA-A02, COS7 transfekowane HLA-A02, ale nie pełnej długości TTK, oraz COS7 transfekowane HLA-A02 i które poddano pulsowemu działaniu peptydu TTK [fig.8-3] Fig. 8 przedstawia wyniki poszukiwania peptydów epitopowych, które z kolei demonstrują, że TTK-A (NR ID. SEKW.: 227), TTK-A (NR ID. SEKW.: 233), TTK-A (NR ID. SEKW.: 228) oraz TTK-A (NR ID. SEKW.: 24) wykazują silne wytwarzanie IFN-gamma. e przedstawia zdolność TTK- A (NR ID. SEKW.: 24) do indukcji CTL. TTK- A (NR ID. SEKW.: 24) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście

40 IFN-gamma ELISPOT, a linię i trzy klony CTL wyprowadzono z dodatniej studzienki #8 oznaczonej w studzienkach prostokątem. Wyprowadzony klon CTL wykazywał specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 transfekowanym zarówno pełnej długości genem TTK, jak i cząsteczką HLA-A02. Jako kontrolę ujemną przygotowano także COS7 transfekowane pełnej długości TTK, ale nie HLA-A02, COS7 transfekowane HLA-A02, ale nie pełnej długości TTK, oraz COS7 transfekowane HLA-A02, które poddano pulsowemu działaniu peptydu TTK [fig.9-1] Fig. 9 przedstawia wyniki poszukiwania peptydów epitopowych, które z kolei demonstrują, że URLC-A (NR ID. SEKW.: 271), URLC-A (NR ID. SEKW.: 272) oraz URLC-A (NR ID. SEKW.: 288) wykazują silne wytwarzanie IFN-gamma. a przedstawia przykład ujemnych peptydów, dla których nie wykryto zdolności indukującej CTL pomimo możliwego wiązania się z HLA. b przedstawia zdolność URLC- A (NR ID. SEKW.: 271) do indukcji CTL. URLC- A (NR ID. SEKW.: 271) wykazywał silne wytwarzanie IFN-gamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia CTL, którą wyprowadzono z dodatniej studzienki #7 oznaczonej w studzienkach prostokątem, wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, do których wprowadzono peptyd epitopowy. c przedstawia zdolność URLC-A (NR ID. SEKW.: 272) do indukcji CTL. URLC-A (NR ID. SEKW.: 272) wykazywał silne wytwarzanie IFNgamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia CTL, którą wyprowadzono z dodatniej studzienki #3 oznaczonej w studzienkach prostokątem,

41 wykazywała specyficzną odpowiedź przeciwko komórkom docelowym, które poddano pulsowemu działaniu peptydu epitopowego. d przedstawia zdolność URLC-A (NR ID. SEKW.: 288) do indukcji CTL. URLC-A (NR ID. SEKW.: 288) wykazywał silne wytwarzanie IFNgamma w porównaniu z kontrolą w teście IFN-gamma ELISPOT, a linia i klony CTL, które wyprowadzono z dodatniej studzienki # oznaczonej w studzienkach prostokątem. [fig.9-2] Fig. 9 przedstawia wyniki poszukiwania peptydów epitopowych, które z kolei demonstrują, że URLC-A (NR ID. SEKW.: 271), URLC-A (NR ID. SEKW.: 272) oraz URLC-A (NR ID. SEKW.: 288) wykazują silne wytwarzanie IFN-gamma. Kontynuacja d Wyprowadzony klon CTL wykazywał wysoką specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7, Hek293 i 293T, które transfekowano zarówno pełnej długości genem URLC, jak i cząsteczką HLA-A02. Jako ujemną kontrolę przygotowano także COS7, Hek293 lub 293T, które transfekowano pełnej długości URLC, ale nie HLA-A02, oraz COS7, Hek293 lub 293T, które transfekowano HLA-A02 i które poddano pulsowemu działaniu URLC--64. Na tych rysunkach + oznacza cel, który poddano pulsowemu działaniu peptydu, - oznacza cel, którego nie poddano pulsowemu działaniu peptydu, R oznacza odpowiadającą, S oznacza stymulator, E oznacza efektor, a T oznacza cel. Szczegółowy opis wynalazku [001] Stosowane tutaj słowa w liczbie pojedynczej oznaczają przynajmniej jeden, jeśli nie zostało

42 wyraźnie wskazane, że jest inaczej. Jeśli nie zostało to zdefiniowane inaczej, wszystkie stosowane tutaj określenia techniczne i naukowe posiadają to samo znaczenie, jakie jest znane specjaliście w tej dziedzinie, do której należy ten wynalazek. [0016] Niniejszy wynalazek jest oparty częściowo na odkryciu celów możliwych do zastosowania w immunoterapii. Identyfikacja nowych peptydów TAA, szczególnie tych, które indukują silne i specyficzne przeciwnowotworowe odpowiedzi immunologiczne, daje podstawy do dalszego opracowywania zastosowań klinicznych w strategii szczepienia peptydami w różnych typach raka (Boon T i wsp., (1996) J Exp Med 183: 72-9.; van der Bruggen P i wsp., (1991) Science 24: ; Brichard V i wsp., (1993) J Exp Med 178: ; Kawakami Y i wsp., (1994) J Exp Med 180: ; Shichijo S i wsp., (1998) J Exp Med 187: ; Chen YT i wsp., (1997) Proc.Natl.Acd. Sci.USA, 94: ; Harris CC, (1996) J Natl Cancer Inst 88:1442-.; Butterfield LH i wsp., (1999) Cancer Res 9: ; Vissers JL i wsp., (1999) Cancer Res 9: 4-9.; van der Burg SH i wsp., (1996) J. Immunol 16:38-14.; Tanaka F i wsp., (1997) Cancer Res 7:446-8.; Fujie T i wsp., (1999) Int J Cancer 80: ; Kikuchi M i wsp., (1999) Int J Cancer 81 : ; Oiso M i wsp., (1999) Int J Cancer 81: ). Ze względu na to, że peptydy TAA często nie posiadają żadnej immunogenności, odkrycie odpowiednich celów jest niezwykle ważnym zagadnieniem. [0017] Jak to zauważono powyżej, CDH3 (Nr Dostępu GenBank NM_001793; NR ID. SEKW.: 1,

43 ), EPHA4 (Nr Dostępu GenBank L3664; NR ID. SEKW.: 3, 4), ECT2 (Nr Dostępu GenBank AY376439; NR ID. SEKW.:, 6), HIG2 (Nr Dostępu GenBank NM_013332; NR ID. SEKW.: 7, 8) INHBB (Nr Dostępu GenBank NM_002193; NR ID. SEKW.: 9, ), KIFA (Nr Dostępu GenBank NM_00733; NR ID. SEKW.: 11, 12), KNTC2 (Nr Dostępu GenBank AF017790; NR ID. SEKW.: 13, 14), TTK (Nr Dostępu GenBank NM_003318; NR ID. SEKW.: 1, 16) oraz URLC (Nr Dostępu GenBank NM_01727; NR ID. SEKW.: 17, 18) zostały wcześniej zidentyfikowane przy użyciu technologii mikromacierzy cdna jako ulegające nadekspresji w różnych rakach. [0018] Tutaj pokazano, że peptydy pochodzące z CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK lub URLC są epitopami TAA podlegającymi restrykcji HLA-A24 oraz HLA-A2, allelami HLA powszechnie znajdowanymi w populacjach japońskiej i kaukaskiej. W szczególności, wykorzystując ich zdolności do wiązania się do HLA-A24 lub HLA-A2, zidentyfikowano kandydatujące peptydy wiążące się do HLA-A24 lub HLA-A2 pochodzące z CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK lub URLC. Po stymulacji in vitro komórek T przez komórki dendrytyczne (DC, ang. dendritic cells) naładowane tymi peptydami udało się wyprowadzić linie CTL przy użyciu następujących peptydów. CDH3-A (NR ID. SEKW.: 19), CDH3-A (NR ID. SEKW.: 22),

44 4 1 2 CDH3-A (NR ID. SEKW.: ), CDH3-A (NR ID. SEKW.: 34), CDH3-A24--6 (NR ID. SEKW.: 344), CDH3-A (NR ID. SEKW.: 38), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 41), EphA4-A24-9- (NR ID. SEKW.: 44), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 46), EphA4-A (SEQ NO: 48), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 78), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 376), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 379), ECT2-A (NR ID. SEKW.: 80), ECT2-A (NR ID. SEKW.: 0), ECT2-A24--1 (NR ID. SEKW.: 1), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 1), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 111), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 387), HIG2-A24--7 (NR ID. SEKW.: 112), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 394), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 114), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 116), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 117), HIG2-A02--8 (NR ID. SEKW.: 121), INHBB-A (NR ID. SEKW.: 39), INHBB-A (NR ID. SEKW.: 133), INHBB-A24-- (NR ID. SEKW.: 13), INHBB-A24--7 (NR ID. SEKW.: 137), INHBB-A (NR ID. SEKW.: 426), KIFA-A24-9- (NR ID. SEKW.: 174), KIFA-A (NR ID. SEKW.: 178), KIEA-A24--4 (NR ID. SEKW.: 186),

45 KIFA-A (NR ID. SEKW.: 194), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 196), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 2), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 2), KNTC2-A24-9- (NR ID. SEKW.: 213), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 214), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 217), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 223), TTK-A (NR ID. SEKW.: 227), TTK-A (NR ID. SEKW.: 228), TTK-A (NR ID. SEKW.: 233), TTK-A (NR ID. SEKW.: 24), URLC-A (NR ID. SEKW.: 271), URLC-A (NR ID. SEKW.: 272) oraz URLC-A (NR ID. SEKW.: 288) [0019] Te peptydy są peptydami epitopowymi każdego TAA podlegającego restrykcji HLA-A24 lub HLA-A2. Ze względu na to, że antygeny te ulegają nadekspresji w większości raków i są związane z proliferacją komórek nowotworowych, znajdują one zastosowanie jako cele w immunoterapii przeciwko rakom. Przykładowe raki obejmują, ale bez ograniczenia, raka pęcherza, raka piersi, raka szyjki macicy, raka komórek przewodów żółciowych, CML, raka jelita grubego, endometriozę, raka przełyku, raka żołądka, raka żołądka typu rozlanego, raka wątroby, NSCLC, chłoniaka, kostniakomięsaka, raka jajnika, raka trzustki, raka prostaty, raka nerki, SCLC, nowotwór tkanek miękkich oraz nowotwór jądra. [00] Podobnie, ujawnione są sposoby leczenia lub zapobiegania chorobie związanej z nadekspresją CDH3,

46 EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np. rakom, u osobnika, przy czym takie sposoby obejmują etapy podawania osobnikowi peptydu immunogennego o mniej niż około 40 aminokwasach, często mniej niż około aminokwasach, zazwyczaj mniej niż około 1 aminokwasach i posiadającego sekwencję aminokwasową o NR ID. SEKW.: 19, 22,, 34, 344, 38, 41, 44, 46, 48, 78, 376, 379, 80, 0, 1, 1, 111, 387, 112, 394, 114, 116, 117, 121, 39, 133, 13, 137, 426, 174, 178, 186, 194, 196, 2, 2, 213, 214, 217, 223, 227, 228, 233, 24, 271, 272 lub 288. [0021] Alternatywnie, peptyd immunogenny może posiadać sekwencję aminokwasową przedstawioną na NR ID. SEKW.: 19, 22,, 34, 344, 38, 41, 44, 46, 48, 78, 376, 379, 80, 0, 1, 1, 111, 387, 112, 394, 114, 116, 117, 121, 39, 133, 13, 137, 426, 174, 178, 186, 194, 196, 2, 2, 213, 214, 217, 223, 227, 228, 233, 24, 271, 272 lub 288, w której 1, 2 lub kilka (np. do ) aminokwasów uległo podstawieniu, delecji, lub addycji, pod warunkiem, że uzyskany wariant peptydu zachowuje aktywność immunologiczną (tj. zdolność indukcji CTL specyficznych wobec komórek z ekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np. raków). [0022] Liczba reszt, które mają ulec podstawieniu, delecji lub addycji, wynosi ogólnie aminokwasów lub mniej, korzystnie 4 aminokwasy lub mniej, bardziej korzystnie 3 aminokwasy lub mniej, jeszcze bardziej korzystnie jeden lub dwa aminokwasy. Raki brane pod uwagę obejmują, ale bez ograniczenia, raka pęcherza, raka piersi, raka szyjki macicy, raka komórek przewodów

47 żółciowych, CML, raka jelita grubego, endometriozę, raka przełyku, raka żołądka, raka żołądka typu rozlanego, raka wątroby, NSCLC, chłoniaka, kostniakomięsaka, raka jajnika, raka trzustki, raka prostaty, raka nerki, SCLC, nowotwór tkanek miękkich oraz nowotwór jądra. Ponadto, ujawnione są sposoby do zapobiegania pooperacyjnemu nawrotowi tych chorób wspomnianych powyżej. [0023] Wiadomo, że warianty peptydów (tj. peptydy posiadające sekwencję aminokwasową zmodyfikowaną przez podstawienie, delecję lub addycję jednej, dwóch lub kilku reszt aminokwasowych w oryginalnej sekwencji aminokwasowej) zachowują oryginalną aktywność biologiczną (Mark DF i wsp., (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81: ; Zoller MJ oraz Smith M, (1982) Nucleic Acids Res : ; Dalbadie-McFarland G i wsp., (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79: ). W kontekście niniejszego wynalazku korzystne jest, aby modyfikacja aminokwasu skutkowała zachowaniem właściwości łańcucha bocznego oryginalnego aminokwasu (proces znany jako konserwatywne podstawienia aminokwasowe). Przykłady właściwości łańcuchów bocznych aminokwasów obejmują aminokwasy hydrofobowe (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), aminokwasy hydrofilowe (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) oraz łańcuchy boczne posiadające następujące grupy funkcyjne lub wspólne cechy: alifatyczny łańcuch boczny (G, A, V, L, I, P); łańcuch boczny zawierający grupę hydroksylową (S, T, Y); łańcuch boczny zawierający atom siarki (C, M); łańcuch boczny zawierający grupę karboksylową i amidową (D; N, E, Q); łańcuch boczny grupę zasadową (R, K, H) oraz

48 łańcuch boczny zawierający grupę aromatyczną (H, F, Y, W). Należy zauważyć, że litery w nawiasach oznaczają jednoliterowe kody aminokwasów. [0024] W korzystnych wykonaniach immunogenny peptyd jest nonapeptydem (9-merem) lub dekapeptydem (- merem). Ujawniony jest także sposób indukcji odporności przeciwnowotworowej dla choroby związanej z nadekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np. raków, u osobnika, przy czym ten sposób obejmuje etapy podawania osobnikowi peptydu immunogennego według niniejszego wynalazku, mianowicie tego posiadającego sekwencję aminokwasową o NR ID. SEKW.: 19, 22,, 34, 344, 38, 41, 44, 46, 48, 78, 376, 379, 80, 0, 1, 1, 111, 387, 112, 394, 114, 116, 117, 121, 39,.133, 13, 137, 426, 174, 178, 186, 194, 196, 2, 2, 213, 214, 217, 223, 227, 228, 233, 24, 271, 272 lub 288, lub jej wariant (tj. zawierający 1, 2 lub kilka (np. do ) podstawień, delecji lub addycji aminokwasowych) osobnikowi, który tego potrzebuje. Raki brane pod uwagę obejmują, ale bez ograniczenia do tego, raka pęcherza, raka piersi, raka szyjki macicy, raka komórek przewodów żółciowych, CML, raka jelita grubego, endometriozę, raka przełyku, raka żołądka, raka żołądka typu rozlanego, raka wątroby, NSCLC, chłoniaka, kostniakomięsaka, raka jajnika, raka trzustki, raka trzustki, raka prostaty, raka nerki, SCLC, nowotwór tkanek miękkich oraz nowotwór jądra. [002] W kontekście niniejszego wynalazku, osobnik korzystnie jest ssakiem. Przykładowe ssaki obejmują, ale bez ograniczenia do tego, człowieka, naczelnego innego niż człowiek, mysz, szczura, psa, kota, konia

49 0 1 2 lub krowę. W niniejszym wynalazku peptyd może być podany osobnikowi według protokołu in vivo lub ex vivo. Ponadto, ujawnione jest także zastosowanie nonapeptydu lub dekapeptydu wybranego spośród peptydów posiadających sekwencję aminokwasową o NR ID. SEKW.: 19, 22,, 34, 344, 38, 41, 44, 46, 48, 78, 376, 379, 80, 0, 1, 1, 111, 387, 112, 394, 114, 116, 117, 121, 39, 133, 13, 137, 426, 174, 178, 186, 194, 196, 2, 2, 213, 214, 217, 223, 227, 228, 233, 24, 271, 272 lub 288 (i ich wariantów) do wytwarzania kompozycji immunogennej do leczenia lub zapobiegania chorobie związanej z nadekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np. raków. Raki brane pod uwagę obejmują, ale bez ograniczenia do tego, raka pęcherza, raka piersi, raka szyjki macicy, raka komórek przewodów żółciowych, CML, raka jelita grubego, endometriozę, raka przełyku, raka żołądka, raka żołądka typu rozlanego, raka wątroby, NSCLC, chłoniaka, kostniakomięsaka, raka jajnika, raka trzustki, raka trzustki, raka prostaty, raka nerki, SCLC, nowotwór tkanek miękkich oraz nowotwór jądra. [0026] Analizy homologii następujących peptydów wskazują, że nie posiadają one znaczącej homologii do peptydów uzyskanych z dowolnych znanych ludzkich produktów genów. CDH3-A (NR ID. SEKW.: 19), CDH3-A (NR ID. SEKW.: 22), CDH3-A (NR ID. SEKW.: ), CDH3-A (NR ID. SEKW.: 34), CDH3-A24--6 (NR ID. SEKW.: 344), CDH3-A (NR ID. SEKW.: 38),

50 1 1 2 EphA4-A (NR ID. SEKW.: 41), EphA4-A24-9- (NR ID. SEKW.: 44), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 46), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 48), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 78), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 376), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 379), ECT2-A (NR ID. SEKW.: 80), ECT2-A (NR ID. SEKW.: 0), ECT2-A24--1 (NR ID. SEKW.: 1), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 1), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 111), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 387), HIG2-A24--7 (NR ID. SEKW.: 112), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 394), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 114), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 116), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 117), HIG2-A02--8 (NR ID. SEKW.: 121), INHBB-A (NR ID. SEKW.: 39), INHBB-A (NR ID. SEKW.: 133), INHBB-A24-- (NR ID. SEKW.: 13), INHBB-A24--7 (NR ID. SEKW.: 137), INHBB-A (NR ID. SEKW.: 426), KIFA-A24-9- (NR ID. SEKW.: 174), KIFA-A (NR ID. SEKW.: 178), KIFA-A24--4 (NR ID. SEKW.: 186), KIFA-A24-l0-66 (NR ID. SEKW.: 194), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 196), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 2), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 2),

51 2 1 2 KNTC2-A24-9- (NR ID. SEKW.: 213), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 214), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 217), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 223), TTK-A (NR ID. SEKW.: 227), TTK-A (NR ID. SEKW.: 228), TTK-A (NR ID. SEKW.: 233), TTK-A (NR ID. SEKW.: 24), URLC-A (NR ID. SEKW.: 271), URLC-A (NR ID. SEKW.: 272) oraz URLC-A (NR ID. SEKW.: 288) [0027] Podobnie, możliwość nieznanych lub niepożądanych odpowiedzi immunologicznych w immunoterapii przeciwko tym cząsteczkom jest znacząco zmniejszona. [0028] Jeżeli chodzi o antygeny HLA, dane tutaj przedstawione wskazują, że zastosowania antygenów typu A-24 lub typu A-2 (o których wiadomo, że ulegają wysokiej ekspresji wśród Japończyków) są korzystne do uzyskania efektywnych wyników. Zastosowania podtypów, takich jak A-2402 oraz A-01 są jeszcze bardziej korzystne. Typowo, w postępowaniu klinicznym, najpierw bada się typ antygenu HLA u pacjenta wymagającego leczenia, co z kolei umożliwia selekcję odpowiednich peptydów posiadających wysokie poziomy powinowactwa do antygenu z antygenem pacjenta lub posiadających zdolność indukcji cytotoksycznych komórek T (CTL) poprzez prezentację antygenu. Ponadto, w celu uzyskania peptydów posiadających duże powinowactwo wiązania i zdolność indukcji CTL, można dokonać podstawienia, delecji lub addycji 1, 2 lub kilku (np. do )

52 3 1 2 aminokwasów w oparciu o sekwencję aminokwasową naturalnie występującego częściowego peptydu CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK oraz URLC. Stosowane tutaj określenie kilka oznacza do lub mniej, bardziej korzystnie 3 lub mniej. Ponadto oprócz peptydów, które są prezentowane naturalnie, ponieważ została poznana regularność sekwencji peptydów prezentowanych poprzez wiązanie się do antygenów HLA (Kubo RT, i wsp., (1994) J. Immunol., 12, ; Rammensee HG, i wsp., (199) lmmuno-genetics. 41: ; Kondo A, i wsp., (199) J. Immunol. 1:47-12.), w oparciu o tę regularność można dokonać modyfikacji na peptydach immunogennych według wynalazku. Na przykład, preferencyjnie mogą być stosowane peptydy posiadające duże powinowactwo wiązania się do HLA-A24, w których drugi aminokwas od końca N jest podstawiony fenyloalaniną, tyrozyną, metioniną lub tryptofanem. Podobnie preferencyjnie mogą być stosowane peptydy, których C-końcowy aminokwas jest podstawiony fenyloalaniną, leucyną, izoleucyną, tryptofanem lub metioniną. Z drugiej strony, korzystnie mogą być stosowane peptydy posiadające wysokie powinowactwo wiązania się do HLA-A2, w których drugi aminokwas od końca N jest podstawiony leucyną lub metioniną, oraz peptydy, których C-końcowy aminokwas jest podstawiony waliną lub izoleucyną. Podstawienie jest wykonywane nie tylko na końcowych aminokwasach, ale także w pozycji potencjalnego rozpoznawania TCR peptydów. Kilka badań pokazało, że podstawienia aminokwasowe w peptydzie mogą być takie same lub lepsze niż oryginalne, na przykład CAP1, p3 ( ), Her-

53 /neu ( ) lub gp0 (9-217) (Zaremba i wsp. Cancer Res. 7, , 1997, T. K. Hoffmann i wsp. J Immunol. (02) Feb 1;168(3): , S. O. Dionne i wsp. Cancer Immunol immunother. (03) 2: oraz S. O. Dionne i wsp. Cancer Immunology, Immunotherapy (04) 3, 7-314). Ponadto, do końca N i/lub końca C peptydu mogą być dodane 1 do 2 aminokwasów. [0029] Jednakże, kiedy sekwencja peptydu jest identyczna z fragmentem sekwencji aminokwasowej białka endogennego lub egzogennego posiadającego odmienną funkcję, mogą zostać zaindukowane skutki uboczne, takie jak choroby autoimmunologiczne lub objawy alergiczne przeciwko specyficznym substancjom. Zatem, korzystne jest unikanie sytuacji, w której sekwencja immunogenna pasuje do sekwencji znanego białka. Tej sytuacji można uniknąć poprzez wykonanie poszukiwania homologii przy użyciu dostępnych baz danych. Jeżeli poszukiwania homologii potwierdzą, że peptydy, w których 1, 2 lub kilka różnych aminokwasów nie istnieje w naturze, wtedy można uniknąć niebezpieczeństwa, że modyfikacje powyżej wspomnianej sekwencji aminokwasowej, które, na przykład, zwiększają powinowactwo wiązania się do antygenów HLA i/lub zwiększają zdolność indukcji CTL. [00] Pomimo, że oczekuje się, iż peptydy posiadające duże powinowactwo do antygenów HLA, jak opisano powyżej, będą wysoce skuteczne jako szczepionki rakowe, kandydujące peptydy, które wybrano ze względu na obecność dużego powinowactwa wiązania jako wskaźnika, muszą być badane pod względem rzeczywistej zdolności indukcji CTL. Zdolność indukcji CTL może być potwierdzona rutynowo poprzez indukowanie komórek

54 1 2 prezentujących antygen niosących ludzkie antygeny MHC (na przykład limfocytów B, makrofagów i komórek dendrytycznych) lub, bardziej szczegółowo, komórek dendrytycznych wywodzących się z ludzkich jednojądrzastych leukocytów krwi obwodowej, oraz, po stymulacji peptydem będącym przedmiotem zainteresowania, mieszanie z komórkami CD8-dodatnimi i mierzenie aktywności cytotoksycznej przeciwko komórkom docelowym. Jako system reakcyjny mogą być stosowane zwierzęta transgeniczne wytworzone w ten sposób, aby wykazywać ekspresję ludzkiego antygenu HLA (na przykład te opisane w BenMohamed L, i wsp., (00) Hum. Immunol.; 61(8): Artykuły pokrewne, książki, LinkOut). Na przykład, komórki docelowe mogą być znakowane radioaktywnie przy użyciu 1 Cr i podobnego, a aktywność cytotoksyczna może być obliczana z radioaktywności uwolnionej z komórek docelowych. Alternatywnie, może być ona badana poprzez pomiar IFNgamma wytworzonego i uwolnionego przez komórki CTL w obecności komórek prezentujących antygen, które niosą immobilizowane peptydy, oraz wizualizację strefy hamowania na pożywkach przy użyciu przeciwciał monoklonalnych anty-ifn-gamma. [0031] W wyniku badania zdolności indukcji CTL przez peptydy opisane powyżej odkryto, że te peptydy, które posiadają duże powinowactwo wiązania się do antygenu HLA, niekoniecznie posiadają wysoką zdolność indukcji. Jednakże, nonapeptydy lub dekapeptydy wybrane spośród grupy peptydów posiadających sekwencje aminokwasowe wskazane przez poniższe peptydy wykazywały szczególnie wysoką zdolność indukcji CTL.

55 6 1 2 CDH3-A (NR ID. SEKW.: 19), CDH3-A (NR ID. SEKW.: 22), CDH3-A (NR ID. SEKW.: ), CDH3-A (NR ID. SEKW.: 34), CDH3-A24--6 (NR ID. SEKW.: 344), CDH3-A (NR ID. SEKW.: 38), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 41), EphA4-A24-9- (NR ID. SEKW.: 44), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 46), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 48), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 78), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 376), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 379), ECT2-A (NR ID. SEKW.: 80), ECT2-A (NR ID. SEKW.: 0), ECT2-A24--1 (NR ID. SEKW.: 1), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 1), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 111), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 387), HIG2-A24--7 (NR ID. SEKW.: 112), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 394), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 114), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 116), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 117), HIG2-A02--8 (NR ID. SEKW.: 121), INHBB-A (NR ID. SEKW.: 39), INHBB-A (NR ID. SEKW.: 133), INHBB-A24-- (NR ID. SEKW.: 13), INHBB-A24--7 (NR ID. SEKW.: 137), INHBB-A (NR ID. SEKW.: 426), KIFA-A24-9- (NR ID. SEKW.: 174),

56 7 1 2 KIFA-A (NR ID. SEKW.: 178), KIFA-A24--4 (NR ID. SEKW.: 186), KIFA-A (NR ID. SEKW.: 194), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 196), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 2), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 2), KNTC2-A24-9- (NR ID. SEKW.: 213), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 214), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 217), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 223), TTK-A (NR ID. SEKW.: 227), TTK-A (NR ID. SEKW.: 228), TTK-A (NR ID. SEKW.: 233), TTK-A (NR ID. SEKW.: 24), URLC-A (NR ID. SEKW.: 271), URLC-A (NR ID. SEKW.: 272) oraz URLC-A (NR ID. SEKW.: 288) [0032] Jak zauważono powyżej, ujawnione są peptydy posiadające zdolność indukcji cytotoksycznych komórek T, mianowicie te mające sekwencję aminokwasową o NR ID. SEKW.: 19, 22,, 34, 344, 38, 41, 44, 46, 48, 78, 376, 379, 80, 0, 1, 1, 111, 387, 112, 394, 114, 116, 117, 121, 39, 133, 13, 137, 426, 174, 178, 186, 194, 196, 2, 2, 213, 214, 217, 223, 227, 228, 233, 24, 271, 272 lub 288 lub jej wariant (tj. te, w których 1, 2 lub kilka aminokwasów poddano podstawieniu, delecji, lub addycji). [0033] Korzystne jest, aby sekwencje aminokwasowe złożone z 9 lub aminokwasów wskazanych w NR ID. SEKW.: 19, 22,, 34, 344, 38, 41, 44, 46, 48, 78, 376, 379, 80, 0, 1, 1, 111, 387, 112, 394, 114,

57 , 117, 121, 39, 133, 13, 137, 426, 174, 178, 186, 194, 196, 2, 2, 213, 214, 217, 223, 227, 228, 233, 24, 271, 272 lub 288 lub ich wariant nie pasowały do sekwencji związanej z innym endogennym białkiem. [0034] W szczególności, przykładami korzystnych wariantów są podstawienie aminokwasowe do leucyny lub metioniny w drugim aminokwasie od końca N, podstawienie aminokwasowe do waliny lub leucyny w C-końcowym aminokwasie i addycja aminokwasowa 1 do 2 aminokwasów na końcu N i/lub końcu C. [003] Specjalista w tej dziedzinie rozpozna, że oprócz substytucji i addycji aminokwasowych w sposobach według wynalazku mogą być także stosowane immunologicznie aktywne fragmenty peptydów. Metody oznaczania aktywnych fragmentów są dobrze znane w tej dziedzinie. Klony CTL uzyskane poprzez stymulację tymi zmodyfikowanymi peptydami mogą rozpoznawać oryginalne peptydy i powodować uszkodzenie komórek z ekspresją oryginalnych peptydów. [0036] Peptydy według niniejszego wynalazku mogą być wytwarzane z zastosowaniem dobrze znanych technik. Na przykład, peptydy mogą być wytwarzane syntetycznie, albo przy użyciu technik rekombinowanego DNA, albo poprzez syntezę chemiczną. Peptydy według niniejszego wynalazku mogą być syntetyzowane odrębnie lub jako dłuższe polipeptydy złożone z dwóch lub większej liczby peptydów. Peptydy według niniejszego wynalazku są korzystnie izolowane, tj. zasadniczo wolne od innych naturalnie występujących białek komórki gospodarza i ich fragmentów. [0037] Peptydy według niniejszego wynalazku mogą

58 9 1 2 zawierać modyfikacje, takie jak glikozylacja, oksydacja łańcucha bocznego, lub fosforylacja; dopóki modyfikacje nie niszczą aktywności biologicznej peptydów tutaj opisanych, mianowicie zdolności wiązania się do antygenu HLA i indukowania CTL. Inne modyfikacje obejmują inkorporację D-aminokwasów lub innych mimetyków aminokwasowych, które mogą być zastosowane, na przykład, w celu wydłużenia okresu półtrwania peptydów w surowicy. [0038] Ponadto, ujawniony jest sposób poszukiwania peptydu, w którym podstawieniu uległ 1, 2 lub kilka aminokwasów, przy czym ten peptyd zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: NR ID. SEKW.: 19, 22,, 34, 344, 38, 41, 44, 46, 48, 78, 80, 0, 1, 1, 111, 387, 112, 394, 39, 133, 13, 137, 426, 174, 178, 186, 194, 196, 2, 2, 213, 214, 217 lub 223, przy czym ten sposób obejmuje etapy: (a) potwierdzania braku istotnej homologii sekwencji 1, 2 lub kilkuaminokwasowego substytutu do całej sekwencji; (b) pomiaru zdolności indukcji CTL kandydującego peptydu z substytucją; oraz (c) selekcji peptydu, którego zdolność indukcji CTL jest taka sama lub wyższa w porównaniu z oryginalnym peptydem. [0039] Na przykład, ujawniono sposób identyfikacji peptydu posiadającego zdolność indukcji CTL przeciwko komórkom z ekspresją przynajmniej jednego antygenu związanego z nowotworem, przy czym antygenem związanym z nowotworem jest antygen wybrany z grupy składającej

59 się z CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK oraz URLC, przy czym ten sposób obejmuje etapy: (i) dostarczania lub wytwarzania przynajmniej jednej kandydującej sekwencji, która składa się z sekwencji aminokwasowej zmodyfikowanej poprzez podstawienie, delecję lub dodanie jednej, dwóch lub kilku reszt aminokwasowych do oryginalnej sekwencji aminokwasowej, przy czym oryginalna sekwencja aminokwasowa jest wybrana z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: NR ID. SEKW.: 19, 22,, 34, 344, 38, 41, 44, 46, 48, 78, 80, 0, 1, 1, 111, 387, 112, 394, 39, 133, 13, 137, 426, 174, 178, 186, 194, 196, 2, 2, 213, 214, 217 lub 223; (ii) wyboru kandydującej sekwencji, która zasadniczo nie posiada znaczącej homologii z peptydami pochodzącymi z dowolnych produktów ludzkich genów innych niż te antygeny związane z nowotworem; (iii) poddawania kontaktowi peptydu składającego się z kandydującej sekwencji wybranej w etapie (ii) z komórkami prezentującymi antygen; (iv) poddawania kontaktowi komórek prezentujących antygen z etapu (iii) z komórkami T w celu oceny zdolności peptydu do stymulowania komórek T; oraz (v) identyfikacji peptydu, którego zdolność indukcji CTL jest taka sama lub wyższa z porównaniu z peptydem składającym się z oryginalnej sekwencji aminokwasowej. [0040] Korzystnie, aminokwas jest podstawiony innym aminokwasem, którego właściwości aminokwasowego łańcucha bocznego aminokwasu są konserwowane (proces znany jako konserwatywne podstawienie aminokwasowe). Przykładami właściwości łańcuchów bocznych aminokwasów

60 są aminokwasy hydrofobowe (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), aminokwasy hydrofilowe (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) oraz łańcuchy boczne posiadające następujące grupy funkcyjne lub wspólne cechy: alifatyczny łańcuch boczny (G, A, V, L, I, P); łańcuch boczny zawierający grupę hydroksylową (S, T, Y); łańcuch boczny zawierający atom siarki (C, M); łańcuch boczny zawierający grupę karboksylową i amidową (D, N, E, Q); łańcuch boczny zawierający grupę zasadową (R, K, H); oraz łańcuch boczny zawierający grupę aromatyczną (H, F, Y, W). Należy zauważyć, że litery w nawiasach oznaczają jednoliterowe kody aminokwasów. W niniejszym wynalazku, zasadniczo istotną homologią jest, na przykład, więcej niż 90%, korzystnie 9%, bardziej korzystnie 99% lub 0% identyczności ze znanym produktem ludzkiego genu do porównywania. [0041] Peptydy tutaj ujawnione mogą być wytwarzane jako kombinacja, która zawiera dwa lub więcej peptydów tutaj ujawnionych, do zastosowania jako szczepionka przeciwko chorobie związanej z nadekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np., rakom, przy czym taka szczepionka indukuje CTL in vivo. Raki brane tutaj pod uwagę obejmują, ale bez ograniczenia do tego, raka pęcherza, raka piersi, raka szyjki macicy, raka komórek przewodów żółciowych, CML, raka jelita grubego, endometriozę, raka przełyku, raka żołądka, raka żołądka typu rozlanego, raka wątroby, NSCLC, chłoniaka, kostniakomięsaka, raka jajnika, raka trzustki, raka prostaty, raka nerki, SCLC, nowotwór tkanek miękkich oraz nowotwór jądra. Peptydy mogą występować w formie mieszaniny lub mogą być połączone

61 ze sobą przy użyciu standardowych technik. Na przykład, peptydy mogą ulegać ekspresji jako pojedyncza sekwencja polipeptydowa. Peptydy w kombinacji mogą być takie same lub różne. [0042] Po podaniu peptydów według niniejszego wynalazku, peptydy są prezentowane przy dużej gęstości na antygenach HLA komórek prezentujących antygen, co z kolei indukuje CTL, które specyficznie reagują z kompleksem utworzonym pomiędzy prezentowanym peptydem a antygenem HLA. Alternatywnie, komórki prezentujące antygen posiadające na swojej powierzchni immobilizowane peptydy według niniejszego wynalazku, uzyskane poprzez usunięcie komórek dendrytycznych z osobników, mogą być stymulowane przez peptydy według niniejszego wynalazku. Ponowne podanie tych komórek odpowiednim osobnikom indukuje CTL i w wyniku tego może być zwiększona agresywność przeciwko komórkom docelowym. [0043] Bardziej konkretnie, ujawnione są leki do leczenia i/lub zapobiegania proliferacji, metastazie i takim chorobom, które związane są z nadekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np. rakom, które zawierają jeden lub większą liczbę peptydów tutaj ujawnionych, lub polinukleotyd kodujący te peptydy. Peptydy lub polinukleotydy ujawnione tutaj znajdują szczególne zastosowanie w leczeniu choroby związanej z CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np. raków. Raki brane tutaj pod uwagę obejmują, ale bez ograniczenia do tego, raka pęcherza, raka piersi, raka szyjki macicy, raka komórek przewodów żółciowych, CML, raka jelita

62 grubego, endometriozę, raka przełyku, raka żołądka, raka żołądka typu rozlanego, raka wątroby, NSCLC, chłoniaka, kostniakomięsaka, raka jajnika, raka trzustki, raka prostaty, raka nerki, SCLC, nowotwór tkanek miękkich oraz nowotwór jądra. [0044] Peptydy według niniejszego wynalazku mogą być podawane osobnikowi bezpośrednio, jako kompozycja farmaceutyczna, którą preparowano tradycyjnymi metodami formulacji. W takich przypadkach, oprócz peptydów według niniejszego wynalazku, włączone mogą być bez szczególnych ograniczeń odpowiednie nośniki, zaróbki, i tym podobne, które są zazwyczaj stosowane w lekach. Ujawnione tutaj kompozycje immunogenne mogą być stosowane do leczenia i zapobiegania chorobie związanej z nadekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC. np. rakom. Raki brane pod uwagę obejmują, ale bez ograniczenia do tego, raka pęcherza, raka piersi, raka szyjki macicy, raka komórek przewodów żółciowych, CML, raka jelita grubego, endometriozę, raka przełyku, raka żołądka, raka żołądka typu rozlanego, raka wątroby, NSCLC, chłoniaka, kostniakomięsaka, raka jajnika, raka trzustki, raka prostaty, raka nerki, SCLC, nowotwór tkanek miękkich oraz nowotwór jądra. [004] Kompozycje immunogenne do leczenia i/lub zapobiegania chorobie związanej z nadekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np., rakom, które zawierają jeden lub większą liczbę ujawnionych peptydów jako składnik aktywny, mogą ponadto zawierać adiuwant, aby skutecznie wzbudzić odporność komórkową. Alternatywnie, mogą być one

63 podawane z innymi aktywnymi składnikami, takimi jak środki przeciwrakowe. [0046] Raki brane tutaj pod uwagę obejmują, ale bez ograniczenia do tego, raka pęcherza, raka piersi, raka szyjki macicy, raka komórek przewodów żółciowych, CML, raka jelita grubego, endometriozę, raka przełyku, raka żołądka, raka żołądka typu rozlanego, raka wątroby, NSCLC, chłoniaka, kostniakomięsaka, raka jajnika, raka trzustki, raka prostaty, raka nerki, SCLC, nowotwór tkanek miękkich oraz nowotwór jądra. Odpowiednie formulacje obejmują granulki. Odpowiednie adiuwanty są opisane w literaturze (Johnson AG. (1994) Clin. Microbiol. Rev., 7: ). [0047] Przykładowe adiuwanty obejmują, ale bez ograniczenia do tego, fosforan glinu, wodorotlenek glinu oraz ałun. Ponadto, korzystnie mogą być stosowane preparaty liposomowe, preparaty w postaci granulek, w których lek jest związany z kulkami o średnicy kilku mc m, oraz preparaty, w których lipid jest związany z peptydem. Sposób podawania może być doustny, w postaci iniekcji śródskórnej, podskórnej, dożylnej, lub podobnej, i może obejmować podawanie ogólnoustrojowe lub podawanie lokalne w pobliże namierzanego nowotworu. [0048] Dawka peptydu(peptydów) według niniejszego wynalazku może być odpowiednio dobrana według choroby, która ma być leczona, wieku pacjenta, masy, sposobu podawania i tym podobnych. Chociaż zazwyczaj dawka wynosi 0,001 mg do 00 mg, korzystnie 0,01 mg do 0 mg, korzystniej 0,1 mg do mg, korzystnie podawana raz na kilka dni do kilku miesięcy, specjalista w tej dziedzinie łatwo może wybrać odpowiednią dawkę i sposób

64 6 1 2 podawania, jako że wybór i optymalizacja tych parametrów jest w zakresie rutynowych umiejętności. [0049] Niniejszy wynalazek dostarcza ponadto pęcherzyków wewnątrzkomórkowych zwanych egzosomami, które prezentują na swojej powierzchni kompleksy tworzone pomiędzy peptydami według niniejszego wynalazku i antygenami HLA. Egzosomy mogą być wytwarzane, na przykład, z zastosowaniem sposobów opisanych szczegółowo w opublikowanym japońskim tłumaczeniu międzynarodowej publikacji Nr Hei oraz , oraz są korzystnie wytwarzane z zastosowaniem komórek prezentujących antygen uzyskanych od osobników, którzy są celem leczenia i/lub zapobiegania. Egzosomy według niniejszego wynalazku mogą być podawane jako szczepionki rakowe, podobnie jak peptydy według niniejszego wynalazku. [000] Zastosowany typ antygenów HLA musi pasować do tego, jaki występuje u osobnika wymagającego leczenia i/lub zapobiegania. Na przykład, w populacji japońskiej często odpowiedni jest HLA-A24 lub HLA-A2, w szczególności HLA-A2402 lub HLA-A01. [001] W pewnych wykonaniach, kompozycje szczepionki według niniejszego wynalazku zawierają składnik, który stymuluje cytotoksyczne limfocyty T. Jako środki zdolne do stymulacji CTL in vivo przeciwko antygenom wirusowym zidentyfikowano lipidy. Na przykład, reszty kwasu palmitynowego mogą być przyłączane do grup aminowych epsilon i alfa reszty lizyny i następnie przyłączane do peptydu immunogennego według wynalazku. Peptyd poddany lipidacji może być następnie podawany albo bezpośrednio, w miceli lub cząstce, włączany do

65 liposomu, albo poddawany emulgacji z adiuwantem. Jako inny przykład lipidu stymulującego odpowiedzi CTL, do stymulacji CTL zastosowane mogą być lipoproteiny E. coli, takie jak tripalmitoilo-sglicerylocysteinyloserylo-seryna (P3CSS), gdy są kowalencyjnie przyłączone do odpowiedniego peptydu (zobacz, np., Deres K, i wsp., (1989) Nature 342:61-4.). [002] Kompozycje immunogenne według niniejszego wynalazku mogą także zawierać kwasy nukleinowe kodujące jeden lub większą liczbę ujawnionych tutaj peptydów immunogennych. Zobacz, np., Wolff JA i wsp., (1990) Science 247:146-8; Patenty USA Nr 8089; 89466; 80466; ; 73624; ; oraz WO 98/047. Przykłady technik dostarczania opartych na DNA obejmują nagi DNA, dostarczanie wspomagane (bupiwikaina, polimery, za pośrednictwem peptydów), kompleksy z lipidami kationowymi, oraz dostarczanie za pośrednictwem cząsteczek ( działo genowe ) lub za pośrednictwem ciśnienia (zobacz, np. Patent USA Nr ). [003] Peptydy immunogenne według wynalazku mogą także ulegać ekspresji z wektorów wirusowych lub bakteryjnych. Przykłady odpowiednich wektorów ekspresyjnych obejmują atenuowanych gospodarzy wirusowych, takich jak wirus ospy krowiej lub wirus ospy ptasiej. To podejście wymaga zastosowania wirusa ospy krowiej, np., jako wektora do ekspresji sekwencji nukleotydowych, które kodują peptyd. Po wprowadzeniu do gospodarza, rekombinowany wirus ospy krowiej wyraża peptyd immunogenny i w ten sposób wywołuje odpowiedź

66 immunologiczną. Wektory ospy krowiej i sposoby stosowane w protokołach immunizacji są opisane w, np., Patencie USA Nr Innym odpowiednim wektorem jest BCG (Bacille Calmette Guerin). Wektory BCG są opisane w Stover CK, i wsp., (1991) Nature 31: W tej dziedzinie znanych jest dużo różnych innych wektorów użytecznych w terapeutycznym podawaniu lub immunizacji, np., wektory oparte na adenowirusach lub wirusach towarzyszących adenowirusom, wektory oparte na retrowirusach, wektory oparte na Salmonella typhi, wektory oparte na detoksyfikowanej toksynie wąglika i tym podobne. Zobacz, np., Shata MT, i wsp., (00) Mol. Med. Today 6:66-71; Shedlock DJ oraz Weiner DB., i wsp., (00) J. Leukoc. Biol. 68: ; oraz Hipp JD, i wsp., (00) In Vivo 14:71-8. [004] Niniejszy wynalazek dostarcza także sposobów in vitro indukowania komórek prezentujących antygen z zastosowaniem jednego lub kilku peptydów według niniejszego wynalazku. Komórki prezentujące antygen mogą być zaindukowane poprzez indukowanie komórek dendrytycznych spośród monocytów krwi obwodowej, a następnie poddawanie ich kontaktowi (stymulacji) z jednym lub większą liczbą peptydów według niniejszego wynalazku in vitro, ex vivo lub in vivo. Ujawniono tutaj, że gdy peptydy według niniejszego wynalazku są podawane osobnikom, w ciele osobnika indukowane są komórki prezentujące antygen, które posiadają immobilizowane na nich peptydy według niniejszego wynalazku. Alternatywnie, ujawniono, że po immobilizacji peptydów według niniejszego wynalazku na komórkach prezentujących antygen, komórki mogą być

67 podawane osobnikowi jako szczepionka. Na przykład, podawanie ex vivo może obejmować etapy: a: pozyskiwania komórek prezentujących antygen od osobnika, oraz b: poddawania kontaktowi komórek prezentujących antygen z peptydem według niniejszego wynalazku. [00] Alternatywnie, według niniejszego ujawnienia, dostarczone jest zastosowanie peptydów według niniejszego wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej indukującej komórki prezentujące antygen. Ponadto, ujawniony jest peptyd według niniejszego wynalazku do indukcji komórek prezentujących antygen. Ujawniono, że komórki prezentujące antygen uzyskane w etapie b mogą być podawane osobnikowi jako szczepionka. Niniejszy wynalazek dostarcza także [006] Sposobu in vitro do indukowania komórek prezentujących antygen posiadających dużą zdolność indukcji cytotoksycznych komórek T, który to sposób obejmuje etap transferu in vitro genów składających się z polinukleotydu kodującego(polinukleotydów kodujących) jeden lub większą liczbę peptydów według niniejszego wynalazku do komórek prezentujących antygen. Wprowadzone geny mogą być w postaci cząsteczek DNA lub RNA. Jeśli chodzi o sposób wprowadzania, bez szczególnych ograniczeń mogą być korzystnie stosowane różne sposoby tradycyjnie wykorzystywane w tej dziedzinie, takie jak lipofekcja, elektroporacja oraz sposób z użyciem fosforanu wapnia. Bardziej konkretnie, transfekcja może być wykonana jak opisano w Reeves ME, i wsp., (1996) Cancer Res., 6:672-7.; Butterfield LH,

68 i wsp., (1998) J. Immunol., 161: ; Boczkowski D, i wsp., (1996) J. Exp. Med., 184:46-72; opublikowane japońskie tłumaczenie publikacji międzynarodowej nr Po transferze genu do komórek prezentujących antygen gen w komórce ulega transkrypcji, translacji i tym podobnych, a następnie uzyskane białko jest poddawane obróbce przez MHC Klasy I lub Klasy II, przechodzi ścieżkę prezentacji antygenów, aby zaprezentować częściowe peptydy. Niniejszy [007] wynalazek dostarcza ponadto sposobu in vitro do indukowania CTL z zastosowaniem jednego lub większej liczby peptydów według niniejszego wynalazku. Ujawniono, że gdy peptydy według niniejszego wynalazku są podawane osobnikowi, w ciele osobnika indukowane są CTL, i przez to zwiększana jest zdolność układu immunologicznego do wykrywania komórek z ekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np. komórek rakowych w tkankach nowotworowych. [008] Raki brane pod uwagę obejmują, ale bez ograniczenia do tego, raka pęcherza, raka piersi, raka szyjki macicy, raka komórek przewodów żółciowych, CML, raka jelita grubego, endometriozę, raka przełyku, raka żołądka, raka żołądka typu rozlanego, raka wątroby, NSCLC, chłoniaka, kostniakomięsaka, raka jajnika, raka trzustki, raka prostaty, raka nerki, SCLC, nowotwór tkanek miękkich oraz nowotwór jądra. Alternatywnie ujawniono, że peptydy według niniejszego wynalazku mogą być stosowane w kontekście terapeutycznego sposobu ex vivo, w którym uzyskane od osobnika komórki

69 prezentujące antygen oraz komórki CD8-dodatnie lub jednojądrzaste leukocyty krwi obwodowej są poddawane kontaktowi (stymulacji) in vitro z jednym lub większą liczbą peptydów według niniejszego wynalazku, a po indukcji CTL komórki są zwracane osobnikowi. Na przykład, sposób może obejmować etapy: a: pozyskiwania komórek prezentujących antygen od osobnika, b: poddawania komórek prezentujących antygen z etapu a kontaktowi z peptydem według niniejszego wynalazku, c: mieszania komórek prezentujących antygen z etapu b z komórkami T CD 8+ oraz wspólnej hodowli w celu zaindukowania cytotoksycznych komórek T:, oraz d: pozyskiwania komórek T CD 8+ ze wspólnej hodowli z etapu c. [009] Alternatywnie, według niniejszego ujawnienia, dostarczone jest zastosowanie peptydów według niniejszego wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej indukującej CTL. Ponadto, ujawniono tu peptyd według niniejszego wynalazku do indukowania CTL. Ujawniono, że komórki T CD 8+ posiadające aktywność cytotoksyczną uzyskane w etapie d mogą być podawane osobnikowi jako szczepionka. [0060] Niniejszy wynalazek dostarcza ponadto wyizolowanych cytotoksycznych komórek T indukowanych przy użyciu peptydów według niniejszego wynalazku. Cytotoksyczne komórki T, zaindukowane poprzez stymulację komórką prezentującą antygen prezentującą jeden lub większą liczbę peptydów według niniejszego wynalazku, korzystnie pochodzą od osobników, którzy są celem leczenia i/lub zapobiegania, i mogą być one

70 podawane same lub w połączeniu z innymi lekami, włączając w to jeden lub większą liczbę peptydów według niniejszego wynalazku lub egzosomy posiadające aktywność przeciwnowotworową. Otrzymane cytotoksyczne komórki T działają specyficznie przeciwko komórkom docelowym prezentującym peptydy według niniejszego wynalazku, lub korzystnie ten sam peptyd stosowany(te same peptydy stosowane) do indukcji. Komórki docelowe mogą być komórkami z endogenną ekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, lub komórkami, które transfekowano genami CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC. Komórki, które prezentują peptydy według niniejszego wynalazku na powierzchni komórki, dzięki stymulacji tymi peptydami, mogą także stać się celem ataku. [0061] Niniejszy wynalazek dostarcza także komórek prezentujących antygen prezentujących kompleksy utworzone pomiędzy antygenami HLA i jednym lub większą liczbą peptydów według niniejszego wynalazku. Ujawniono, że komórki prezentujące antygen, uzyskane poprzez kontakt z peptydami według niniejszego wynalazku lub nukleotydami kodującymi takie peptydy, korzystnie pochodzą od osobników, którzy są celem leczenia i/lub zapobiegania, i mogą być podawane jako szczepionki, same lub w połączeniu z innymi lekami, włączając w to peptydy, egzosomy lub cytotoksyczne komórki T według niniejszego wynalazku. [0062] Ujawniono także kompozycję złożoną z kwasów nukleinowych kodujących polipeptydy, które są zdolne do tworzenia podjednostki receptora komórki T (TCR, ang. T cell receptor) oraz sposoby ich stosowania.

71 Podjednostki TCR posiadają zdolność do tworzenia TCR, które nadają komórkom T specyficzność względem komórek nowotworowych prezentujących CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK lub URLC. Poprzez zastosowanie znanego w tej dziedzinie sposobu można zidentyfikować kwasy nukleinowe o łańcuchu alfa i beta jako podjednostki TCR CTL zaindukowanych jednym lub większą liczbą peptydów według niniejszego wynalazku (WO07/0322 oraz Morgan i wsp., Immunol, 171, 3288 (03)). Uzyskane receptory TCR korzystnie wiążą się z dużą siłą do docelowych komórek prezentujących peptyd CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK lub URLC i opcjonalnie pośredniczą w skutecznym zabijaniu in vivo oraz in vitro komórek docelowych prezentujących peptyd CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK lub URLC. [0063] Kwasy nukleinowe kodujące podjednostki TCR mogą być wprowadzone do odpowiednich wektorów, np. wektorów retrowirusowych. Te wektory są dobrze znane w tej dziedzinie. Kwasy nukleinowe lub wektory je zawierające mogą być w sposób użyteczny wprowadzane do komórki T, która to komórka T korzystnie pochodzi od pacjenta. Korzystnie, ujawniono dostępną od ręki kompozycję pozwalającą na szybką modyfikację komórek T pacjenta (lub tych z innego z ssaka) tak, aby szybko i łatwo wytworzyć zmodyfikowane komórki T posiadające doskonałe właściwości zabijania komórek rakowych. [0064] Ujawniono także CTL, które otrzymano poprzez transdukcję kwasami nukleinowymi kodującymi polipeptydy podjednostek TCR wiążących się z peptydem CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK lub URLC, np.,

72 NR ID. SEKW.: 19, 22,, 34, 344, 38, 41, 44, 46, 48, 78, 376, 379, 80, 0, 1, 1, 111, 387, 112, 394, 114, 116, 117, 121, 39, 133, 13, 137, 426, 174, 178, 186, 194, 196, 2, 2, 213, 214, 217, 223, 227, 228, 233, 24, 271, 272 lub 288 w kontekście HLA-A24 lub HLA-A2. Transdukowane TCL są zdolne do odnajdywania komórek rakowych in vivo, i są namnażane dobrze znaną metodą hodowli in vitro (np., Kawakami i wsp., J Immunol., 142, (1989)). Komórki T według wynalazku mogą być stosowane do tworzenia kompozycji immunogennej użytecznej w leczeniu lub zapobieganiu raka u pacjenta potrzebującego terapii lub ochrony (WO06/031221). [006] W kontekście niniejszego wynalazku określenie szczepionka (określana także jako kompozycja immunogenna) dotyczy substancji, która indukuje odporność przeciwnowotworową lub hamuje raki po podaniu zwierzętom. Według niniejszego ujawnienia zasugerowano, że polipeptydy posiadające sekwencję aminokwasową o NR ID. SEKW.: 19, 22,, 34, 344, 38, 41, 44, 46, 48, 78, 80, 0, 1, 1, 111, 387, 112, 394, 39, 133, 13, 137, 426, 174, 178, 186, 194, 196, 2, 2, 213, 214, 217 lub 223 są peptydami epitopowymi podlegającymi restrykcji HLA-A24, i zasugerowano, że te o ID SEK ID 376, 379, 114, 116, 117, 121, 227, 228, 233, 24, 271, 272 lub 288 są peptydami epitopowymi podlegającymi restrykcji HLA-A2, które mogą indukować silną i specyficzną odpowiedź immunologiczną przeciwko komórkom z ekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np., komórkom rakowym z ekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA,

73 KNTC2, TTK i/lub URLC. Raki brane pod uwagę obejmują, ale bez ograniczenia do tego, raka pęcherza, raka piersi, raka szyjki macicy, raka komórek przewodów żółciowych, CML, raka jelita grubego, endometriozę, raka przełyku, raka żołądka, raka żołądka typu rozlanego, raka wątroby, NSCLC, chłoniaka, kostniakomięsaka, raka jajnika, raka trzustki, raka prostaty, raka nerki, SCLC, nowotwór tkanek miękkich oraz nowotwór jądra. [0066] Tak więc, ujawniono sposób indukowania odpowiedzi immunologicznej z zastosowaniem polipeptydów posiadających sekwencję aminokwasową o NR ID. SEKW.: 19, 22,, 34, 344, 38, 41, 44, 46, 48, 78, 376, 379, 80, 0, 1, 1, 111, 387, 112, 394, 114, 116, 117, 121, 39, 133, 13, 137, 426, 174, 178, 186, 194, 196, 2, 2, 213, 214, 217, 223, 227, 228, 233, 24, 271, 272 lub 288 lub jej wariant (tj. zawierający 1, 2 lub kilka (np. do ) podstawień, delecji lub addycji aminokwasowych). Ogólnie odporność przeciwnowotworowa obejmuje następujące odpowiedzi immunologiczne: - indukcję limfocytów cytotoksycznych przeciwko nowotworom zawierającym komórki z ekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, - indukcję przeciwciał, które rozpoznają nowotwory zawierające komórki z ekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, oraz - indukcję wytwarzania cytokin przeciwnowotworowych. [0067] Zatem, gdy pewien peptyd indukuje dowolną z tych odpowiedzi immunologicznych po podaniu zwierzęciu, stwierdza się, że peptyd posiada efekt indukowania

74 7 1 2 odporności przeciwnowotworowej. Indukcja odporności przeciwnowotworowej przez peptyd może być wykryta przez obserwację in vivo lub in vitro odpowiedzi układu odpornościowego przeciwko peptydowi w gospodarzu. [0068] Na przykład, dobrze znany jest sposób detekcji indukowania cytotoksycznych limfocytów T. Obca substancja, która wchodzi do żywego organizmu jest prezentowana komórkom T i komórkom B poprzez działanie komórek prezentujących antygen (APC). Komórki T, które odpowiadają na antygen prezentowany przez APC w sposób specyficzny dla antygenu różnicują się w cytotoksyczne komórki T (określane także jako cytotoksyczne limfocyty T lub CTL) dzięki stymulacji antygenem, a następnie mnożą się; ten proces jest określany tutaj jako aktywacja komórek T. Zatem indukcja CTL przez pewien peptyd może być oceniona poprzez prezentację peptydu komórkom T przez APC, i detekcję indukcji CTL. Ponadto, komórki APC posiadają właściwość aktywowania komórek T CD4+, komórek T CD8+, makrofagów, eozynofili oraz komórek NK. Ze względu na to, że komórki T CD4+ są również ważne w odporności przeciwnowotworowej, działanie peptydu indukujące odporność przeciwnowotworową może być ocenione przy użyciu skutku aktywacji tych komórek jako wskaźników. [0069] Sposób do oceny zdolności indukowania CTL przy użyciu komórek dendrytycznych (komórek DC) jako APC jest dobrze znany w tej dziedzinie. DC jest przedstawicielem APC posiadającym największą zdolność indukowania CTL pośród komórek APC. W tym sposobie, testowany polipeptyd jest początkowo poddawany kontaktowi z DC, a następnie ta DC jest poddawana

75 kontaktowi z komórkami T. Detekcja komórek T wykazujących efekt cytotoksyczny przeciwko komórkom będącym przedmiotem zainteresowania po kontakcie z komórkami DC pokazuje, że testowany polipeptyd posiada zdolność indukowania cytotoksycznych komórek T. Aktywność komórek CTL przeciwko nowotworom może być wykrywana, na przykład, przy użyciu jako wskaźnika lizy komórek nowotworowych wyznakowanych 1 Cr. Alternatywnie, dobrze wiadomo, że stopień uszkodzenia komórki nowotworowej można ocenić przy użyciu zdolności do pobierania 3H-tymidyny lub uwalniania LDH (dehydrogenazy mleczanowej), jako wskaźnika. Ponadto, można je także badać poprzez pomiar IFN-gamma wytworzonego i uwolnionego przez CTL w obecności komórek prezentujących antygen, które niosą immobilizowane peptydy, poprzez wizualizację przy użyciu przeciwciał anty-ifn-gamma, taką jak test ELISPOT. [0070] Jako APC mogą być także stosowane, oprócz DC, jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC). Doniesiono, że indukcja CTL jest zwiększona przez hodowlę PBMC w obecności GM-CSF oraz IL-4. Podobnie pokazano, że CTL można zaindukować poprzez hodowlę PBMC w obecności hemocyjaniny ze skałoczepu Megathura crenulata (KLH, ang. keyhole limpet hemocyanin) oraz IL-7. [0071] Testowane polipeptydy, dla których potwierdzono przy użyciu tych sposobów, że posiadają zdolność indukowania CTL, są polipeptydami zdolnymi do aktywacji DC, a następnie indukowania CTL. Zatem polipeptydy, które indukują CTL przeciwko komórkom z

76 ekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC są użyteczne jako szczepionki przeciwko chorobom związanym z CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np. rakom. Ponadto APC, które nabyły zdolności indukowania CTL przeciwko chorobie związanej z nadekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np. rakom, poprzez kontakt z polipeptydami, są użyteczne jako szczepionki przeciwko chorobie. Ponadto CTL, które nabyły cytotoksyczność dzięki prezentacji antygenów polipeptydowych przez APC, mogą także być stosowane jako szczepionki przeciwko chorobie związanej z CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np. rakom. Takie sposoby terapeutyczne dla chorób związanych z CDH3, EPHA4, ECT2, HID2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np. raków, przy użyciu odporności przeciwnowotworowej dzięki APC i CTL, są określane jako immunoterapia komórkowa. Raki brane pod uwagę obejmują, ale bez ograniczenia do tego, raka pęcherza, raka piersi, raka szyjki macicy, raka komórek przewodów żółciowych, CML, raka jelita grubego, endometriozę, raka przełyku, raka żołądka, raka żołądka typu rozlanego, raka wątroby, NSCLC, chłoniaka, kostniakomięsaka, raka jajnika, raka trzustki, raka prostaty, raka nerki, SCLC, nowotwór tkanek miękkich oraz nowotwór jądra. [0072] Ogólnie, podczas stosowania polipeptydu do immunoterapii komórkowej, efektywność indukcji CTL może zostać zwiększona poprzez łączenie różnorodnych polipeptydów posiadających różne struktury i poddawanie ich kontaktowi z DC. Zatem, podczas stymulacji DC

77 fragmentami białek korzystne jest stosowanie mieszaniny fragmentów różnych typów. [0073] Indukcja odporności przeciwnowotworowej może być ponadto potwierdzona poprzez obserwowanie indukcji wytwarzania przeciwciał przeciwko nowotworom. Na przykład, gdy przeciwciała przeciwko polipeptydowi ulegną indukcji u zwierzęcia laboratoryjnego poddanego immunizacji polipeptydem i gdy wzrost, proliferacja i/lub metastaza komórek nowotworowych ulegnie supresji przez te przeciwciała, stwierdza się, że polipeptyd indukuje odporność przeciwnowotworową. [0074] Odporność przeciwnowotworowa może być zaindukowana poprzez podanie szczepionki ujawnionej tutaj, a indukcja odporności przeciwnowotworowej umożliwia leczenie i zapobieganie chorobie związanej z nadekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np. rakom. Terapia przeciwko chorobie lub zapobieganie pojawieniu się choroby związanej z nadekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np. raków, może obejmować hamowanie wzrostu komórek z ekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB. KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np. komórek rakowych, regres tych komórek oraz supresję wystąpienia tych komórek, np. komórek rakowych. Zmniejszenie śmiertelności osobników posiadających chorobę związaną z CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np. raki, zmniejszenie markerów choroby we krwi, łagodzenie wykrywalnych objawów towarzyszących chorobie i tym podobne są także włączone do terapii lub zapobiegania chorobie, np. rakom. Korzystnie, jeśli takie efekty

78 terapeutyczne i zapobiegawcze są istotne statystycznie, na przykład, obserwowane na poziomie istotności wynoszącym % lub mniej, przy czym efekt terapeutyczny lub zapobiegawczy szczepionki przeciwko chorobie związanej z CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np. rakom, jest porównywany z kontrolą bez podania szczepionki. Do wyznaczenia istotności statystycznej może być stosowany, na przykład, test t Studenta, test U Mann-Whitney a lub ANOVA. [007] Ujawniono sposób leczenia lub zapobiegania chorobie związanej z nadekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np. rakom, w której związki lub kompozycje terapeutyczne mogą być podawane profilaktycznie lub terapeutycznie osobnikom cierpiącym na chorobę lub zagrożonym rozwojem choroby (lub będącym podatnymi na chorobę). Takich osobników można identyfikować przy użyciu standardowych metod klinicznych. W kontekście niniejszego wynalazku, podawanie profilaktyczne zachodzi przed pojawieniem się widocznych objawów klinicznych choroby tak, że zapobiega się chorobie lub zaburzeniu lub alternatywnie opóźnia sie jego rozwój. W kontekście dziedziny medycyny, określenie zapobiegać obejmuje dowolną czynność, która zmniejsza stopień śmiertelności i nasilenie objawów choroby. Zapobieganie może zachodzić na pierwszym, drugim i trzecim poziomie zapobiegania. Podczas, gdy zapobieganie na pierwszym poziomie pozwala uniknąć rozwoju choroby, drugi i trzeci poziom zapobiegania obejmują działania wymierzone na zapobieganie progresji choroby i pojawieniu się

79 objawów, jak również na zmniejszanie negatywnego wpływu już powstałej choroby poprzez przywrócenie funkcji i zmniejszenie powikłań związanych z chorobą. [0076] W kontekście leczenia raka, określenie skuteczny dotyczy leczenia, które prowadzi do zmniejszenia rozmiaru, częstości występowania lub potencjału do tworzenia przerzutów raka u osobnika. Gdy leczenie jest zastosowane profilaktycznie, skuteczny oznacza, że leczenie spowalnia lub zapobiega pojawieniu się raka lub łagodzi objawy kliniczne raka. Ocenę raka można wykonać przy użyciu standardowych protokołów klinicznych. Ponadto, skuteczność leczenia może być wyznaczona w powiązaniu z dowolnym znanym sposobem diagnostyki lub leczenia raka. Na przykład, rak może być diagnozowany histopatologicznie lub poprzez identyfikację objawowych nieprawidłowości. [0077] Wyżej wspomniany peptyd posiadający aktywność immunologiczną lub polinukleotyd albo wektor kodujący taki peptyd może być łączony z adiuwantem. Adiuwant odnosi się do związku, który zwiększa odpowiedź immunologiczną przeciwko peptydowi, gdy jest podawany razem (lub kolejno) z peptydem posiadającym aktywność immunologiczną. Przykłady odpowiednich adiuwantów obejmują toksynę cholery, toksynę salmonelli, ałun i tym podobne, ale nie są do nich ograniczone. Ponadto, szczepionka według niniejszego wynalazku może być odpowiednio łączona z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem. Przykładami takich nośników są sterylizowana woda, roztwór soli fizjologicznej, bufor fosforanowy, płyn hodowlany i tym podobne. Ponadto, szczepionka może zawierać, jeśli to konieczne, stabilizatory, zawiesiny,

80 konserwanty, sufraktanty i tym podobne. Szczepionka jest podawana ogólnoustrojowo lub lokalnie. Podawanie szczepionki może być wykonane jako pojedyncze podanie lub być wzmocnione przez podawanie wielokrotne. [0078] Przy użyciu APC lub CTL jako szczepionki tutaj ujawnionej, chorobę związaną z nadekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np. raki, można leczyć lub jej zapobiegać, na przykład, sposobem ex vivo. Bardziej konkretnie, komórki PBMC od osobnika otrzymującego leczenie lub zabieganie są pobierane, poddawane kontaktowi ex vivo z peptydem według niniejszego wynalazku. Po indukcji APC lub CTL, komórki mogą być podane osobnikowi. APC mogą być także zaindukowane poprzez wprowadzenie wektora kodującego peptyd do komórek PBMC ex vivo. Zaindukowane in vitro APC lub CTL mogą być klonowane przed podaniem. Poprzez klonowanie i hodowlę komórek posiadających wysoką zdolność uszkadzania komórek docelowych, immunoterapia komórkowa może być wykonana bardziej skutecznie. Ponadto, wyizolowane w ten sposób APC i CTL mogą być stosowane do immunoterapii komórkowej nie tylko przeciwko osobnikom, od których te komórki pochodzą, ale także przeciwko podobnym typom choroby u innych osobników. [0079] Aspekty niniejszego wynalazku są opisane w następujących przykładach, które są przedstawione tylko w celu zilustrowania niniejszego wynalazku i aby pomóc specjaliście w ich realizacji i zastosowaniu. W każdym razie, przykłady w żaden sposób nie stanowią ograniczenia zakresu wynalazku. [0080] Pomimo, że w realizacji i testowaniu

81 82 1 niniejszego wynalazku mogą być stosowane sposoby i materiały podobne lub równoważne do tych opisanych tutaj, odpowiednie sposoby i materiały są opisane poniżej. Przykłady [0081] Poniżej niniejszy wynalazek jest zilustrowany, ale nie ograniczony, przez poniższe Przykłady. Jednakże, materiały, sposoby i tym podobne opisane tutaj, jedynie ilustrują aspekty wynalazku i w żaden sposób nie stanowią ograniczenia zakresu niniejszego wynalazku. Jako takie, materiały, sposoby itd. podobne lub równoważne do tych opisanych tutaj mogą być zastosowane w realizacji lub testowaniu niniejszego wynalazku. 2 Materiały i Sposoby Linie komórkowe [0082] Komórki A24-LCL (HLA-A24), linia ludzkich komórek B-limfoblastycznych została wyprowadzona przez transformowanie wirusem Epstain-Bara. Komórkę T2, COS7, A498, Caki-2 i HEK 293 zakupiono w ATCC. Caki-1 oraz MIAPaca-2 nabyto w JCRB. PK-4P, PK-9, TE- oraz TE-6 nabyto w TKG. 293 T nabyto w GenHunter. Selekcja kandydujących peptydów pochodzących z CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK oraz URLC [0083] Peptydy w postaci 9-merów i -merów pochodzących z CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK lub URLC, które wiążą się do cząsteczki

82 83 HLA-A*2402 lub HLA-A*01 przewidziano przy użyciu oprogramowania do przewidywania wiązania BIMAS (http: //bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parkercomboform) (Parker KC, i wsp., (1994) J Immunol.;12(1):163-7.; Kuzushima K, i wsp., (01) Blood.;98(6): ). Te peptydy zostały zsyntetyzowane przez Sigma (Sapporo, Japonia) według standardowej syntezy na stałym podłożu i oczyszczone przez HPLC w odwróconych fazach. Czystość (>90%) i identyczność peptydów oznaczono przy użyciu, odpowiednio, analitycznej HPLC i spektroskopii masowej. Peptydy rozpuszczono w dimetylosulfotlenku (DMSO) w stężeniu mg/ml i przechowywano w -80 stopniach C. 1 2 Indukcja CTL in vitro [0084] Komórki dendrytyczne pochodzące z monocytów (komórki DC) zastosowano jako komórki prezentujące antygen (komórki APC) w celu indukcji odpowiedzi CTL przeciwko peptydom prezentowanym na HLA. Komórki DC wytwarzano in vitro, jak to opisano gdzie indziej (Nukaya I i wsp., (1999) Int. J. Cancer 80, 92-7., Tsai V i wsp., (1997) J. Immunol 18: ). W skrócie, jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) wyizolowane od zdrowego ochotnika (HLA-A*2402 i/lub HLA-A*01) przy użyciu roztworu Ficoll-Paque (Pharmacia) rozdzielono poprzez przyleganie do plastikowej butelki do hodowli tkankowej (Becton Dickinson), aby wzbogacić je we frakcję monocytów. Populację wzbogaconą w monocyty hodowano w obecności 00 U/ml GM-CSF (Genzyme) oraz 00 U/ml IL-4 w AIM-V (Invitrogen) zawierającej 2% autologicznej surowicy

83 84 1 (AS) inaktywowanej ciepłem. Po 7 dniach hodowli komórki DC wytworzone przy pomocy cytokin poddawano pulsowemu działaniu mikro g/ml zsyntetyzowanych peptydów w obecności 3 mikro g/ml beta 2-mikroglobuliny w ciągu 4 godz. w stopniach C w AIM-V. Te komórki poddane pulsowemu działaniu peptydów inaktywowano następnie przy użyciu MMC ( micro g/ml przez min) i zmieszano w stosunku 1: z autologicznymi komórkami T CD8+, uzyskanymi poprzez pozytywną selekcję przy użyciu Dynabeads M-40 CD8 (Dynal) oraz DETACHa BEAD (Dynal). Te hodowle założono w 48-dołkowych płytkach (Coming); każda studzienka zawierała 1,x 4 komórek DC poddanych pulsowemu działaniu peptydów, 3x komórek T CD8+ oraz ng/ml IL-7 (Genzyme) w 0, ml AIM-V/2% AS. Trzy dni później do tych hodowli dodano IL-2 (CHIRON) do końcowego stężenia IU/ml. W dniu 7 i 14 komórki T znów ponownie stymulowano przy użyciu autologicznych komórek DC poddanych pulsowemu działaniu peptydów. Komórki DC za każdym razem przygotowywano w ten sam sposób opisany powyżej. CTL testowano przeciwko komórkom A24-LCL lub komórkom T2 poddanym pulsowemu działaniu peptydów po 3-ciej rundzie stymulacji peptydami w dniu Procedura namnażania CTL [008] Komórki CTL namnażano w hodowli przy użyciu sposobu podobnego do tego opisanego przez Riddell SR, i wsp., (Walter EA i wsp., (199) N Engl J Med 333:38-44.; Riddel SR, i wsp., (1996) Nature Med. 2: ). Całkowitą ilość x 4 CTL zawieszono w 2 ml AIM-V/% AS z 2 rodzajami linii ludzkich komórek B-

84 8 limfoblastycznych, inaktywowanych przy użyciu MMC, w obecności 40 ng/ml monoklonalnego przeciwciała anty-cd3 (Pharmingen). Jeden dzień po zapoczątkowaniu hodowli dodano do nich 1 IU/ml IL-2. Hodowle zasilano świeżą AIM-V/% AS zawierającą IU/ml IL-2 w dniach, 8 i Wyprowadzenie klonów CTL [0086] Wykonano rozcieńczenia w celu uzyskania 0,3, 1, i 3 CTL/studzienkę w 96 okrągłodennej płytce do mikromiareczkowania (Nalge Nunc International). CTL hodowano z 7x 4 komórek/studzienkę dwóch rodzajów linii ludzkich komórek B-limfoblastycznych, ng/ml przeciwciała anty-cd3, oraz 12 U/ml IL-2 w całkowitej objętości mikro l/studzienkę AIM-V zawierającej % AS. 0 mikro 1/studzienkę IL-2 dodano do pożywki dni później tak, aby końcowe stężenie IL-2 wynosiło 12 U/ml. Aktywność CTL komórek CTL testowano 14-go dnia, a klony CTL namnożono przy użyciu tego samego sposobu, jak powyżej. 2 Specyficzna aktywność CTL [0087] Aby zbadać specyficzną aktywność CTL wykonano test IFN-gamma ELISPOT oraz test IFN-gamma ELISA. W skrócie, jako komórki stymulujące przygotowano komórki A24-LCL lub T2 poddane pulsowemu działaniu peptydu (1x 4 /studzienkę). Jako komórki odpowiadające stosowano komórki hodowane w 48 studzienkach lub klony CTL po granicznym rozcieńczeniu. Test IFN-gamma ELISPOT oraz test IFN-gamma ELISA wykonano według procedury podanej przez producenta.

85 Wyprowadzanie komórek z wymuszoną ekspresją jednego lub obydwu genu docelowego i HLA-A02 lub HLA-A24. [0088] cdna kodujący otwartą ramkę odczytu docelowych genów lub HLA-A02 lub HLA-A24 namnożono w reakcji PCR. Produkty namnożone w reakcji PCR sklonowano do wektora pcdna3.1 myc-his (Invitrogen). Plazmidami transfekowano komórki docelowe, linie prawidłowych ludzkich komórek COS7 lub 293T pozbawionych HLA-A02 i HLA-A24, przy użyciu lipofektaminy (Invitrogen) według procedur rekomendowanych przez producenta. Alternatywnie, plazmid zawierający docelowe geny transfekowano do A24- LCL poprzez elektroporację przy użyciu GenePulserII (Biorad). W skrócie 2,x 6 komórek A24-LCL poddano pulsowemu działaniu mcg plazmidu przy 140V i 00 mikro F. Po dwóch dniach od transfekcji, transfekowane komórki traktowano roztworem do dysocjacji komórek i stosowano jako komórki docelowe w teście na aktywność CTL. Test cytotoksyczności [0089] Aktywność cytotoksyczną oceniono w czterogodzinnym teście uwalniania 1 Cr. Do komórek docelowych wprowadzano przez noc peptyd w stężeniu mikro g/ml. Komórki docelowe znakowano przy użyciu 0 mikro Ci Na 1 2 CrO 4 w 37 stopniach C przez jedną godzinę, a następnie przemyto trzy razy przy użyciu RPMI1640. Komórki docelowe (1x 4 /0 mikro l) oraz 0 mikro l różnych ilości komórek efektorowych w całkowitej objętości 0 mikro l umieszczono w okrągłodennej 96- dołkowej płytce do mikromiareczkowania (Coming) i

86 87 hodowano w 37 stopniach C w inkubatorze z CO 2 przez cztery godziny. Po hodowli, z każdej studzienki pobrano po 0 mikro l supernatantu i mierzono radioaktywność przy użyciu licznika promieniowania gamma. Spontanicznie uwalniana była radioaktywność z komórek docelowych w pożywce w nieobecności komórek efektorowych, a maksymalne uwalnianie było w przypadku radioaktywności z komórek docelowych inkubowanych z 1 M HCl. Odsetek specyficznej cytotoksyczności wyznaczono przez obliczenie według następującego wzoru: 1 2 % lizy specyficznej = [(uwalnianie doświadczalne uwalnianie spontaniczne) / (uwalnianie maksymalne uwalniane spontaniczne)] x0 Wyniki Zwiększona ekspresja CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK oraz URLC w rakach [0090] Dane z całościowych profili ekspresji genów uzyskane z różnych raków przy użyciu mikromacierzy cdna ujawniły, że ekspresja następujących genów była podwyższona. CDH3 (Nr Dostępu GenBank NM_001793; NR ID. SEKW.: 1, 2), EPHA4 (Nr Dostępu GenBank L3664; NR ID. SEKW.: 3, 4), ECT2 (Nr Dostępu GenBank AY376439; NR ID. SEKW.:, 6), HIG2 (Nr Dostępu GenBank NM_013332; NR ID. SEKW.: 7, 8), INHBB (Nr Dostępu GenBank NM_002193; NR ID. SEKW.: 9, ), KIFA (Nr Dostępu GenBank NM_00733; NR ID. SEKW.: 11, 12),

87 KNTC2 (Nr Dostępu GenBank AF017790; NR ID. SEKW.: 13, 14), TTK (Nr Dostępu GenBank NM_003318; NR ID. SEKW.: 1,16) oraz URLC (Nr Dostępu GenBank NM_01727; NR ID. SEKW.: 17, 18) Ekspresja CDH3 była znacząco podniesiona w następujących rakach w porównaniu z odpowiednią tkanką prawidłową. 26 z 34 raków pęcherza, 17 z 19 raków szyjki macicy, 19 z 19 raków komórek przewodów żółciowych, z 34 raków jelita grubego, z 21 endometrioz, 13 z raków żołądka, 7 z 8 raków żołądka typu rozlanego, 36 z 37 NSCLC, 16 z 16 raków trzustki, 21 z 21 nowotworów tkanek miękkich oraz z nowotworów jądra [0091] Ekspresja EPHA4 była znacząco podniesiona w następujących rakach w porównaniu z odpowiednią tkanką prawidłową. 14 z 34 raków pęcherza, 8 z 14 raków szyjki macicy, z 2 raków komórek przewodów żółciowych, z 1 endometrioz, z 8 raków żołądka typu rozlanego, z raków jajnika, 14 z 14 raków trzustki, z 1 raków prostaty oraz

88 z 23 nowotworów tkanek miękkich [0092] Ekspresja ECT2 była znacząco podniesiona w następujących rakach w porównaniu z odpowiednią tkanką prawidłową. 17 z 19 raków pęcherza, z 12 raków piersi, 14 z 14 raków szyjki macicy, 13 z 13 raków komórek przewodów żółciowych, z CML, 7 z 8 raków jelita grubego, 12 z 16 raków przełyku, 6 z 16 NSCLC, 8 z chłoniaków, 1 z 1 raków trzustki, z 13 raków prostaty, 3 z 6 raków nerki oraz 12 z 13 raków SCLC Ekspresja HIG2 była znacząco podniesiona w 19 z raków nerki oraz 7 z 9 nowotworów tkanek miękkich w porównaniu z odpowiednią tkanką prawidłową. Ekspresja INHBB była znacząco podniesiona w następujących rakach w porównaniu z odpowiednią tkanką prawidłową. z 21 raków komórek przewodów żółciowych, 12 z 12 raków przełyku, z 13 NSCLC, 22 z 24 raków nerki, 8 z 14 raków SCLC oraz 4 z 49 nowotworów tkanek miękkich [0093] Ekspresja KIFA była znacząco podniesiona w następujących rakach w porównaniu z odpowiednią tkanką

89 prawidłową. 31 z 31 raków pęcherza, 38 z 61 raków piersi, z 11 raków komórek przewodów żółciowych, 7 z 19 raków przełyku, 21 z 22 NSCLC, 6 z 6 raków jajnika, 17 z 36 raków prostaty, 6 z 11 raków nerki oraz 1 z 1 SCLC [0094] Ekspresja KNTC2 była znacząco podniesiona w następujących rakach w porównaniu z odpowiednią tkanką prawidłową. z 32 raków pęcherza, 47 z 6 raków piersi, z raków szyjki macicy, 16 z 22 raków komórek przewodów żółciowych, 17 z 37 CML, 3 z raków jelita grubego, 11 z 46 raków przełyku, 1 z 19 NSCLC, 7 z 8 chłoniaków, z 24 kostniakomięsaków, 3 z raków jajnika, 2 z 2 raków trzustki, 1 z 37 raków prostaty, 14 z 19 raków nerki, 1 z 1 SCLC oraz 40 z 9 nowotworów tkanek miękkich [009] Ekspresja TTK była znacząco podniesiona w następujących rakach w porównaniu z odpowiednią tkanką

90 prawidłową. 27 z 27 raków pęcherza, 2 z raków piersi, 1 z 16 raków szyjki macicy, z raków komórek przewodów żółciowych, z 7 CML, 6 z raków jelita grubego, 24 z 44 raków przełyku, 8 z 1 raków wątroby, 12 z 12 NSCLC, 6 z 6 chłoniaków, 13 z 16 kostniakomięsaków, 12 z 17 raków prostaty, 1 z 1 SCLC oraz 16 z 33 nowotworów tkanek miękkich [0096] Ekspresja URLC była znacząco podniesiona w następujących rakach w porównaniu z odpowiednią tkanką prawidłową. 29 z 29 raków pęcherza, 1 z 16 raków szyjki macicy, 7 z 7 raków komórek przewodów żółciowych, 7 z 19 raków przełyku, 3 z 3 raków żołądka, 24 z 27 NSCLC, 1 z 19 kostniakomięsaków, 4 z raków trzustki, 33 z 43 nowotworów tkanek miękkich.

91 92 [0097] [Tabela 1] Odsetek przypadków z zaobserwowaną regulacją w górę CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK lub URLC w tkankach rakowych w porównaniu z odpowiednią tkanką prawidłową CDH3 EPHA4 ECT2 HIG2 INHBB Rak pęcherza 26/34 14/34 17/ Rak piersi - - / Rak szyjki macicy 17/19 8/14 14/ Rak komórek przewodów żółciowych 19/19 /2 13/13 - /21 CML - - / - - Rak jelita grubego /34-7/8 - - Endometrioza /21 / Rak przełyku /16-12/12 Rak żołądka 13/ Rak żołądka 7/8 / typu rozlanego Rak wątroby Niedrobnokomórkowy 36/37-6/16 - /13 rak płuca Chłoniak - - 8/ - - Kostniakomięsak Rak jajnika - / Rak trzustki 16/16 14/14 1/1 - - Rak prostaty - /1 / Rak nerki - - 3/6 19/ 22/24 Drobnokomórkowy rak płuca /13-8/14 Nowotwór tkanek miękkich 21/21 14/23-7/9 4/49 Nowotwór jądra /

92 93 KIFA KNTC2 TTK URLC Rak pęcherza 31/31 /32 27/27 29/29 Rak piersi 38/61 47/6 2/ - Rak szyjki macicy - / 1/16 1/16 Rak komórek przewodów żółciowych /11 16/22 / 7/7 CML - 17/37 /7 - Rak jelita grubego - 3/ 6/ - Endometrioza Rak przełyku 7/19 11/46 24/44 7/19 Rak żołądka /3 Rak żołądka typu rozlanego Rak wątroby - - 8/1 - Niedrobnokomórkowy 21/22 1/19 12/12 24/27 rak płuca Chłoniak - 7/8 6/6 - Kostniakomięsak - /24 13/16 1/19 Rak jajnika - 3/ - - Rak trzustki 6/6 2/2-4/ Rak prostaty 17/36 1/37 12/17 - Rak nerki 6/11 14/ Drobnokomórkowy rak płuca 1/1 1/1 1/1 - Nowotwór tkanek miękkich - 40/9 16/33 33/43 Nowotwór jądra Przewidywanie peptydów wiążących się z HLA-A24 lub HLA- A2 pochodzących z CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK lub URLC [0098] Tabela 2 przedstawia peptydy wiążące się z HLA-A*2402 dla CDH3 w kolejności powinowactwa wiązania. Tabela 2A przedstawia peptydy 9-merowe pochodzące z CDH3, a Tabela 2B przedstawia peptydy -merowe pochodzące z

93 CDH3. Tabela 3 przedstawia peptydy wiążące się z HLA-A*2402 oraz HLA-A*01 dla EPHA4 w kolejności powinowactwa wiązania. Tabela 3A przedstawia peptydy 9-merowe wiążące się z HLA-A*2402 pochodzące z EPHA4, Tabela 3B przedstawia peptydy -merowe wiążące się z HLA-A*2402 pochodzące z EPHA4, a Tabela 3C przedstawia 9-merowe peptydy wiążące się z HLA-A*01 pochodzące z EPHA4. Tabela 4 przedstawia peptydy wiążące się z HLA-A*2402 dla ECT2 w kolejności powinowactwa wiązania. Tabela 4A przedstawia peptydy 9-merowe pochodzące z ECT2, a Tabela 4B przedstawia peptydy -merowe pochodzące z ECT2. Tabela przedstawia peptydy wiążące się z HLA-A*2402 oraz HLA-A*01 dla HIG2, Tabela A przedstawia peptydy 9-merowe wiążące się z HLA-A*2402 pochodzące z HIG2, Tabela B przedstawia peptydy -merowe wiążące się z HLA-A*2402 pochodzące z HIG2, Tabela C przedstawia peptydy 9-merowe wiążące się z HLA-A*01 pochodzące z HIG2, a Tabela D przedstawia peptydy -merowe wiążące się z HLA-A*01 pochodzące z HIG2. Tabela 6 przedstawia peptydy wiążące się z HLA-A*2402 oraz HLA-A*01 dla INHBB, Tabela 6A przedstawia peptydy 9-merowe wiążące się z HLA-A*2402 pochodzące z INHBB, Tabela 6B przedstawia peptydy -merowe wiążące się z HLA-A*2402 pochodzące z INHBB, Tabela 6C przedstawia peptydy 9-merowe wiążące się z HLA-A*01 pochodzące z INHBB, a Tabela 6D przedstawia peptydy - merowe wiążące się z HLA-A*01 pochodzące z INHBB.

94 9 1 2 Tabela 7 przedstawia peptydy wiążące się z HLA-A*2402 dla KIFA w kolejności powinowactwa wiązania. Tabela 7A przedstawia peptydy 9-merowe pochodzące z KIFA, a Tabela 7B przedstawia peptydy -merowe pochodzące z KIFA. Tabela 8 przedstawia peptydy wiążące się z HLA-A*2402 dla KNTC2 w kolejności powinowactwa wiązania. Tabela 8A przedstawia peptydy 9-merowe pochodzące z KNTC2, a Tabela 8B przedstawia peptydy -merowe pochodzące z KNTC2. Tabela 9 przedstawia peptydy wiążące się z HLA-A*01 dla TTK w kolejności powinowactwa wiązania. Tabela 9A przedstawia peptydy 9-merowe pochodzące z TTK, a Tabela 9B przedstawia peptydy -merowe pochodzące z TTK. Tabela przedstawia peptydy wiążące się z HLA-A*01 dla URLC w kolejności powinowactwa wiązania. Tabela A przedstawia peptydy 9-merowe pochodzące z URLC, a Tabela B przedstawia peptydy -merowe pochodzące z URLC. Wyjaśnienie i zdefiniowanie określeń w tabelach [0099] Pozycja początkowa oznacza numer aminokwasu od końca N. Współczynnik wiązania pochodzi z BIMAS opisanego w Materiałach i Sposobach. Liczba dodatnich donorów oznacza liczbę donorów, których komórki T CD8+ mogą być zaindukowane do specyficznych CTL poprzez stymulację ex vivo przy użyciu komórek prezentujących antygen. Jest to pokazane jako (liczba dodatnich donorów/całkowita liczba donorów). Liczba dodatnich studzienek oznacza liczbę studzienek, w których może być wykryte specyficzne wytwarzanie IFN-gamma przy

95 96 1 użyciu testu IFN-gamma ELISPOT. Z jednego donora można przygotować 4 do 8 studzienek. Jest to pokazane jako (liczba dodatnich studzienek/całkowita liczba studzienek oznaczonych w teście IFN-gamma ELISPOT). Dodatnia linia CTL oznacza liczbę linii CTL wyprowadzonych z dodatnich studzienek. Powstanie linii CTL jest oceniane w teście ELISA. Jest ono pokazane jako (liczba wyprowadzonych linii CTL/liczba dodatnich studzienek oznaczonych w teście IFN-gamma ELISPOT). Brak dodatniego donora nie jest zdefiniowany przez brak wykrytych dodatnich studzienek, lecz poprzez brak wyprowadzonej linii CTL. Peptydy przedstawione w tabelach pogrubioną czcionką posiadają zdolność stymulowania komórek T. Brak danych przy liczbie dodatnich donorów, liczbie dodatnich studzienek oraz dodatniej linii CTL oznaczony jako - oznacza, że peptydy nie mogą być zsyntetyzowane z jakiegoś powodu. 2

96 97 [00] [Tabela 2A-1] Peptydy 9-merowe wiążące się z HLA-A*2402 pochodzące z CDH3 1

97 98 [Tabela 2A-2] 1

98 99 [01] [Tabela 2B-1] Peptydy -merowe wiążące się z HLA-A*2402 pochodzące z CDH3 1 2

99 0 [Tabela 2B-2] 1

100 1 [02] [Tabela 3A] Peptydy 9-merowe wiążące się z HLA-A*2402 pochodzące z EPHA4 1

101 2 [03] [Tabela 3B] Peptydy -merowe wiążące się z HLA-A*2402 pochodzące z EPHA4 1

102 3 [04] [Tabela 3C] Peptydy 9-merowe wiążące się z HLA-A*01 pochodzące z EPHA4 1 2

103 4 [0] [Tabela 4A] Peptydy 9-merowe wiążące się z HLA-A*2402 pochodzące z ECT2 1 2

104 [06] [Tabela 4B] Peptydy -merowe wiążące się z HLA-A*2402 pochodzące z ECT2 [07] [Tabela A] Peptydy 9-merowe wiążące się z HLA-A*2402 pochodzące z HIG2 1

105 6 [08] [Tabela B] Peptydy -merowe wiążące się z HLA-A*2402 pochodzące z HIG2 [09] [Tabela C] Peptydy 9-merowe wiążące się z HLA-A*01 pochodzące z HIG2 1 [01] [Tabela D] Peptydy -merowe wiążące się z HLA-A*01 pochodzące z HIG2

106 7 [0111] [Tabela 6A] Peptydy 9-merowe wiążące się z HLA-A*2402 pochodzące z INHBB 1

107 8 [0112] [Tabela 6B] Peptydy -merowe wiążące się z HLA-A*2402 pochodzące z INHBB

108 9 [0113] [Tabela 6C] Peptydy 9-merowe wiążące się z HLA-A*01 pochodzące z INHBB 1 2

109 1 [0114] [Tabela 6D] Peptydy -merowe wiążące się z HLA-A*01 pochodzące z INHBB 1 2

110 111 [011] [Tabela 7A] Peptydy 9-merowe wiążące się z HLA-A*2402 pochodzące z KIFA 1 2

111 112 [0116] [Tabela 7B] Peptydy -merowe wiążące się z HLA-A*2402 pochodzące z KIFA 1 2

112 113 [0117] [Tabela 8A] Peptydy 9-merowe wiążące się z HLA-A*2402 pochodzące z KNTC2 1 2

113 114 [0118] [Tabela 8B] Peptydy -merowe wiążące się z HLA-A*2402 pochodzące z KNTC2 1 2

114 11 [0119] [Tabela 9A] Peptydy 9-merowe wiążące się z HLA-A*01 pochodzące z TTK 1

115 116 [01] [Tabela 9B] Peptydy -merowe wiążące się z HLA-A*01 pochodzące z TTK 1

116 117 [0121] [Tabela A] Peptydy 9-merowe wiążące się z HLA-A*01 pochodzące z URLC 1

117 118 [0122] [Tabela B] Peptydy -merowe wiążące się z HLA-A*01 pochodzące z URLC 1 Stymulacja komórek T przy użyciu peptydów przewidzianych na podstawie CDH3 podlegających restrykcji HLA-A*2402 i wyprowadzanie linii CTL stymulowanych peptydami pochodzącymi z CDH3 [0123] CTL dla tych peptydów pochodzących z CDH3 uzyskano według protokołów przedstawionych w sekcji Materiały i Sposoby powyżej. Uzyskane komórki CTL posiadające możliwą do wykrycia specyficzną aktywność CTL oznaczoną testem IFN-gamma ELISPOT przedstawiono na Fig. 1. W szczególności, CDH3-A (NR ID. SEKW.: 19), CDH3-A (NR ID. SEKW.: 22), CDH3-A

118 119 1 (NR ID. SEKW.: ), CDH3-A (NR ID. SEKW.: 34), CDH3-A24--6 (NR ID. SEKW.: 344) oraz CDH3-A (NR ID. SEKW.: 38) wykazywały w porównaniu z kontrolą silne wytwarzanie IFN-gamma oznaczone testem IFN-gamma ELISPOT, a komórki w dodatniej studzience numer # stymulowane NR ID. SEKW.: 19, #2 stymulowane NR ID. SEKW.: 22, # stymulowane NR ID. SEKW.:, #4 stymulowane NR ID. SEKW.: 34, #1 stymulowane NR ID. SEKW.: 344 oraz #4 stymulowane NR ID. SEKW.: 38 namnożono i wyprowadzono linie CTL. Te linie CTL, które miały wyższe specyficzne aktywności CTL przeciwko celowi, który poddano pulsowemu działaniu peptydu, w porównaniu do aktywności przeciwko celowi, którego nie poddano pulsowemu działaniu peptydu oznaczono przy użyciu testu ELISA. Wyniki są przedstawione na Fig. 1. Natomiast przy użyciu innych peptydów przedstawionych w tabeli 2 nie można było wyprowadzić linii CTL pomimo posiadania przez nie możliwej aktywności wiązania się z HLA-A*2402. Na przykład, typowy peptyd ujemny (CDH3- A ) przedstawiono na Fig. 1a. W tym wynalazku, peptydy, przy pomocy których można było wyprowadzić linie CTL, wybrano jako peptyd silnie stymulujący CTL. 2 Wyprowadzanie klonów CTL stymulowanych peptydami pochodzącymi z CDH3 [0124] Ponadto z tych linii CTL wykonano graniczne rozcieńczenie według protokołów przedstawionych w sekcji Materiały i Sposoby powyżej. Wyprowadzanie klonów CTL z linii CTL # CDH3-A (NR ID. SEKW.: ) oraz #1 CDH3-A24--6 (NR ID. SEKW.: 344) przedstawiono na Fig. 1f oraz g. Klony CTL posiadały

119 1 1 2 silne i specyficzne aktywności CTL przeciwko celowi, który poddano pulsowemu działaniu peptydu, w porównaniu z aktywnościami przeciwko celowi, którego nie poddano pulsowemu działaniu peptydu. Specyficzne aktywności CTL przeciwko komórkom docelowym z ekspresją CDH3 i HLA-A*2402 [012] Wyprowadzoną linię CTL wzbudzoną przeciwko tym peptydom badano pod kątem jej zdolności do rozpoznawania komórek docelowych z ekspresją CDH3 i HLA-A*2402. Specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 transfekowanym zarówno pełnej długości genem CDH3, jak i cząsteczką HLA-A*2402, które służą jako specyficzny model komórek docelowych z endogenną ekspresją CDH3 i HLA-A*2402, testowano przy użyciu linii CTL wzbudzonych przez CDH3-A (NR ID. SEKW.: ) oraz CDH3-A (NR ID. SEKW.: 344) jako komórek efektorowych. Jako kontrolę przygotowano COS7 transfekowane pełnej długości CDH3, ale nie HLA-A*2402, oraz COS7 transfekowane HLA-A*2402, ale nie pełnej długości CDH3. Klony CTL wykazujące najwyższą specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 były tymi, które transfekowano zarówno CDH3, jak i HLA-A2402 (Fig. 1f oraz g). Te wyniki jasno pokazują, że CDH3-A (NR ID. SEKW.: ) oraz CDH3-A24--6 (NR ID. SEKW.: 344) ulegają naturalnej ekspresji na powierzchni komórki docelowej wraz z cząsteczką HLA-A2402 i rozpoznają CTL. Ponadto, te peptydy są peptydami epitopowymi, które mogą służyć jako szczepionki rakowe przeciwko nowotworom z ekspresją CDH3.

120 Stymulacja komórek T przy użyciu peptydów przewidzianych na podstawie EPHA4 podlegających restrykcji HLA-A*2402 lub HLA-A*01 oraz wyprowadzanie linii CTL stymulowanych peptydami pochodzącymi z EPHA4 [0126] Komórki CTL dla tych peptydów pochodzących z EphA4 uzyskano przy użyciu testu IFN-gamma ELISPOT. Uzyskane komórki CTL posiadające wykrywalną specyficzną aktywność CTL oznaczoną testem IFN-gamma ELISPOT przedstawiono na Fig. 2. W szczególności EphA4-A (NR ID. SEKW.: 41), EphA4-A24-9- (NR ID. SEKW.: 44), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 46), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 48), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 78), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 376) oraz EphA4- A (NR ID. SEKW.: 379) wykazywały w teście IFNgamma ELISPOT silne wytwarzanie IFN-gamma, a komórki w dodatniej studzience #3 stymulowane EphA4-A (NR ID. SEKW.: 41), #2 stymulowane EphA4-A24-9- (NR ID. SEKW.: 44), # stymulowne EphA4-A (NR ID. SEKW.: 46), #6 stymulowane EphA4-A (NR ID. SEKW.: 48), #4 stymulowane EphA4-A (NR ID. SEKW.: 78), #8 stymulowane EphA4-A (NR ID. SEKW.: 376) oraz #3 stymulowane EphA4-A (NR ID. SEKW.: 379) namnożono i wyprowadzono linie CTL. Te linie CTL posiadające wyższe specyficzne aktywności CTL przeciwko celowi, który poddawano pulsowemu działaniu peptydu, w porównaniu z aktywnościami przeciwko celowi, którego nie poddawano pulsowemu działaniu peptydu oznaczono testem ELISA. W szczególności, linie CTL stymulowane przy użyciu EphA4-A (NR ID. SEKW.: 376) oraz EphA4-A (NR ID. SEKW.: 379) testowano

121 122 przy użyciu testu z uwalnianiem 1Cr według protokołów przedstawionych w sekcji Materiały i Sposoby powyżej. Wyniki przedstawiono na Fig. 2a-h. Natomiast przy użyciu innych peptydów przedstawionych w tabeli 3 nie można były wyprowadzić linii CTL, pomimo posiadania przez nie możliwej aktywności wiązania się z HLA-A*2402 lub HLA-A*01. Na przykład, typowy peptyd ujemny (EphA4-A ) przedstawiono na Fig. 2a. W tym wynalazku, peptydy, przy użyciu których można było wyprowadzić linie CTL, wyselekcjonowano jako peptydy silnie stymulujące CTL. 1 2 Stymulacja komórek T przy użyciu peptydów przewidzianych na podstawie ECT2 podlegających restrykcji HLA-A*2402 oraz wyprowadzanie linii CTL stymulowanych peptydami pochodzącymi z ECT2 [0127] CTL dla tych peptydów pochodzących z ECT2 uzyskano według protokołów przedstawionych w sekcji Materiały i Sposoby powyżej. Uzyskane CTL posiadające możliwą do wykrycia specyficzną aktywność CTL oznaczoną testem IFN-gamma ELISPOT są przedstawione na Fig. 3. W szczególności, ECT2-A (NR ID. SEKW.: 80). ECT2- A (NR ID. SEKW.: 0) oraz ECT2-A24--1 (NR ID. SEKW.: 1) wykazywały silne wytwarzanie IFN-gamma, a komórki w dodatniej studzience numer #7 stymulowanej ECT2-A (NR ID. SEKW.: 80), #2 stymulowanej ECT2-A (NR ID. SEKW.: 0) oraz #1 stymulowanej ECT2-A24--1 (NR ID. SEKW.: 1) namnożono i wyprowadzono linie CTL. Te linie CTL posiadające wyższe specyficzne aktywności CTL przeciwko celowi, który poddawano pulsowemu działaniu peptydu, w porównaniu z

122 123 aktywnościami przeciwko celowi, którego nie poddawano pulsowemu działaniu peptydu oznaczono testem ELISA. Wyniki przedstawiono na Fig. 3a-d. Natomiast przy użyciu innych peptydów przedstawionych w tabeli 4 nie można było wyprowadzić linii CTL, pomimo posiadania przez nie możliwej aktywności wiązania z HLA-A*2402. Na przykład, typowy peptyd ujemny (ECT2-A , ECT2- A oraz ECT2-A ) przedstawiono na Fig. 3a. W tym wynalazku peptydy, przy użyciu których można było wyprowadzić linie CTL, wyselekcjonowano jako peptyd silnie stymulujący CTL. 1 Wyprowadzenie klonów CTL stymulowanych peptydami pochodzącymi z ECT2 [0128] Ponadto z tych linii CTL wykonano graniczne rozcieńczenia według protokołów przedstawionych w sekcji Materiały i Sposoby powyżej. Wyprowadzenie klonów CTL z linii CTL #2 ECT2-A (NR ID. SEKW.: 0) przedstawiono na Fig. 3c. Klony CTL posiadały silne i specyficzne aktywności CTL przeciwko celowi, który poddawano pulsowemu działaniu peptydu, w porównaniu z aktywnościami przeciwko celowi, którego nie poddawano pulsowemu działaniu peptydu. 2 Specyficzna aktywność CTL przeciwko komórkom docelowym z ekspresją ECT2 i HLA-A*2402 [0129] Wyprowadzoną linię CTL wzbudzoną przeciwko tym peptydom badano pod kątem jej zdolności do rozpoznawania komórek docelowych z ekspresją ECT2 i HLA-A*2402. Specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 transfekowanym zarówno pełnej długości genem ECT2, jak

123 124 1 i cząsteczką HLA-A*2402, które służą jako specyficzny model dla komórek docelowych z endogenną ekspresją ECT2 oraz HLA-A*2402, testowano przy użyciu klonu CTL wzbudzonego przez ECT2-A (NR ID. SEKW.: 0) oraz linii CTL wzbudzonej przez ECT2-A24--1 (NR ID. SEKW.: 1) jako komórek efektorowych. Jako kontrole przygotowano COS7 transfekowane pełnej długości ECT2, ale nie HLA-A*2402, oraz COS7 transfekowane HLA-A*2402, ale nie pełnej długości ECT2 (zastąpionym innym genem, np., URLC lub INHBB). Linia CTL wykazująca najwyższą specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 była tą transfekowaną zarówno ECT2, jak i HLA-A2402 (Fig. 3c i d). Te wyniki jasno pokazują, że ECT2-A (NR ID. SEKW.: 0) oraz ECT2-A24--1 (NR ID. SEKW.: 1) ulegają naturalnej ekspresji na powierzchni komórek docelowych wraz z cząsteczką HLA-A2402 i rozpoznają CTL. Ponadto, te peptydy są peptydami epitopowymi, które mogą służyć jako szczepionki rakowe skierowane przeciwko nowotworom z ekspresją ECT2. 2 Cytotoksyczna aktywność przeciwko linii komórek rakowych z endogenną ekspresją HLA-A*2402 oraz ECT2 [01] Ponadto oznaczono aktywność cytotoksyczną przy użyciu oznaczenia cytotoksyczności według protokołów przedstawionych w sekcji Materiały i Sposoby powyżej. W wyniku przedstawionym na Fig. 3b, klon CTL stymulowany ECT2-A (NR ID. SEKW.: 80) wykazywał znacząco wysoki efekt cytotoksyczny przeciwko liniom komórek rakowych TE6 dodatnich względem HLA-A24 i dodatnich względem ECT, w porównaniu do tego

124 12 przeciwko liniom komórek rakowych TE ujemnym względem HLA-A24 i pozytywnym względem ECT. 1 2 Stymulacja komórek T przy użyciu peptydów przewidzianych na podstawie HIG2 wiążących się z HLA- A*2402 lub HLA-A*01 oraz wyprowadzenie linii CTL stymulowanych peptydami pochodzącymi z HIG2 [0131] CTL dla tych peptydów pochodzących z HIG2 uzyskano według protokołów przedstawionych w sekcji Materiały i Sposoby powyżej. Uzyskane CTL posiadające możliwą do wykrycia specyficzną aktywność CTL oznaczoną testem IFN-gamma ELISPOT przedstawiono na Fig. 4. W szczególności, HIG2-A (NR ID. SEKW.: 1), HIG2- A (NR ID. SEKW.: 111), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 387), HIG2-A24--7 (NR ID. SEKW.: 112), HIG2- A (NR ID. SEKW.: 394), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 114), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 116), HIG2- A (NR ID. SEKW.: 117) oraz HIG2-A02--8 (NR ID. SEKW.: 121) wykazywały silne wytwarzanie IFN-gamma oznaczone testem IFN-gamma ELISPOT, a komórki w dodatniej studzience numer #6 stymulowanej HIG2-A (NR ID. SEKW.: 1), #7 stymulowanej HIG2-A (NR ID. SEKW.: 111), # stymulowanej HIG2-A (NR ID. SEKW.: 387), #1 stymulowanej HIG2-A24--7 (NR ID. SEKW.: 112), #7 stymulowanej HIG2-A (NR ID. SEKW.: 394), # stymulowanej HIG2-A (NR ID. SEKW.: 114), # stymulowanej HIG2-A (NR ID. SEKW.: 116), # stymulowanej HIG2-A (SEQ NO: 117) oraz #9 stymulowanej HIG2-A02--8 (NR ID. SEKW.: 121) namnożono i wyprowadzono linie CTL. Te linie posiadające wyższe specyficzne aktywności CTL przeciwko

125 126 celowi, który poddawano pulsowemu działaniu peptydu, w porównaniu z aktywnościami przeciwko celowi, którego nie poddawano pulsowemu działaniu peptydu oznaczono testem ELISA. Wyniki przedstawiono na Fig. 4a-j. Natomiast, dla innych peptydów przedstawionych w tabeli nie można było wyprowadzić linii CTL pomimo posiadania przez nie możliwej aktywności wiązania się z HLA-A*2402. Na przykład, typowy peptyd ujemny (HIG2- A24-9-7) przedstawiono na Fig. 4a. W tym wynalazku peptydy, dla których można było wyprowadzić linię CTL, wyselekcjonowano jako peptyd silnie stymulujący CTL. 1 2 Wyprowadzanie klonów CTL stymulowanych peptydami pochodzącymi z HIG2 [0132] Ponadto wykonano graniczne rozcieńczenie tych linii CTL według protokołów przedstawionych w sekcji Materiały i Sposoby powyżej. Wyprowadzenie klonów CTL z linii CTL #7 HIG2-A (NR ID. SEKW.: 111), linii CTL # HIG2-A (NR ID. SEKW.: 387), linii CTL #1 HIG2-A24--7 (NR ID. SEKW.: 112), linii CTL #7 HIG2- A (NR ID. SEKW.: 394) oraz linii CTL # HIG2- A (NR ID. SEKW.: 117) są przedstawione na Fig. 4c, e, f, g oraz i. Klony CTL posiadały silne i specyficzne aktywności CTL przeciwko celowi, który poddawano pulsowemu działaniu peptydu, w porównaniu z aktywnościami przeciwko celowi, którego nie poddawano pulsowemu działaniu peptydu. Specyficzna aktywność CTL przeciwko komórkom docelowym z ekspresją HIG2 i HLA-A*01 [0133] Wyprowadzoną linię CTL wzbudzoną przeciwko

126 tym peptydom badano pod kątem jej zdolności do rozpoznawania komórek docelowych z ekspresją HIG2 i HLA-A*01. Specyficzną aktywność CTL przeciwko 293T lub COS7 transfekowanym zarówno pełnej długości genem HIG2, jak i cząsteczką HLA-A*01, służącym jako specyficzny model komórek docelowych z endogenną ekspresją HIG2 i HLA-A*01, testowano przy użyciu linii CTL wzbudzonych przez HIG2-A (NR ID. SEKW.: 114), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 116) oraz klonu CTL wzbudzonego przez HIG2-A (NR ID. SEKW.: 117) jako komórek efektorowych. Jako kontrole przygotowano 293T lub COS7 transfekowane pełnej długości ECT2, ale nie HLA-A*01, oraz 293T lub COS7 transfekowane HLA- A*01, ale nie pełnej długości ECT2 (lub zastąpiono innym genem, np., FoxP3 lub TTK). Linia CTL wykazująca najwyższą specyficzną aktywność CTL przeciwko 293T lub COS7 była tą transfekowaną zarówno ECT2, jak i HLA- A*01 (Fig. 4e, h oraz i). Te wyniki jasno pokazują, że HIG2-A (NR ID. SEKW.: 114), [0134] HIG2-A (NR ID. SEKW.: 116) oraz HIG2- A (NR ID. SEKW.: 117) ulegają naturalnej ekspresji na powierzchni komórki docelowej z cząsteczką HLA-A2402 lub HLA-A01 i rozpoznają CTL. Ponadto, te peptydy są peptydami epitopowymi, które mogą posłużyć jako szczepionki rakowe skierowane przeciwko nowotworom z ekspresją HIG2. Cytotoksyczna aktywność przeciwko linii komórek rakowych z endogenną ekspresją HLA-A*01 oraz HIG2 [013] Ponadto oznaczono aktywność cytotoksyczną

127 przy użyciu testu cytotoksyczności według protokołów przedstawionych w sekcji Materiały i Sposoby powyżej. W wyniku przedstawionym na Fig. 4i, klon CTL stymulowany HIG2-A (NR ID. SEKW.: 117) wykazywał znacząco wysoki efekt cytotoksyczności przeciwko linii komórek rakowych CAki-1 dodatniej względem HLA-A02 oraz dodatniej względem HIG2, w porównaniu z tą przeciwko linii komórek rakowych A498 ujemnej względem HLA-A02 i dodatniej względem HIG2. Stymulacja komórek T przy użyciu peptydów przewidzianych na podstawie INHBB podlegających restrykcji HLA-A*2402 lub HLA-A*01 oraz wyprowadzenie linii CTL stymulowanych peptydami pochodzącymi z INHBB [0136] Komórki CTL dla tych peptydów pochodzących z INHBB uzyskano według protokołów przedstawionych w sekcji Materiały i Sposoby powyżej. Uzyskane CTL posiadające wykrywalną specyficzną aktywność CTL oznaczoną testem IFN-gamma ELISPOT przedstawiono na Fig.. W szczególności, INHBB-A (NR ID. SEKW.: 39), INHBB-A (NR ID. SEKW.: 133), INHBB-A24- - (NR ID. SEKW.: 13), INHBB-A24--7 (NR ID. SEKW.: 137) oraz INHBB-A (NR ID. SEKW.: 426) wykazywały silne wytwarzanie IFN-gamma w oznaczeniu IFN-gamma ELISPOT, a komórki z dodatniej studzienki numer #7 stymulowanej INHBB-A (NR ID. SEKW.: 39), #3 stymulowanej INHBB-A (NR ID. SEKW.: 133), #2 stymulowanej INHBB-A24-- (NR ID. SEKW.: 13), #8 i #2 stymulowanej INHBB-A24--7 (NR ID. SEKW.: 137) oraz #1 stymulowanej INHBB-A (NR ID. SEKW.: 426) namnożono i wyprowadzono linie CTL. Te

128 129 linie CTL posiadające wyższe specyficzne aktywności CTL przeciwko celowi, który poddawano pulsowemu działaniu peptydu, w porównaniu z aktywnościami przeciwko celowi, którego nie poddawano pulsowemu działaniu peptydu oznaczono testem ELISA. Wyniki przedstawiono na Fig. b-e. Natomiast dla innych peptydów przedstawionych w tabeli 6 nie można było wyprowadzić linii CTL, pomimo posiadania przez nie możliwej aktywności wiązania się z HLA-A*2402 i HLA-A*01. Na przykład, typowy peptyd ujemny (INHBB-A ) przedstawiono na Fig. a. W tym wynalazku peptydy, dla których można było wyprowadzić linię CTL, wybrano jako peptydy silnie stymulujące CTL. 1 2 Wyprowadzanie klonów CTL stymulowanych peptydami pochodzącymi z INHBB [0137] Ponadto wykonano graniczne rozcieńczenie dla tych linii CTL według protokołów przedstawionych w sekcji Materiały i Sposoby powyżej. Wyprowadzenie klonów CTL z linii CTL #7 INHBB-A (NR ID. SEKW.: 39), oraz linii CTL #2 INHBB-A24-- (NR ID. SEKW.: 13) przedstawiono na Fig. b oraz d. Klony CTL posiadały silne i specyficzne aktywności CTL przeciwko celowi, który poddawano pulsowemu działaniu peptydu, w porównaniu z aktywnościami przeciwko celowi, którego nie poddawano pulsowemu działaniu peptydu. Specyficzna aktywność CTL przeciwko komórkom docelowym z ekspresją INHBB i HLA-A*2402 [0138] Wyprowadzoną linię CTL wzbudzoną przeciwko tym peptydom badano pod kątem jej zdolności do

129 1 1 2 rozpoznawania komórek docelowych z ekspresją INHBB i HLA-A*2402. Specyficzną aktywność CTL przeciwko 293T transfekowanym zarówno pełnej długości genem INHBB, jak i cząsteczką HLA-A*2402 służącą jako specyficzny model komórek docelowych z endogenną ekspresją INHBB i HLA- A*2402, testowano przy użyciu linii CTL wzbudzonych przez INHBB-A (NR ID. SEKW.: 133) i INHBB-A (NR ID. SEKW.: 137) oraz klonu CTL wzbudzonego przez INHBB-A24-- (NR ID. SEKW.: 13) jako komórek efektorowych. Jako kontrole przygotowano 293T transfekowane pełnej długości INHBB, ale nie HLA- A*2402, oraz 293T transfekowane HLA-A*2402, ale nie pełnej długości INHBB. Linia CTL wykazująca najwyższą specyficzną aktywność CTL przeciwko 293T była tą, którą transfekowano zarówno INHBB, jak i HLA-A*2402 (Fig. c, d oraz e). [0139] Te wyniki jasno pokazują, że INHBB-A24-- (NR ID. SEKW.: 13), INHBB-A (NR ID. SEKW.: 133) oraz INHBB-A24--7 (NR ID. SEKW.: 137) ulegają naturalnej ekspresji na powierzchni komórki docelowej z cząsteczką HLA-A2402 i rozpoznają CTL. Ponadto, te peptydy są peptydami epitopowymi, które mogą służyć jako szczepionki rakowe skierowane przeciwko nowotworom z ekspresją INHBB. Aktywność cytotoksyczna przeciwko linii komórek rakowych z endogenną ekspresją HLA-A*2402 oraz INHBB [0140] Ponadto oznaczono aktywność cytotoksyczną przy użyciu testu cytotoksyczności według protokołów przedstawionych w sekcji Materiały i Sposoby powyżej. W wyniku przedstawionym na Fig. b, klon CTL

130 131 stymulowany INHBB-A (NR ID. SEKW.: 39) wykazywał znacząco wysoki efekt cytotoksyczny przeciwko linii komórek rakowych MIAPaca2 dodatniej względem HLA- A24 i dodatniej względem INHBB w porównaniu z linią komórek rakowych CAki-2 ujemną względem HLA-A24 i pozytywną względem INHBB. 1 2 Stymulacja komórek T przy użyciu przewidzianych peptydów z KIFA podlegających restrykcji HLA-A*2402 oraz wyprowadzanie linii CTL stymulowanych peptydami pochodzącymi z KIFA [0141] Komórki CTL dla tych peptydów pochodzących z KIFA uzyskano według protokołów przedstawionych w sekcji Materiały i Sposoby powyżej. Uzyskane komórki CTL posiadające wykrywalną specyficzną aktywność CTL oznaczoną testem IFN-gamma ELISPOT przedstawiono na Fig. 6. W szczególności KIFA-A24-9- (NR ID. SEKW.: 174), KIFA-A (NR ID. SEKW.: 178), KIFA-A (NR ID. SEKW.: 186) oraz KIFA-A (NR ID. SEKW.: 194) wykazywały silne wytwarzanie IFN-gamma oznaczone testem IFN-gamma ELISPOT, a komórki z dodatniej studzienki numer #2 stymulowanej KIFA-A24-9- (NR ID. SEKW.: 174), #3 stymulowanej KIFA-A (NR ID. SEKW.: 178), # stymulowanej KTFA-A (NR ID. SEKW.: 186) oraz #6 stymulowanej KIFA- A (NR ID. SEKW.: 194) namnożono i wyprowadzono linie CTL. Te linie posiadające wyższe specyficzne aktywności CTL przeciwko celowi, który poddawano pulsowemu działaniu peptydu, w porównaniu z aktywnościami przeciwko celowi, którego nie poddawano pulsowemu działaniu peptydu oznaczono testem ELISA.

131 132 Wyniki przedstawiono na Fig. 6a-e. Natomiast dla innych peptydów przestawionych w tabeli 7 nie można było wyprowadzić linii CTL, pomimo posiadania przez nie możliwej aktywności wiązania się z HLA-A*2402. Na przykład, typowe peptydy ujemne (KIFA -A oraz KIFA -A ) przedstawiono na Fig. 6a. W tym wynalazku peptydy, dla których można było uzyskać linię CTL wybrano jako peptyd silnie stymulujący CTL. 1 Wyprowadzanie klonów CTL stymulowanych peptydami pochodzącymi z KIFA [0142] Ponadto wykonano graniczne rozcieńczenie dla tych linii CTL według protokołów przedstawionych w sekcji Materiały i Sposoby powyżej. Wyprowadzenie klonów CTL z linii CTL #2 KIFA-A24-9- (NR ID. SEKW.: 174), linii CTL # KIFA-A24--4 (NR ID. SEKW.: 186) oraz linii CTL #6 KIFA-A (NR ID. SEKW.: 194) przedstawiono na Fig. 6b, d oraz e. Klony CTL posiadały silne i specyficzne aktywności przeciwko celowi, który poddawano pulsowemu działaniu peptydu, w porównaniu z aktywnościami przeciwko celowi, którego nie poddawano pulsowemu działaniu peptydu. 2 Specyficzna aktywność CTL przeciwko komórkom docelowym z ekspresją KIFA i HLA-A*2402 [0143] Wyprowadzoną linię CTL wzbudzoną przeciwko tym peptydom badano pod kątem jej zdolności do rozpoznawania komórek docelowych z ekspresją KIFA i HLA-A*2402. Specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 transfekowanym zarówno pełnej długości genem KIFA, jak i cząsteczką HLA-A*2402, oraz A24-LCL

132 transfekowanym poprzez elektroporację pełnej długości genem KIFA, które służą jako specyficzny model komórek docelowych z endogenną ekspresją KIFA i HLA- A*2402, testowano przy użyciu linii CTL wzbudzonych przez KIFA-A (NR ID. SEKW.: 178) i KIFA- A24--4 (NR ID. SEKW.: 186) oraz klonu CTL wzbudzonego przez KIFA-A (NR ID. SEKW.: 194) jako komórek efektorowych. Jako kontrole przygotowano COS7 transfekowane pełnej długości KIFA, ale nie HLA- A*2402, oraz COS7 transfekowane HLA-A*2402, ale nie pełnej długości KIFA (lub zastąpiono pełnej długości genem URLC ), COS7 transfekowane HLA-A*2402 i poddane pulsowemu działaniu KIFA--8, oraz A24-LCL transfekowane pustym wektorem. Linią CTL wykazującą największą specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 była ta, którą transfekowano zarówno KIFA, jak i HLA- A*2402 (Fig. 6b, c oraz d). Alternatywnie, linia CTL stymulowana KIFA-A24--4 (NR ID. SEKW.: 186) wykazywała przeciwko A24-LCL transfekowanym KIFA. [0144] Te wyniki jasno pokazują, że KIFA-A (NR ID. SEKW.: 178), KIFA-A24--4 (NR ID. SEKW.: 186) oraz KIFA-A (NR ID. SEKW.: 194) ulegają naturalnej ekspresji na powierzchni komórki docelowej z cząsteczką HLA-A2402 i rozpoznają CTL. Ponadto, te peptydy są peptydami epitopowymi, które mogą służyć jako szczepionki rakowe skierowane przeciwko nowotworom z ekspresją KIFA. Aktywność cytotoksyczna przeciwko linii komórek rakowych z endogenną ekspresją HLA-A*2402 i KIFA [014] Ponadto oznaczono aktywność cytotoksyczną

133 134 przy użyciu oznaczenia cytotoksyczności według protokołów przedstawionych w sekcji Materiały i Sposoby powyżej. W wyniku przedstawionym na Fig. 6b oraz e, klon CTL stymulowany KIFA-A24-9- (NR ID. SEKW.: 174) lub KIFA-A24--4 (NR ID. SEKW.: 186) wykazywał znacząco wysoki efekt cytotoksyczny przeciwko liniom komórek rakowych odpowiednio PK4P lub MIAPaca2 dodatnich względem HLA-A24 i dodatnich względem KIFA, w porównaniu do tego przeciwko linii komórek rakowych PK9 ujemnej względem HLA-A24 i dodatniej względem KIFA. 1 2 Stymulacja komórek T przy użyciu peptydów przewidzianych na podstawie KNTC2 podlegających restrykcji HLA-A*2402 oraz wyprowadzanie linii CTL stymulowanych peptydami pochodzącymi z KNTC2 [0146] CTL dla tych peptydów pochodzących z KNTC2 uzyskano według protokołów przedstawionych w sekcji Materiały i Sposoby powyżej. Uzyskane CTL posiadające wykrywalną specyficzną aktywność CTL oznaczoną testem IFN-gamma ELISPOT przedstawiono na Fig. 7. W szczególności, KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 196), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 2), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 2), KNTC2-A24-9- (NR ID. SEKW.: 213), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 214), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 217) oraz KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 223) wykazywały silne wytwarzanie IFN-gamma w teście IFN-gamma ELISPOT, a komórki w dodatniej studzience #8 stymulowane KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 196), # stymulowane KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 2), # stymulowane KNTC2-A (NR ID.

134 13 1 SEKW.: 2), #7 stymulowane KNTC2-A24-9- (NR ID. SEKW.: 213), #4 i # stymulowane KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 214), #1 stymulowane KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 217) oraz #8 stymulowane KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 223) namnożono i wyprowadzono linie CTL. Te linie CTL posiadające wyższe specyficzne aktywności CTL przeciwko celowi, który poddawano pulsowemu działaniu peptydu, w porównaniu z aktywnościami przeciwko celowi, którego nie poddawano pulsowemu działaniu peptydu oznaczono testem ELISA. Wyniki przedstawiono na Fig. 7a-h. Natomiast dla innych peptydów przedstawionych w tabeli 8 nie można było wyprowadzić linii CTL, pomimo posiadania przez nie możliwej aktywności wiązania się z HLA-A*2402. Na przykład typowy peptyd ujemny (KNTC2-A24--6) przedstawiono na Fig. 7a. W tym wynalazku peptydy, dla których można było wyprowadzić linię CTL, wybrano jako peptydy silnie stymulujące CTL. 2 Wyprowadzenie klonów CTL stymulowanych peptydami pochodzącymi z KNTC2 [0147] Ponadto, wykonano graniczne rozcieńczenie tych linii CTL według protokołów przedstawionych w sekcji Materiały i Sposoby powyżej. Wyprowadzenie klonów CTL z linii CTL # KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 2) oraz linii CTL # KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 214) przedstawiono na Fig. 7d oraz f. Klony posiadały silne i specyficzne aktywności CTL przeciwko celowi, który poddawano pulsowemu działaniu peptydu, w porównaniu z aktywnościami przeciwko celowi, którego nie poddawano pulsowemu działaniu peptydu.

135 Specyficzna aktywność CTL przeciwko komórkom docelowym z ekspresją KNTC2 i HLA-A*2402 [0148] Wyprowadzoną linię CTL wzbudzoną przeciwko tym peptydom badano pod kątem ich zdolności do rozpoznawania komórek docelowych z ekspresją KNTC2 i HLA-A*2402. Specyficzną aktywność CTL przeciwko HEK293 transfekowanym zarówno pełnej długości genem KNTC2, jak i cząsteczką HLA-A*2402, służącym jako specyficzny model komórek docelowych z endogenną ekspresją KNTC2 i HLA-A*2402, testowano przy użyciu klonów CTL wzbudzonych przez KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 214) jako komórek efektorowych. Jako kontrole przygotowano HEK293 transfekowane pełnej długości KNTC2, ale nie HLA-A*2402, HEK293 transfekowane HLA-A*2402, ale nie pełnej długości KNTC2, oraz HEK293 transfekowane HLA- A*2402 i które poddano pulsowemu działaniu KNTC Linią CTL wykazującą najwyższą specyficzną aktywność CTL przeciwko HEK293 była ta transfekowana zarówno KNTC2, jak i HLA-A*2402 (Fig. 7f). [0149] Te wyniki jasno pokazują, że KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 214) ulega naturalnej ekspresji na powierzchni komórki docelowej z cząsteczką HLA-A2402 i rozpoznaje CTL. Ponadto, te peptydy są peptydami epitopowymi, które mogą służyć jako szczepionki rakowe skierowane przeciwko nowotworom z ekspresją KNTC2. Stymulacja komórek T przy użyciu peptydów przewidzianych na podstawie TTK podlegających restrykcji HLA-A*01 oraz wyprowadzanie linii CTL stymulowanych peptydami pochodzącymi z TTK [0] CTL dla tych peptydów pochodzących z TTK

136 uzyskano według protokołów przedstawionych w sekcji Materiały i Sposoby powyżej. Uzyskane CTL posiadające wykrywalną specyficzną aktywność CTL oznaczoną testem IFN-gamma ELISPOT przedstawiono na Fig. 8. Jak pokazano na Fig. 8b-d TTK-A (NR ID. SEKW.: 227), TTK-A (NR ID. SEKW.: 228), TTK-A (NR ID. SEKW.: 233) oraz TTK-A (NR ID. SEKW.: 24) wykazywały silne wytwarzanie IFN-gamma oznaczone testem IFN-gamma ELISPOT, a komórki w dodatniej studzience numer #4 stymulowane TTK-A (NR ID. SEKW.: 227), #2 stymulowane TTK-A (NR ID. SEKW.: 228), #1 stymulowane TTK-A (NR ID. SEKW.: 233) oraz #8 stymulowane TTK-A (NR ID. SEKW.: 24) namnożono. Te linie CTL posiadające wyższe specyficzne aktywności CTL przeciwko celowi, który poddawano pulsowemu działaniu peptydu, w porównaniu z aktywnościami przeciwko celowi, którego nie poddawano pulsowemu działaniu peptydu oznaczono testem ELISA. Natomiast dla innych peptydów przedstawionych w tabeli 9 nie można było wyprowadzić linii CTL, pomimo posiadania przez nie możliwej aktywności wiązania się z HLA-A*01. Na przykład, typowy peptyd ujemny (TTK-A ) przedstawiono na Fig. 8a. W tym wynalazku peptydy, dla których można było wyprowadzić linię CTL, wybrano jako peptyd silnie stymulujący CTL. Wyprowadzanie klonów CTL stymulowanych peptydami pochodzącymi z TTK [011] Ponadto wykonano graniczne rozcieńczenie z tych linii CTL według protokołów przedstawionych w sekcji Materiały i Sposoby powyżej. Wyprowadzanie

137 klonów CTL z linii CTL #4 TTK-A (NR ID. SEKW.: 227), linii CTL #2 TTK-A (NR ID. SEKW.: 228), linii CTL #1 TTK-A (NR ID. SEKW.: 233) oraz linii CTL #8 TTK-A (NR ID. SEKW.: 24) przedstawiono na Fig. 8d, c, d oraz e. Klony CTL posiadały silne i specyficzne aktywności CTL przeciwko celowi, który poddawano pulsowemu działaniu peptydu, w porównaniu z aktywnościami przeciwko celowi, którego nie poddawano pulsowemu działaniu peptydu. Specyficzna aktywność CTL przeciwko komórkom docelowym z ekspresją TTK i HLA-A*01 [012] Wyprowadzony klon CTL wzbudzony przeciwko tym peptydom badano pod kątem jego zdolności do rozpoznawania komórek docelowych z endogenną ekspresją TTK i HLA-A*01. Specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 transfekowanym zarówno pełnej długości genem TTK, jak i cząsteczką HLA-A*01, które są specyficznym modelem komórek docelowych z endogenną ekspresją TTK i HLA-A*01, testowano przy użyciu klonów CTL wzbudzonych przez TTK-A (NR ID. SEKW.: 227), TTK-A (NR ID. SEKW.: 228), TTK-A (NR ID. SEKW.: 233) oraz TTK-A (NR ID. SEKW.: 24) jako komórek efektorowych. Jako kontrole przygotowano COS7 transfekowane przy użyciu pełnej długości TTK, ale nie HLA-A*01, COS7 transfekowane HLA-A*01, ale nie pełnej długości TTK (lub zastępiono pełnej długości genem HIG2) oraz COS7 transfekowane HLA-A*01, które poddano pulsowemu działaniu różnych docelowych peptydów epitopowych. Klon CTL posiadający najwyższą specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7 był tym transfekowanym

138 zarówno TTK, jak i HLA-A*01 (Fig. 8b, c, d oraz e). [013] Te wyniki jasno pokazują, że TTK-A (NR ID. SEKW.: 227), TTK-A (NR ID. SEKW.: 228), TTK-A (NR ID. SEKW.: 233) oraz TTK-A (NR ID. SEKW.: 24) ulegają naturalnej ekspresji na powierzchni komórki docelowej z cząsteczką HLA-A2 i rozpoznają CTL. Ponadto te peptydy są peptydami epitopowymi, które mogą służyć jako szczepionka rakowa skierowana przeciwko nowotworom z ekspresją TTK. Stymulacja komórek T przy użyciu peptydów przewidzianych na podstawie URLC podlegających restrykcji HLA-A*01 oraz wyprowadzanie linii CTL stymulowanych peptydami pochodzącymi z URLC [014] CTL dla tych peptydów pochodzących z URLC uzyskano według protokołów przedstawionych w sekcji Materiały i Sposoby powyżej. Uzyskane CTL posiadające wykrywalną specyficzną aktywność CTL oznaczoną testem IFN-gamma ELISPOT przedstawiono na Fig. 9. Jak przedstawiono na Fig. 9b-d URLC-A2-9-6 (NR ID. SEKW.: 271), URLC-A (NR ID. SEKW.: 272) oraz URLC-A (NR ID. SEKW.: 288) wykazywały silne wytwarzanie IFN-gamma oznaczone testem IFN-gamma ELISPOT, a komórki w dodatniej studzience #7 stymulowane URLC-A2-9-6 (NR ID. SEKW.: 271), #3 stymulowane URLC-A (NR ID. SEKW.: 272) oraz # stymulowane URLC-A (NR ID. SEKW.: 288) namnożono. Te linie CTL posiadające wyższe aktywności CTL przeciwko celowi, który poddawano pulsowemu działaniu peptydu, w porównaniu z aktywnościami przeciwko celowi, którego nie poddawano pulsowemu działaniu peptydu oznaczono testem ELISA.

139 140 Natomiast dla innych peptydów przedstawionych w tabeli nie można było wyprowadzić linii CTL pomimo posiadania przez nie możliwej aktywności wiązania się z HLA-A*01. Na przykład, typowy peptyd ujemny (URLC-A2-9-8) przedstawiono na Fig. 9a. W tym wynalazku peptyd, dla którego można było wyprowadzić linie CTL, wybrano jako peptyd silnie stymulujący CTL. 1 2 Specyficzna aktywność CTL przeciwko komórkom docelowym z ekspresją URLC i HLA-A*01 [01] Wyprowadzoną linię CTL wzbudzoną przeciwko tym peptydom badano pod kątem jej zdolności do rozpoznawania komórek docelowych z endogenną ekspresją URLC i HLA-A*01. Specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7, Hek293 i 293T transfekowanym zarówno pełnej długości genem URLC, jak i cząsteczką HLA- A*01, które służą jako specyficzny model komórek docelowych z endogenną ekspresją URLC i HLA-A*01, testowano przy użyciu linii wzbudzonej przez URLC- A jako komórek efektorowych. Jako kontrole przygotowano COS7, Hek293 lub 293T transfekowane pełnej długości URLC, ale nie HLA-A*01 (zastąpiono ją HLA- A*2402), COS7, Hek293 lub 293T transfekowane HLA- A*01, ale bez pełnej długości URLC, oraz COS7 transfekowane HLA-A*01, które poddano pulsowemu działaniu innego docelowego peptydu epitopowego (URLC-A02--64). Linią CTL wykazującą najwyższą specyficzną aktywność CTL przeciwko COS7, Hek293 lub 293T była ta transfekowana zarówno URLC, jak i HLA- A*01 (Fig. 9-2). [016] Te wyniki jasno pokazują, że URLC-A02--

140 ulega naturalnej ekspresji na powierzchni komórki docelowej z cząsteczką HLA-A*01 i rozpoznaje CTL. Ponadto ten peptyd jest peptydem epitopowym, który może służyć jako szczepionka rakowa skierowana przeciwko nowotworom z ekspresją URLC. 1 2 Analiza homologii peptydów antygenowych [017] Klony CTL wyprowadzone przeciwko następującym peptydom wykazywały silną specyficzną aktywność CTL. CDH3-A (NR ID. SEKW.: 19), CDH3-A (NR ID. SEKW.: 22), CDH3-A (NR ID. SEKW.: ), CDH3-A (NR ID. SEKW.: 34), CDH3-A24--6 (NR ID. SEKW.: 344), CDH3-A (NR ID. SEKW.: 38), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 41), EphA4-A24-9- (NR ID. SEKW.: 44), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 46), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 48), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 78), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 376), EphA4-A (NR ID. SEKW.: 379), ECT2-A (NR ID. SEKW.: 80), ECT2-A (NR ID. SEKW.: 0), ECT2-A24--1 (NR ID. SEKW.: 1), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 1), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 111), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 387), HIG2-A24--7 (NR ID. SEKW.: 112), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 394), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 114),

141 HIG2-A (NR ID. SEKW.: 116), HIG2-A (NR ID. SEKW.: 117), HIG2-A02--8 (NR ID. SEKW.: 121), INHBB-A (NR ID. SEKW.: 39), INHBB-A (NR ID. SEKW.: 133), INHBB-A24-- (NR ID. SEKW.: 13), INHBB-A24--7 (NR ID. SEKW.: 137), INHBB-A (NR ID. SEKW.: 426), KIFA-A24-9- (NR ID. SEKW.: 174), KIFA-A (NR ID. SEKW.: 178), KIFA-A24--4 (NR ID. SEKW.: 186), KIFA-A (NR ID. SEKW.: 194), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 196), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 2), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 2), KNTC2-A24-9- (NR ID. SEKW.: 213), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 214), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 217), KNTC2-A (NR ID. SEKW.: 223), TTK-A (NR ID. SEKW.: 227), TTK-A (NR ID. SEKW.: 228), TTK-A (NR ID. SEKW.: 233), TTK-A (NR ID. SEKW.: 24), URLC-A (NR ID. SEKW.: 271), URLC-A (NR ID. SEKW.: 272) oraz URLC-A (NR ID. SEKW.: 288) [018] To sugeruje, że te sekwencje o NR ID. SEKW.: 19, 22,, 34, 344, 38, 41, 44, 46, 48, 78, 376, 379, 80, 0, 1, 1, 111, 387, 112, 394, 114, 116, 117, 121, 39, 133, 13, 137, 426, 174, 178, 186, 194, 196, 2, 2, 213, 214, 217, 223, 227, 228, 233, 24, 271,

142 lub 288 są homologiczne do peptydów pochodzących z innych cząsteczek, o których wiadomo, że uwrażliwiają ludzki układ immunologiczny. [019] Aby wykluczyć tę możliwość, wykonano analizę homologii z sekwencjami peptydowymi jako zapytaniami przy użyciu algorytmu BLAST ( Nie wykazano istnienia żadnej znaczącej homologii sekwencji. Te wyniki sugerują, że sekwencje z NR ID. SEKW.: 19, 22,, 34, 344, 38, 41, 44, 46, 48, 78, 376, 379, 80, 0, 1, 1, 111, 387, 112, 394, 114, 116, 117, 121, 39, 133, 13, 137, 426, 174, 178, 186, 194, 196, 2, 2, 213, 214, 217, 223, 227, 228, 233, 24, 271, 272 lub 288 są unikalne, a zatem posiadają niskie ryzyko wywołania niechcianej odpowiedzi immunologicznej wobec cząsteczki niespokrewnionej. 2 Dyskusja [0160] Identyfikacja nowych antygenów TAA, szczególnie tych, które indukują silne i specyficzne przeciwnowotworowe odpowiedzi immunologiczne, gwarantuje dalszy rozwój klinicznego zastosowania strategii szczepienia peptydami w różnych typach raka (Boon T. i wsp., (1996) J Exp Med 183: 72-9.; van der Bruggen P i wsp., (1991) Science 24: ; Brichard V i wsp., (1993) J Exp Med 178: ; Kawakami Y i wsp., (1994) J Exp Med 180: ; Shichijo S i wsp., (1998) J Exp Med 187: ; Chen YT i wsp., (1997) Proc.Natl.Acd. Sci. USA, 94: ; Harris CC., (1996) J Natl Cancer Inst 88:1442-.; Butterfield LH i wsp., (1999) Cancer Res 9: ; Vissers JL i wsp.,

143 (1999) Cancer Res 9: 4-9.; van der Burg SH i wsp., (1996) J. Immunol 16:38-14.; Tanaka F i wsp., (1997) Cancer Res 7:446-8.; Fujie T i wsp., (1999) Int J Cancer 80: ; Kikuchi M i wsp., (1999) Int J Cancer 81 : ; Oiso M i wsp., (1999) Int J Cancer 81: ). [0161] Technologie związane z mikromacierzami cdna mogą ujawnić obszerne profile ekspresji genów w komórkach zezłośliwionych (Lin YM, i wsp., Oncogene. 02 Jun 13;21:41-8.; Kitahara O, i wsp., Cancer Res. 01 May 1;61:344-9.; Suzuki C i wsp., Cancer Res. 03 Nov 1;63: ; Ashida S, Cancer Res. 04 Sep 1;64: ; Ochi K i wsp., Int J Oncol. 04 Mar;24(3):647-.; Kaneta Y i wsp., Int J Oncol. 03 Sep;23: ; Obama K, Hepatology. 0 Jun;41: ; Kato T i wsp., Cancer Res. 0 Jul 1;6: ; Kitahara O i wsp., Neoplasia. 02 Jul-Aug;4:29-3.; Saito-Hisaminato A i wsp., DNA Res 02,9: 3-4.) i znajdują zastosowanie w identyfikacji potencjalnych antygenów TAA. Przy użyciu tych technologii zidentyfikowano, pośród transkryptów, które ulegają regulacji w górę w różnych rakach, nowe geny ludzkie nazwane CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK oraz URLC. [0162] Jak pokazano powyżej, CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK oraz URLC ulegają nadekspresji w różnych rakach, ale wykazują minimalną ekspresję w prawidłowych tkankach. Dodatkowo pokazano, że te geny pełnią istotną funkcję związaną z proliferacją komórki. Tak więc, peptydy pochodzące z CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK oraz

144 URLC mogą służyć jako epitopy TAA, które z kolei mogą być stosowane do indukowania znaczących i specyficznych odpowiedzi immunologicznych przeciwko komórkom rakowym. Tak więc, ponieważ CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK oraz URLC są nowymi TAA, szczepionki z zastosowaniem tych peptydów epitopowych znajdują zastosowanie jako immunoterapeutyki przeciwko różnym rakom lub innej chorobie związanej z ekspresją tych cząsteczek. Zastosowanie w przemyśle [0163] Niniejszy wynalazek identyfikuje nowe TAA, w szczególności te, które indukują silne i specyficzne przeciwnowotworowe odpowiedzi immunologiczne. Takie TAA gwarantują dalszy rozwój jako szczepionki peptydowe przeciwko chorobom związanym z nadekspresją CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIFA, KNTC2, TTK i/lub URLC, np. rakom. Wszystkie cytowane tutaj patenty, zgłoszenia patentowe i publikacje są włączone przez odniesienie. [0164] Podczas, gdy wynalazek opisano szczegółowo i w odniesieniu do jego specyficznych wykonań, należy rozumieć, że powyższy opis jest przykładowy i ma charakter objaśniający i zakłada się, że jego celem jest zilustrowanie wynalazku i jego korzystnych wykonań. Poprzez wykonanie rutynowych eksperymentów specjalista w tej dziedzinie z łatwością rozpozna, że można w nim wykonać szereg różnych zmian i modyfkacji. Tak więc, zakłada się, że wynalazek nie jest zdefiniowany przez powyższy opis, ale przez poniższe zastrzeżenia i ich równoważniki.

145 146 Lista sekwencji [016] <1> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC <1> SZCZEPIONKI PEPTYDOWE DLA RAKÓW Z EKSPRESJĄ ANTYGENÓW ZWIĄZANYCH Z NOWOTWORAMI <1> R214 EP S3 <140> EP <141> <> US 60/902,949 <11> <160> 434 <170> PatentIn wersja <2> 1 <211> 3649 <212> DNA <213> Homo sapiens <221> CDS <222> (08).. (2997) <400> 1

146 147

147 148

148 149

149

150 11 <2> 2 <211> 829 <213> Homo sapiens <400> 2

151 12

152 13

153 14

154 1 <2> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Homo sapiens <221> CDS <222> (34)..(2994) <400> 3 1

155 16

156 17

157 18

158 19

159 160 <2> 4 86 <213> Homo sapiens <400> 4

160 161

161 162

162 163

163 164

164 <2> <211> 4349 <212> DNA

165 166 <213> Homo sapiens <221> CDS <222> (44).. (93) <400>

166 167

167 168

168 169

169 170 <2> 6 <211> 882 <213> Homo sapiens <400> 6

170 171

171 172

172 173

173 174

174 17 <2> 7 <211> 1372 <212> DNA <213> Homo sapiens <221> CDS <222> (6)..(397) <400> 7

175 176 <2> 8 <211> 63 <213> Homo sapiens <400> 8

176 177 <2> 9 <211> 316 <212> DNA <213> Homo sapiens <221> CDS <222> (767).. (1990) <400> 9

177 178

178 179

179 180

180 181 <2> <211> 407 <213> Homo sapiens <400>

181 182

182 183

183 184 <2> 11 <211> 2972 <212> DNA <213> Homo sapiens <221> CDS <222> (28).. (2700) <400> 11

184 18

185 186

186 187

187 188

188 189 <2> 12 <211> 890 <213> Homo sapiens <400> 12

189 190

190 191

191 192

192 193

193 194 <2> 13 <211> 2 <212> DNA <213> Homo sapiens <221> CDS <222> ()..(33) <400> 13

194 19

195 196

196 197 <2> 14 <211> 642 <213> Homo sapiens <400> 14

197 198

198 199

199 0

200 1 <2> 1 <211> 2984 <212> DNA <213> Homo sapiens <221> CDS <222> (7)..(2648) <400> 1

201 2

202 3

203 4

204 <2> 16 <211> 87 <213> Homo sapiens <400> 16

205 6

206 7

207 <2> 17 <211> 173 <212> DNA 8

208 9 <213> Homo sapiens <221> CDS <222> (242)..(913) <400> 17

209 2

210 211 <2> 18 <211> 223 <213> Homo sapiens <400> 18

211 212

212 213 <2> 19 <22C> <400> 19

213 214 <2> <400> 1 <2> 21 <400> 21 2 <2> 22 <400> <2> 23

214 21 <400> 23 1 <2> 24 <400> 24 2 <2> 2 <400> 2 3 <2> 26

215 216 <400> 26 <2> 27 <400> 27 1 <2> 28 <400> <2> 29 <400> <2>

216 217 <211> <400> 1 <2> 31 <211> <400> 31 2 <2> 32 <211> <400> 32 3 <2> 33 <211> 40

217 218 <400> 33 <2> 34 <211> <400> 34 1 <2> 3 <211> <400> 3 2 <2> 36 <211> <22C> <400> 36 3 <2> 37 <211>

218 219 <400> 37 1 <2> 38 <211> <400> 38 2 <2> 39 <211> <400> 39 <2> 40 3

219 2 <400> 40 <2> 41 <400> 41 1 <2> 42 <400> 42 2 <2> 43 <400> 43 3 <2> 44

220 221 <400> 44 1 <2> 4 <400> 4 2 <2> 46 <400> 46 3 <2> 47 <400> 47

221 222 <2> 48 <400> 48 1 <2> 49 <400> 49 2 <2> 0 <400> 0 3 <2> 1 <<213> Sztuczna sekwencja

222 223 <400> 1 <2> 2 <400> 2 1 <2> 3 2 <400> 3 <2> 4 3 <400> 4

223 224 <2> <400> 1 <2> 6 <400> 6 2 <2> 7 <400> 7 3 <2> 8 <273> Sztuczna sekwencja

224 22 <400> 8 <2> 9 <<213> Sztuczna sekwencja <400> 9 1 <2> 60 <211> <400> 60 2 <2> 61 <211> <400> 61 3

225 226 <2> 62 <211> <400> 62 <2> 63 <211> 1 <400> 63 <2> 64 <211> 2 <400> 64 <2> 6 <211> 3

226 227 <400> 6 <2> 66 <211> 1 <400> 66 <2> 67 <211> <223> /note= Opis sztucznej sekwencji: SYGIVMWEVM <400> 67 2 <2> 68 <211> <222> źródło <400> 68 3 <2> 69

227 228 <211> <400> 69 1 <2> 70 <211> <22C> <400> 70 <2> 71 <211> 2 <400> 71 <2> 72 <211> 3 <400> 72

228 229 <2> 73 <211> <400> 73 1 <2> 74 <211> <400> 74 2 <2> 7 <211> <400> 7 3 <2> 76 <211>

229 2 <400> 76 <2> 77 <211> <212> FRT <400> 77 1 <2> 78 <211> <400> 78 2 <2> 79 <211> <400> 79

230 231 <2> 80 <400> 80 <2> 81 <223> Sztuczna sekwencja 1 <400> 81 2 <2> 82 <400> 82 <2> 83 3

231 232 <400> 83 <2> 84 <400> 84 1 <2> 8 <400> 8 2 <2> 86 <400> 86 3

232 233 <2> 87 <400> 87 <2> 88 1 <400> 88 <2> 89 2 <400> 89 <2> 90 3

233 234 <400> 90 <2> 91 <400> 91 1 <2> 92 <400> 92 2 <2> 93 <400> 93 3 <2> 94

234 23 <222> źródło <400> 94 1 <2> 9 <400> 9 <2> 96 <212> FRT 2 <400> 96 <2> 97 3 <400> 97

235 236 <2> 98 <211> <400> 98 1 <2> 99 <211> <400> 99 2 <2> 0 <211> <22C> <400> 0 3 <2> 1 <211>

236 237 <400> 1 <2> 2 <211> <400> 2 1 <2> 3 <211> <400> <2> 4 <211> <400> 4

237 238 <2> <211> <400> 1 <2> 6 <211> <400> 6 2 <2> 7 <211> <400> 7 3 <2> 8 <211>

238 239 <400> 8 <2> 9 <211> 1 <400> 9 <2> 1 <22C> 2 <400> 1 3 <2> 111 <400> 111

239 240 <2> 112 <211> <212> FRT <400> 112 <213> 113 <211> 1 <400> 113 <2> <222> /notatka= Opis sztucznej sekwencji: Sztucznie " <400> 114 <2> 11 3

240 241 <400> 11 <2> 116 <400> <2> 117 <228> <400> <2> 118 <400> <2> 119

241 242 <400> <2> 1 <400> 1 2 <2> 121 <211> <400> <2> 122 <211>

242 243 <400> 122 <2> 123 <211> <400> <2> 124 <211> <400> <2> 12 <211> <400> 12 3 <2> 126

243 244 <211> <400> <2> 127 <211> <400> <2> 128 <211> <223> <400> <2> 129

244 24 <400> 129 <2> 1 <400> 1 1 <2> 131 <400> <2> 132 <400> <213> 133 <211>

245 246 <400> <2> 134 <211> <400> <2> 13 <211> <400> 13 3 <2> 136 <211> <223> /notatka= Opis sztucznej sekwencji: DFLEAVKRHI" <400> 136

246 247 <2> 137 <211> <400> <2> 138 <211> <400> <2> 139 <211> <400> <2> 140

247 248 <400> 140 <2> <400> <2> 142 <400> <2> 143 <400> 143

248 249 <2> 144 <400> <2> 14 <22C> <400> 14 2 <2> 146 <400> <2> 147

249 <400> 147 <2> 148 <400> <2> <400> 149 <2> 3 <400>

250 21 <2> 11 <400> 11 <2> 12 1 <400> 12 2 <2> 13 <400> <2> 14 <211>

251 22 <400> 14 <2> 1 <211> <400> 1 1 <2> 16 <211> <400> 16 2 <2> 17 <211> <228> <400> 17 3 <2> 18 <211>

252 23 <400> 18 1 <2> 19 <211> <222> źródło <400> 19 2 <2> 160 <211> <400> <2> 161 <211> <400> 161

253 24 <2> 162 <211> <400> <2> 163 <211> <400> <2> 164 <211> <400> <2> 16 <211>

254 2 <400> 16 <2> 166 <211> <222> źródło 1 <400> 166 <2> 167 <211> 2 <400> 167 <2> <400> 168

255 26 <2> 169 <223> /note= Opis sztucznej sekwencji: MYEEKLNIL <400> <2> 170 <400> <2> 171 <400> <2> 172 <22C> <400> 172

256 27 <2> 173 <400> <2> 174 <400> <2> 17 <400> 17 3 <2> 176

257 28 <400> 176 <2> 177 <212> FRT 1 <400> <2> 178 <400> <2> 179 <400> 179

258 29 <2> 180 <400> 180 <2> <400> <2> 182 <400> <2> 183

259 260 <400> 183 <2> 184 <211> <403> <2> 18 <211> <400> 18 2 <2> 186 <211> <400> <2> 187

260 261 <211> <400> <2> 188 <211> <400> <2> 189 <211> <400> <2> 190 <211> <22C>

261 262 <400> 190 <2> 191 <211> <400> <2> 192 <211> <400> <2> 193 <211> <400> <2> 194 <211>

262 263 <400> <2> 19 <211> <223> <400> 19 2 <2> 196 <400> <2> 197 <400> 197

263 264 <2> 198 <400> <2> 199 <400> <2> 0 <400> 0 3 <2> 1 <212> Sztuczna sekwencja

264 26 <400> 1 <2> 2 1 <400> 2 2 <2> 3 <22C> <400> 3 3 <2> 4 <400> 4

265 266 <2> <400> <2> 6 1 <400> 6 <2> 7 2 <400> 7 <2> 8 3

266 267 <400> 8 <2> 9 <400> 9 1 <2> 2 <400> 2 2 <2> 211 <400> 211 3

267 268 <2> 212 <22C> <400> 212 <2> <400> 213 <2> 214 <211> 2 <400> <2> 21 <211>

268 269 <400> 21 <2> 216 <211> <400> <2> 217 <211> <400> <2> 218 <211> <400> 218 3

269 270 <2> 219 <211> <400> <2> 2 <211> <400> 2 2 <2> 221 <211> <400> <2> 222 <211>

270 271 <400> 222 <2> 223 <211> <400> <2> 224 <211> <400> <2> 22 <211> <400> 22 3 <2> 226 <211>

271 272 <400> 226 <2> <400> <2> 228 <400> <2> 229 <400> 229

272 273 <2> 2 <400> 2 1 <2> 231 <400> <2> 232 <400> <2> 233

273 274 <400> 233 <2> <400> 234 <2> 23 2 <400> 23 3 <2> 236 <400> 236

274 27 <2> 237 <400> <2> 238 <400> <2> 239 <400> <2> 240

275 276 <400> 240 <2> <400> 241 <2> <400> <2> 243 <400> 243

276 277 <2> 244 <400> <2> 24 <400> 24 2 <2> 246 <400> <2> 247 <211>

277 278 <400> 247 <2> 248 <211> <400> <2> 249 <211> <400> <2> <211> <400> 3 <2> 21

278 279 <211> <400> 21 1 <2> 22 <211> <400> 22 2 <2> 23 <211> <400> 23 3 <2> 24 <211>

279 280 <400> 24 <2> 2 <211> <400> 2 1 <2> 26 <211> <400> 26 2 <2> 27 <211> <400> 27 3 <2> 28 <211>

280 281 <400> 28 1 <2> 29 <211> <400> 29 2 <2> 260 <211> <400> <2> 261 <211>

281 282 <400> 261 <2> 262 <211> <400> <2> 263 <211> <400> <2> 264 <211> <400> <2> 26 <211>

282 283 <400> 26 1 <2> 266 <211> <2<213> Sztuczna sekwencja <400> <2> 267 <400> <2> 268

283 284 <400> 268 <2> 269 <400> <2> 270 <400> <2> 271 <400> <2> 272

284 28 <400> <2> 273 <400> <2> 274 <400> 274 <2> 27 3 <400> 27

285 286 <2> 276 <400> <2> 277 <222> PRT <400> <2> 278 <400> <2> 279

286 287 <400> 279 <2> 280 <400> <2> 281 <400> <2> <400> 282

287 288 <2> 283 <400> <2> 284 <400> <2> 28 <400> 28 3 <2> 286 <211>

288 289 <400> 286 <2> 287 <211> 1 <400> 287 <2> 288 <211> 2 <400> 288 <2> 289 <211> 3 <400> 289

289 290 <2> 290 <211> <400> <2> 291 <211> <400> <2> 292 <211> <400> <2> 293 <211>

290 291 <400> 293 <2> 294 <211> 1 <400> <2> 29 <211> <400> 29 3 <2> 296 <211> <400> 296

291 292 <2> 297 <211> <400> <2> 298 <211> <400> <2> 299 <211> <400> <2> 0 <211>

292 293 <400> 0 <2> 1 <211> <400> 1 1 <2> 2 <211> <400> 2 2 <2> 3 <211> 3 <400> 3

293 294 <2> 4 <211> <400> 4 <2> <211> 1 <400> <2> 6 2 <400> 6 <2> 7 3

294 29 <400> 7 <2> 8 <223> Sztuczna sekwencja <400> 8 1 <2> 9 <400> 9 2 <2> 3 <400> 3

295 296 <2> 311 <400> <2> 312 <400> <2> 313 <400> <2> 314

296 297 <400> 314 <2> 31 <400> 31 1 <2> 316 <22C> <400> <2> 317 <400> 317

297 298 <2> 318 <400> <2> 319 <400> <2> 3 <400> <2> 321

298 299 <400> 321 <2> 322 <400> <2> 323 <223> Sztuczna sekwencja <400> <2> 324 <400> <2> 32

299 0 <400> 32 <2> 326 <211> 1 <400> 326 <2> <400> <2> 328 <400> 328

300 1 <2> 329 <400> 329 <2> 3 1 <400> 3 <2> <400> <2> 332

301 2 <400> 332 <2> <400> 333 <2> <400> 334 <2> 33 <223> Sztuczna sekwencja 3 <400> 33

302 3 <2> 336 <400> <2> 337 <400> <2> 338 <400> <2> 339

303 4 <400> <2> 340 <400> <2> 341 <22C> <400> <2> 342 <400> 342

304 <2> 343 <400> <2> 344 <211> <400> <2> 34 <211> <400> 34 3 <2> 346 <211>

305 6 <400> 346 <2> 347 <211> 1 <400> 347 <2> 348 <211> 2 <400> <2> 349 <211> <400> 349

306 7 <2> <211> <400> <2> 31 <211> 1 <400> 31 <2> 32 <211> 2 <400> <2> 33 <211>

307 8 <0> 33 <2> 34 <211> <212> PRAT <400> 34 1 <2> 3 <211> <400> 3 2 <2> 36 <211> <400> 36 3 <2> 37 <211>

308 9 <400> 37 1 <2> 38 <211> <400> 38 2 <2> 39 <211> <400> 39 3 <2> 360 <211> <222> źródło

309 3 <400> 360 <2> 361 <211> <400> <2> 362 <211> <400> <2> 363 <211> <400> <2> 364 <211>

310 311 <40> <2> 36 <211> <400> 36 2 <2> 366 <211> <400> <2> 367 <211>

311 312 <400> 367 <2> 368 <211> <400> <2> 369 <211> <211> <22C> <400> <2> 370 <211> <400> 370

312 313 <2> 371 <211> <400> 371 <2> 372 <211> 1 <400> 372 <2> 373 <211> 2 <400> <2> 374 <211>

313 314 <400> 374 <2> 37 <400> 37 1 <2> 376 <223> Sztuczna sekwencja <400> <2> 377 <400> <2> 378

314 31 <400> 378 <2> <400> 379 <2> <400> 380 <2> <400> 381

315 316 <2> 382 <400> <2> 383 <400> <2> 384 <400> <2> 38

316 317 <400> 38 1 <2> 386 <400> <2> 387 <400> <2> 388 <400> 388

317 318 <2> 389 <400> <2> 390 <400> <2> 391 <211> <400> <2> 392 <211>

318 319 <400> 392 <2> 393 <211> 1 <400> <2> 394 <211> <400> <2> 39 <400> 39

319 3 <2> 396 <400> <2> 397 <400> <2> 398 <400> <2> 399

320 321 <400> 399 <2> 400 <400> <2> 401 <400> <2> 402 <400> 402 3

321 322 <2> 403 <400> 403 <2> <400> 404 <2> 40 2 <400> 40 <2> 406 3

322 323 <400> 406 <2> 407 <400> <2> 408 <400> <2> 409 <400> 409 <2> 4

323 324 <400> 4 1 <2> 411 <400> 411 <2> 412 <211> 2 <400> 412 <2> 413 <211> 3

324 32 <400> 413 <2> 414 <211> <400> <2> 41 <211> <400> 41 2 <2> 416 <211> <400> <2> 417 <211>

325 326 <400> 417 <2> 418 <211> 1 <400> <2> 419 <211> <400> <2> 4 <211> <400> 4

326 327 <2> 421 <211> <400> 421 <2> 422 <211> 1 <400> 422 <2> 423 <211> 2 <400> <2> 424 <211>

327 328 <400> 424 <2> 42 <211> <400> 42 1 <2> 426 <211> <400> <2> 427 <211> <400> <2> 428 <211>

328 329 <400> <2> 429 <211> <400> <2> 4 <211> <400> 4 3 <2> 431 <211> <400> 431

329 3 <2> 432 <211> <400> <2> 433 <211> <400> <2> 434 <400> 434 Oncotherapy Science, Inc. Pełnomocnik:

330 331 Zastrzeżenia patentowe Wyizolowany peptyd o mniej niż 1 aminokwasach, posiadający zdolność indukcji cytotoksycznych komórek T, który to peptyd jest wybrany z grupy składającej się z peptydów zawierających sekwencję aminokwasową o NR ID. SEKW.:, 19, 22, 34 lub Peptyd o mniej niż 1 aminokwasach, posiadający zdolność indukcji cytotoksycznych komórek T, który to peptyd zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z NR ID. SEKW.:, 19, 22, 34 oraz 38, w której 1 lub 2 aminokwasy są podstawione, usunięte lub dodane, przy czym ten peptyd indukuje cytotoksyczne limfocyty T specyficzne dla komórki z ekspresją CDH3. 3. Peptyd posiadający zdolność indukcji cytotoksycznych komórek T według zastrz. 2, który to peptyd składa się z sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.:, 19, 22, 34 oraz 38, w której 1 lub 2 aminokwasy są podstawione, usunięte lub dodane, przy czym ten peptyd indukuje cytotoksyczne limfocyty T specyficzne dla komórki z ekspresją CDH3. 4. Peptyd posiadający zdolność indukcji cytotoksycznych komórek T według zastrz. 2, który to peptyd składa się z sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.:, 19, 22, 34 oraz 38, w której 1 lub 2 aminokwasy są podstawione lub dodane, przy czym ten peptyd indukuje cytotoksyczne limfocyty T specyficzne dla komórki z ekspresją CDH3.

331 Peptyd według dowolnego z zastrz. 2 do 4, w którym drugim aminokwasem od końca N jest fenyloalanina, tyrozyna, metionina lub tryptofan. 6. Peptyd według dowolnego z zastrz. 2 do, w którym C-końcowym aminokwasem jest fenyloalanina, leucyna, izoleucyna, tryptofan lub metionina. 7. Wyizolowany peptyd składający się z sekwencji aminokwasowej NR ID. SEKW.:, 19, 22, 34 lub Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu lub zapobieganiu raka, przy czym ta kompozycja zawiera przynajmniej jeden peptyd według dowolnego z zastrz. 1 do 7 lub polinukleotyd kodujący ten peptyd. 9. Zastosowanie przynajmniej jednego peptydu według dowolnego z zastrz. 1 do 7 lub polinukleotydu kodującego ten peptyd do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia lub zapobiegania rakowi.. Egzosom, który prezentuje na swojej powierzchni kompleks zawierający peptyd według dowolnego z zastrz. 1 do 7 oraz antygen HLA. 11. Egzosom według zastrz., w którym antygenem HLA jest HLA-A Egzosom według zastrz. 11, w którym antygenem HLA jest HLA-A Sposób in vitro indukowania komórki prezentującej antygen, posiadającej dużą zdolność indukcji cytotoksycznej komórki T, obejmujący etap kontaktowania komórki prezentującej antygen z peptydem według dowolnego z zastrz. 1 do 7 lub obejmująca etap transferu genu zawierającego polinukleotyd kodujący peptyd według dowolnego z zastrz. 1 do 7 do komórki prezentującej antygen.

332 Sposób in vitro indukowania cytotoksycznej komórki T poprzez kontaktowanie komórki T z peptydem według dowolnego z zastrz. 1 do Wyizolowana cytotoksyczna komórka T, która jest zaindukowana poprzez kontaktowanie komórki T z peptydem według dowolnego z zastrz. 1 do 7 lub która jest poddana transdukcji kwasem nukleinowym kodującym polipeptydy podjednostki TCR wiążące się z peptydem według dowolnego z zastrz. 1 do 7 w kontekście HLA-A Komórka prezentująca antygen, która zawiera kompleks utworzony pomiędzy antygenem HLA i peptydem według dowolnego z zastrz. 1 do 7, lub która jest zaindukowana sposobem według zastrz Szczepionka do zastosowania w hamowaniu proliferacji komórki z ekspresją genu o NR ID. SEKW.: 1, która to szczepionka zawiera peptyd według dowolnego z zastrz. 1 do 7 jako składnik aktywny. 18. Zastosowanie peptydu według dowolnego z zastrz. 1 do 7 jako składnika aktywnego do wytwarzania szczepionki do hamowania proliferacji komórki z ekspresją genu o NR ID. SEKW.: Szczepionka według zastrz. 17 lub zastosowanie według zastrz. 18, w których komórka z ekspresją genu o NR ID. SEKW.: 1 jest komórką rakową.. Szczepionka lub zastosowanie według zastrz. 19, przygotowane do podania osobnikowi, którego antygenem HLA jest HLA-A Szczepionka do zastosowania w leczeniu lub zapobieganiu rakowi, przy czym ta szczepionka zawiera przynajmniej jeden peptyd według dowolnego z zastrz. 1 do 7 lub polinukleotyd kodujący ten peptyd.

333 Zastosowanie przynajmniej jednego peptydu według dowolnego z zastrz. 1 do 7 lub polinukleotydu kodującego ten peptyd do wytwarzania szczepionki do leczenia lub zapobiegania rakowi. 23. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 8, zastosowanie według zastrz. 9, 19 albo 22, lub szczepionka według zastrz. 19 albo 21, w których rak jest wybrany z grupy składającej się z raka pęcherza, raka piersi, raka szyjki macicy, raka komórek przewodów żółciowych, CML, raka jelita grubego, endometriozy, raka przełyku, raka żołądka, raka żołądka typu rozlanego, raka wątroby, NSCLC, chłoniaka, kostniakomięsaka, raka jajnika, raka trzustki, raka prostaty, raka nerki, SCLC, nowotworu tkanek miękkich i nowotworu jądra. 24. Sposób identyfikacji peptydu posiadającego zdolność indukcji CTL przeciwko komórkom z ekspresją CDH3, który to sposób obejmuje etapy: (i) dostarczania lub wytwarzania przynajmniej jednej sekwencji kandydującej, która składa się z sekwencji aminokwasowej zmodyfikowanej poprzez substytucję jednej lub dwóch reszt aminokwasowych w oryginalnej sekwencji aminokwasowej, przy czym oryginalna sekwencja aminokwasowa jest wybrana z grupy składającej się z NR ID. SEKW.:, 19, 22, 34 i 38; (ii) wyboru sekwencji kandydującej, która nie ma znacząco istotnej homologii z peptydami pochodzącymi z dowolnych innych produktów ludzkich genów innych niż CDH3; (iii) kontaktowania peptydu składającego się z sekwencji kandydującej wybranej w etapie (ii) z

334 33 komórkami prezentującymi antygen; (iv) kontaktowania komórek prezentujących antygen z etapu (iii) z komórkami T w celu oceny zdolności peptydu do stymulowania komórek T; oraz (v) identyfikacji peptydu, którego zdolność indukcji CTL jest taka sama lub wyższa niż dla peptydu składającego się z oryginalnej sekwencji aminokwasowej. Oncotherapy Science, Inc. Pełnomocnik:

335 336

336 337

337 338

338 339

339 340

340 341

341 342

342 343

343 344

344 34

345 346

346 347

347 348

348 349