(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2013/28 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. G01N 33/564 ( ) G01N 33/68 ( ) A61P 37/00 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Metody diagnostyki i leczenia chorób posiadających składnik autoimmunologiczny i/lub zapalny (30) Pierwszeństwo: US P US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/08 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/12 (73) Uprawniony z patentu: Novartis AG, Basel, CH XOMA Technology Ltd., Berkeley, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 SHARON LEA AUKERMAN, Emeryville, US BAHIJA JALLAL, Emeryville, US MOHAMMAD LUQMAN, Emeryville, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Aleksandra Twardowska KANCELARIA PATENTOWA KULIKOWSKA & KULIKOWSKI SP.J. SKR. POCZT Warszawa 12 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 EP B /PE/13 Opis Zakres wynalazku [0001] Wynalazek dotyczy dziedziny medycyny diagnostycznej i prognostycznej, bardziej szczegółowo dotyczy metod określania skuteczności czynników terapeutycznych w leczeniu chorób zawierających składnik autoimmunologiczny i/lub zapalny, który jest związany z niewłaściwym przekazywaniem sygnałów przez CD40. Podstawa wynalazku [0002] Wielu przedstawicieli rodziny ligandów czynnika nekrozy nowotworów (TNF) oraz ich odpowiadające receptory regulują wzrost normalnych komórek przez indukcję apoptozy lub zwiększenie przeżywalności i proliferację komórek. To jest ta równowaga pomiędzy sygnałami apoptotycznymi oraz sygnałami przeżywania i proliferacji, która utrzymuje normalną homeostazę komórkową. Do tej pory zidentyfikowano rodzinę co najmniej 26 receptorów TNF oraz 18 ligandów TNF. Biologicznie aktywne formy zarówno receptorów, jak i ligandów są samo składającymi się trimerami białkowymi. Zidentyfikowano formy transbłonowe i rozpuszczalne zarówno receptorów, jak i ligandów. Chociaż wewnątrzkomórkowe domeny receptorów nie wykazują homologii sekwencji, ich zewnątrzkomórkowe domeny zawierają 40-aminokwasowe, bogate w cysteinę powtórzenia. Ich cytoplazmatyczne ogony wysyłają sygnał przez oddziaływania z dwoma głównymi grupami białek wewnątrzkomórkowych: czynnikami związanymi z receptorem TNF (TRAF3) i białkami zawierającymi domenę śmierci (DD).

3 2 Oddziaływania pomiędzy co najmniej sześcioma ludzkimi TRAF i miejscami wiążącymi TRAF na ogonie cytoplazmatycznym niektórych z tych receptorów inicjują kilka szlaków sygnałowych, obejmujących AKT (kinazę serynową/treoninową określaną jako białkową kinazę B lub PKB), jądrowy czynnik KB (NF-κB), oraz kinazę aktywowaną mitogenem (MAPK). Patrz, na przykład, praca przeglądowa Younes i Kadin (2003) J. Clin. Oncol. 18: [0003] Członek rodziny receptorów TNF CD40 jest antygenem powierzchniowym komórki o masie kda obecny na powierzchni zarówno normalnych, jak i nowotworowych ludzkich komórek B, komórek dendrytycznych, monocytów, makrofagów, komórek T CD8+ T, komórek śródbłonkowych, oraz monocytów i komórek nabłonkowych. Antygen CD40 ulega również ekspresji na aktywowanych komórkach T, aktywowanych płytkach krwi, komórkach mięśni gładkich naczyń, granulocytów kwasochłonnych, błon maziowych w reumatoidalnym zapaleniu stawów, fibroblastów skórnych, oraz innych nie limfoidalnych typach komórek. W zależności od typu komórki, w której zachodzi ekspresja CD40, ligacja może indukować międzykomórkową adhezję, różnicowanie, aktywację i proliferację. Na przykład, wiązanie CD40 z jego pokrewnym ligandem, CD40L (również określanym jako CD154), stymuluje proliferację i różnicowanie komórek B w komórki plazmatyczne, wytwarzanie przeciwciał, przełączanie izotypów, oraz tworzenie komórek B pamięci. Podczas różnicowania komórek B, CD40 ulega ekspresji na komórkach pre-b, ale ekspresja ustaje po zróżnicowaniu w komórki plazmatyczne. [0004] Ligand CD40 (CD40L), znany również jako CD154, jest białkiem transbłonowym o masie kda, który występuje w

4 3 dwóch mniejszych biologicznie aktywnych rozpuszczalnych formach, odpowiednio, 18 kda i 31 kda (Graf i in. (1995) Eur.J.Immunol. 25: ; Mazzei i in. (1995) J. Biol. Chem. 270: ; Pietravalle i in. (1996) J. Biol. Chem. 271: ). CD40L ulega ekspresji na aktywowanych, ale nie spoczynkowych komórkach pomocniczych T CD4+ (Lane i in. (1992) Eur. J. Immunol. 22: ; Spriggs i in. (1992) J. Exp. Med. 176: ; oraz Roy i in. (1993) J. Immunol. 151:1-14). Zarówno CD40 jak i CD40L sklonowano i scharakteryzowano (Stamenkovi i in. (1989) EMBO J. 8: ; Armitage i in. (1992) Nature 357: 80-82; Lederman i in. (1992) J. Exp. Med. 175: ; oraz Hollenbaugh i in. (1992) EMBO J. 11: ). Patrz również opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer , opisujący ludzki CD40L. Komórki stransfekowane genem CD40L i prowadzące ekspresję białka CD40L na ich powierzchni mogą wyzwalać proliferację komórek B, i razem z innymi sygnałami stymulującymi mogą indukować wytwarzanie przeciwciał (Armitage i in. (1992) supra; oraz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer ). Pacjenci z chorobami autoimmunologicznymi mają podwyższone poziomy w surowicy rozpuszczalnego CD40L (scd40l), które nie są widoczne u zdrowych osobników. Nadekspresja CD40L powoduje choroby autoimmunologiczne podobne do układowego tocznia rumieniowatego w modelach gryzoni (Higuchi i in. (2002) J. Immunol. 168:9-12). W przeciwieństwie, nieobecność funkcjonalnego CD40L na aktywowanych komórkach T powoduje zespół hiper IgM sprzężony z chromosomem X (Allen i in. (1993) Science 259: 990; oraz Korthauer i in. (1993) Nature 361:539). Ponadto, blokowanie oddziaływań CD40/CD40L może

5 4 zapobiegać odrzucaniu przeszczepów w modelach naczelnych innych niż człowiek. Patrz, na przykład, Wee i in. (1992) Transplantation 53: [0005] Ekspresja CD40 na APC odgrywa ważną ko-stymulującą rolę w aktywacji tych komórek. Na przykład, wykazano, że agonistyczne przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw CD40 (mabs) naśladują wpływy limfocytów T pomocniczych w aktywacji komórek B. Jeśli prezentowane są na adherentnych komórkach, w których zachodzi ekspresja FcγRII, to te przeciwciała indukują proliferację komórek B (Banchereau i in. (1989) Science 251: 70). Ponadto, agonistyczne mab skierowane przeciw CD40 mogą zastępować sygnał pomocniczych komórek T dla sekrecji IgM, IgG, i IgE w obecności IL-4 (Gascan i in. (1991) J. Immunol. 147:8). Ponadto, agonistyczne mab skierowane przeciw CD40 mogą zapobiegać zaprogramowanej śmierci komórkowej (apoptozie) komórek B wyizolowanych z węzłów limfatycznych. [0006] Te i inne obserwacje podtrzymują aktualną teorię, że wzajemne oddziaływania CD40 i CD40L odgrywają zasadniczą rolę w regulacji zarówno humoralnej, jak i komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Ostatnie badania ujawniły znacznie szerszą rolę wzajemnych oddziaływań CD40/CD40L w różnych fizjologicznych i patologicznych procesach. [0007] Szlak transdukcji sygnału CD40 zależy od skoordynowanej regulacji wielu czynników wewnątrzkomórkowych. Podobnie jak inni członkowie rodziny receptorów TNF, CD40 aktywuje TRAF, obejmujące TRAF-1, TRAF-2, -3, -5, oraz -6, które regulują wzmacniająco różne szlaki sygnałowe po zetknięciu się CD40 z CD40L (albo CD40L związanego z błoną, albo rozpuszczalnego CD40L), obejmując kinazę regulowaną

6 5 sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK), kinazę aminokońcową c-jun (JNK), p38 MAPK, oraz NF-κB (patrz, na przykład, Younes i Carbone (1999) Int. J. Biol. Markers 14: ; van Kooten i Banchereau (2000) J. Leukoc. Biol. 67: 2-17). [0008] Wykazano, że przekazywanie sygnałów przez CD40 zapobiega śmierci komórkowej w wyniku apoptozy (Makus i in. (2002) J. Immunol. 14: ). Sygnały apoptotyczne są konieczne do indukowania zaprogramowanej śmierci komórek w skoordynowany sposób. Sygnały śmierci komórkowej mogą obejmować bodźce wewnętrzne pochodzące z wnętrza komórki, takie jak bodźce stresu retikulum endoplazmatycznego lub bodźce zewnętrzne, takie jak wiązanie receptora FasL lub TNFα. Szlak przekazywania sygnałów jest złożony, obejmujący aktywację kaspaz, takich jak kaspaza-3 oraz kaspaza-9, polimerazy poli(adp rybozy) (PARP). Podczas kaskady, białka przekazujące sygnały anty-apoptotyczne, takie jak Mcl-1 i Bcl-x, oraz członkowie rodziny białek IAP, takie jak inhibitor apoptozy sprzężony z chromosomem X (XIAP), podlegają regulacji zmniejszającej (Budihardjo i in. (1999) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15: ). Na przykład, w komórkach dendrytycznych, sygnały komórkowe CD40 mogą blokować sygnały apoptozy transdukowane przez FasL (Bjorck i in. (1997) Intl. Immunol. 9: ). [0009] A zatem, połączenie CD40 z CD40L i następnie aktywacja przekazywania sygnałów przez CD40 są koniecznymi etapami normalnych odpowiedzi immunologicznych; jednakże, rozregulowanie przekazywania sygnałów przez CD40 może prowadzić do choroby. Wykazano, że szlak sygnałowy CD40 jest zaangażowany w chorobie autoimmunologicznej (Ichikawa i in. (2002) J. Immunol. 169: i Moore i in. (2002) J.

7 6 Autoimmun. 19: ). Ponadto, wzajemne oddziaływania CD40/CD40L odgrywają ważną rolę w procesach zapalnych. Na przykład, zarówno CD40,jak i CD40L ulegają nadekspresji u ludzi i w eksperymentalnych zmianach miażdżycowych. Stymulacja CD40 indukuje ekspresję enzymów degradujących macierz oraz ekspresję czynnika tkankowego w typach komórek związanych z ogniskami miażdżycowymi, takich jak komórki śródbłonkowe, komórki mięśni gładkich i makrofagi. Ponadto, stymulacja CD40 indukuje wytwarzanie prozapalnych cytokin, takich jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), IL-1, IL-6 i IL-8, oraz cząsteczek adhezyjnych, takich jak ICAM-1, selektyna E, i VCAM. Hamowanie wzajemnych oddziaływań CD40/CD40L zapobiega tworzeniu się blaszek miażdżycowych w modelach zwierzęcych. W modelach przeszczepów, blokowanie oddziaływań CD40/CD40L zapobiega zapaleniu. Wykazano, że wiązanie CD40/CD40L działa synergistycznie z peptydem betaamyloidu Alzheimera w pobudzaniu aktywacji mikrogleju, prowadząc w ten sposób do neurotoksyczności. [0010] U pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów (RA), ekspresja CD40 jest podwyższona na chondrocytach stawowych, a zatem przekazywanie sygnałów przez CD40 przyczynia się prawdopodobnie do wytwarzania uszkadzających cytokin i metaloproteinaz macierzy. Patrz, Gotoh i in. (2004) J. Rheumatol. 31: Ponadto wykazano, że amplifikacja odpowiedzi zapalnej błony maziowej zachodzi przez aktywację MAPK i NF-κB poprzez ligację CD40 na komórkach błony maziowej CD14+ od pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów (Harigai i in. (2004) Arthritis. Rheum. 50: ). W eksperymentalnym modelu RA, leczenie przeciwciałami skierowanymi przeciw CD40L zapobiega indukcji choroby,

8 7 zapaleniu stawów i wytwarzaniu przeciwciał skierowanych przeciw kolagenowi (Durie i in. (1993) Science 261: ). Wreszcie, w próbach klinicznych wykazano, że zmniejszenie ilości komórek B CD20+ pozytywnych u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów przez podawanie Rituxan (generalnie wskazany w przypadku chłoniaka komórek B) poprawia objawy (Shaw i in. (2003) Ann. Rheum. Dis. 62(Supl. 2): ii55-ii59). [0011] Wykazano również, że blokowanie oddziaływań CD40/CD40L podczas prezentacji antygenu komórkom T indukuje tolerancję komórek T. A zatem, blokowanie wzajemnych oddziaływań CD40/CD40L zapobiega początkowej aktywacji komórek T, jak również indukuje długoterminową tolerancję na ponowną ekspozycję na antygen. [0012] Biorąc pod uwagę ważną rolę przekazywania sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L w utrzymywaniu normalnej odporności, potrzebne są metody identyfikowania osobników z chorobą autoimmunologiczną i/lub zapalną, którzy mogliby odpowiadać na schemat leczenia, w którym celem byłoby przekazywanie sygnałów przez CD40. Podsumowanie wynalazku [0013] Wynalazek dostarcza metodę identyfikowania osobnika dotkniętego chorobą zapalną lub autoimmunologiczną, która odpowiada na leczenie czynnikiem terapeutycznym anty-cd40, przy czym rzeczona metoda obejmuje: a) dostarczenie testowej próbki biologicznej i kontrolnej próbki biologicznej otrzymanej od rzeczonego osobnika, gdzie rzeczona testowa próbka biologiczna i kontrolna próbka biologiczna zawierają komórki, w których zachodzi ekspresja CD40 i które stymulowano ligandem CD40; b) dostarczenie kontaktu rzeczonej testowej próbki

9 8 biologicznej ze skuteczną ilością rzeczonego czynnika terapeutycznego anty-cd40; c) wykrywanie poziomu co najmniej jednego biomarkera w rzeczonej testowej próbce biologicznej, przy czym rzeczony biomarker wybiera się z grupy składającej się z: (i) biomarkera apoptozy komórkowej, przy czym rzeczony biomarker apoptozy wybiera się z grupy składającej się z rozszczepionego białka kaspazy, rozszczepionej polimerazy poli ADP-rybozy (PARP), ekspresji na powierzchni komórki fosfatydyloseryny (PS), fragmentacji genomowego DNA, oraz ich dowolnych kombinacji; (ii) biomarkera szlaku sygnałowego CD40, w którym uczestniczy CD40L, przy czym rzeczony szlak sygnałowy CD40, w którym uczestniczy CD40L wybiera się z grupy składającej się z szlaku sygnałowego AKT, szlaku sygnałowego NF-κB, oraz szlaku sygnałowego kinazy aktywowanej mitogenem (MAPK), i rzeczony biomarker rzeczonego szlaku sygnałowego CD40, w którym uczestniczy CD40L wybiera się z grupy składającej się z białka fosfo-pi3k, fosfo-pdk1, fosfo-akt, fosfo-mek, fosfo- ERK, fosfo-p38, fosfo-ikkα/β, fosfo-iκb oraz aktywowanego NFκB; i (iii) biomarkera przeżywalności komórek, przy czym rzeczony biomarker przeżywalności komórek wybiera się z grupy składającej się z białka antyapoptotycznego, które jest członkiem rodziny Bcl-2, białka inhibitora apoptozy IAP, oraz czynnika-1 związanego z receptorem TNF (TRAF-1); i d) porównywanie poziomu co najmniej jednego rzeczonego biomarkera w rzeczonej testowej próbce biologicznej z poziomem co najmniej jednego rzeczonego biomarkera w rzeczonej kontrolnej próbce biologicznej, gdzie rzeczona kontrolna próbka biologiczna nie kontaktuje się z rzeczonym

10 9 czynnikiem terapeutycznym anty-cd40, przy czym (i) wzrost poziomu co najmniej jednego z rzeczonych biomarkerów apoptozy; i/lub (ii) obniżenie poziomu co najmniej jednego z rzeczonych biomarkerów co najmniej jednego z rzeczonych szlaków sygnałowych CD40, w których uczestniczy CD40L; i/lub (iii) obniżenie poziomu co najmniej jednego z rzeczonych biomarkerów przeżywalności komórek; stosunek rzeczonej testowej próbki biologicznej do rzeczonej kontrolnej próbki biologicznej wskazuje osobnika, który mógłby odnieść korzyść z leczenia rzeczonym czynnikiem terapeutycznym anty-cd40, i w której rzeczony czynnik terapeutyczny anty-cd40 jest antagonistą przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciw CD40 lub jego fragmentem wiążącym antygen, który jest zdolny do specyficznego wiązania z ludzkim antygenem CD40 ulegającym ekspresji na powierzchni ludzkiej komórki B, i który jest wolny od znaczącej aktywności agonistycznej kiedy wiąże się z antygenem CD40 ulegającym ekspresji na powierzchni rzeczonej komórki B. Krótkie podsumowanie [0014] Dostarcza się metody identyfikowania osobników dotkniętych chorobą zapalną i/lub chorobą autoimmunologiczną, którzy będą mogli odnosić korzyść z czynników terapeutycznych anty-cd40, obejmujących te, które modulują przekazywanie sygnałów za pośrednictwem CD40L i/lub modulują zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową (ADCC). Takie czynniki terapeutyczne anty-cd40 obejmują, ale nie są ograniczone do antagonistów przeciwciał skierowanych przeciw CD40,

11 10 antagonistów przeciwciał skierowanych przeciw CD40L, oraz czynników farmakologicznych, które blokują lub zakłócają oddziaływania CD40/CD40L, w szczególności przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, jak również antagonistów przeciwciał skierowanych przeciw CD40, które dodatkowo lub alternatywnie, wykazują aktywność ADCC jako sposób działania. W niektórych przykładach, metody obejmują stosowanie biomarkerów apoptozy komórkowej, proliferacji i przeżywalności komórek, oraz szlaków sygnałowych CD40 do monitorowania ex vivo odpowiedzi komórkowej na jeden lub więcej czynników terapeutycznych anty-cd40 będących przedmiotem zainteresowania. Te oznaczania prognostyczne ex vivo obejmują zapewnianie testowej próbki biologicznej i kontrolnej próbki biologicznej od osobnika będącego kandydatem, przy czym te próbki biologiczne zawierają komórki, w których zachodzi ekspresja CD40 i które stymulowano ligandem CD40, albo in vivo albo ex vivo; zapewnianie kontaktu testowej próbki biologicznej z czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 będącym przedmiotem zainteresowania; wykrywanie poziomu ekspresji co najmniej jednego biomarkera w testowej próbce biologicznej; oraz porównywanie poziomu ekspresji biomarkera(ów) z odpowiadającym poziomem ekspresji wykrytym w kontrolnej próbce biologicznej, która nie miała kontaktu z czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 będącym przedmiotem zainteresowania. Biomarkery do stosowania w tych oznaczeniach prognostycznych ex vivo obejmują białka i/lub geny, których poziomy ekspresji są prognostycznymi wskaźnikami odpowiedzi na interwencję terapeutyczną, obejmując biomarkery apoptozy komórkowej, biomarkery szlaków sygnałowych CD40, w których uczestniczy

12 11 CD40L, oraz biomarkery proliferacji i przeżywalności komórek, w zależności od sposobu działania czynnika terapeutycznego anty-cd40. Jeśli czynnik terapeutyczny anty-cd40 ma sposób działania przez niszczenie przekazywania sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, to w tych oznaczeniach prognostycznych ex vivo można stosować biomarkery apoptozy komórkowej, szlaków sygnałowych CD40, w których uczestniczą CD40L, oraz proliferacji i przeżywalności komórek. W niektórych przykładach, można oznaczać dodatkowe markery szlaków sygnałowych CD40, w których uczestniczą CD40L, obejmujące, ale nie ograniczające się do cytokin, które podlegają regulacji zwiększającej w wyniku oddziaływań CD40L- CD40, na przykład, czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), interleukin (IL)-6, IL-8, IL-10, czynnika nekrozy nowotworów α (TNF-α), białka chemotaktycznego dla monocytów-1 (MCP-1), oraz białka zapalnego makrofagów 1β (MIP-1β). Jeśli czynnik terapeutyczny anty-cd40 wykazuje sposób działania przez ADCC, na przykład, w tych oznaczeniach prognostycznych ex vivo można stosować przeciwciała skierowane przeciw CD40, biomarkery apoptozy komórkowej. [0015] W innych przykładach, osobników będących kandydatami przeszukuje się pod względem poziomu ekspresji jednego lub więcej czynników związanych z CD40, które są prognostyczne dla indywidualnych osobników, lub subpopulacji indywidualnych osobników, którzy będą odnosić korzyść z interwencji czynnikami terapeutycznymi anty-cd40. A zatem, próbki biologiczne zebrane od osobników będących kandydatami, na przykład, osobników dotkniętych chorobą obejmującą składnik autoimmunologiczny i/lub zapalny, przeszukuje się pod względem jednego lub więcej czynników związanych z CD40,

13 12 wybranych z grupy składającej się z poziomu ekspresji antygenu powierzchniowego komórki CD40 na komórkach próbki biologicznej, poziomu ekspresji powierzchniowego CD40L na komórkach próbki biologicznej, poziomu krążenia rozpuszczalnego CD40 (scd40), oraz poziomu krążenia rozpuszczalnego CD40L (scd40l). Te związane z CD40 czynniki mogą być prognostycznymi wskaźnikami choroby, i mogą ponadto być stosowane do identyfikowania osobników, którzy mogliby lub nie odpowiadać na terapeutyczną interwencję z zastosowaniem czynników terapeutycznych anty-cd40, niezależnie od sposobu działania czynnika terapeutycznego anty-cd40. Podwyższony poziom ekspresji jednego lub więcej z tych czynników związanych z CD40 w próbce biologicznej w porównaniu z kontrolą lub standardem referencyjnym może wskazywać na indywidualnego osobnika, który mógłby odnosić korzyść z interwencji terapeutycznej z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40, który moduluje przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, moduluje ADCC, lub obydwa. Osobników, będących kandydatami, zidentyfikowanych w tym procesie przeszukiwania można leczyć za pomocą będącego przedmiotem zainteresowania czynnika terapeutycznego anty-cd40, lub można dalej testować pod względem odpowiedzi na czynniki terapeutyczne anty-cd40 z zastosowaniem opisanych w niniejszym opisie oznaczeń prognostycznych ex vivo. [0016] W jeszcze innych przykładach, osobników będących kandydatami przeszukuje się pod względem obecności lub nieobecności jednego lub więcej klinicznie użytecznych markerów prognostycznych w celu zdefiniowania subpopulacji osobników będących kandydatami, którzy mają słabe prognozy

14 13 odnośnie innych klas czynników terapeutycznych, ale którzy mogą odnosić korzyść z interwencji z zastosowaniem czynników terapeutycznych anty-cd40. W tym sposobie, próbki biologiczne zebrane od osobników będących kandydatami przeszukuje się pod względem jednego lub więcej klinicznie użytecznych markerów prognostycznych, znanych jako wskaźniki słabej prognozy z aktualnie stosowanymi czynnikami terapeutycznymi, których sposób działania nie obejmuje ukierunkowania na CD40 lub przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L. W tym procesie przeszukiwania można wykorzystywać dowolny klinicznie użyteczny marker prognostyczny danej choroby autoimmunologicznej lub zapalnej. Osobników będących kandydatami w obrębie subpopulacji zidentyfikowanej za pomocą tego procesu przeszukiwania, można dalej przeszukiwać pod względem odpowiedzi na czynniki terapeutyczne anty-cd40, stosowane w opisanych w niniejszym opisie oznaczeniach prognostycznych ex vivo. [0017] W niniejszym opisie ujawnia się również metody monitorowania skuteczności czynnika terapeutycznego anty-cd40 w leczeniu osobnika dotkniętego chorobą zapalną lub chorobą autoimmunologiczną. W tym sposobie, osobnika poddawanego terapii z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40, który mógł być wcześniej poddawany lub nie, wcześniejszym testom przesiewowym z wykorzystaniem ujawnionego tu oznaczenia prognostycznego ex vivo, monitoruje się pod względem zmian ekspresji in vivo co najmniej jednego biomarkera apoptozy komórkowej, proliferacji i przeżywalności komórki i/lub jednego lub więcej szlaków sygnałowych CD40, w których uczestniczą CD40L po leczeniu czynnikiem terapeutycznym anty-cd40. Konkretne biomarkery do oznaczania

15 14 można wybierać opierając się na sposobie działania czynnika terapeutycznego, jak opisano powyżej. Alternatywnie, lub dodatkowo, osobnika można monitorować pod względem zmian in vivo w poziomie ekspresji jednego lub więcej czynników związanych z CD40 wybranych z grupy składającej się z antygenu powierzchniowego CD40 na komórkach, CD40L powierzchniowego na komórkach, poziomu scd40 w krążeniu, oraz poziomu scd40l w krążeniu po leczeniu z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40. W tym sposobie, pierwszą próbkę biologiczną otrzymuje się od osobnika i oznacza pod względem poziomu ekspresji jednego lub więcej tych biomarkerów i/lub czynników związanych z CD40 w celu uzyskania poziomu podstawowego ekspresji dla każdego oznaczanego czynnika, a następnie jedną lub więcej kolejnych próbek biologicznych otrzymuje się od osobnika i oznacza pod względem tego(tych) samego(mych) biomarkera(rów) i/lub czynnika(ków) związanego(nych) z CD40, gdzie kolejną próbkę biologiczną otrzymuje się po podaniu co najmniej jednej dawki czynnika terapeutycznego anty-cd40 będącego przedmiotem zainteresowania. Monitorowanie można przeprowadzać w jednym punkcie w czasie lub wielu punktach w czasie, dla ustalenia skuteczności danego protokołu leczenia, w którym czynnik terapeutyczny anty-cd40 podaje się osobnikowi. W zależności od oznaczanego biomarkera, obniżenie lub wzrost poziomu ekspresji biomarkera pomiędzy dowolnymi dwoma punktami w czasie mogą wskazywać na skuteczność czynnika terapeutycznego anty-cd40 w leczeniu choroby zapalnej lub choroby autoimmunologicznej. Jeśli monitorowanie ujawnia obniżenie pod względem poziomu ekspresji jednego lub więcej czynników związanych z CD40, to taki wynik może wskazywać na

16 15 skuteczność czynnika terapeutycznego anty-cd40 w leczeniu choroby zapalnej lub choroby autoimmunologicznej. [0018] Poziom ekspresji tych różnych biomarkerów i czynników związanych z CD40, oraz dowolnych klinicznie użytecznych markerów prognostycznych w próbce biologicznej można wykrywać na poziomie białka lub kwasu nukleinowego, wykorzystując, na przykład, techniki immunohistochemiczne lub techniki oparte na kwasach nukleinowych, takie jak hybrydyzacja in situ i RT- PCR. W niektórych rozwiązaniach, podwyższony poziom lub wzrost ekspresji co najmniej jednego biomarkera wskazuje na pozytywną odpowiedź terapeutyczną na leczenie z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40. W innych rozwiązaniach, obniżony poziom lub zmniejszenie ekspresji co najmniej jednego biomarkera wskazuje na pozytywną odpowiedź terapeutyczną na leczenie z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40. [0019] Metody ujawnione w niniejszym opisie można stosować do identyfikowania pacjentów dla których interwencja terapeutyczna z zastosowaniem anty-cd40 może być korzystna w zapobieganiu, łagodzeniu lub leczeniu chorób, zawierających składnik autoimmunologiczny i/lub zapalny, obejmując, ale bez ograniczeń, choroby autoimmunologiczne i zapalne, takie jak toczeń rumieniowaty układowy (SLE), toczeń rumieniowaty przewlekły, toczniowe zapalenie nerek, sarkoidozę, zapalenie stawów, obejmujące, ale nie ograniczające się do młodzieńczego zapalenia stawów, reumatoidalnego zapalenia stawów, łuszczycowego zapalenia stawów, zespołu Reitera, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, oraz dnawego zapalenia stawów, odrzucanie przeszczepionego narządu lub tkanki, hiperostre, ostre lub przewlekłe odrzucanie i/lub

17 16 choroba przeszczep przeciw gospodarzowi, stwardnianie rozsiane, zespół hiper IgE, guzkowate zapalenie tętnic, pierwotną żółciową marskości wątroby, chorobę zapalną jelit, chorobę Crohna, celiakię (enteropatię związaną z wrażliwością na gluten), autoimmunologiczne zapalenie wątroby, niedokrwistość złośliwą, autoimmunologiczną niedokrwistość hemolityczną, łuszczycę, twardzinę, miastenię, autoimmunologiczną plamicę małopłytkową, autoimmunologiczne zapalenie tarczycy, chorobę Grave a, zapalenie tarczycy Hasimoto, chorobę kompleksów immunologicznych, zespół przewlekłego zmęczenia i dysfunkcji immunologicznych (CFIDS), zapalenie wielomięśniowe i zapalenie skórno-mięśniowe, krioglobulinemię, trombolizę, kardiomiopatię, pęcherzycę zwykłą, śródmiąższowe zwłókniające zapalenie płuc, sarkoidozę, cukrzycę typu I i typu II, nadwrażliwość późną typu 1, 2, 3 i 4, alergię lub zaburzenia alergiczne, nie chciane/nie zamierzone odpowiedzi immunologiczne na białka terapeutyczne, astmę, zespół Churg-Straussa (ziarniniakowatość alergiczna), atopowe zapalenie skóry, kontaktowe zapalenie skóry alergiczne i z podrażnienia, pokrzywkę, alergię z udziałem IgE, miażdżycę, zapalenia naczyń, idiopatyczne miopatie zapalne, chorobę hemolityczną, chorobę Alzheimera, przewlekłą zapalną polineuropatię demielinizacyjną i podobne. Krótki opis rysunków [0020] Figura 1 pokazuje, że przekazywanie sygnałów i przeżywalność normalnych ludzkich komórek B indukowana jest przez CD40L, a blokowana przez CHIR

18 17 Szczegółowy opis [0021] Niniejszy wynalazek dotyczy metod identyfikowania osobników dotkniętych chorobą zapalną lub chorobą autoimmunologiczną, którzy mogliby odnosić korzyść z leczenia z zastosowaniem czynników terapeutycznych anty-cd40, które ukierunkowane są na receptor CD40 i, które modulują ADCC, zakłócają przekazywanie sygnałów przez CD40, w szczególności szlaki sygnałowe CD40, w których pośredniczą wzajemne oddziaływania CD40 z ligandem CD40 (CD40L), lub obydwu. W jednym przykładzie, metody obejmują stosowanie ex vivo oznaczeń prognostycznych do monitorowania efektów antagonistycznych czynników terapeutycznych anty-cd40, które blokują lub zakłócają przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L na poziomie ekspresji trzech klas biomarkerów, które są związane z przekazywaniem sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, w szczególności biomarkerów proliferacji lub przeżywania komórek i szlaków apoptotycznych komórki oraz biomarkerów kluczowych szlaków sygnałowych CD40, w których uczestniczą CD40L, obejmujących szlaki sygnałowe AKT, NF-κB, i kinazą aktywowaną mitogenem (MAPK). Dodatkowe markery, które mogą służyć do monitorowania efektów antagonistycznych czynników terapeutycznych anty- CD40, które blokują lub zakłócają przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, obejmują cytokiny podlegają regulacji zwiększającej w wyniku przekazywania sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, jak opisano poniżej w tym opisie. Biomarkery szlaków apoptotycznych komórki mogą również służyć do monitorowania efektów czynników terapeutycznych anty-cd40, które modulują ADCC, na przykład, przeciwciała skierowane przeciw CD40, których

19 18 sposobem działania jest ADCC. Czynniki terapeutyczne, które działają jako antagoniści przekazywania sygnałów przez CD40, określa się tu "antagonistami CD40", mogą zakłócać jeden lub więcej sygnałów sygnalizacyjnych normalnie wyzwalanych przez wiązanie CD40L z receptorem CD40. Oznaczenia prognostyczne ex vivo można stosować do rozróżniania pacjentów, którzy będą odnosić korzyści z interwencji z zastosowaniem antagonistów CD40 i czynników terapeutycznych, które są ukierunkowane na CD40 i modulują ADCC oraz tych dla których interwencja z zastosowaniem czynników terapeutycznych tego typu nie będzie korzystna. Osobników będących kandydatami można dodatkowo, lub alternatywnie, przeszukiwać pod względem obecności lub nieobecności, lub podwyższonych bądź obniżonych poziomów, jednego lub więcej czynników związanych z CD40 i/lub jednego lub więcej klinicznie użytecznych markerów prognostycznych do definiowania indywidualnych lub subpopulacji osobników będących kandydatami, którzy będą mogli odnosić korzyść z interwencji terapeutycznej z zastosowaniem czynników terapeutycznych anty-cd40, które modulują przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L i/lub ADCC. Osobników zidentyfikowanych za pomocą tych metod przeszukiwania można dalej przeszukiwać, stosując ex vivo oznaczenia prognostyczne opisane w tym opisie. Biomarkery i czynniki związane z CD40 opisane w niniejszym opisie mogą również znaleźć zastosowanie w monitorowaniu skuteczności leczenia z zastosowaniem czynników terapeutycznych anty-cd40, które modulują przekazywanie sygnałów przez CD40 i/lub ADCC, oraz w określaniu podstawy dla odpowiedzi na leki u indywidualnych pacjentów lub subpopulacji pacjentów dotkniętych chorobą zapalną lub chorobą autoimmunologiczną.

20 19 [0022] Przez "antygen CD40", "antygen powierzchniowy komórki CD40", "receptor CD40" lub "CD40" rozumie się glikoproteinę transbłonową, która należy do rodziny receptorów czynnika nekrozy nowotworów (TNF) (patrz, na przykład, opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach oraz ; Stamenkovic i in. (1989) EMBO 8: 1403; Clark (1990) Tissue Antigens 36: 33; Barclay i in. (1997) The Leucocyte Antigen Facts Book (wyd.2; Academic Press, San Diego)). Zidentyfikowano dwie izoformy ludzkiego CD40, kodowanego przez alternatywnie cięte i składane warianty transkryptu tego genu. Pierwsza izoforma (znana również jako "izoforma długa" lub "izoforma 1") ulega ekspresji jako polipeptyd prekursorowy o długości 277 aminokwasów (SEQ ID NO:12 (najpierw opisywany jako numer dostępu GenBank CAA43045, i zidentyfikowany jako izoforma 1 w GenBank pod numerem dostępu NP_001241), kodowany przez SEQ ID NO:11 (patrz GenBank pod numerami dostępu X60592 i NM_001250)), która posiada sekwencję sygnałową reprezentowaną przez pierwszych 19 reszt. Druga izoforma (znana również jako "izoforma krótka" lub "izoforma 2") ulega ekspresji jako polipeptyd prekursorowy o długości 203 aminokwasów (SEQ ID NO:10 (Genbank numer dostępu NP_690593), kodowany przez SEQ ID NO:9 (Genbank numer dostępu NM_152854)), która również posiada sekwencję sygnałową reprezentowaną przez pierwszych 19 reszt. Polipeptydy prekursorowe tych dwóch izoform ludzkiego CD40 mają takie same 165 pierwszych reszt (tj., reszty SEQ ID NO:10 i SEQ ID NO:12). Polipeptyd prekursorowy krótkiej izoformy (przedstawiony w SEQ ID NO:10) jest kodowany przez wariant transkryptu (SEQ ID NO:9), który pozbawiony jest segmentu kodującego, co prowadzi do

21 20 przesunięcia ramki translacji; otrzymana izoforma CD40 zawiera krótszy i odrębny koniec C (reszty SEQ ID NO:10) od tego zawartego w długiej izoformie CD40 (koniec C przedstawiają reszty SEQ ID NO:12). Dla celów tego wynalazku, termin "antygen CD40", "antygen powierzchniowy komórki CD40", "receptor CD40" lub "CD40" obejmuje obydwie izoformy CD40, krótką i długą. [0023] Antygen CD40 jest prezentowany na powierzchni szeregu typów komórek, jak opisano w innym miejscu tego opisu. Przez "prezentowany na powierzchni" i "ulegający ekspresji na powierzchni" rozumie się, że całość lub część antygenu jest eksponowana na zewnątrz komórki. Prezentowany lub ulegający ekspresji antygen CD40 może być w pełni lub częściowo glikolizowany. [0024] Przez aktywność agonistyczną" rozumie się, że substancja działa jako agonista. Agonista łączy się z receptorem na komórce i inicjuje reakcję lub aktywność, która jest podobna lub taka sama jak inicjowana przez naturalny ligand receptora. Na przykład, agonista CD40 indukuje którąkolwiek lub wszystkie, ale bez ograniczeń, następujące odpowiedzi: proliferację i/lub różnicowanie komórek; regulację zwiększającą międzykomórkową adhezję poprzez takie cząsteczki jak ICAM-1, selektyna E, VCAM, i podobne; sekrecję prozapalnych cytokin, takich jak VEGF, IL-1, IL-6, IL-8, IL- 12, TNF, i podobnych; transdukcję sygnału przez receptor CD40 takimi szlakami jak TRAF (np., TRAF-1, TRAF2, TRAF3), kinaz MAP, takich jak NIK (kinaza indukująca NF-κB), kinaz I-kappa B (IKK α/β), czynnika transkrypcyjnego NF-κB, Ras oraz szlakiem MEK/ERK, szlakiem PI3K/AKT, szlakiem P38 MAPK, i podobnymi; transdukcję sygnału anty-apoptotycznego przez

22 21 takie cząsteczki jak XIAP, Mcl-1, Bcl-x, i podobne; wytwarzanie komórek pamięci B i/lub T; wytwarzanie przeciwciał przez komórki B; przełączanie izotypu komórek B, regulacja zwiększająca ekspresję na powierzchni komórki MHC klasy II oraz CD80/86, i podobnych. [0025] Przez "aktywność antagonistyczną" rozumie się, że substancja działa jako antagonista. Na przykład, antagonista CD40 zapobiega lub zmniejsza indukcję którejkolwiek z odpowiedzi indukowanych przez wiązanie receptora CD40 z agonistycznym ligandem, w szczególności CD40L. Antagonista może zmniejszać indukcję jednej lub więcej odpowiedzi na wiązanie agonisty o 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, korzystnie 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, korzystniej 70%, 80%, 85%, i najkorzystniej o 90%, 95%, 99%, lub 100%. Metody pomiaru specyficzności wiązania liganda CD40 i aktywności antagonistycznej czynnika terapeutycznego anty-cd40, na przykład, przeciwciała skierowanego przeciw CD40, są znane specjalistom w tej dziedzinie i obejmują, ale nie ograniczają się do standardowych oznaczeń wiązania kompetytywnego, oznaczeń do monitorowania sekrecji immunoglobulin przez komórki B, oznaczeń proliferacji komórek B, oznaczeń proliferacji komórek B według Banchereau, oznaczeń komórek T pomocniczych pod względem wytwarzania przeciwciał, oznaczeń ko-stymulacji proliferacji komórek B, oraz oznaczeń regulacji zwiększającej markerów aktywacji komórek B. Patrz, na przykład, takie oznaczenia ujawnione w światowym opisie patentowym numer WO 00/75348 i opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer Patrz również, międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer PCT/US2004/ (numer akt pełnomocnika PP (035784/282916)),

23 22 zatytułowane również "Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use," złożone 4 listopada 2004, i opublikowane jako światowy opis patentowy numer WO 2005/ [0026] Przez "znaczącą" aktywność agonistyczną rozumie się aktywność agonistyczną o co najmniej 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, lub 100% większą aniżeli aktywność agonistyczną indukowaną przez substancję obojętną lub kontrolę negatywną, jak mierzono w oznaczaniu odpowiedzi komórek B. Korzystnie, "znacząca" aktywność agonistyczna jest aktywnością agonistyczną, która jest co najmniej 2-krotnie większa lub 3-krotnie większa niż aktywność agonistyczna indukowana przez substancję obojętną lub kontrolę negatywną, jak mierzono w oznaczaniu odpowiedzi komórek B. A zatem, na przykład, jeśli będącą przedmiotem zainteresowania odpowiedzią komórek B jest proliferacja komórek B, "znaczącą" aktywnością agonistyczną byłaby indukcja poziomu proliferacji komórek B, która jest co najmniej 2-krotnie większa lub co najmniej 3-krotnie większa, niż poziom proliferacji komórek B indukowany przez substancję obojętną lub kontrolę negatywną. W jednym przykładzie, niespecyficzna immunoglobulina, na przykład IgG1, która nie wiąże się z CD40 służy jako kontrola negatywna. Substancja "wolna od znaczącej aktywności agonistycznej" może wykazywać aktywność agonistyczną nie więcej niż około 25% większą, niż aktywność agonistyczna indukowana przez substancję obojętną lub kontrolę negatywną, korzystnie nie więcej niż około 20% większą, 15% większą, 10% większą, 5% większą, 1% większą, 0,5% większą, lub nawet nie więcej niż około 0,1 % większą, niż aktywność agonistyczna indukowana przez substancję obojętną lub kontrolę negatywną,

24 23 jak mierzono w oznaczeniach biologicznych, takich jak oznaczenie odpowiedzi komórek B. [0027] W niektórych rozwiązaniach według wynalazku, czynnik terapeutyczny anty-cd40 jest antagonistą przeciwciała skierowanego przeciw CD40. Takie przeciwciała są wolne od znaczącej aktywności agonistycznej, jak opisano powyżej, kiedy wiążą się z antygenem CD40 na komórce ludzkiej. W jednym rozwiązaniu wynalazku, antagonista przeciwciała skierowanego przeciw CD40 jest wolny od znaczącej aktywności agonistycznej w jednej odpowiedzi komórkowej. W kolejnym rozwiązaniu według wynalazku, antagonista przeciwciała skierowanego przeciw CD40 jest wolny od znaczącej aktywności agonistycznej w oznaczeniach więcej niż jednej odpowiedzi komórkowej (np., proliferacji i różnicowaniu, lub proliferacji, różnicowaniu i, dla komórek B, wytwarzaniu przeciwciał). W niektórych przykładach według wynalazku, będącym przedmiotem zainteresowania czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 jest pełne ludzkie przeciwciało monoklonalne CHIR lub CHIR-5.9, bądź jego fragment wiążący antygen, jak opisano w tym opisie poniżej. [0028] Do określania czy czynnik terapeutyczny anty-cd40 działa jako antagonista jednej lub więcej odpowiedzi komórek B, można stosować dowolne oznaczenia znane w nauce. W niektórych przykładach, czynnikiem terapeutycznym jest przeciwciało skierowane przeciw CD40, które działa jako antagonista co najmniej jednej odpowiedzi komórek B wybranej z grupy składającej się z proliferacji komórek B, różnicowania komórek B, wytwarzania przeciwciał, adhezji międzykomórkowej, tworzenia komórek pamięci B, przełączania izotypu, regulacji zwiększającej ekspresję na powierzchni

25 24 komórki MHC klasy II i CD80/86, oraz sekrecja cytokin prozapalnych, takich jak VEGF, IL-8, IL-12, i TNF. Przedmiotem szczególnego zainteresowania są antagonistyczne przeciwciała skierowane przeciw CD40, które są wolne od znaczącej aktywności agonistycznej w odniesieniu do proliferacji komórek B, kiedy wiążą się z ludzkim antygenem CD40 na powierzchni ludzkiej komórki B. [0029] W jednym takim przykładzie, przeciwciało skierowane przeciw CD40 jest antagonistą proliferacji komórek B, jak mierzono w oznaczeniu proliferacji komórek B, tak jak opisano w Przykładzie 4 poniżej w niniejszym opisie, i antagonista przeciwciała skierowanego przeciw CD40 stymuluje proliferację komórek B na poziomie, który jest nie więcej niż 25% większy niż proliferacja komórek B indukowana przez substancję obojętną lub kontrolę negatywną, korzystnie nie więcej niż około 20% większy, 15% większy, 10% większy, 5% większy, 1% większy, 0,5% większy, lub nawet nie więcej niż około 0,1 % większy, niż proliferacja komórek B indukowana przez substancję obojętną lub kontrolę negatywną. [0030] W innym przykładzie, przeciwciało skierowane przeciw CD40 jest antagonistą proliferacji komórek B, która jest indukowana przez inne przeciwciało skierowane przeciw CD40, na przykład, przeciwciało S2C6 skierowane przeciw CD40, jak mierzono przez oznaczenie proliferacji komórek B, tak jak opisano w Przykładzie 4 poniżej w niniejszym opisie, i poziom proliferacji komórek B stymulowanej przez inne przeciwciało skierowane przeciw CD40 w obecności antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40 jest nie większy niż 25% niż proliferacji komórek B indukowanej przez inne przeciwciało skierowane przeciw CD40 w nieobecności

26 25 antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40 (tj., co najmniej 75% hamowanie), korzystnie nie więcej niż około 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, lub nawet nie więcej niż około 0,1 % proliferacji komórek B indukowanej przez inne przeciwciało skierowane przeciw CD40 w nieobecności antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40. [0031] W jeszcze innym przykładzie, przeciwciało skierowane przeciw CD40 jest antagonistą proliferacji komórek B, która jest indukowana przez komórki linii EL4B5,jak mierzono w oznaczeniu aktywacji komórek B, opisanym w Przykładzie 4 poniżej w niniejszym opisie, i poziom proliferacji komórek B stymulowanej przez linię komórkową EL4B5 w obecności antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40 jest nie większy niż 25% niż proliferacji komórek B indukowanej przez tę linię komórkową w nieobecności antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40 (tj., co najmniej 75% hamowanie), korzystnie nie więcej niż około 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, lub nawet nie więcej niż około 0,1 % proliferacji komórek B indukowanej przez tę linię komórkową w nieobecności antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40. [0032] W jeszcze innych przykładach, przeciwciało skierowane przeciw CD40 jest antagonistą indukowanego przez ludzkie komórki T wytwarzania przeciwciał przez komórki B, jak mierzono przez oznaczenie ludzkich komórek pomocniczych T pod względem wytwarzania przeciwciał przez komórki B, opisanego w Przykładzie 4 poniżej w niniejszym opisie. W tym sposobie, poziom wytwarzania przeciwciała IgG, wytwarzania przeciwciała IgM lub wytwarzania obydwu przeciwciał IgG i IgM przez komórki B stymulowane przez komórki T w obecności

27 26 antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40 jest nie większy niż około 50% wytwarzania odpowiadającego przeciwciała przez komórki B stymulowane przez komórki T w nieobecności antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40 (tj., co najmniej 75% hamowanie), korzystnie nie więcej niż około 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, lub nawet nie więcej niż około 0,1 % wytwarzania odpowiadającego przeciwciała przez komórki B stymulowane przez komórki T w nieobecności antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40. [0033] Przez "ligand CD40" rozumie się dowolny peptyd, polipeptyd, lub białko, które wiążą się z i aktywują jeden lub więcej szlaków sygnałowych CD40. A zatem, "ligandy CD40" obejmują, ale nie są ograniczone do, pełnej długości białka ligandu CD40 oraz jego wariantów i fragmentów, które zachowują odpowiednią aktywność, aby spełniać funkcje wiązania z i stymulowania przekazywania sygnałów przez CD40 na komórkach, w których zachodzi ekspresja CD40. Modyfikacje natywnego liganda CD40, na przykład, ludzkiego liganda CD40 (CD40L; znanego również jako CD154), obejmują, ale nie ograniczają się do substytucji, delecji, skracania, wydłużania, białek fuzyjnych, fragmentów, peptydomimetyków, i podobnych. W niektórych rozwiązaniach według wynalazku, oznaczenie prognostyczne ex vivo obejmuje stosowanie rozpuszczalnego CD40L, na przykład, rozpuszczalnego, rekombinowanego ludzkiego CD40L (Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire, UK) do stymulacji przekazywania sygnałów przez CD40 na komórkach próbki biologicznej, w których zachodzi ekspresja CD40. [0034] Przez "przekazywanie sygnału przez CD40 za

28 27 pośrednictwem CD40L" rozumie się dowolne aktywności biologiczne, które wynikają z wzajemnego oddziaływania receptora powierzchniowego komórki CD40 z ligandem CD40. Przykładami przekazywanych sygnałów CD40 są sygnały, które prowadzą do proliferacji i przeżywania komórek, w których zachodzi ekspresja CD40, oraz stymulacja jednego lub więcej szlaków sygnałowych CD40 w obrębie komórek, w których zachodzi ekspresja CD40. "Szlak sygnałowy" lub "szlak przetwarzania sygnałów CD40 w zamierzeniu oznacza co najmniej jedną reakcję biochemiczną, lub grupę reakcji biochemicznych, których wynikiem jest wzajemne oddziaływanie receptora CD40 z ligandem CD40, na przykład, CD40L, i które powodują powstanie sygnału, który jest przeniesiony przez szlak sygnałowy, prowadzi do aktywacji jednej lub więcej położonych za nim cząsteczek w kaskadzie przekazywania sygnałów. Szlaki przekazywania sygnałów obejmują liczne cząsteczki przetwarzania sygnałów, które prowadzą do transmisji sygnału od receptora powierzchniowego komórki CD40, przez błonę cytoplazmatyczną komórki i przez jedną lub więcej w seriach cząsteczek przetwarzania sygnału, przez cytoplazmę komórki i, w niektórych przypadkach, do jądra komórkowego. Przedmiotem szczególnego zainteresowania według niniejszego wynalazku są szlaki przetwarzania sygnałów CD40, obejmujące szlak sygnałowy AKT, który prowadzi do aktywacjiakt i ostatecznej aktywacji NF-KB przez szlak sygnałowy NF-κB; i szlak sygnałowy kinazy aktywowanej mitogenem (MAPK), obejmujący szlak sygnałowy MEK/ERK i szlak sygnałowy MEK/p38, które prowadzą do aktywacji, odpowiednio, ERK i p38. Równowaga pomiędzy aktywacją i blokowaniem tych szlaków sygnałowych sprzyja albo przeżyciu komórek albo

29 28 apoptozie, jak opisano poniżej w tym opisie. [0035] Metody według niniejszego wynalazku dotyczą oznaczeń prognostycznych ex vivo, a w oznaczeniach prognostycznych wykorzystujących przeciwciała, wykorzystuje się je albo w etapie wykrywania, albo jako kandydatów na czynniki terapeutyczne anty-cd40, które testuje się w tych oznaczeniach prognostycznych ex vivo. Poniższe terminy i definicje stosuje się do takich przeciwciał. [0036] "Przeciwciała" i "immunoglobuliny" (Igs) są glikoproteinami posiadającymi taką samą charakterystykę strukturalną. Terminy te używa się zamiennie. W niektórych przypadkach może być znana specyficzność antygenowa immunoglobulin. [0037] Termin "przeciwciało" stosuje się w szerszym sensie i obejmuje on w pełni złożone przeciwciała, fragmenty przeciwciał, które wiążą się z antygenem (np., Fab, F(ab ) 2, Fv, przeciwciała jednołańcuchowe, diaciała, chimery przeciwciał, przeciwciała hybrydowe, przeciwciała bispecyficzne, przeciwciała humanizowane, i podobne), oraz rekombinowane peptydy zawierające powyższe. [0038] Terminy "przeciwciało monoklonalne" i "mab", jak stosuje się w tym opisie, dotyczy przeciwciała otrzymanego z zasadniczo homogennej populacji przeciwciał, tj., indywidualne przeciwciała w populacji są identyczne, za wyjątkiem możliwych naturalnie występujących mutacji, które mogą występować w niewielkiej ilości. [0039] "Natywne przeciwciała" i "natywne immunoglobuliny" są zazwyczaj heterotetramerycznymi glikoproteinami o masie około daltonów, składającymi się z dwóch identycznych lekkich łańcuchów (L) i dwóch identycznych ciężkich łańcuchów

30 29 (H). Każdy łańcuch lekki jest połączony z łańcuchem ciężkim przez jedno kowalencyjne wiązanie disiarczkowe, przy czym liczba wiązań disiarczkowych różni się wśród łańcuchów ciężkich różnych izotypów immunoglobulin. Każdy ciężki i lekki łańcuch jest również regularnie oddzielony międzyłańcuchowymi mostkami disiarczkowymi. Każdy łańcuch ciężki posiada przy jednym końcu domenę zmienną (V H ), po której następuje kilka domen stałych. Każdy łańcuch lekki posiada domenę zmienną przy jednym końcu (V L ) i domenę stałą przy drugim końcu; domena stała łańcucha lekkiego jest połączona z pierwszą domeną stałą łańcucha ciężkiego, a domena zmienna łańcucha lekkiego jest połączona z domeną zmienną łańcucha ciężkiego. Uważa się, że określone reszty aminokwasowe tworzą przejście pomiędzy domenami zmiennymi łańcucha lekkiego i ciężkiego. [0040] Termin "zmienny" odnosi się do faktu, że pewne części zmiennych domen różnią się w znacznym stopniu między przeciwciałami pod względem sekwencji. Regiony zmienne nadają specyficzność wiązania antygenu. Jednakże, zmienność nie jest równomiernie rozłożona w obrębie domen zmiennych przeciwciał. Koncentruje się ona w trzech segmentach zwanych regionami determinującymi komplementarność (CDR) lub regionach hiperzmiennych, zarówno w domenach zmiennych łańcucha lekkiego, jak i łańcucha ciężkiego. Bardziej konserwatywne części domen zmiennych nazywa się regionami zrębu (FR). Każda domena zmienna natywnego łańcucha ciężkiego i lekkiego zawiera cztery regiony FR, głównie przyjmujące konfigurację β pofałdowanej kartki, połączone przez trzy CDR, które tworzą pętle łączące, i w niektórych przypadkach tworzące część, struktury β pofałdowanej kartki. CDR w każdym łańcuchu są

31 30 utrzymywane w bliskim sąsiedztwie przez regiony FR i, z CDR z innego łańcucha, biorąc udział w tworzeniu miejsca wiązania antygenu przeciwciała (patrz, Kabat i in. (1991) NIH Publ. nr , tom I, strony ). Domeny stałe nie są bezpośrednio zaangażowane w wiązaniu przeciwciała z antygenem, ale pełnią różne funkcje efektorowe, takie jak wiązanie receptora Fc, udział przeciwciała w toksyczności komórkowej zależnej od przeciwciała, inicjacja cytotoksyczności zależnej od dopełniacza, oraz degranulacji mastocytów. [0041] Termin "region hiperzmienny" jeśli stosuje się w tym opisie, odnosi się do reszt aminokwasowych przeciwciała, które są odpowiedzialne za wiązanie antygenu. Region hiperzmienny zawiera reszty aminokwasowe od "regionu determinującego komplementarność" lub "CDR" (tj., reszty (L1), (L2), oraz (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego i (H1), (H2), oraz (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego; Kabat i in. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5 Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD) i/lub te reszty z "hiperzmiennej pętli" (tj., reszty (L1), (L2), i (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego oraz (H1), (H2), i (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego; Clothia i Lesk, (1987) J. Mol. Biol., 196: ). Reszty "zrębu" lub "FR" są resztami domeny zmiennej innymi niż reszty regionu hiperzmiennego, jak tu się uważa. [0042] "Fragmenty przeciwciała" zawierają część nienaruszonego przeciwciała, korzystnie region wiązania antygenu lub region zmienny nienaruszonego przeciwciała.

32 31 Przykłady fragmentów przeciwciała obejmują fragmenty Fab, Fab, F(ab )2, i Fv; diaciała; przeciwciała liniowe (Zapata i in. (1995) Protein Eng. 10: ); cząsteczki przeciwciał jednołańcuchowych; oraz przeciwciała multispecyficzne utworzone z fragmentów przeciwciała. Trawienie papainą przeciwciał powoduje powstanie dwóch identycznych fragmentów wiążących antygen, nazywanych fragmentami "Fab", każdy z pojedynczym miejscem wiążącym antygen, i pozostałego fragmentu "Fc", którego nazwa odzwierciedla jego zdolność do łatwej krystalizacji. Trawienie pepsyną daje fragment F(ab )2, który posiada dwa miejsca wiązania antygenu i nadal jest zdolny do sieciowania antygenu. [0043] "Fv" jest minimalnym fragmentem przeciwciała, który zawiera kompletne miejsce rozpoznawania i wiązania antygenu. Region ten składa się z dimeru domeny zmiennej jednego łańcucha ciężkiego i jednego łańcucha lekkiego w ścisłym, niekowalencyjnym połączeniu. W tej konfiguracji jest tak, że trzy CDR każdej domeny zmiennej oddziałują ze sobą definiując miejsce wiązania antygenu na powierzchni dimeru V H -V L. Razem, sześć CDR nadaje przeciwciału specyficzność wiązania antygenu. Jednakże, nawet pojedyncza domena zmienna (lub połowa Fv zawierająca jedynie trzy CDR specyficzne dla antygenu) posiada zdolność rozpoznawania i wiązania antygenu, chociaż z mniejszym powinowactwem niż w przypadku całego miejsca wiązania. [0044] Fragment Fab zawiera również domenę stałą łańcucha lekkiego i pierwszą domenę stałą (C H 1) łańcucha ciężkiego. Fragmenty Fab różnią się od fragmentów Fab przez dodanie kilku reszt przy karboksylowym końcu domeny C H 1 łańcucha

33 32 ciężkiego, obejmujących jedną lub więcej cystein z regionu zawiasowego przeciwciała. Fab -SH jest oznaczeniem w niniejszym opisie dla Fab, w którym reszta(y) cysteiny domen stałych niesie wolną grupę tiolową. Fragmenty Fab wytwarzane są przez redukcję mostku disiarczkowego ciężkiego łańcucha fragmentów F(ab )2. Znane są również inne chemiczne wiązania fragmentów przeciwciał. [0045] "Łańcuchy lekkie" przeciwciał (immunoglobulin) z dowolnego gatunku kręgowca można przypisać do jednego z dwóch wyraźnie odrębnych typów, zwanych kappa (κ) i lambda (λ), w oparciu o sekwencje aminokwasowe ich domen stałych. [0046] W zależności od sekwencji aminokwasowej domeny stałej ich łańcuchów ciężkich, immunoglobuliny można przypisać do różnych klas. Istnieje pięć głównych klas ludzkich immunoglobulin: IgA, IgD, IgE, IgG, oraz IgM, a kilka z nich można dalej dzielić na subklasy (izotypy), np., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Domeny stałe łańcucha ciężkiego, które odpowiadają różnym klasom immunoglobulin nazywa się, odpowiednio, alfa, delta, epsilon, gamma oraz mu. Struktury podjednostek i trójwymiarowe konfiguracje różnych klas immunoglobulin są dobrze znane. Różne izotypy posiadają różne funkcje efektorowe. Na przykład, ludzkie izotypy IgG1 i IgG3 wykazują aktywność ADCC (zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej). [0047] Słowo "znacznik", jeśli stosuje się go w niniejszym opisie, odnosi się do wykrywalnego związku lub kompozycji, która jest sprzężona bezpośrednio lub pośrednio z przeciwciałem, w wyniku czego powstaje "wyznakowane" przeciwciało. Znacznik może być wykrywalny sam z siebie (np., znaczniki radioizotopowe lub znaczniki fluorescencyjne) lub,

34 33 w przypadku znacznika enzymatycznego, może katalizować chemiczną przemianę substratu lub kompozycji, który jest wykrywalny. [0048] "Komórka gospodarza," jak stosuje się w niniejszym opisie, dotyczy mikroorganizmu lub komórki eukariotycznej lub linii komórkowej hodowanej jako jednostka jednokomórkowa, którą można lub stosuje się jako biorcę rekombinowanego wektora lub innych polinukleotydów transferowych, i obejmuje komórki potomne oryginalnej komórki, którą stransfekowano. Zrozumiałe jest, że komórki potomne pojedynczej komórki niekoniecznie jest całkowicie identyczne pod względem morfologicznym lub genomowym czy całkowitego DNA jak oryginalna komórka macierzysta, ze względu na naturalną, przypadkową lub celową mutację. [0049] "Ludzkimi komórkami efektorowymi" są leukocyty, w których zachodzi ekspresja jednego lub więcej FcRs i które pełnią funkcje efektorowe. Korzystnie, w komórkach zachodzi ekspresja co najmniej FcγRIII i pełnią funkcję efektorową zależnej od antygenu cytotoksyczności komórkowej (ADCC). Przykłady ludzkich leukocytów, które pośredniczą w ADCC obejmują komórki monojądrzaste krwi obwodowej (PBMC), naturalne komórki cytotoksyczne (komórki NK), monocyty, makrofagi, granulocyty kwasochłonne, oraz granulocyty obojętnochłonne, przy czym preferowane są komórki PBMC i NK. Przeciwciałami, które wykazują aktywność ADCC są zazwyczaj izotypy IgG1 lub IgG3. Należy zauważyć, że oprócz izolowania przeciwciał IgG1 i IgG3, takie przeciwciała pośredniczące w ADCC można uzyskać przez modyfikacje technikami inżynierii genetycznej regionu zmiennego z przeciwciała nie-adcc lub fragmentu regionu zmiennego do regionu stałego izotypu IgG1

35 34 lub IgG3. [0050] Terminy "receptor Fc" lub "FcR" stosuje się do opisania receptora, który wiąże się z regionem Fc przeciwciała. Korzystnym FcR jest natywna sekwencja ludzkiego FcR. Ponadto, korzystnym FcR jest receptor, który wiąże się z przeciwciałem IgG (receptor gamma) i obejmuje receptory subklas FcγRI, FcγRII, i FcγRIII, obejmując warianty alleliczne i formy alternatywnie cięte i składane tych receptorów. Receptory FcγRII obejmują FcγRIIA ("receptor aktywujący") oraz FcγRIIB ("receptor hamujący"), które posiadają podobne sekwencje aminokwasowe, różniące się głównie ich cytoplazmatycznymi domenami. Receptor aktywujący FcγRIIA zawiera motyw aktywujący oparty na immunoreceptorze tyrozyny (ITAM) w swojej domenie cytoplazmatycznej. Receptor hamujący FcγRIIB zawiera motyw hamujący oparty na immunoreceptorze tyrozyny (ITIM) w swojej domenie cytoplazmatycznej (patrz Daeron (1997) Annu. Rev. Immunol. 15: ). Przegląd FcRs znajduje się w Ravetch i Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9: ; Capel i in. (1994) Immunomethods 4: 25-34; oraz de Haas i in. (1995) J. Lab. Clin. Med. 126: Inne FcR, obejmujące te, które będą zidentyfikowane w przyszłości, są zawarte w stosowanym w niniejszym opisie terminie "FcR". Termin obejmuje również receptor noworodkowy, FcRn, który jest odpowiedzialny za transfer matczynych IgG do płodu (Guyer i in. (1976) J. Immunol. 117: 587 oraz Kim i in. (1994) J. Immunol. 24: 249). [0051] Istnieją liczne sposoby wytwarzania ludzkich przeciwciał. Na przykład, komórki sekrecyjne można unieśmiertelniać poprzez infekcję wirusem Epsteina-Barr (EBV). Jednakże, komórki zainfekowane EBV są trudne do

36 35 klonowania i zwykle wytwarzają jedynie stosunkowo niskie ilości immunoglobulin (James i Bell (1987) J. Immunol. Methods 100: 5-40). W przyszłości, unieśmiertelnienie ludzkich komórek B może ewentualnie być osiągnięte przez wprowadzenie zdefiniowanej kombinacji transformujących genów. Na taką możliwość wskazuje ostatnie wykazanie, że ekspresja katalitycznej podjednostki telomerazy wraz z dużą onkoproteiną SV40 i onkogennym allelem H-ras powoduje konwersję nowotworową normalnych ludzkich komórek nabłonkowych i fibroblastów (Hahn i in. (1999) Nature 400: ). Obecnie jest możliwe tworzenie zwierząt transgenicznych (np. myszy), które są zdolne, po immunizacji, do wytwarzania repertuaru przeciwciał ludzkich, przy braku produkcji endogennych immunoglobulin (Jakobovits i in. (1993) Nature 362: ; Lonberg i Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13: 65-93; Fishwild i in. (1996) Nat. Biotechnol. 14: ; Mendez i in. (1997) Nat. Genet. 15: ; Green (1999) J. Immunol. Methods 231: 11-23; Tomizuka i in. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: ; przegląd w Little i in. (2000) Immunol. Today 21: ). Na przykład, opisano, że homozygotyczna delecja genu regionu łączącego (JH) łańcucha ciężkiego u mutantów chimerycznych i linii zarodkowej myszy powoduje całkowite zahamowanie wytwarzania przeciwciał endogennych (Jakobovits i in. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: ). Przeniesienie układu genów immunoglobulin ludzkiej linii zarodkowej do takich zmutowanych linii zarodkowych myszy powoduje wytwarzanie ludzkich przeciwciał po prowokacji antygenem (Jakobovits i in. (1993) Nature 362: ). Mendez i in. (1997) (Nature Genetics 15: ) utworzyli linię transgenicznych myszy,

37 36 które po prowokacji antygenem, wytwarzały całkowite ludzkie przeciwciała o wysokim powinowactwie. Osiągnięto to przez integrację loci o wielkości miliona par zasad ludzkiego łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego linii zarodkowych do myszy z delecją endogennego segmentu J H, jak opisano powyżej. Myszy te (technologia XenoMouse II (Abgenix; Fremont, California)) niosą kb locus ludzkiego łańcucha ciężkiego zawierającego w przybliżeniu 66 genów VH, Kompletne regiony D H i J H, oraz trzy różne stałe regiony, i niosą również 800 kb ludzkiego locus κ zawierającego 32 geny Vκ, segmenty Jκ oraz geny Cκ. Przeciwciała wytwarzane w tych myszach były zbliżone do obserwowanych u ludzi pod każdym względem, w tym rearanżacji genów, składania i repertuaru. Przeciwciała ludzkie ulegają korzystnie ekspresji w ciągu przeciwciał endogennych z powodu delecji w segmencie endogennym, który zapobiega rearanżacji genów w locus mysim. Takie myszy można immunizować antygenem będącym przedmiotem szczególnego zainteresowania. [0052] Surowice od takich immunizowanych zwierząt można przeszukiwać pod kątem reaktywności przeciwciał przeciwko antygenowi wyjściowemu. Limfocyty można izolować z węzłów chłonnych lub komórek śledziony i poddawać dalszej selekcji pod kątem komórek B przez selekcję pod względem komórek CD138-negatywnych i CD19-pozytywnych. W jednym z aspektów takie hodowle komórek B (BCC) można poddawać fuzji z komórkami szpiczaka z wytworzeniem hybrydomy, jak opisano szczegółowo powyżej. [0053] W innym aspekcie takie hodowle komórek B można poddawać dalszym badaniom przesiewowym korzystnie pod kątem reaktywności przeciw antygenowi wyjściowemu. Takie badania

38 37 przesiewowe obejmują immunosorbcyjne oznaczenie enzymatyczne (ELISA) z białkiem docelowym/antygenem, oznaczenie kompetytywne ze znanymi przeciwciałami, które wiążą antygen będący przedmiotem zainteresowania, oraz wiązanie in vitro z przejściowo stransfekowanymi CHO lub innymi komórkami, w których zachodzi ekspresja docelowego antygenu. Biomarkery, markery cytokinowe, czynniki związane z CD40 i kliniczne użyteczne markery prognostyczne do stosowania w oznaczeniach prognostycznych według wynalazku [0054] W niektórych rozwiązaniach, metody według niniejszego wynalazku obejmują zastosowanie ex vivo oznaczeń prognostycznych w celu monitorowania zmian w poziomie ekspresji jednego lub kilku biomarkerów przeżywalności komórek, proliferacji, apoptozy, szlaków sygnałowych CD40. Oznaczenia prognostyczne ex vivo można stosować same lub w kombinacji z innymi oznaczeniami prognostycznymi, na przykład, oznaczeniami prognostycznymi, które identyfikują osobników będących kandydatami dotkniętych chorobą zapalną lub chorobą autoimmunologiczną, którzy mogliby odpowiadać na leczenie z zastosowaniem czynników terapeutycznych anty-cd40, opierając się na ekspresji innych czynników związanych z CD40 i/lub opierając się na obecności lub nieobecności, bądź podwyższonej lub obniżonej ekspresji, innych klinicznie użytecznych markerów prognostycznych, które wskazują na słabą prognozę interwencji terapeutycznej za zastosowaniem standardowych czynników terapeutycznych mających innych sposób działania, niż czynniki terapeutyczne anty-cd40. W zamierzeniu, przez "odpowiadającego na leczenie z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40" rozumie się osobnika będącego kandydatem (tj., osobnika dotkniętego

39 38 chorobą zapalną lub chorobą autoimmunologiczną, jak opisano powyżej w niniejszym opisie), który jeśli będzie leczony z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40, będzie wykazywać pozytywną odpowiedź terapeutyczną w odniesieniu do choroby autoimmunologicznej i/lub choroby zapalnej, dla których poszukiwane jest leczenie. Biomarkery do stosowania w oznaczeniach prognostycznych ex vivo. [0055] Szlaki sygnałowe charakteryzują rodziny białek, które ułatwiają przetwarzanie sygnału. Termin "rodzina", w odniesieniu do białka i cząsteczek kwasów nukleinowych, w zamierzeniu oznacza dwa lub więcej białek lub cząsteczek kwasów nukleinowych posiadających wspólną domenę strukturalną lub motyw i wykazujących odpowiednią homologię sekwencji aminokwasowej lub nukleotydowej, jak zdefiniowano w niniejszym opisie. Członkowie takich rodzin mogą występować naturalnie lub nienaturalnie i mogą pochodzić albo z tego samego albo z różnych gatunków. Na przykład, rodzina może zawierać pierwsze białko pochodzenia ludzkiego, jak również inne różne białka pochodzenia ludzkiego lub, alternatywnie, może zawierać homologi nie pochodzące od człowieka. Członkowie rodziny mogą mieć również wspólne cechy funkcjonalne. [0056] AKT (czasami określana jako PKB, dla kinazy białkowej B), rodzina kinaz serynowo/treoninowych, jest integralnie zaangażowana we wzrost komórek, przeżywanie i metabolizm. PKB pierwotnie zidentyfikowano jako onkogen retrowirusowy. Obecnie, scharakteryzowano trzy warianty rodziny AKT, AKT-1 zawierająca 480 reszt, AKT-2 zawierająca 481 oraz AKT-3 zawierająca 479. Dla celów niniejszego wynalazku, członków rodziny białek AKT będzie określać ogólnie jako białka AKT,

40 39 chociaż uznaje się, że metody stosuje się do wszystkich trzech form AKT, tj., AKT-1, AKT-2, i AKT-3, oraz ich wariantów. [0057] AKT jest regulowaną czynnikiem wzrostu kinazą serynowo/treoninową, która zawiera domenę PH (homologiczną do plekstryny). Ta domena PH oddziałuje z produktami lipidowymi kinazy 3-fosfatydyloinozytolu (PI3K), fosfatydyloinozytolo- 3,4-bifosforanem i fosfatydyloinozytolo-3,4,5-trifosforanem, czego wynikiem jest translokacja AKT z cytozolu komórki do jej błony plazmatycznej. Ta translokacja jest konieczna dla prezentacji AKT do aktywacji kinazy powyżej, PDK1 (zależnej od fosfoinozytydu kinazy 1). Znanych jest szereg czynników przeżywalności i wzrostowych, takich jak PDGF, EGF, insulina, trombina, oraz NGF do aktywacji translokacji AKT. Zaktywowana (tj. fosforylowana) forma białka AKT/PKB fosforyluje liczne substraty, obejmujące GSK-3 (kinazę syntazy glikogenu 3), enos (śródbłonkową syntazę tlenku azotu), FKHR 1 (członka rodziny czynników transkrypcyjnych forkhead 1), Bad (członka rodziny pro-apoptotycznej Bcl-2), oraz p21 CIP (inhibitor progresji cyklu komórkowego). Te działania mogą dawać różne efekty biologiczne, takie jak supresja apoptozy, kontrola metabolizmu glukozy, proliferacja komórek, transkrypcja, translacja, migracja komórek oraz angiogeneza. Aktywowana AKT (tj., p-akt) sprzyja przeżywalności komórek poprzez kilka odrębnych szlaków, które obejmują fosforylację dalszych cząsteczek efektorowych. Po pierwsze, p-akt hamuje apoptozę przez fosforylację składnika Bad kompleksu Bcl-xl. Fosforylowany Bad wiąże się z powodującym dysocjację kompleksu Bad/Bcl-xl i w ten sposób uwalnia Bcl-xl dla umożliwienia przeżycia komórek. Po drugie, NF-κB, który jest

41 40 utrzymywany w postaci nieaktywnej w cytoplazmie przez związanie z białkami hamującymi rodziny kappa-b (Iκ-B), może być aktywowany przez oddziaływanie z kinazą indukującą NF-κB (NIK) lub może być aktywowany przez szlak sygnałowy AKT. W ten sposób, aktywowana AKT (tj., p-akt) aktywuje cząsteczkę hamującą NF-κB rodziny Iκ-B (na przykład, Iκ-Bα), poprzez pośrednią fosforylację kompleksu wielobiałkowego kinazy Iκ-B (IKK-α/β); aktywacja Iκ-B prowadzi do jej degradacji i uwolnienia wcześniej związanego NF-κB, co prowadzi do aktywacji tego czynnika transkrypcyjnego. Aktywna postać NFκB może następnie przemieszczać się do jądra i regulować ekspresję setek genów przeciwstawiających się apoptozie. Innymi sposobami poprzez które AKT promuje przeżywalność komórek i przeciwstawia się apoptozie jest fosforylacja proteazy kaspazy 9 lub czynników transkrypcyjnych forkhead, takich jak FKHRL1. [0058] Metody według niniejszego wynalazku do identyfikowania pacjentów dotkniętych chorobą zapalną lub chorobą autoimmunologiczną, którzy mogą odnosić korzyść z leczenia z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40, który blokuje lub zakłóca przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, obejmują stosowanie oznaczenia prognostycznego ex vivo do monitorowania efektów czynników terapeutycznych anty-cd40 na przekazywanie sygnałów przez CD40 przez szlaki sygnałowe AKT i NF-κB. W tym sposobie, zapewnia się kontakt testowej próbce biologicznej, pobranej od osobnika będącego kandydatem, z będącym przedmiotem zainteresowania czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 przez czas odpowiedni do umożliwienia modulacji przekazywania sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, jak opisano

42 41 poniżej w niniejszym opisie, i próbkę następnie oznacza się pod względem zmian w poziomie ekspresji co najmniej jednego biomarkera sygnałowego CD40 wybranego z grupy składającej się z fosforylowanej AKT (p-akt), fosforylowanej PI3K (p-pi3k), fosforylowanej PDK1 (p-pdk1), fosforylowanej IKK-α/β(p-IKKα/β), fosforylowanej Iκ-B (p-iκ-b; na przykład, p-iκ-bα), oraz aktywowanego NF-κB. Wykrycie obniżonych poziomów ekspresji tych fosforylowanych biomarkerów w testowej próbce biologicznej, zawierającej stymulowane CD40L komórki, w których zachodzi ekspresja CD40, w odpowiedzi na inkubację z czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 w stosunku do tej, obserwowanej dla kontrolnej próbki biologicznej, wskazuje na regulację zmniejszającą przekazywania sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, a zatem wskazuje na pozytywny wynik leczenia z zastosowaniem tego czynnika terapeutycznego anty- CD40. W niektórych rozwiązaniach, poziom ekspresji danego biomarkera przekazywania sygnałów przez CD40 przez szlaki sygnałowe AKT i NF-κB jest zmniejszony o co najmniej około 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, lub 100% w stosunku do tego wykrywanego w kontrolnej próbce biologicznej. [0059] Wzajemne oddziaływania CD40/CD40L prowadzą również do aktywacji kaskady sygnałowej MAPK, obejmującej szlak sygnałowy MEK/ERK, szlak sygnałowy MEK/p38, oraz szlak sygnałowy MEKK/JNKK/JNK. Wszystkie szlaki sygnałowe MAPK działają przez kolejne zdarzenia fosforylacji do fosforylacji czynników transkrypcyjnych i regulacji ekspresji genów. Mogą one również fosforylować cele cytozolowe dla regulacji zdarzeń wewnątrzkomórkowych. Te kaskady biorą udział w regulacji proliferacji komórkowej, różnicowania, rozwoju,

43 42 cyklu komórkowego oraz transmisji sygnałów onkogennych. Przedmiotem szczególnego zainteresowania są metody aktywacji szlaków sygnałowych MEK/ERK i MEK/p38. [0060] Kinazy MAP (określane również jako regulowane sygnałem zewnątrzkomórkowym kinazy białkowe, lub ERK) są enzymami terminalnymi w kaskadzie trzech kinaz, gdzie każdy enzym fosforyluje i w ten sposób aktywuje następnego członka w tej sekwencji. Każdy moduł MAPK składa się z trzech białek kinaz: kinazy kinazy MAPK (lub MEKK), która aktywuje kinazę MAPK (lub MEK), która z kolei aktywuje enzym MAPK/ERK. MEKK są specyficznymi kinazami białkowymi serynowo/treoninowymi, które fosforylują podwójnie, a tym samym aktywują, jeden lub więcej enzymów MEK na resztach Ser lub Thr (Ser-X-X-X- Ser/Thr) w obrębie rdzenia katalitycznego. MEK są specyficznymi kinazami białkowymi serynowo/treoninowo/tyrozynowymi, które aktywują MAPK przez fosforylację zarówno Thr jak i Tyr w obrębie sekwencji konsensowej TXY MAPK. Ta podwójna foforylacja jest wymagana do aktywacji. ERK1 (p44), ERK2 (p42), p38/hog, oraz JNK/SAPK reprezentują zbliżone, ale odrębne terminalne MAPK w równoległych szlakach. [0061] Metody według wynalazku do identyfikowania pacjentów dotkniętych chorobą zapalną lub chorobą autoimmunologiczną, którzy mogą odnosić korzyść z leczenia z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40, obejmują stosowanie oznaczenia prognostycznego ex vivo do monitorowania efektów czynników terapeutycznych anty-cd40 na przekazywanie sygnałów przez CD40 poprzez szlaki sygnałowe MEK/ERK i MEK/p38. W tym sposobie, zapewnia się kontakt testowej próbce biologicznej, pobranej od osobnika będącego kandydatem, z będącym

44 43 przedmiotem zainteresowania czynnikiem terapeutycznym anty- CD40 przez czas odpowiedni do umożliwienia modulacji przekazywania sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, jak opisano poniżej w niniejszym opisie, i próbkę następnie oznacza się pod względem zmian w poziomie ekspresji co najmniej jednego biomarkera sygnałowego CD40 wybranego z grupy składającej się z fosforylowanej MEK (p-mek), na przykład, p-mek1, p-mek2, p-mek3, oraz p-mek6, fosforylowanej ERK (p-erk), na przykład, p-erk1 lub p-erk2, oraz fosforylowanego p38 (p-p38). Wykrycie obniżonych poziomów ekspresji tych fosforylowanych biomarkerów w testowej próbce biologicznej, zawierającej stymulowane komórki CD40L, w których zachodzi ekspresja CD40, w odpowiedzi na inkubację z czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 w stosunku do tej obserwowanej dla kontrolnej próbki biologicznej wskazuje na regulację zmniejszającą przekazywania sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, a zatem wskazuje na pozytywny wynik leczenia z zastosowaniem tego czynnika terapeutycznego anty- CD40. W niektórych rozwiązaniach, poziom ekspresji danego biomarkera przekazywania sygnałów przez CD40 poprzez szlaki MEK/ERK oraz MEK/p38 jest zmniejszony o co najmniej około 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, lub 100% w stosunku do tego wykrywanego w kontrolnej próbce biologicznej. [0062] Odpowiedź osobnika będącego kandydatem na terapię z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40, który blokuje lub zakłóca przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L można również oceniać przez monitorowanie ex vivo wpływów czynnika terapeutycznego na poziom ekspresji dowolnego z markerów cytokinowych przekazywania sygnałów

45 44 przez CD40 za pośrednictwem CD40L. Połączenie CD40 z jego naturalnym ligandem in vivo prowadzi do pobudzenia licznych cytokin prozapalnych w zależności od typu komórek, w których zachodzi ekspresja CD40. Stymulacja ex vivo CD40L normalnych komórek B prowadzi do pobudzenia wytwarzania szeregu cytokin, obejmujących, ale nie ograniczających się do czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), interleukin (IL)-6, IL-8, IL- 10, czynnika nekrozy nowotworów α (TNF-α), białka chemotaktycznego dla monocytów-1 (MCP-1), oraz makrofagowego białka zapalenia-1β (MIP-1β), podczas gdy stymulacja CD40L monocytów ex vivo prowadzi do pobudzenia wytwarzania VEGF, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α, MCP-1, oraz MIP-1β, jak opisano poniżej w niniejszym opisie. [0063] Zgodnie z metodami przeszukiwania próbce biologicznej pobranej od osobnika będącego kandydatem zapewnia się kontakt z będącym przedmiotem zainteresowania czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 przez czas odpowiedni do umożliwienia modulacji przekazywania sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, jak opisano poniżej w niniejszym opisie, i próbkę następnie oznacza się pod względem zmian w poziomie ekspresji co najmniej jednego biomarkera cytokinowego wybranego z grupy składającej się z VEGF, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α, MCP-1, oraz MIP-1β. Poziom ekspresji cytokin można określać stosując dowolną metodę wykrywania znaną w nauce, jak opisano poniżej w niniejszym opisie. Wykrycie obniżonych poziomów ekspresji tych markerów cytokinowych w testowej próbce biologicznej, zawierającej stymulowane CD40L komórki, w których zachodzi ekspresja CD40, w odpowiedzi na inkubację z czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 w stosunku do tej obserwowanej dla kontrolnej próbki biologicznej, wskazuje na

46 45 regulację zmniejszającą przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, a zatem wskazuje na pozytywny wynik leczenia z zastosowaniem tego czynnika terapeutycznego anty- CD40. W niektórych przykładach, poziom ekspresji danej cytokiny jest obniżony o co najmniej około 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%,70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, lub 100% w stosunku do tego wykrywanego w kontrolnej próbce biologicznej. [0064] Wszystkie szlaki sygnałowe AKT, NF-κB, oraz MAPK uczestniczą w proliferacji i przeżywaniu komórek. W układzie immunologicznym, apoptoza odgrywa ważną rolę w selekcji zestawu limfocytów T, usuwaniu samoreaktywnych limfocytów T oraz B, usuwaniu obwodowych efektorowych komórek T po zakończeniu odpowiedzi immunologicznej, regulacji pamięci immunologicznej, oraz cytotoksyczności komórek docelowych przez komórki CTL i NK. Czynniki terapeutyczne, które blokują sygnał przeżycia CD40 na komórkach, w których zachodzi ekspresja CD40 i promują procesy apoptotyczne komórki mogą być korzystne w leczeniu chorób posiadających składnik autoimmunologiczny i/lub zapalny, który jest związany z przekazywaniem sygnału CD40 za pośrednictwem CD40L. [0065] A zatem, oprócz monitorowania przekazywania sygnałów przez CD40 na komórkach, w których zachodzi ekspresja CD40, metody identyfikowania osobników dotkniętych chorobą zapalną lub chorobą autoimmunologiczną, którzy będą mogli odnosić korzyść z czynników terapeutycznych anty-cd40 obejmują stosowanie ex vivo oznaczeń prognostycznych, które monitorują wpływy czynników terapeutycznych anty-cd40 na ekspresję jednego lub więcej biomarkerów apoptozy, w szczególności komórkowych białek pro-apoptotycznych, obejmujących, ale nie

47 46 ograniczających się do rozszczepionych białek kaspazy i rozszczepionej polimerazy poli ADP-rybozy (PARP). Dodatkowe biomarkery apoptozy, które można oznaczać obejmują, ale nie ograniczają się do zmian w błonie cytoplazmatycznej na powierzchni komórki, na przykład, obecności na powierzchni komórki fosfotydyloseryny (PS), i rozszczepiania lub fragmentacji genomowego DNA. PS normalnie znajduje się wyłącznie po wewnętrznej stronie błony cytoplazmatycznej, ale przemieszcza się do powierzchni zewnętrznej komórki podczas wczesnej fazy apoptotycznej śmierci komórki, podczas której błona komórkowa pozostaje nienaruszona. Obecność powierzchniowej PS i fragmentacji genomowego DNA można wykrywać, na przykład, przez barwienie aneksyną V i barwienie TUNEL, odpowiednio, jak opisano poniżej w niniejszym opisie. Wykrycie podwyższonych poziomów ekspresji jednego lub więcej biomarkerów apoptozy w testowej próbce biologicznej, zawierającej stymulowane CD40L komórki, w których zachodzi ekspresja CD40, w odpowiedzi na inkubację z czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 w stosunku do tej obserwowanej dla kontrolnej próbki biologicznej wskazuje na pozytywny wynik leczenia z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40. W niektórych rozwiązaniach, poziom ekspresji danego biomarkera apoptozy jest większy o co najmniej około 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 200%, 250%, 300%, lub więcej w stosunku do tego wykrywanego w kontrolnej próbce biologicznej. [0066] Alternatywnie, lub w kombinacji z oznaczeniami ex vivo opisanymi powyżej, metody obejmują stosowanie ex vivo oznaczeń prognostycznych, które monitorują wpływ czynników

48 47 terapeutycznych anty-cd40 na ekspresję jednego lub więcej białek, które są biomarkerami proliferacji komórek i/lub przeżywalności komórek, obejmującymi, ale bez ograniczeń, białko antyapoptotyczne, które jest członkiem rodziny Bcl-2, białko hamujące apoptozę IAP oraz czynnik-1 związany z receptorem TNF (TRAF-1). Wykrycie obniżonych poziomów ekspresji tych biomarkerów proliferacji komórki i/lub przeżywalności komórki w testowej próbce biologicznej, zawierającej stymulowane CD40L komórki, w których zachodzi ekspresja CD40, w odpowiedzi na inkubację z czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 w stosunku do tej obserwowanej dla kontrolnej próbki biologicznej wskazuje na pozytywny wynik leczenia z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40. W niektórych rozwiązaniach, poziom ekspresji danego biomarkera proliferacji komórki i/lub przeżywalności komórki jest mniejszy o co najmniej około 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, lub 100% w stosunku do tego wykrywanego w kontrolnej próbce biologicznej. [0067] Członkowie rodziny białek kaspaz są głównymi efektorami apoptozy komórkowej. Kaspazy są proteazami cysteinowymi, które występują w komórce w nieaktywnych proformach lub tak zwanych "zymogenach." Zymogeny są rozszczepiane do form aktywnych enzymów w wyniku indukcji apoptozy albo przez szlak działający za pośrednictwem receptora śmierci albo przez mitochondrialny szlak apoptozy. Patrz, na przykład, Gupta i in. (2003) Intl. J. Oncol. 22: W zależności od szlaku apoptotycznego, różne kaspazy inicjują proces apoptozy, przy czym kaspaza-8 i -10 inicjują szlak receptora śmierci, a kaspaza-9 inicjuje szlak

49 48 mitochondrialny. Aktywny inicjator kaspaz aktywuje następnie (tj., rozszczepia) kaspazy efektorowe, na przykład, kaspazę- 3, -6, i -7, dla indukcji apoptozy. Te kaspazy efektorowe rozszczepiają kluczowe białka komórkowe, które prowadzą do typowych zmian morfologicznych obserwowanych w komórkach, w których zachodzi apoptoza. [0068] A zatem, metody według niniejszego wynalazku do identyfikowania pacjentów dotkniętych chorobą zapalną lub chorobą autoimmunologiczną, którzy mogliby odnieść korzyść z leczenia z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40, obejmują stosowanie ex vivo oznaczeń prognostycznych do monitorowania proteolizy specyficznych białek komórkowych związanych z apoptozą. Na przykład, polimeraza poli(adprybozy) (PARP-1) jest specyficznie rozszczepiana podczas apoptozy. PARP-1 jest białkiem wiążącym DNA, które katalizuje dodawanie łańcucha poli(adp-rybozy) do niektórych białek jądrowych i uważa się, że odgrywa kluczową rolę w naprawianiu uszkodzonego DNA. PARP-1 ulega szybkiej aktywacji podczas stresu komórkowego, takiego jak szok cieplny, promieniowanie jonizujące, ekspozycji na karcynogeny, oraz leczenie czynnikami chemioterapeutycznymi (Scovassi i Poirier (1999) Mol. Cell Biochem. 199: ; Wyllie (1997) Eur. J. Cell Biol. 73: ). Podczas apoptozy, aktywowana (tj., rozszczepiona) kaspaza-3 rozszczepia z kolei PARP-1; faktycznie, rozdział fragmentów proteolitycznych 89 kda i 24 kda przyjmuje się jako cechy apoptozy (Scovassi i Poirier (1999) supra; Wyllie i in. (1997) supra. Opisywane w niniejszym opisie oznaczenia prognostyczne ex vivo monitorują zmiany pod względem poziomu jednego lub więcej rozszczepionych białek kaspaz, na przykład, rozszczepionej

50 49 kaspazy-3, rozszczepionej kaspazy-7, i rozszczepionej kaspazy-9, i ewentualnie, poziomu rozszczepionej PARP-1, powierzchniowej PS, i/lub fragmentacji genomowego DNA, w testowej próbce biologicznej otrzymanej od osobnika będącego kandydatem w odpowiedzi na czynniki terapeutyczne anty-cd40, które modulują przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L i/lub modulują ADCC Podwyższone poziomy biomarkerów apoptotycznych w obrębie próbki biologicznej można wykrywać stosując dowolne metody znane specjalistom w tej dziedzinie, obejmując te opisane poniżej w niniejszym opisie. [0069] Biomarkery przeżywalności i proliferacji komórkowej obejmują, ale nie ograniczają się do białek antyapoptotycznych, które są członkami rodziny białek Bcl-2. Rodzina białek Bcl-2, która obejmuje co najmniej 16 członków, bierze udział w regulacji apoptozy komórkowej. Niektórzy członkowie rodziny są mają właściwości antyapoptotyczne, na przykład, Bcl-2, Bcl-xl, Mcl-1, Bcl-w i Al, a zatem biomarkery przeżycia komórek i inne są pro-apoptotyczne (na przykład, Bid, Bim, Bik, Bmf, Bad, Hrk, BNIP3, Bax, Bak, i Bok), a zatem biomarkerami o aktywności apoptotycznej. Sugeruje się, że rodzina białek Bcl-2 działa poprzez różne mechanizmy, obejmujące tworzenie porów w zewnętrznej błonie mitochondrialnej, przez które cytochrom c (Cyt c) i inne białka międzybłonowe mogą uciekać; oraz heterodimeryzację pomiędzy pro- i antyapoptotycznymi członkami rodziny. [0070] Wpływ czynników terapeutycznych anty-cd40 na przekazywanie sygnałów przez CD40 i modulowanie apoptozy można oceniać stosując ex vivo oznaczenia prognostyczne opisane w niniejszym opisie do monitorowania jednego lub

51 50 więcej biomarkerów przeżycia/apoptozy komórek. Biomarkery przeżycia komórek, które są przedmiotem szczególnego zainteresowania, obejmują, ale bez ograniczeń, białka antyapoptotyczne Bcl-xl i Mcl-1. [0071] Gen bcl-2, który koduje białko błony mitochondrialnej Bcl-2, zidentyfikowano po raz pierwszy w chłoniakach komórek B (Tsujimoto i in. (1984) Science 226: 1097), gdzie przyczynowe genetyczne uszkodzenie scharakteryzowano jako chromosomalną translokację (t(14:18)), która umieściła gen bcl-2 pod kontrolą promotora immunoglobulin. Wynikająca z tego nadekspresj Bcl-2 hamuje normalny przebieg apoptotycznej śmierci komórki, która w innym przypadku utrzymuje homeostazę komórek, w wyniku czego następuje akumulacja komórek B i powstaje chłoniak pęcherzykowy (Adams i Cory, 1998; Cory (1994) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 345: 289). Bcl-2 może występować jako homodimer lub może tworzyć heterodimer z bax. Jako homodimer, bax działa indukując apoptozę. Jednakże, tworzenie kompleksu bax-bcl-2 blokuje apoptozę. Ekspresja Bcl-2 może również odgrywać rolę w rozwoju oporności na leki. [0072] Następnie scharakteryzowano kilka genów o homologii do genu bcl-2, obejmujące następujące geny: al, który koduje 80- aminokwasowe białko Al, które podlega szybkiej indukcji w makrofagach w odpowiedzi na GM-CSF lub LPS (Lin i in. (1993) J. Immunol. 151: ); mcl-1, gen wczesnej odpowiedzi w linii komórek szpikowych, które podlegają różnicowaniu na makrofagi (Kozopas i in. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: ); i bak, homolog bcl-2, który może wzmacniać apoptozę (Chittenden i in. (1995) Nature 374: 733; Kiefer i in. (1995) Nature 374: 736). Zidentyfikowano również inne

52 51 białka, które oddziałują z i/lub są strukturalnie zbliżone do produktu genu bcl-2, takie jak na przykład, Bcl-xl, i Bcl-xs (Boise i in. (1993) Cell 74: 597); Ced-9 (Vaux i in. (1992) Science 258: 1955). [0073] Produkt genu bcl-x, Bcl-x, który jest ściśle zbliżony do białka Bcl-2, również chroni komórki przed apoptozą. W wyniku alternatywnego cięcia i składania ludzkiego Bcl-x mogą być co najmniej dwa odrębne rodzaje mrna Bcl-x, Bcl-xl i Bclxs. Dominujący produkt białkowy (233 aminokwasy) większego mrna bcl-x, Bcl-xl, hamuje śmierć komórek po usunięciu czynnika wzrostu (Boise i in. (1993) Cell 74: ) i jego transgeniczna ekspresja zmienia dojrzewanie tymocytów prowadząc do zwiększenia liczby dojrzałych tymocytów (Chao i in. (1995) J. Exp. Med. 182: ; Grillot i in. (1995) J. Exp. Med. 182: ). [0074] Gen związany z komórkami białaczki szpikowej mcl-1 koduje białko, Mcl-1, które ulega wczesnej ekspresji podczas zaprogramowanego różnicowania w komórkach białaczki szpikowej (patrz, na przykład, publikacja zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki numer ). Część karboksylowa Mcl-1 wykazuje homologię z Bcl-2. Podobnie jak inni członkowie rodziny Bcl-2, Mcl-1 charakteryzuje się programowaniem zmian losu komórki, jak na przykład od przeżycia do śmierci lub od proliferacji do różnicowania. [0075] Oprócz członków rodziny Bcl-2, biomarkery przeżywalności komórek obejmują członków rodziny genów inhibitorów apoptozy związanych z bakulowirusowym genem IAP (Bimbaum i in. (1994) J. Virol. 68: ; Clem i in. (1994) Mol. Cell Biol. 14: ; Duckett i in. (1996) EMBO J. (1996) 15: ; Hay i in. (1995) Cell 83: 1253-

53 ; Liston i in. (1996) Nature 379: ; Rothe i in. (1995) Cell 83: ; Roy i in. (1995) Cell 80: ). Zidentyfikowano co najmniej osiem ludzkich IAP (Salvesen and Duckett (2002) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3 : ). [0076] IAP są wysoce konserwatywne ewolucyjnie; wykazują one podobną architekturę uorganizowaną w jeden do trzech w przybliżeniu 70 aminokwasowych końców aminowych Cys/His bakulowirusowych powtórzeń IAP (BIR) i karboksykońcową domenę wiążącą cynk, nazywaną palcem RING. Rodzina białek IAP jest znana jako odgrywająca potencjalnie ważne role w regulacji apoptozy i tworzenia nowotworów (Deveraux i Reed (1999) Genes Dev. 13: ; Tamm i in. (2000) Clin. Cancer Res. 6: ). [0077] IAP hamują śmierć komórek przez hamowanie kaspaz umiejscowionych przed nimi i terminalnie (patrz, na przykład, Thompson (1995) Science 267:1456). Aktywne (tj., rozszczepione) formy kaspazy-3 i -7 są bezpośrednio hamowane przez XIAP, c-iap1, oraz c-iap2 (patrz, na przykład, Roy i in. (1997), supra), co może również zapobiegać proteolitycznej obróbce pro-kaspazy-3, -6, i -7 przez blokowanie indukowanej cytochromem c aktywacji pro-kaspazy-9 (Deveraux i in. (1998) EMBO J. 17: ). Terapeutyczne i diagnostyczne stosowanie kwasów nukleinowych, które kodują różne inhibitory apoptozy związane z członkiem rodziny IAP opisano w literaturze patentowej. Patrz, na przykład, międzynarodowe zgłoszenia patentowe o numerach WO 97/06255, WO 97/26331, i WO 97/ Przykłady białek IAP, które można stosować jako biomarkery przeżywalności komórkowej obejmują, ale nie ograniczają się do XIAP, ciap1, IAP2, i surwiwiny.

54 53 [0078] XIAP ulega najczęściej ekspresji i jest najsilniejszym inhibitorem kaspaz (patrz, na przykład, Takahasi i in. (1998) J. Biol. Chem. 273: 7787; Reed (1994) J. Cell Biol. 124: 1). Surwiwina jest białkiem cytoplazmatycznym o wielkości w przybliżeniu 16,5 kda (patrz, na przykład, publikacja zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki numer ), zawierającym pojedynczy BIR, i wysoce naładowany karboksylowy końcowy region coiled-coil zamiast palca RING, które hamuje apoptozę indukowaną przez usunięcie czynnika wzrostu (IL-3), jeśli przeniesiona jest do prekursorów komórek B (Ambrosini i in. (1997) Nature Med. 3: ). Nadekspresja egzogennego białka surwiwiny broni komórki przed apoptozą p53 indukowaną w sposób zależny od dawki, sugerując, że utrata surwiwiny pośredniczy, co najmniej częściowo w szlaku apoptotycznym zależnym od p53 (Mirza i in. (2002) Oncogene 21: ). [0079] Innym reprezentatywnym biomarkerem przeżywalności komórkowej do stosowania w metodach jest TRAF-1. Członkowie rodziny TRAF wiążą się z domeną cytoplazmatyczną CD40 i pośredniczą w aktywacji wielu szlaków sygnałowych, które regulują przeżywalność komórek B, proliferację, różnicowanie, przełączanie izotypu, rozwój centrów rozrodczych, humoralną odpowiedź pamięci (patrz, na przykład, Pullen i in. (1999) J. Biol. Chem. 274: ). Donoszono, że aktywacja receptora CD40 może powodować transkrypcję genu TRAF-1 (Schwenzer i in. (1999) J. Biol. Chem. 274(27): ) i silną regulację zwiększającą ekspresję TRAF-1 w ludzkich monocytach (Pearson i in. (2001) Internat. Immunol. 13(3): ). Zmiany w ekspresji genu TRAF-1 w odpowiedzi na aktywację receptora CD40 mogą być prognostyczne dla

55 54 skuteczności leku, zapewniając w ten sposób odpowiedni biomarker do oceniania i/lub monitorowania skutków czynników terapeutycznych anty-cd40 na przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L i modulację przeżywania/apoptozy komórek. Zmiany w ekspresji TRAF-1 można łatwo wykrywać albo na poziomie mrna stosując techniki takie jak Northern blotting lub ilościowy RT-PCR, albo na poziomie białka, na przykład, Western blotting, jak opisano poniżej w opisie. [0080] Powyższe biomarkery przeżywalności komórek można monitorować w opisanych w niniejszym opisie oznaczeniach prognostycznych ex vivo, w dowolnej kombinacji, obejmującej jeden lub wszystkie te biomarkery, jak również w kombinacji z innymi biomarkerami proliferacji komórkowej. A zatem, w jednym rozwiązaniu, opisane w niniejszym opisie oznaczenia prognostyczne ex vivo stosuje się również do monitorowania testowej próbki biologicznej pochodzącej od osobnika będącego kandydatem pod względem ekspresji biomarkera proliferacji komórkowej Ki67. [0081] Ki67 jest białkiem jądrowym związanym z cyklem komórkowym, które występuje w fazach G1, S, M i G2 dzielących się komórek, ale nie w fazie G0 stanu spoczynku komórek (Gerdes i in. (1984) J. Immunol. 133, ). Z tych powodów, stosuje się go jako marker proliferacji komórki. [0082] A zatem, biomarkery, które mają być monitorowane w oznaczeniach prognostycznych ex vivo obejmują opisane powyżej przeżywalność komórek i białka apoptotyczne, oraz białka biorące udział w szlakach sygnałowych CD40, jak opisano powyżej w opisie. Monitorowanie może odbywać się na poziomie białka lub kwasu nukleinowego. A zatem, biomarkery obejmują te białka oraz geny kodujące te białka. Jeśli wykrywanie

56 55 odbywa się na poziomie białka, białko biomarkera zawiera pełnej długości polipeptyd lub jego wykrywalny fragment, i może obejmować warianty tych sekwencji białkowych. Podobnie, jeśli wykrywanie odbywa się na poziomie nukleotydu, kwas nukleinowy biomarkera obejmuje DNA, zawierający pełnej długości sekwencję kodującą, fragment pełnej długości sekwencji kodującej, warianty takich sekwencji, na przykład naturalnie występujące warianty lub warianty cięcia i składania, sekwencje komplementarne takiej sekwencji. Kwas nukleinowy biomarkera obejmuje również RNA, na przykład, mrna,zawierające pełnej długości sekwencję kodującą białka biomarkera będącego przedmiotem zainteresowania, fragment pełnej długości sekwencji RNA będącej przedmiotem zainteresowania lub warianty tych sekwencji. Białka biomarkera i kwasy nukleinowe biomarkera obejmują również warianty tych sekwencji. Przez "fragment" w zamierzeniu rozumie się część polinukleotydu lub część sekwencji aminokwasowej, a więc białko kodowane w ten sposób. Polinukleotydy, które są fragmentami sekwencji nukleotydowej biomarkera generalnie zawierają co najmniej 10, 15, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, lub 1400 ciągłych nukleotydów, lub aż do liczby nukleotydów obecnych w pełnej długości biomarkera polinukleotydowego ujawnionego w niniejszym opisie. Fragment biomarkera polinukleotydowego będzie zazwyczaj kodować co najmniej 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, lub 250 ciągłych aminokwasów, lub aż do liczby całkowitej liczby aminokwasów obecnych w pełnej długości białka biomarkera. "Wariant" w zamierzeniu oznacza zasadniczo podobne sekwencje. Na ogół, warianty określonych biomarkerów

57 56 według wynalazku będą wykazywać co najmniej około 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub więcej, identyczność sekwencji z tym biomarkerem, jak określono za pomocą programów przyporządkowywania sekwencji znanych w nauce. Białko i odpowiadająca sekwencja kodująca każdego z tych markerów jest znana w nauce. Patrz Tabela 6 w Przykładzie 3 poniżej w niniejszym opisie. Czynniki związane z CD40 i klinicznie użyteczne markery prognostyczne do stosowania w innych oznaczeniach prognostycznych. [0083] Indywidualne osoby lub subpopulacje pacjentów dotknięte chorobą zapalną lub chorobą autoimmunologiczną, którzy mogą odnosić korzyść z leczenia czynnikami terapeutycznymi anty-cd40, można również identyfikować stosując oznaczenia prognostyczne, które poszukują obecności lub nieobecności, lub podwyższonych lub obniżonych poziomów, jednego lub więcej czynników związanych z CD40. Osobników zidentyfikowanych jako odpowiadających na leczenie z zastosowaniem czynnika anty-cd40 na podstawie tych czynników związanych z CD40 można leczyć z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40. Alternatywnie, można ich dalej przeszukiwać pod względem potencjalnej korzyści z leczenia z zastosowaniem czynników terapeutycznych anty-cd40 przy użyciu oznaczeń prognostycznych ex vivo opisanych w niniejszym opisie, na przykład, dla identyfikacji czy choroba zapalna lub choroba autoimmunologiczna może lepiej reagować na leczenie z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40, który blokuje przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L lub który moduluje aktywność ADCC, lub który wykazuje te dwa sposoby działania.

58 57 [0084] Czynniki związane z CD40 będące przedmiotem zainteresowania obejmują, ale nie są ograniczone do poziomu ekspresji antygenu powierzchni komórkowej CD40, poziomu ekspresji powierzchniowego CD40L, poziomów w krążeniu rozpuszczalnego CD40 (scd40), i poziomów w krążeniu rozpuszczalnego CD40L (scd40l). W tym sposobie, próbkę biologiczną pobraną od osobnika będącego kandydatem analizuje się pod względem poziomu ekspresji co najmniej jednego tych czynników związanych z CD40. Poziom ekspresji tych czynników związanych z CD40 można stosować jako markery prognostyczne dla chorób autoimmunologicznych i/lub chorób zapalnych. Mogą być one użyteczne jako czynniki diagnostyczne osobników, którzy mogliby reagować lub nie na czynniki terapeutyczne anty-cd40. [0085] Do analizy tych markerów można stosować dowolne metody znane w nauce. Poziomy w krążeniu scd40 lub scd40l, na przykład, w próbce krwi otrzymanej od osobnika będącego kandydatem można mierzyć, na przykład, stosując test ELISA, oznaczenie radioimmunologiczne (RIA), elektrochemiluminescencję (ECL), Western blotting, technologie multipleksowe, lub inne podobne metody. Ekspresję na powierzchni komórki CD40 lub CD40L można mierzyć, na przykład, stosując cytometrię przepływową, immunohistochemię, Western blotting, immunoprecypitację, selekcję z wykorzystaniem perełek magnetycznych, oraz określanie ilościowe komórek, w których zachodzi ekspresja obydwu tych markerów powierzchni komórkowej. Poziomy ekspresji RNA CD40 i CD40L można mierzyć stosując RT-PCR, Qt-PCR, mikromacierze, Northern blotting lub inne podobne technologie. Sekwencje antygenu CD40, CD40L, oraz rozpuszczalnego CD40L są znane w

59 58 nauce. Patrz, na przykład, Tabela 7 w Przykładzie 3 poniżej w niniejszym opisie. W niektórych rozwiązaniach, scd40 izoluje się i sekwencjonuje w celu ustalenia różnic pomiędzy scd40, który jest wydzielany przez komórki, w których zachodzi ekspresja CD40 w stosunku do scd40, który jest proteolitycznie odszczepiany od powierzchni tych komórek. Poziom ekspresji wydzielanego scd40 i/lub proteolitycznie odszczepianego scd40 można korelować ze stanem choroby i/lub odpowiedzią choroby na leczenie czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 będącym przedmiotem zainteresowania. [0086] Subpopulacje pacjentów dotkniętych chorobą zapalną lub chorobą autoimmunologiczną, którzy mogliby odnosić korzyść z leczenia z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40 identyfikuje się przez przeszukiwanie osobników będących kandydatami pod względem jednego lub więcej klinicznie użytecznych markerów prognostycznych znanych w nauce. Przykłady klinicznie użytecznych markerów obejmują, ale nie ograniczają się do interleukiny (IL)-18 w surowicy, której poziomy odpowiadają ostrości pierwotnej żółciowej marskości wątroby (Yamano i in. (2000) Clin. Exp. Immunol. 122: ); rozpuszczalnej międzykomórkowej cząsteczki adhezyjnej-1 (ICAM-1), ekspresja której jest większa w późnym stadium pierwotnej żółciowej marskości wątroby, niż we wczesnym stadium choroby, i która koreluje z progresją histologiczną (Lim i in. (1994) Hepatology 20: ); komórkowej ekspresji cząsteczek adhezji komórkowej, takich jak ICAM-1 i CD40, które służą do przewidywania przebiegu toczniowego zapalenia nerek (Daniel i in. (2001) Kidney Int. 60: ); poziomów rozpuszczalnego receptora IL-2 w surowicy (sil-2r), który okazał się być znakomitym odzwierciedleniem

60 59 aktywności klinicznej choroby w reumatoidalnym zapaleniu stawów (RA) (Wood i in. (1988) J. Autoimmun. 1: ); jelitowego białka oporności wielolekowej (MDR1), którego poziom jest silnym wskaźnikiem prognostycznym skutku przeszczepu wątroby od żywego dawcy (Hashida i in. (2001) Clin. Pharmacol. Ther. 69: ); aminopeptydazy leucynowej w surowicy, której podwyższone poziomy mogą być wskaźnikiem aktywności układowego tocznia rumieniowatego (Inokuma i in. (1999) Rheumatology (Oxford) 38: ); białka C-reaktywnego, które jest ogólnym wskaźnikiem stanu zapalnego; oraz antytrypsyny alfa 1, która jest wskaźnikiem aktywności choroby w chorobie Crohna, zapalenia jelita grubego i zapalenia jelita krętego (Meyers i in. (1985) Gastroenterology 89: 13-18). [0087] A zatem, subpopulacje pacjentów dotkniętych chorobami autoimmunologicznymi i/lub zapalnymi, którzy słabiej odpowiadają na istniejące czynniki terapeutyczne można z łatwością zidentyfikować stosując aktualne metody oznaczeń, obejmujące oznaczenia prognostyczne ujawnione w niniejszym opisie, które wykorzystują użyteczne markery prognostyczne. Mając zidentyfikowanego osobnika, który zalicza się do jednej z tych subpopulacji w oparciu o te klinicznie użyteczne markery prognostyczne, osobnika można dalej poddawać testom przesiewowym wykorzystując jedno lub więcej oznaczeń prognostycznych ex vivo, zidentyfikowanych powyżej w niniejszym opisie, w celu oszacowania korzyści leczenia tego osobnika z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40, który moduluje przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L i/lub aktywność ADCC. Oznaczenia prognostyczne

61 60 [0088] Potencjalne korzyści terapeutyczne przy zastosowaniu czynnika terapeutycznego anty-cd40, który moduluje przekazywanie sygnałów za pośrednictwem CD40L, moduluje ADCC, lub obydwa, ocenia się stosując ex vivo oznaczenia prognostyczne, które monitorują zmiany pod względem poziomu ekspresji jednego lub więcej wcześniej wymienionych biomarkerów proliferacji i przeżywalności komórek, apoptozy komórkowej, oraz szlaków sygnałowych CD40 w próbce biologicznej, którą pobrano od osobnika będącego kandydatem, który potrzebuje interwencji terapeutycznej w związku z chorobą autoimmunologiczną i/lub chorobą zapalną, w której pośredniczy stymulacja przekazywania sygnałów przez CD40 na komórkach, w których zachodzi ekspresja CD40. Przez określenie komórki, w których zachodzi ekspresja CD40 rozumie się komórki, w których zachodzi ekspresja antygenu CD40. Metody wykrywania ekspresji CD40 w komórkach są dobrze znane w nauce i obejmują, ale nie ograniczają się do technik PCR, immunohistochemii, cytometrii przepływowej, Western blottingu, testu ELISA, i podobnych. Jeśli oznaczenia ex vivo dają pozytywną zmianę pod względem poziomu ekspresji jednego lub więcej będących przedmiotem zainteresowania biomarkerów w próbce biologicznej, interwencja terapeutyczna z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40 jest uzasadniona. Ponadto, biomarkery, markery cytokinowe, oraz czynniki związane z CD40, omawiane w niniejszym opisie, można stosować do monitorowania skuteczności leczenia z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40 u osobnika, który może, ale nie musi być poddawany testom przesiewowym z wykorzystaniem ujawnionych w niniejszym opisie oznaczeń prognostycznych ex vivo, a zatem do określania czy dalsze

62 61 leczenie z zastosowaniem tego samego czynnika terapeutycznego anty-cd40 jest uzasadnione, lub czy alternatywne protokoły leczenia są konieczne bądź pożądane. Jeśli leczenie z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40 jest uzasadnione, jak określono stosując metody według niniejszego wynalazku, czynnik terapeutyczny można podawać dowolną odpowiednią drogą podawania. [0089] Osobnik będący kandydatem, co do którego uważa się, że interwencja terapeutyczna z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40, który moduluje przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, moduluje ADCC, lub obydwa, może być dotknięty lub narażony na ryzyko rozwoju lub nawrotu dowolnej choroby zapalnej lub autoimmunologicznej, w której ma swój udział przekazywanie sygnałów przez CD40 na komórkach, w których zachodzi ekspresja CD40. Choroby zapalne charakteryzuje zapalenie i destrukcja tkanek, lub ich kombinacja. "Choroba zapalna" obejmuje każdy proces zapalny, w którym pośredniczy układ immunologiczny, w którym zdarzenie inicjujące lub cel odpowiedzi immunologicznej obejmuje obcy(ce) antygen(y), obejmujące, na przykład, alloantygeny, ksenoantygeny, antygeny wirusowe, antygeny bakteryjne, nieznane antygeny, lub alergeny. [0090] Termin "choroba(by) zapalna(ne)"obejmuje "chorobę(by) autoimmunologiczną(ne)". Jak stosuje się w niniejszym opisie, termin "autoimmunizacja", generalnie obejmuje procesy zapalne z udziałem układu immunologicznego obejmujące własne antygeny. W chorobach autoimmunologicznych, własny(ne) antygen(y) wyzwala(ją) odpowiedzi immunologiczne gospodarza. [0091] Ponadto, metody ujawnione w niniejszym opisie można

63 62 stosować do oceny skuteczności czynnika terapeutycznego anty- CD40 w leczeniu zapalenia związanego z odrzucaniem przeszczepu tkankowego. "Odrzucenie transplantu" lub "odrzucenie przeszczepu" odnosi się każdej odpowiedzi immunologicznej wywołanej u gospodarza przeciw przeszczepowi, obejmując, ale bez ograniczeń, antygeny HLA, antygeny grup krwi i podobne. [0092] Ujawnienie można również stosować do oceny skuteczności czynnika terapeutycznego anty-cd40 w leczeniu choroby przeszczep przeciw gospodarzowi, takiej jak ta związana, na przykład, z przeszczepem szpiku kostnego. W takiej chorobie przeszczep przeciw gospodarzowi, szpik kostny dawcy zawiera limfocyty i komórki, które dojrzewają do limfocytów. Limfocyty dawcy rozpoznają antygeny biorcy jako nie swoje i wywołują zapalną odpowiedź immunologiczną. A zatem, jak stosuje się w niniejszym opisie, "choroba przeszczep przeciw gospodarzowi" lub "reakcja przeszczep przeciw gospodarzowi" odnosi się do dowolnej odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem komórek T, w której limfocyty dawcy reagują z antygenami gospodarza. [0093] Przykłady chorób autoimmunologicznych i/lub zapalnych obejmują, ale nie bez ograniczeń, toczeń rumieniowaty układowy (SLE), toczeń rumieniowaty przewlekły, toczniowe zapalenie nerek, sarkoidozę, zapalenie stawów, obejmujące młodzieńcze zapalenie stawów, reumatoidalne zapalenie stawów, łuszczycowe zapalenie stawów, zespół Reitera, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, oraz dnawe zapalenie stawów, odrzucanie przeszczepionego narządu lub tkanki, hiperostre, ostre lub przewlekłe odrzucanie i/lub choroba przeszczep przeciw gospodarzowi, stwardnianie rozsiane, zespół hiper

64 63 IgE, guzkowate zapalenie tętnic, pierwotną żółciową marskości wątroby, chorobę zapalną jelit, chorobę Crohna, celiakię (enteropatię związaną z wrażliwością na gluten), autoimmunologiczne zapalenie wątroby, niedokrwistość złośliwa, autoimmunologiczną niedokrwistość hemolityczną, łuszczycę, twardzinę, miastenię, autoimmunologiczną plamicę małopłytkową, autoimmunologiczne zapalenie tarczycy, chorobę Grave a, zapalenie tarczycy Hasimoto, chorobę kompleksów immunologicznych, zespół przewlekłego zmęczenia i dysfunkcji immunologicznych (CFIDS), zapalenie wielomięśniowe i zapalenie skórno-mięśniowe, krioglobulinemię, trombolizę, kardiomiopatię, pęcherzycę zwykłą, śródmiąższowe zwłókniające zapalenie płuc, cukrzycę typu I i typu II, nadwrażliwość późną typu 1, 2, 3 i 4, alergię lub zaburzenia alergiczne, nie chciane/nie zamierzone odpowiedzi immunologiczne na białka terapeutyczne (patrz na przykład, zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer US 2002/ i Koren, i in. (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3: ), astmę, zespół Churg-Straussa (ziarniniak alergiczny), atopowe zapalenie skóry, alergiczne i podrażnieniowe kontaktowe zapalenie skóry, pokrzywkę, alergię z udziałem IgE, miażdżycę, zapalenia naczyń, idiopatyczne zapalne miopatie, chorobę hemolityczną, chorobę Alzheimera, przewlekłą zapalną polineuropatię demielinizacyjną i podobne. Metody według niniejszego wynalazku stosuje się do identyfikowania osobników, którzy mogliby odnosić korzyść z leczenia z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40 w przypadku stanów zapalnych płuc, obejmujących, ale nie ograniczających się do odrzucania przeszczepu płuc, astmy, sarkoidozy, rozedmy, mukowiscydozy, idiopatycznego zwłóknienia płuc,

65 64 przewlekłego zapalenia oskrzeli, alergicznego nieżytu nosa oraz chorób alergicznych, takich jak alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych, eozynofilowe zapalenie płuc, zarostowe zapalenie pęcherzyków spowodowane przeszczepem szpiku kostnego i/lub płuc, bądź innymi przyczynami, miażdżyca przeszczepu/stwardnienie żyły przeszczepu, jak również zwłóknienie płuc wynikające z chorób kolagenowych, naczyniowych i autoimmunologicznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów i toczeń rumieniowaty. [0094] Metody według wynalazku są użyteczne do identyfikowania i leczenia chorób autoimmunologicznych i zapalnych, które od początku są oporne lub, w przypadku których rozwinie się oporność na inne znane czynniki terapeutyczne, których sposób działania jest inny niż modulowanie przekazywania sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, modulowanie ADCC, lub obydwa. Oznaczenia prognostyczne ex vivo można stosować do identyfikowania subpopulacji pacjentów, dla których interwencja terapeutyczna z zastosowaniem jednego lub więcej czynników terapeutycznych anty-cd40, które modulują przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, modulują ADCC, lub obydwa, jest pożądana. [0095] Termin "prognoza" jest znany w dziedzinie i obejmuje przewidywanie prawdopodobnego przebiegu odpowiedzi na interwencję terapeutyczną i prawdopodobnego przebiegu choroby lub postępu choroby, w szczególności w odniesieniu do prawdopodobieństwa remisji choroby, nawrotu choroby i śmierci. Oznaczenia prognostyczne ex vivo według niniejszego wynalazku można stosować do przewidywania odpowiedzi osobnika będącego kandydatem na konkretny czynnik terapeutyczny anty-

66 65 CD40, lub klasę czynników terapeutycznych anty-cd40, które modulują przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, modulują ADCC, lub obydwa. Przez "przewidywanie odpowiedzi osobnika będącego kandydatem", w zamierzeniu, rozumie się prawdopodobieństwo, że badany osobnik będzie doświadczał pozytywnych lub negatywnych wyników przy stosowaniu konkretnego czynnika terapeutycznego anty-cd40. Dla celów niniejszego wynalazku, "wskazujący na pozytywny wynik leczenia" w kontekście oznaczeń prognostycznych ex vivo według niniejszego wynalazku, w zamierzeniu, oznacza podwyższone prawdopodobieństwo, że osobnik będący kandydatem będzie doświadczać korzystnych wyników w odpowiedzi na leczenie z zastosowaniem branego pod uwagę czynnika terapeutycznego anty-cd40, a zatem interwencja terapeutyczna z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40 będzie uzasadniona. W przeciwieństwie, "wskazujący na negatywny wynik leczenia", w zamierzeniu, oznacza zwiekszone prawdopodobieństwo, że pacjent nie będzie doświadczać korzystnych wyników w odpowiedzi na leczenie z zastosowaniem branego pod uwagę czynnika terapeutycznego anty-cd40, a zatem interwencja terapeutyczna z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40 nie będzie uzasadniona. [0096] Korzystne wyniki, które można uzyskać przy interwencji terapeutycznej z zastosowaniem czynników terapeutycznych anty-cd40, które modulują przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, obejmują wszystkie pozytywne odpowiedzi terapeutyczne. Przez "pozytywną odpowiedź terapeutyczną" w odniesieniu do choroby autoimmunologicznej i/lub choroby zapalnej, w zamierzeniu, rozumie się poprawę choroby związaną z aktywnością przeciwzapalną tych

67 66 przeciwciał lub ich fragmentów wiążących antygen i/lub poprawę pod względem objawów związanych z chorobą. To jest, można obserwować efekt antyproliferacyjny, zapobieganie dalszej proliferacji komórek, w których zachodzi ekspresja CD40, zmniejszenie odpowiedzi zapalnej, obejmujące, ale nie ograniczające się do zmniejszonej sekrecji cytokin zapalnych, cząsteczek adhezyjnych, proteaz, immunoglobulin (w przypadku gdy komórką niosącą CD40 jest komórka B), ich kombinacji i podobnych, zwiększone wytwarzanie białek przeciwzapalnych, zmniejszenie liczby komórek autoreaktywnych, zwiększenie tolerancji immunologicznej, hamowanie przeżywalności komórek autoreaktywnych i/lub zmniejszenie jednego lub więcej objawów, w których ma udział stymulacja komórek, w których zachodzi ekspresja CD40. Takie pozytywne odpowiedzi terapeutyczne nie są ograniczone drogą podawania i mogą obejmować podawanie dawcy, do tkanek dawcy (tak jak na przykład przez perfuzję narządu), gospodarzowi, dowolnej ich kombinacji i podobnych. [0097] Odpowiedzi kliniczne można oceniać stosując techniki przeszukiwania, takie jak obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI), obrazowanie rentgenowskie, obrazowanie metodą tomografii komputerowej (CT), analiza metodą cytometrii przepływowej i sortera komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS), histologia, patologii w obrazie makroskopowym, badanie chemiczne krwi, obejmujące ale nie ograniczające się do zmian wykrywalnych z zastosowaniem testu ELISA, RIA, chromatografii, i podobnych. Oprócz tych pozytywnych odpowiedzi terapeutycznych, osobnik który przechodzi terapię czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 może doświadczać korzystnego wpływu poprawy objawów związanych z

68 67 chorobą. [0098] Oznaczenia prognostyczne ex vivo obejmują dostarczenie testowej próbki biologicznej i kontrolnej próbki biologicznej od osobnika będącego kandydatem, wymagającego prognozy odnośnie interwencji terapeutycznej z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40, jak opisano w niniejszym opisie, gdzie próbki biologiczne, testowa i kontrolna, zawierają komórki, w których zachodzi ekspresja CD40 i, które stymulowano ligandem CD40, albo in vivo albo ex vivo; zapewnianie kontaktu testowej próbce biologicznej ze skuteczną ilością czynnika terapeutycznego anty-cd40 będącego przedmiotem zainteresowania; wykrywanie poziomu co najmniej jednego biomarkera w tej testowej próbce biologicznej, przy czym biomarker wybiera się z grupy składającej się z biomarkera apoptozy komórkowej, biomarkera szlaku sygnałowego CD40, w którym uczestniczy CD40L, oraz biomarkera przeżywalności komórkowej, w zależności od sposobu działania czynnika terapeutycznego anty-cd40 będącego przedmiotem zainteresowania; i porównywanie poziomu biomarkera(rów) w testowej próbce biologicznej z poziomem biomarkera(rów) w kontrolnej próbce biologicznej, która nie miała kontaktu z czynnikiem terapeutycznym anty-cd40. Jeśli czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 jest antagonista, który blokuje lub zakłóca przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40, bądź blokuje lub zakłóca to przekazywanie sygnałów i również moduluje ADCC, oznaczenia prognostyczne ex vivo ujawnione w niniejszym opisie dla dowolnego lub wszystkich tych biomarkerów proliferacji i przeżywalności komórek, apoptozy, oraz przekazywania sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, można stosować do oszacowywania

69 68 potencjalnego korzystnego wpływu czynnika terapeutycznego, same lub w kombinacji z oznaczeniami markerów cytokinowych, które podlegają regulacji zwiększającej w wyniku przekazywania sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, i/lub oznaczeniami jednego lub więcej opisanych w opisie czynników związanych z CD40, w celu identyfikacji osobnika dotkniętego chorobą zapalną lub chorobą autoimmunologiczną, który mógłby odpowiadać na leczenie z zastosowaniem tego czynnika terapeutycznego anty-cd40. Jeśli czynnik terapeutyczny anty-cd40 wykazuje sposób działania przez modulowanie aktywności ADCC, na przykład, przeciwciała skierowanego przeciw CD40, oznaczenie prognostyczne ex vivo pod względem jednego lub więcej markerów apoptozy można stosować do oszacowywania potencjalnego korzystnego wpływu czynnika terapeutycznego, samodzielnie lub w kombinacji z oznaczeniami jednego lub więcej czynników związanych z CD40, opisanych w niniejszym opisie, w celu identyfikacji osobnika dotkniętego chorobą zapalną lub chorobą autoimmunologiczną, który mógłby odpowiadać na leczenie z zastosowaniem tego czynnika terapeutycznego anty-cd40. [0099] Poziom ekspresji jednego lub więcej biomarkerów, i ewentualnie jednego lub więcej markerów cytokinowych, w testowej próbce biologicznej, której zapewnia się kontakt z czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 będącym przedmiotem zainteresowania, porównuje się z poziomem ekspresji biomarkera (rów)), w ewentualnie markera(rów) cytokinowego(wych) w kontrolnej próbce biologicznej. Przez "testową próbkę biologiczną", w zamierzeniu, rozumie się próbkę biologiczną zawierającą komórki, w których zachodzi ekspresja CD40, otrzymane od osobnika będącego kandydatem i

70 69 której zapewniono kontakt z czynnikiem terapeutycznym anty- CD40, branym pod uwagę do leczenia osobnika będącego kandydatem. Przez "kontrolną próbkę biologiczną", w zamierzeniu, rozumie się próbkę biologiczną, która jest porównywalna do testowej próbki biologicznej pod tym względem, że również zawiera w przybliżeniu taką samą liczbę i rodzaj komórek, w których zachodzi ekspresja CD40 i otrzymano ją od osobnika będącego kandydatem w tej samej ramie czasowej i w sposób równoważny do tego stosowanego do uzyskania testowej próbki biologicznej, oraz którą będzie się wystawiać na takie same warunki eksperymentalne co próbkę testową, ale nie będzie się jej kontaktować z czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 będącym przedmiotem zainteresowania. Testowa próbka biologiczna i kontrolna próbka biologiczna mogą być dostarczone z pojedynczej próbki biologicznej, którą otrzymano od osobnika i podzielona na subpróbki, z których jedną przeznaczono na testową próbkę biologiczną, a drugą przeznaczono na kontrolną próbkę biologiczną. Alternatywnie, testową próbkę biologiczną i kontrolną próbkę biologiczną można dostarczyć z dwóch lub więcej próbek biologicznych, które można zbierać, a następnie dzielić na subpróbki jak powyżej, lub które mogą indywidualnie stanowić próbki biologiczne, testową i kontrolną. [0100] Chociaż uważa się, że komórki, w których zachodzi ekspresja CD40, pobrane od osobnika będącego kandydatem mogą być konstytutywnie stymulowane przez CD40L in vivo przed pobraniem próbki biologicznej, korzystne jest, aby przeprowadzać stymulację komórek, w których zachodzi ekspresja CD40, testowych i kontrolnych próbek biologicznych ex vivo tak, że działanie antagonistyczne czynnika

71 70 terapeutycznego anty-cd40 na aktywności związane z CD40, na przykład, stymulację proliferacji komórkowej i przekazywania sygnałów przez CD40, mogą skutecznie być oceniane. [0101] W tym sposobie, przed zetknięciem testowej próbki biologicznej komórek, w których zachodzi ekspresja CD40, z czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 będącym przedmiotem zainteresowania, komórki, w których zachodzi ekspresja CD40 w obrębie dowolnej danej próbki biologicznej pobranej od osobnika będącego kandydatem, można stymulować, na przykład, CD40L, w celu zapewnienia próbkom biologicznym, testowej i kontrolnej, stosowanych w oznaczeniach prognostycznych ex vivo, regulacji zwiększającej przekazywanie sygnałów przez CD40 na komórkach, w których zachodzi ekspresja CD40. Można stosować dowolne źródło CD40L, obejmujące, ale nie ograniczające się do rozpuszczalnego CD40L. Inne odpowiednie cząsteczki stymulujące CD40 mogą obejmować, na przykład, przeciwciała agonistyczne, które wiążą się specyficznie z zewnątrzkomórkową domeną CD40. A zatem, odpowiednie stymulujące cząsteczki CD40 obejmują, ale nie są ograniczone do związanego z błoną CD40L (na przykład, CD40L związanego z błoną plazmatyczną komórki, na przykład, utrwalonych formaldehydem transfektantów komórek CHO, w których zachodzi ekspresja CD40L; lub CD40L włączonych do syntetycznego substratu na bazie lipidów, takiego jak liposom lub micella), rozpuszczalnego CD40L, agonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40, na przykład, przeciwciała skierowanego przeciw ludzkiemu CD40 G28-5 (Bristol-Myers Squibb, Seattle, Washington), oraz ich mieszanin. Skuteczna ilość cząsteczek stymulujących, które mają być zetknięte z komórkami pobranej próbki biologicznej lub jej subpróbkami, w

72 71 celu stymulacji jednego lub więcej szlaków sygnałowych CD40, będzie zależeć od czynników, takich jak rodzaj stosowanego liganda (np., monomeryczny lub multimeryczny; rozpuszczalność i przenikalność, i tym podobne) oraz ilości dostępnego receptora CD40, na komórkach w których zachodzi ekspresja CD40. Korzystnie, do stymulacji przekazywania sygnałów przez CD40 stosuje się pomiędzy około 1,0 nm a około 1 mm CD40L lub rozpuszczalnego CD40L. [0102] Komórki, w których zachodzi ekspresja CD40 w obrębie próbki biologicznej lub jej subpróbek stymuluje się rozpuszczalnym ludzkim rekombinowanym CD40L (Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire, UK) przed etapem kontaktu, przez inkubację próbki biologicznej lub jej subpróbki w rozpuszczalnym CD40L przez czas odpowiedni dla stymulacji przekazywania sygnałów przez CD40. Czas inkubacji wynosi około 10 minut do około 4 godzin. Ilość rozpuszczalnego CD40L obecnego podczas okresu inkubacji można z łatwością określić przez miareczkowanie. Ilość rozpuszczalnego CD40L wynosi około 1 g/ml. W oznaczeniach prognostycznych ex vivo można stosować dowolny akceptowalny protokół kontaktu testowej próbki biologicznej z będącym przedmiotem zainteresowania czynnikiem terapeutycznym anty- CD40. Czynniki, które bierze się pod uwagę obejmują, ale nie są ograniczone do liczby komórek, które się kontaktuje w pojemniku zawierającym próbkę biologiczną lub jej subpróbkę; stężenie czynnika terapeutycznego anty-cd40, które kontaktuje się z testową próbką biologiczną; czas inkubacji czynnika terapeutycznego anty-cd40 z komórkami w testowej próbce biologicznej; jeśli się stosuje, stężenie cząsteczki stymulującej, na przykład, CD40L, rozpuszczalnego CD40L, lub

73 72 jego stymulującego fragmentu bądź wariantu, które będzie się kontaktować z testową próbką biologiczną; oraz, jeśli się stosuje, czas inkubacji cząsteczki stymulującej z komórkami w testowej próbce biologicznej. Oznaczenie takich czynników mogą przeprowadzać specjaliści w tej dziedzinie, opierając się na zmiennych, takich jak rodzaj testowanej próbki biologicznej, wielkość pojemnika do przechowywania, objętość płynu w pojemniku, oraz skład chemiczny testowanej kompozycji czynnika terapeutycznego anty-cd40 (tj. wielkość, ładunek i podobne). [0103] W jednym przykładzie, testową próbkę biologiczną lub jej subpróbkę, zawierającą odpowiednią liczbę komórek, w których zachodzi ekspresja CD40, dodaje się do 96- studzienkowych płytek do hodowli tkankowych. Odpowiednią liczbą komórek jest liczba komórek, która umożliwia wykrycie zmian pod względem jednej lub więcej aktywności, w których pośredniczy CD40 (tj., proliferacji komórkowej i przeżywalności komórkowej, poziomu apoptozy, szlaków sygnałowych CD40), przy wykorzystaniu jednej lub więcej metod wykrywania opisanych w innym miejscu tego opisu. Odpowiednia liczba komórek wynosi pomiędzy około 1 a około 1x10 6 komórek na studzienkę, 96-studzienkowej płytki do hodowli tkankowych. Po dodaniu komórek na płytkę do hodowli tkankowych, komórki można preinkubować przez pomiędzy około 0 do około 96 godzin przed zetknięciem komórek z czynnikiem terapeutycznym anty- CD40. Komórki preinkubuje się z cząsteczką stymulującą CD40, jak opisano powyżej w niniejszym opisie. [0104] Skuteczną ilość czynnika terapeutycznego anty-cd40 dodaje się do komórek testowej próbki biologicznej w celu zapewnienia regulacji będących przedmiotem zainteresowania

74 73 aktywności, w których pośredniczy CD40 (tj., przekazywania sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, aktywności ADCC czynnika, który wiąże się z CD40, lub obydwu) tak, że regulacja jest wykrywalna przy wykorzystaniu jednej lub więcej metod wykrywania ujawnionych w innym miejscu tego opisu. Skuteczna ilość będzie oczywiście zależeć od testowanego czynnika terapeutycznego anty-cd40. Ogólnie, skuteczna ilość czynnika terapeutycznego anty-cd40 wynosi pomiędzy około 1 nm do około 10 mm czynnika na studzienkę 96- studzienkowej płytki. Czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 jest antagonistyczne przeciwciało skierowane przeciw CD40, na przykład, pełne ludzkie przeciwciało monoklonalne CHIR lub CHIR-5.9, bądź jego fragment wiążący antygen, a jego skuteczna ilość wynosi około 0,01 g/ml do około 30 g/ml, obejmując około 0,01 g/ml, 0,1 g/ml, 0,5 g/ml, 1 g/ml, 5 g/ml, 10 g/ml, 20 g/ml, i 30 g/ml, oraz inne wartości pomiędzy około 0,01 g/ml a około 30 g/ml. Komórkom testowej próbki biologicznej lub jej subpróbce zapewnia się inkubację przez odpowiednią długość czasu dla umożliwienia czynnikowi terapeutycznemu anty-cd40 oddziaływania z komórkami i wytworzenia jednej lub więcej odpowiedzi biologicznych. Korzystny czas inkubacji między czynnikiem terapeutycznym anty-cd40, a komórkami testowej próbki biologicznej lub jej subpróbki wynosi pomiędzy około 1 minutą do około 48 godzin. W innych rozwiązaniach, czas inkubacji wynosi około 20 minut, około 30 minut, około 1 godziny, około 4 godziny, około 12 godzin, około 22 godziny lub około 24 godziny. [0105] Próbka(ki) biologiczna(ne), która(re) służy(żą) jako próbki biologiczne, testowa i kontrolna, można pobierać z komórek, tkanek lub płynów ciała, które zwierają komórki, w

75 74 których zachodzi ekspresja antygenu CD40. Przykłady takich próbek biologicznych obejmują, ale nie ograniczają się do krwi, limfy, próbek tkanki, wymazów i podobnych. Próbki biologiczne można pobierać od osobnika będącego kandydatem stosując procedury akceptowalne w nauce, na przykład, przez aspirację igłą płynów ciała, pobranie próbki tkanki i podobne. Jeśli próbka biologiczna musi być przechowywana przed oznaczeniem, można ją przenieść na szkiełko lub można ją zamrozić dla dalszego przygotowywania lub natychmiast umieścić z roztworze utrwalającym. [0106] Jak opisano uprzednio, wykrywanie będącego przedmiotem zainteresowania biomarkera na poziomie białka lub nukleotydu można przeprowadzać stosując dowolną metodę wykrywania znaną specjalistom w tej dziedzinie. Przez "wykrywanie ekspresji" lub "wykrywanie poziomu", w zamierzeniu, rozumie się określanie ilości lub obecności białka lub genu biomarkera w próbce biologicznej. A zatem, "wykrywanie ekspresji" obejmuje przypadki, kiedy wykrywany biomarker nie ulega ekspresji, nie ulega wykrywalnej ekspresji, ulega ekspresji na niskim poziomie, ulega ekspresji na normalnym poziomie, lub ulega nadekspresji. W celu określenia wpływu czynnika terapeutycznego anty-cd40 na przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, testową próbkę biologiczną zawierającą komórki, w których zachodzi ekspresja CD40 i które stymulowano ligandem CD40 (albo in vivo albo ex vivo) kontaktuje się z czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 przez czas odpowiedni dla umożliwienia czynnikowi terapeutycznemu wywołanie odpowiedzi komórkowej, a następnie poziom ekspresji jednego lub więcej biomarkerów będących przedmiotem zainteresowania w tej testowej próbce biologicznej porównuje

76 75 się z poziomem ekspresji w kontrolnej próbce biologicznej, która nie miała kontaktu z czynnikiem terapeutycznym anty- CD40. W niektórych przykładach, kontrolną próbkę biologiczną komórek kontaktuje się z substancją obojętną lub kontrolą negatywną, która nie zakłóca przekazywania sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L. Na przykład, niespecyficzna immunoglobulina, na przykład IgG1, która nie wiąże się z CD40 służy jako kontrola negatywna. Wykrywanie można przeprowadzać w czasie dla umożliwienia monitorowania zmian biomarkerów w czasie. Wykrywanie można również przeprowadzać stosując ekspozycję na różne stężenia czynnika terapeutycznego anty- CD40 w celu utworzenia krzywej "dawka-odpowiedź" dla każdego danego biomarkera będącego przedmiotem zainteresowania. [0107] Metody wykrywania ekspresji biomarkerów, i ewentualnie markerów cytokinowych, w próbkach biologicznych, testowej i kontrolnej, obejmują dowolne metody, które określają ilość lub obecność markerów albo na poziomie kwasu nukleinowego albo białka. Takie metody są dobrze znane w nauce i obejmują, ale nie ograniczają się do Western blottingu, Northern blottingu, testu ELISA, immunoprecypitacji, immunofluorescencji, cytometrii przepływowej, immunohistochemii, technik hybrydyzacji kwasów nukleinowych, metod odwrotnej transkrypcji kwasów nukleinowych oraz metod amplifikacji kwasów nukleinowych. W konkretnych przykładach, ekspresję biomarkera wykrywa się na poziomie białka stosując, na przykład, przeciwciała, które skierowane są przeciw specyficznym białkom biomarkerów. Te przeciwciała można wykorzystywać w różnych metodach, takich jak Western blotting, test ELISA, technologie multipleksowe, immunoprecypitacja, lub techniki immunohistochemii. W

77 76 niektórych przykładach, wykrywanie markerów cytokinowych przeprowadza się stosując elektrochemiluminescencję (ECL). Dowolne z tych metod wykrywania dla biomarkerów i ewentualnie markerów cytokinowych można łączyć do oceny z informacjami klinicznymi, konwencjonalnymi metodami prognostycznymi, ekspresją innych czynników związanych z CD40, w szczególności ekspresją CD40 i/lub CD40L powierzchni komórki oraz poziomami w krążeniu rozpuszczalnych CD40 i/lub CD40L, oraz ekspresją lub obecnością klinicznie użytecznych markerów prognostycznych znanych w nauce, obejmujących, ale nie ograniczających się do tych opisanych powyżej w niniejszym opisie. W tym sposobie, ujawnione metody mogą umożliwiać dokładniejsze określenie osobników będących kandydatami, których choroba autoimmunologiczna lub choroba zapalna będzie odnosić korzyść z interwencji terapeutycznej z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40 opisanego w niniejszym opisie. [0108] A zatem, osobnika będącego kandydatem, dotkniętego chorobą zapalną lub chorobą autoimmunologiczną związaną z komórkami, w których zachodzi ekspresja CD40, testuje się pod względem odpowiedzi na będący przedmiotem zainteresowania czynnik terapeutyczny anty-cd40, stosując ex vivo oznaczenia prognostyczne opisane w niniejszym opisie, w których oznacza się wpływ czynnika terapeutycznego na jedną lub więcej aktywności, w których pośredniczy CD40. Jeśli pożądane jest dalsze udoskonalanie oznaczenia prognostycznego ex vivo, to osobnika będącego kandydatem można sprawdzać pod względem poziomu ekspresji, lub braku ekspresji, jednego lub więcej czynników związanych z CD40 zidentyfikowanych powyżej w niniejszym opisie, jednego lub więcej klinicznie użytecznych

78 77 markerów prognostycznych, obejmujących te zidentyfikowane powyżej w niniejszym opisie, lub obydwu. W tym sposobie, próbkę biologiczną zawierającą komórki, w których zachodzi ekspresja CD40 można pobierać od osobnika będącego kandydatem i oznaczać pod względem poziomu ekspresji, lub braku ekspresji, czynnika(ków) związanego(nych) z CD40 i/lub klinicznie użytecznego(nych) markera(rów) prognostycznego(nych), będących przedmiotem zainteresowania. Dowolne próbki biologiczne zawierające komórki, w których zachodzi ekspresja CD40, jak opisano powyżej w niniejszym opisie, można pobierać do tych oznaczeń prognostycznych. Ponadto, dowolną metodę wykrywania znaną specjalistom w tej dziedzinie można stosować do wykrywania poziomu ekspresji, lub braku ekspresji, czynnika(ków) związanego(nych) z CD40 i/lub klinicznie użytecznego(nych) markera(rów) prognostycznego(nych), będących przedmiotem zainteresowania, jak opisano w innym miejscu niniejszego opisu. [0109] Jeśli poziom ekspresji jednego lub więcej czynników związanych z CD40 ocenia się w celu identyfikacji osobnika dotkniętego chorobą zapalną lub chorobą autoimmunologiczną, który będzie odpowiadać na leczenie z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40, pobiera się próbkę biologiczną od tego osobnika, i poziom ekspresji w próbce porównuje się z poziomem ekspresji tego czynnika (lub czynników) w kontrolnym lub referencyjnym standardzie. Dla określania poziomu ekspresji na powierzchni komórki CD40 i/lub CD40L, można stosować dowolną próbkę biologiczną zawierającą komórki, w których zachodzi ekspresja CD40 i/lub CD40L, jak opisano powyżej w niniejszym opisie. Dla określania poziomów w krążeniu scd40 i/lub scd40l, próbkę krwi lub próbkę

79 78 zawierającą składnik krwi, taką jak osocze lub surowica można uzyskiwać od osobnika będącego kandydatem. Przez "kontrolny" lub "referencyjny standard", w zamierzeniu, rozumie się standard, który pochodzi z tego samego źródła biologicznego (tj., tkanki lub płynu ciała) i, których pozwala odróżniać osobników dotkniętych chorobą zapalną lub autoimmunologiczną od zdrowych osobników, którzy nie są dotknięci tą chorobą. Specjaliści w tej dziedzinie mogą zapewnić standard referencyjny, biorąc pomiary poziomów ekspresji tych czynników związanych z CD40 (tj., CD40 na powierzchni komórki, CD40L na powierzchni komórki, scd40, scd40l) u zdrowych osobników, nie dotkniętych chorobą i osobników dotkniętych chorobą, kontrolując wiek, płeć, rasę, i podobne, i porównując poziomy ekspresji dla określenia standardowego poziomu ekspresji, oczekiwanego u zdrowego osobnika. W niektórych przykładach, poziom ekspresji u osobnika będącego kandydatem dotkniętego chorobą zapalną lub autoimmunologiczną jest co najmniej 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300% większy, niż poziom ekspresji w standardzie referencyjnym. Uważa się, że możliwość stosowania leczenia z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40 można oceniać przez wykrywanie poziomu ekspresji jednego lub więcej tych czynników związanych z CD40, przy czym podwyższony poziom ekspresji w próbce biologicznej w stosunku do standardu referencyjnego jest wystarczający do uznania, że osobnik jest dotknięty chorobą zapalną lub autoimmunologiczną, która będzie odpowiadać na leczenie z zastosowaniem będącego przedmiotem zainteresowania czynnika terapeutycznego anty-cd40 bez konieczności wykonywania dalszych oznaczeń przesiewowych ex vivo pod względem wpływu

80 79 czynnika terapeutycznego anty-cd40 na aktywności, w których pośredniczy CD40, takie jak przeżywalność i proliferacja komórek i/lub aktywność ADCC. [0110] W niniejszym opisie ujawniono również zestawy do przeprowadzania ex vivo oznaczeń prognostycznych według niniejszego wynalazku. Na przykład, zestaw może zawierać wyznakowany związek lub czynnik zdolny do wykrywania opisanego w niniejszym opisie biomarkera, np., biomarkera apoptozy, proliferacji lub przeżywalności komórek, lub szlaków sygnałowych CD40, w których bierze udział CD40L, albo na poziomie białka albo kwasu nukleinowego, w próbce biologicznej oraz środek do wykrywania ilości biomarkera w próbce (na przykład, przeciwciało lub sondę oligonukleotydową, która wiąże się z RNA kodującym biomarker będący przedmiotem zainteresowania), po czym następuje inkubacja próbki z czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 będącym przedmiotem zainteresowania. Zestaw może być pakowany dla umożliwienia wykrywania wielu biomarkerów będących przedmiotem zainteresowania przez włączenie pojedynczych wyznakowanych związków lub czynników zdolnych do wykrywania każdego indywidualnego biomarkera będącego przedmiotem zainteresowania oraz środków do wykrywania ilości każdego biomarkera w próbce. Zestaw może również zawierać instrukcje leczenia osobnika, jeśli w oznaczeniu prognostycznym ex vivo uzyska się wynik wskazujący na pozytywny wynik leczenia z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40. [0111] W przypadku zestawów opartych na przeciwciałach, zestaw może zawierać, na przykład: (1) pierwsze przeciwciało (np., przyłączone do stałego nośnika), które wiąże się z biomarkerem będącym przedmiotem zainteresowania; i,

81 80 ewentualnie, (2) drugie, inne przeciwciało, które wiąże się z biomarkerem lub pierwszym przeciwciałem i jest sprzężone z wykrywalnym czynnikiem. W przypadku zestawów opartych na oligonukleotydach, zestaw może zawierać, na przykład: (1) oligonukleotyd, np., wykrywalny wyznakowany oligonukleotyd, który hybrydyzuje z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą biomarker lub (2) parę starterów użytecznych do amplifikacji cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej biomarker będący przedmiotem zainteresowania. Zestaw może zawierać również, np., czynnik buforujący, środek konserwujący, lub czynnik stabilizujący białko. Zestaw może zawierać również składniki konieczne do wykrywania wykrywalnego czynnika (np., enzym lub substrat). Zestaw może zawierać również próbkę kontrolną lub serię próbek kontrolnych, które można oznaczać i porównywać z zawartą próbką testową. Każdy składnik zestawu jest zwykle zamknięty w pojedynczym pojemniku i wszystkie z różnych pojemników znajdują się w pojedynczym opakowaniu wraz z instrukcjami do obserwowania czy testowany osobnik jest kandydatem do leczenia z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40. Metody wykrywania [0112] Rozważa się wszystkie sposoby specyficznego identyfikowania i ilościowego określania biomarkera, markera cytokinowego, lub białka czynnika związanego z CD40, będących przedmiotem zainteresowania (na przykład, biomarkera przeżywalności lub proliferacji komórkowej, biomarkera apoptozy, biomarkera szlaku sygnałowego CD40, w którym ma udział CD40L, obecnych w krążeniu rozpuszczalnych CD40 lub CD40L, CD40 lub CD40L na powierzchni komórki, lub klinicznie użytecznego markera prognostycznego) w próbce biologicznej osobnika będącego kandydatem. A zatem, poziom ekspresji

82 81 białka biomarkera będącego przedmiotem zainteresowania w próbce biologicznej wykrywa się za pomocą białka wiążącego zdolnego do specyficznego oddziaływania z tym białkiem biomarkera lub jego biologicznie aktywnym wariantem. Korzystnie, można stosować znakowane przeciwciała, ich części wiążące, lub innych partnerów wiążących. Słowo "znacznik", jeśli stosuje się go w niniejszym opisie, odnosi się do wykrywalnego związku lub kompozycji, który jest sprzężony bezpośrednio lub pośrednio z przeciwciałem, tworząc w ten sposób "znakowane" przeciwciało. Znacznik może być wykrywalny sam z siebie (np., znaczniki radioizotopowe lub znaczniki fluorescencyjne) lub, w przypadku znacznika enzymatycznego, mogą katalizować chemiczną przemianę związku lub kompozycji substratu, która jest wykrywalna. Przeciwciała do wykrywania białka biomarkera mogą być z pochodzenia monoklonalne lub poliklonalne, lub mogą być wytwarzane syntetycznie bądź rekombinacyjnie. Ilość skompleksowanego białka, na przykład, ilość białka biomarkera związanego z białkiem wiążącym, na przykład, przeciwciałem, które specyficznie wiąże się z białkiem biomarkera, określa się stosując standardowe metodologie wykrywania białka, znane specjalistom w tej dziedzinie. Szczegółowy przegląd projektów oznaczeń immunologicznych, teorii i protokołów można znaleźć w różnych tekstach z tej dziedziny (patrz, na przykład, Ausubel i in., red. (1995) Current Protocols in Molecular Biology) (Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY)); Coligan i in., red. (1994) Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). [0113] Dostępne są różne oznaczenia do wykrywania białek za pomocą znakowanych przeciwciał. W oznaczeniu jednoetapowym,

83 82 docelowe białko będące przedmiotem zainteresowania, które ma być wykryte, jeśli jest obecne, immobilizuje się i inkubuje ze znakowanym przeciwciałem. Znakowane przeciwciało wiąże się z immobilizowaną docelową cząsteczką białka. Po płukaniu w celu usunięcia niezwiązanych cząsteczek, próbkę oznacza się pod względem obecności znacznika. W standardowym formacie, w próbce jest oznaczane pojedyncze białko. Wykorzystując nowsze technologie multipleksowe, w pojedynczej próbce można oznaczać wiele białek stosując różne znaczniki dla każdego wykrywającego przeciwciała. [0114] W oznaczeniu dwuetapowym, będącą przedmiotem zainteresowania immobilizowaną docelową cząsteczkę białka inkubuje się z nieznakowanym przeciwciałem. Kompleks docelowy białko-nieznakowane przeciwciało, jeśli jest obecny, wiąże się następnie z drugim, znakowanym przeciwciałem, które jest specyficzne wobec nieznakowanego przeciwciała. Próbkę płucze się i oznacza pod względem obecności znacznika. [0115] Wybór markera stosowanego do znakowania przeciwciał będzie się różnić w zależności od zastosowania. Ponadto, wyboru markera bez trudu dokonana specjalista w tej dziedzinie. Takie znakowane przeciwciała można stosować w oznaczeniach immunologicznych, jak również do zastosowań histologicznych do wykrywania obecności dowolnego biomarkera lub białka, będących przedmiotem zainteresowania. Znakowane przeciwciała mogą być poliklonalne lub monoklonalne. Ponadto, przeciwciała stosowane do wykrywania białka, będącego przedmiotem zainteresowania, można znakować atomem promieniotwórczym, enzymem, grupą chromoforową lub fluorescencyjną, lub znacznikiem kolorymetrycznym, jak opisano w innym miejscu niniejszego opisu. Wybór znacznika

84 83 będzie również zależeć od pożądanych ograniczeń wykrywania. Oznaczenia enzymatyczne (ELISA) zazwyczaj umożliwiają wykrywanie barwnego produktu utworzonego w wyniku oddziaływań kompleksu wyznakowanego enzymem z substratem enzymu. Radionuklidy, które służą jako wykrywalne znaczniki obejmują, na przykład, J-131, J-123, J-125, Y-90, Re-188, Re-186, At- 211, Cu-67, Bi-212, oraz Pd-109. Przykłady enzymów, które mogą służyć jako wykrywalne znaczniki obejmują, ale nie ograniczają się do peroksydazy chrzanowej, fosfatazy alkalicznej, beta-galaktozydazy, oraz dehydrogenazy glukozo- 6-fosforanowej. Grupy chromoforowe obejmują, ale nie ograniczają się do fluoresceiny i rodaminy. Przeciwciała mogą być sprzęgane z tymi znacznikami metodami znanymi w nauce. Na przykład, enzymy i cząsteczki chromoforowe można sprzęgać z przeciwciałami za pomocą czynników sprzęgających, takich jak dialdehydy, karbodiimidy, dimaleimidy, i podobne. Alternatywnie, sprzęganie można przeprowadzać przez parę ligand-receptor. Przykładami odpowiednich par ligand-receptor są biotyna-awidyna lub biotina-streptawidyna, oraz przeciwciało-antygen. [0116] W niektórych przykładach, niniejsze ujawnienie rozważa stosowanie technik typu sandwich do wykrywania jednego lub więcej biomarkerów, lub innych białek będących przedmiotem zainteresowania, jak opisano powyżej w niniejszym opisie, w surowicy lub w innych płynach biologicznych. Jak opisano w międzynarodowej publikacji numer WO 93/09437, taka technika wykorzystuje dwa przeciwciała zdolne do wiązania się z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania: np., jedno, które jest wolne w roztworze, ale wyznakowane wykrywalnym związkiem chemicznym, drugie, które jest immobilizowane na

85 84 stałym nośniku. Przykłady chemicznych znaczników, które można stosować dla drugiego przeciwciała obejmują, ale nie ograniczają się do izotopów promieniotwórczych, związków fluorescencyjnych i enzymów lub innych cząsteczek, które wytwarzają barwne lub aktywne elektrochemicznie produkty, kiedy wystawia się je na działanie odczynnika lub substratu enzymu. Jeśli próbkę zawierającą biomarker lub inne białko będące przedmiotem zainteresowania umieści się w takim układzie, biomarker lub inne białko będące przedmiotem zainteresowania wiąże się z obydwoma, immobilizowanym przeciwciałem i znakowanym przeciwciałem. Wynikiem jest "sandwich" kompleksu immunologicznego na powierzchni nośnika. Skompleksowane białko wykrywa się przez odpłukiwanie niezwiązanych składników próbki i nadmiaru znakowanego przeciwciała, a następnie mierzy się ilości znakowanego przeciwciała tworzącego kompleks z białkiem na powierzchni nośnika. Oznaczenia immunologiczne typu sandwich są wysoce specyficzne i bardzo czułe, pod warunkiem, że stosuje się znaczniki o dobrych granicach wykrywalności. [0117] Próbki biologiczne można przeszukiwać indywidualnie; alternatywnie, wiele próbek płynów biologicznych można przeszukiwać w tym samym czasie, na przykład, wykorzystując konwencjonalny format 96-studzienkowej płytki do mikromiareczkowania, który jest szeroko stosowany i prosto zautomatyzowany. Jest również wiele komercjalnie dostępnych spektrometrów ("czytników płytek") do kalorymetrycznego analizowania 96-studzienkowych płytek. Ponadto, próbki biologiczne można przeszukiwać pod względem jednego biomarkera, lub wielu markerów, na przykład, panelu biomarkerów, stosując metody dobrze znane w nauce.

86 85 [0118] W korzystnych przykładach, ekspresję jednego lub więcej biomarkerów lub innych białek będących przedmiotem zainteresowania w próbce biologicznej, na przykład, próbce płynu ciała, wykrywa się przez oznaczenia radioimmunologiczne lub enzymatyczne oznaczenia immunologiczne (ELISA), enzymatyczne oznaczenia immunologiczne wiązania kompetytywnego, dot blot (patrz, na przykład, Promega Protocols and Applications Guide (wyd. 2; Promega Corporation (1991), Western blotting (patrz, na przykład, Sambrook i in. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, tom 3, rozdział 18 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY), chromatografię, korzystnie wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC), lub inne oznaczenia znane w nauce. A zatem, oznaczenia wykrywające mogą obejmować etapy takie jak, ale nie ograniczające się do immunoblottingu, immunodyfuzji, immunoelectroforezy, lub immunoprecypitacji. [0119] Dla danego oznaczenia wykrywania białka, próbce biologicznej, lub jej subpróbce, zawierającą komórki, w których zachodzi ekspresja CD40, zapewnia się kontakt z partnerem wiążącym, na przykład, przeciwciałem, lub wykrywalnie znakowanym przeciwciałem, dla biomarkera lub innego białka będącego przedmiotem zainteresowania, przez czas wystarczający do zapewnienia tworzenia kompleksów przeciwciało-antygen, a następnie związane przeciwciało wykrywa się, na przykład, stosując sposób opisany powyżej w niniejszym opisie. Przeciwciała i wykrywalnie znakowane przeciwciała dla biomarkerów, czynników związanych z CD40, oraz klinicznie użytecznych markerów prognostycznych opisanych w niniejszym opisie są dobrze znane w nauce i komercyjnie dostępne. Patrz, na przykład, przeciwciała

87 86 specyficzne wobec biomarkerów apoptozy, przeżywalności komórek, oraz szlaków sygnałowych CD40, jak również klinicznie użytecznych markerów prognostycznych, dostępnych, na przykład, z Cell Signaling Technology, Beverly, Massachusetts; DAKO, Copenhagen, Denmark; i podobne. Alternatywnie, przeciwciała lub wykrywalnie znakowane formy tych przeciwciał można wytwarzać stosując metody wytwarzania przeciwciał dobrze znane w nauce i dalej opisane poniżej w opisie. [0120] Liczne zestawy do oznaczeń dla biomarkerów kaspaz są komercyjnie dostępne. Na przykład, Homogeneous Caspases Assay (Roche Applied Sciences, Indianapolis, Indiana), jest fluorymetrycznym oznaczeniem do ilościowego określania aktywności kaspazy in vitro w mikropłytkach. Oznaczenie jest szczególnie użyteczne jako wysoko wydajne oznaczenie przesiewowe, umożliwiając na przykład, wykonanie 100 testów na 96-studzienkwoych płytkach, i 400 testów na 384- studzienkowych płytkach (nr kat ). Oznaczenie to umożliwia wykrywanie kilku kaspaz, obejmujących kaspazę-2, kaspazę-3, kaspazę-7, oraz w mniejszym stopniu, kaspazę-6, kaspazę-8, kaspazę-9 i kaspazę-10, w próbkach biologicznych, obejmujących, na przykład, surowicę lub osocze. Oznaczenie Cell Death Detection ELISAPLUS (nr kat ; Roche Applied Sciences, Indianapolis, Indiana) opiera się na zasadzie ilościowego enzymatycznego oznaczenia immunologicznego typu sandwich, z zastosowaniem mysich przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw, odpowiednio, DNA i histonom. Oznaczenie to umożliwia specyficzne wykrywanie i określanie ilościowe mono- i oligonukleosomów, które uwalniają się do cytoplazmy komórek, które umierają w

88 87 wyniku apoptozy. Można je stosować dla różnych próbek, obejmujących lizaty komórkowe, surowicę, supernatanty hodowlane i podobne. [0121] PS powierzchni komórkowej można wykrywać stosując dowolne komercyjnie dostępne odczynniki barwiące aneksyny V, które opierają się na wysokim powinowactwie aneksyny V do PS. Patrz, na przykład, odczynniki barwiące aneksyny V, komercyjnie dostępne w Roche Applied Science. Przez połączenie FITC z aneksyną V możliwa jest identyfikacja i ilościowe określanie komórek apoptotycznych na bazie pojedynczej komórki przy zastosowaniu cytometrii przepływowej. Jednoczesne barwienie komórek FITC-aneksyną V (zielona fluorescencja) oraz martwych komórek barwnikiem jodkiem propidyny (czerwona fluorescencja) może zapewniać rozróżnienie nienaruszonych komórek (FITC-PI-), komórek we wczesnej fazie apoptotycznej (FITC+PI-), oraz komórek w późnej fazie apoptotycznej lub komórek martwych (FITC+PI+). [0122] Ponadto, podwyższoną apoptozę w próbce biologicznej można potwierdzać metodami opartymi na kwasach nukleinowych, które wykrywają fragmentację DNA, charakterystyczną dla apoptozy. Jeśli rozdziela się z wykorzystaniem elektroforezy na żelach agarozowych, to apoptotyczny DNA początkowo wykazuje charakterystyczny wzór "drabinki", w przeciwieństwie do rozmazanych kwasów nukleinowych, które obserwuje się, na przykład, w martwicy lub innej niespecyficznej degradacji DNA. Ogólna technika histochemiczna do wykrywania fragmentacji DNA wykorzystuje DNA znakowany na końcach DNA. Takie zestawy są komercjalnie dostępne, tak jak APOLERT DNA Fragmentation Kit (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California). Oznaczenie to opiera się na znakowaniu nick-end

89 88 dutp za pośrednictwem terminalnej deoksynukleotydylotransferazy (Tdt) (TUNEL), gdzie Tdt katalizuje włączanie fluoresceiny-dutp przy wolnych końcach 3 -hydroksylowych fragmentowanego DNA w komórkach, które przechodzą apoptozę. [0123] Dowolną metodę znaną w nauce można stosować do wykrywania wytwarzania markerów cytokinowych. Standardowe oznaczenia obejmują format ELISA, gdzie na próbkę mierzy się jedną cytokinę. Alternatywnie, bardziej czułą technologią jest elektrochemiluminescencja (ECL). W jednym rozwiązaniu, wytwarzanie cytokin oznacza się stosując ECL, na przykład, wykorzystując wielowymiarowy system, taki jak komercyjnie dostępny Meso Scale Discovery system do wysokowydajnych oznaczeń cytokin (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland). Inne formaty, które umożliwiają jednoczesny pomiar wielu cytokin (lub innych analitów) w próbce, obejmują technologie multipleksowe. Jednym z takich produktów jest Luminex bead technology (Luminex Corporation, Austin, Texas), w której do 100 kodowanych kolorem mikrokuleczek opłaszczonych odczynnikami specyficznymi dla określonego biooznaczenia (tak jak przeciwciało do cytokiny) można mieszać razem i analizować stosując technologię laserową. [0124] Obecność jednego lub więcej biomarkerów, cytokin, czynników związanych z CD40, i klinicznie użytecznych markerów prognostycznych opisanych w niniejszym opisie w próbce biologicznej otrzymanej od osobnika będącego kandydatem można również określać na poziomie kwasu nukleinowego. Techniki opierające się na kwasach nukleinowych do oceniania ekspresji są dobrze znane w nauce i obejmują, na przykład, określanie poziomu biomarkera mrna w próbce biologicznej. Wiele metod wykrywania ekspresji wykorzystuje

90 89 wyizolowany RNA. Dowolną technikę izolacji RNA, która nie selekcjonuje wobec izolacji mrna można wykorzystywać do oczyszczania RNA (patrz, np., Ausubel i in., red. ( ) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York). Dodatkowo, duża liczba próbek tkankowych może być z łatwością poddawana obróbce przy wykorzystaniu technik dobrze znanych specjalistom w tej dziedzinie, tak jak, na przykład, jednoetapowy proces izolacji RNA ujawniony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer [0125] A zatem, w niektórych przykładach, wykrywanie biomarkera lub innego białka będącego przedmiotem zainteresowania oznacza się na poziomie kwasu nukleinowego stosując sondy kwasy nukleinowego. Termin "sonda kwasu nukleinowego" dotyczy dowolnej cząsteczki, która jest zdolna do selektywnego wiązania ze specyficzną zamierzoną docelową cząsteczką kwasu nukleinowego, na przykład, transkryptu nukleotydów. Sondy mogą byc syntetyzowane przez specjalistów w dziedzinie lub mogą one pochodzić z odpowiednich preparatów biologicznych. Sondy mogą być specjalnie zaprojektowane do znakowania, na przykład, znacznikiem radioaktywnym, znacznikiem fluorescencyjnym, enzymem, znacznikiem chemiluminescencyjnym, znacznikiem kolorymetrycznym, lub innymi znacznikami, które omówiono powyżej lub, które są znane w nauce. Przykłady cząsteczek, które można wykorzystywać jako sondy obejmują, ale nie ograniczają się do RNA i DNA. [0126] Na przykład, wyizolowany mrna można stosować w oznaczeniach hybrydyzacji lub amplifikacji, które obejmują, ale nie ograniczają się do, analiz Southern lub Northern, analiz reakcji łańcuchowej polimerazy i szeregu sond. Jedna z

91 90 metod wykrywania poziomów mrna obejmuje zapewnienie kontaktu wyizolowanego mrna z cząsteczką kwasu nukleinowego (sondą), która może hybrydyzować z mrna kodowanym przez wykrywany gen. Sondę kwasu nukleinowego może stanowić, na przykład, pełnej długości cdna, lub jego część, tak jak oligonukleotyd o długości co najmniej 7, 15, 30, 50, 100, 250 lub 500 nukleotydów wystarczający do specyficznej hybrydyzacji w surowych warunkach z mrna lub genomowym DNA kodującym biomarker, czynnik związany z CD40, lub klinicznie użyteczny marker prognostyczny opisany powyżej w niniejszym opisie. Hybrydyzacja mrna z sondą wskazuje, że biomarker lub inne docelowe białko będące przedmiotem zainteresowania ulega ekspresji. [0127] W jednym przykładzie, mrna immobilizuje się na nośniku stałym i zapewnia kontakt z sondą, na przykład poprzez rozwijanie wyizolowanego mrna na żelu agarozowym i przeniesienie mrna z żelu na membranę, taką jak nitroceluloza. W alternatywnym rozwiązaniu, sondę(dy) immobilizuje się na powierzchni stałej i mrna kontaktuje się z sondą(dami), na przykład, stosując mikromacierze genowe. Specjalista w tej dziedzinie może bez trudu przystosować znane metody wykrywania mrna do stosowania w wykrywaniu poziomu mrna, kodującego biomarkery lub inne białka będące przedmiotem zainteresowania. [0128] Alternatywna metoda określania poziomu mrna będącego przedmiotem zainteresowania obejmuje proces amplifikacji kwasu nukleinowego, np., RT-PCR (patrz, na przykład, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer ), reakcję łańcuchową ligazy (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: ), samowystarczalną replikację sekwencji

92 91 (Guatelli i in. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: ), układ amplifikacji transkrypcyjnej (Kwoh i in. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: ), replikazę Q-Beta (Lizardi i in. (1988) Bio/Technology 6: 1197), replikację według modelu obracającego się koła (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer ) lub dowolne inne metody amplifikacji kwasu nukleinowego, po których następuje wykrywanie zamplifikowanych cząsteczek z zastosowaniem technik dobrze znanych specjalistom w tej dziedzinie. Te schematy wykrywania są szczególnie użyteczne do wykrywania cząsteczek kwasu nukleinowego, jeśli takie cząsteczki występują w bardzo niskiej liczbie. W określonych aspektach według wynalazku, ekspresję biomarkera, lub ekspresję czynnika związanego z CD40 lub innego klinicznie użytecznego markera prognostycznego, ocenia się przez ilościową fluorogenną RT-PCR (tj., TaqMan System). [0129] Poziomy ekspresji RNA będącego przedmiotem zainteresowania można monitorować stosując blotting membranowy (taki jak wykorzystuje się w analizie hybrydyzacji, takiej jak Northern, Dot blot, i podobnych), lub mikrostudzienki, probówki, żele, perełki lub włókna z próbkami (lub dowolny nośnik stały zawierający związane kwasy nukleinowe). Patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach , , , oraz Wykrywanie ekspresji może również obejmować wykorzystywanie sond kwasów nukleinowych w roztworze. [0130] W jednym przykładzie, mikromacierze stosuje się do wykrywania ekspresji jednego lub więcej biomarkerów, czynników związanych z CD40 i/lub klinicznie użytecznych markerów prognostycznych. Mikromacierze są szczególnie

93 92 odpowiednie w tym celu, ze względu na powtarzalność pomiędzy różnymi eksperymentami. Mikromacierze DNA zapewniają jedną metodę do jednoczesnych pomiarów poziomów ekspresji dużej liczby genów. Każda macierz składa się z powtarzalnych wzorów wychwytujących sond przyłączonych do stałego nośnika. Wyznakowany RNA lub DNA poddaje się hybrydyzacji z komplementarnymi sondami na macierzy, a następnie wykrywa przez skanowanie laserowe. Określa się intensywność hybrydyzacji dla każdej sondy w macierzy i przekształca na wartość ilościową odpowiadającą względnym poziomom ekspresji genów. Patrz, opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach , i , i Mikromacierze o dużej gęstości oligonukleotydów są szczególnie użyteczne do określania profilu ekspresji genów dla dużej liczby RNA w próbce. [0131] Techniki syntezy takich mikromacierzy wykorzystujące metody syntezy mechanicznej opisano w, np. opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer Chociaż preferowana jest płaska powierzchnia macierzy, macierz może być wytworzona na powierzchni o praktycznie dowolnym kształcie lub nawet różnorodnych powierzchniach. Macierzami mogą być peptydy lub kwasy nukleinowe na perełkach, żelach, powierzchniach polimerycznych, włóknach, takich jak włókna optyczne, szkle lub innych odpowiednich substratach, patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach , , , i Macierze mogą być pakowane w taki sposób, aby umożliwić diagnostykę lub inne manipulacje kompleksowym urządzeniem. Patrz, na przykład, opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach i

94 93 [0132] W jednym podejściu, całkowity mrna wyizolowany z próbki przekształca się w znakowany crna, a następnie hybrydyzuje z macierzą oligonukleotydową. Każdą próbkę hybrydyzuje się z oddzielną macierzą. Odpowiednie poziomy transkryptu można obliczać odnosząc się do odpowiednich kontroli obecnych w macierzy i próbce. Czynniki terapeutyczne anty-cd40 [0133] Oznaczenia prognostyczne ex vivo opisane w niniejszym opisie można stosować do identyfikowania osobników dotkniętych chorobą zapalną i/lub autoimmunologiczną związaną z komórkami, w których zachodzi ekspresja CD40, którzy mogliby odnosić korzyść z leczenia z zastosowaniem dowolnego, będącego przedmiotem zainteresowania, czynnika terapeutycznego anty-cd40. Przedmiotem szczególnego zainteresowania są czynniki terapeutyczne anty-cd40, które modulują przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L i/lub modulują ADCC. Takie czynniki terapeutyczne anty- CD40 obejmują, ale nie ograniczają się do antagonistycznych przeciwciał skierowanych przeciw CD40, które blokują lub zakłócają przekazywanie sygnałów za pośrednictwem CD40L i/lub modulują aktywność ADCC, kiedy wiążą się z CD40, antagonistów CD40L, obejmujących przeciwciała skierowane przeciw CD40L, zmutowane postacie CD40L, które mogą wiązać się z CD40, ale które nie wyzwalają przekazywania sygnału przez CD40, rozpuszczalne CD40, rozpuszczalne postacie białek fuzyjnych zawierających CD40, oraz czynników farmakologicznych, które niszczą lub zakłócają wzajemne oddziaływania CD40L-CD40 i/lub zakłócają przekazywanie sygnałów przez CD40, na przykład, związki rozrywające wiązanie CD40:CD40L ujawnione w

95 94 publikacji zgłoszenia patentowego US nr Przedmiotem szczególnego zainteresowania są antagonistyczne czynniki terapeutyczne anty-cd40, na przykład, antagonistyczne przeciwciała skierowane przeciw CD40 oraz antagonistyczne przeciwciała skierowane przeciw CD40L, lub ich fragmenty wiążące antygen, które służą do blokowania przekazywania sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, oraz czynniki terapeutyczne anty-cd40, które modulują ADCC, na przykład, przeciwciała skierowane przeciw CD40 oraz ich fragmenty wiążące antygen. Przeciwciała skierowane przeciw CD40. [0134] Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw CD40 są dobrzez znane w nauce. Patrz, na przykład, części poświęcone antygenom komórek B w McMichael, red. (1987; 1989) Leukocyte Typing III and IV (Oxford University Press, New York); opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach ; ; ; ; światowy opis patentowy numer WO 00/63395; międzynarodowe publikacje o numerach WO 02/28905 i WO 02/28904; Gordon i in. (1988) J. Immunol. 140: 1425; Valle i in. (1989) Eur. J. Immunol. 19: 1463; Clark i in. (1986) PNAS 83: 4494; Paulie i in. (1989) J. Immunol. 142: 590; Gordon i in. (1987) Eur. J. Immunol. 17: 1535; Jabara i in. (1990) J. Exp. Med. 172: 1861; Zhang i in. (1991) J. Immunol. 146: 1836; Gascan i in. (1991) J. Immunol. 147: 8; Banchereau i in. (1991) Clin. Immuno. Spectrum 3: 8; oraz Banchereau i in. (1991) Science 251: 70. Inne przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw CD40 obejmują, ale nie ograniczają się do, humanizowanych przeciwciał skierowanych przeciw CD40, takich jak SGN-40 (Tai i in. (2004) Cancer Res. 64: ; opis patentowy Stanów

96 95 Zjednoczonych Ameryki numer ), które jest humanizowaną formą mysiego przeciwciała skierowanego przeciw CD40 SGN-14 (Francisco i in. (2000) Cancer Res. 60: ), oraz agonistyczne i antagonistyczne przeciwciała ujawnione w publikacji zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 2004/ [0135] W jednym przykładzie, oznaczenia prognostyczne ex vivo stosuje się do sprawdzania przydatności lub skuteczności leczenia z zastosowaniem antagonistycznych przeciwciał skierowanych przeciw CD40. Antagonistyczne przeciwciała skierowane przeciw CD40 do stosowania w metodach, obejmują przeciwciała monoklonalne lub ich fragmenty wiążące antygen, które są zdolne do specyficznego wiązania z ludzkim antygenem CD40, który ulega ekspresji na powierzchni ludzkiej komórki. W niektórych rozwiązaniach, antagonistyczne przeciwciała skierowane przeciw CD40, do stosowania w metodach według niniejszego wynalazku, wykazują silne powinowactwo wiązania z jednym miejscem dla antygenu powierzchni komórkowej CD40. Takie przeciwciała monoklonalne wykazują stałą równowagi dysocjacji (KD) dla CD40 wynoszącą co najmniej 10-5 M, co najmniej 3 X 10-5 M, korzystnie co najmniej 10-6 M do 10-7 M, korzystniej co najmniej 10-8 M do około M, mierzoną z zastosowaniem standardowego oznaczenia, takiego jak Biacore. Analiza Biacore jest znana w nauce, a szczegóły zawarto w "BIAapplications handbook." Metody opisane w światowym opisie patentowym numer WO 01/27160 można stosować do modulowania powinowactwa wiązania. [0136] Przedmiotem szczególnego zainteresowania są antagonistyczne przeciwciała skierowane przeciw CD40, które są wolne od znaczącej agonistycznej aktywności, jak

97 96 zdefiniowano powyżej w niniejszym opisie, ale wykazują aktywność antagonistyczną, kiedy wiążą się z antygenem na komórkach ludzkich. W jednym rozwiązaniu wynalazku, antagonistyczne przeciwciało skierowane przeciw CD40 jest wolne od zasadniczej aktywności agonistycznej w jednej odpowiedzi komórek B. W kolejnym przykładzie, antagonistyczne przeciwciało skierowane przeciw CD40 jest wolne od zasadniczej aktywności agonistycznej w więcej niż jednej odpowiedzi komórek B (np., proliferacji i różnicowania, lub proliferacji, różnicowania i wytwarzania przeciwciał). Odpowiednie przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw CD40 posiadają ludzkie regiony stałe; korzystnie posiadają one również całkowicie lub częściowo humanizowane regiony zrębu; a najkorzystniej są w pełni ludzkimi przeciwciałami lub ich fragmentami wiążącymi antygen. Przykładami takich przeciwciał monoklonalnych są przeciwciała oznaczone w niniejszym opisie jako CHIR-5.9 i CHIR [0137] Przeciwciała monoklonalne CHIR-5.9 i CHIR reprezentują antagonistyczne przeciwciała skierowane przeciw CD40 do stosowania w metodach według wynalazku. Przeciwciała CHIR-5.9 i CHIR są w pełni ludzkimi przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciw CD40 izotypu IgG1 wytwarzanymi przez linie komórkowe hybrydoma 131.2F8.5.9 (określanej w niniejszym opisie jako linia komórkowa 5.9) i 153.8E2.D10.D (określanej w niniejszym opisie jako linia komórkowa 12.12). Te linie komórkowe utworzono stosując splenocyty z immunizowanych ksenotypowych myszy zawierających locus ciężkiego łańcucha ludzkiej IgG1 i locus ludzkiego łańcucha κ (technologia XenoMouse ; Abgenix; Fremont, California). Utworzono fuzję komórek śledziony z mysimi

98 97 komórkami szpiczaka SP2/0 (Sierra BioSource). Otrzymane hybrydomy subklonowano kilka razy dla utworzenia stabilnej monoklonalnej linii komórkowej 5.9 i Inne przeciwciała według wynalazku można przygotowywać podobnie stosując myszy transgeniczne dla loci ludzkich immunoglobulin lub stosując inne metody znane w nauce i/lub opisane w niniejszym opisie. [0138] Ujawniono sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionów zmiennych przeciwciała CHIR-12.12, i sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych przeciwciała CHIR-5.9. Bardziej szczegółowo, sekwencje aminokwasowe lidera, regionów zmiennych i stałych dla łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego przeciwciała monoklonalnego mab CHIR przedstawiono w SEQ ID NO: 2 (pełna sekwencja dla łańcucha lekkiego przeciwciała monoklonalnego mab CHIR-12.12), SEQ ID NO: 4 (pełna sekwencja dla łańcucha ciężkiego przeciwciała monoklonalnego mab CHIR-12.12), i SEQ ID NO: 5 (pełna sekwencja dla wariantu łańcucha ciężkiego przeciwciała monoklonalnego mab CHIR przedstawionego w SEQ ID NO: 4, gdzie wariant zawiera podstawienie seryny w miejsce reszty alaniny w pozycji 153 SEQ ID NO: 4). Sekwencje nukleotydowe kodujące łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała monoklonalnego mab CHIR przedstawiono w SEQ ID NO: 1 (sekwencja kodująca dla łańcucha lekkiego przeciwciała monoklonalnego mab CHIR-12.12) i SEQ ID NO: 3 (sekwencja kodująca dla łańcucha ciężkiego przeciwciała monoklonalnego mab CHIR-12.12). Sekwencje aminokwasowe lidera, regionów zmiennych i stałych dla łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego przeciwciała monoklonalnego mab CHIR-5.9 przedstawiono w SEQ ID NO: 6 (pełna sekwencja łańcucha lekkiego przeciwciała monoklonalnego mab CHIR-5.9), SEQ ID

99 98 NO: 7 (pełna sekwencja łańcucha ciężkiego przeciwciała monoklonalnego mab CHIR-5.9), i SEQ ID NO: 8 (pełna sekwencja wariantu łańcucha ciężkiego przeciwciała monoklonalnego mab CHIR-5.9 przedstawionego w SEQ ID NO: 7, gdzie wariant zawiera podstawienie seryny w miejsce reszty alaniny w pozycji 158 SEQ ID NO: 7). Ponadto, hybrydomy, w których zachodzi ekspresja przeciwciał CHIR-5.9 i CHIR zdeponowano w ATCC z oznaczeniem depozytu patentowego PTA i PTA-5543, odpowiednio. [0139] Oprócz aktywności antagonistycznej, przeciwciała skierowane przeciw CD40 do stosowania w metodach według niniejszego wynalazku mogą mieć inny mechanizm działania przeciw komórkom nowotworowym. Na przykład, natywne przeciwciała CHIR-5.9 i CHIR wykazują aktywność ADCC. Alternatywnie, regiony zmienne przeciwciał CHIR-5.9 i CHIR mogą ulegać ekspresji w innym izotypie przeciwciała, niż wykazującym aktywność ADCC. Możliwe jest również sprzęganie natywnych form, rekombinowanych form, lub fragmentów wiążących antygen CHIR-5.9 lub CHIR z cytotoksyną, czynnikiem terapeutycznym lub aktywnym promieniotwórczo jonem metalu lub izotopem promieniotwórczym, jak opisano poniżej w niniejszym opisie. [0140] Przeciwciała monoklonalne CHIR-5.9 i CHIR wiążą się z rozpuszczalnym CD40 w oznaczeniach typu ELISA, zapobiegając wiązaniu liganda CD40 z CD40 na powierzchni komórki, i wypierają wcześniej związany ligand CD40, jak określono przez oznaczenie techniką cytometrii przepływowej. Przeciwciała CHIR--5.9 i CHIR współzawodniczą ze sobą o wiązanie z CD40, ale nie 15B8, przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciw CD40 opisanym w międzynarodowym

100 99 zgłoszeniu PCT numer PCT1US01/30857 opublikowanym jako światowy opis patentowy numer WO 02/28904, zatytułowanym "Human Anti-CD40 Antibodies," złożonym 2 października 2001 (numer akt pełnomocnika PP ). W testach in vitro badania wpływu proliferacji komórek B pochodzących od normalnych ludzkich osobników, CHIR-5.9 i CHIR działają jako antagonistyczne przeciwciała skierowane przeciw CD40. Ponadto, CHIR-5.9 i CHIR nie indukują silnej proliferacji ludzkich limfocytów pochodzących od normalnych osobników. Przeciwciała te są zdolne do zabijania komórek docelowych, w których zachodzi ekspresja CD40 przez zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową (ADCC). Powinowactwo wiązania CHIR-5.9 z ludzkim CD40 wynosi 1.2x10-8 M, a powinowactwo wiązania CHIR wynosi 5x10-10 M, jak określono w oznaczeniu Biacore. [0141] Inne antagonistyczne przeciwciała skierowane przeciw CD40, które wykazują właściwości wiązania takie jak opisane powyżej przeciwciała monoklonalne CHIR--5.9 i CHIR obejmują, ale nie ograniczają się do następujących: (1) przeciwciał monoklonalnych wytwarzanych przez linie komórkowe hybrydoma oznaczone jako 131.2F8.5.9 (określane w niniejszym opisie jako linia komórkowa 5.9) i 153.8E2.D10.D (określane w niniejszym opisie jako linia komórkowa 12.12), zdeponowane w ATCC z numerem depozytu patentowego PTA-5542 i numerem depozytu patentowego PTA-5543, odpowiednio; (2) przeciwciała monoklonalnego zawierającego sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji przedstawionej w SEQ ID NO: 2, sekwencji przedstawionej w SEQ ID NO: 4, sekwencji przedstawionej w SEQ ID NO: 5, obydwu sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 4, i

101 100 obydwu sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 5; (3) przeciwciała monoklonalnego zawierającego sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji przedstawionej w SEQ ID NO: 6, sekwencji przedstawionej w SEQ ID NO: 7, sekwencji przedstawionej w SEQ ID NO: 8, obydwu sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 7, i obydwu sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO:8; (4) przeciwciała monoklonalnego zawierającego sekwencję aminokwasową kodowaną przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową wybraną z grupy składającej się z sekwencji nukleotydowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1, sekwencji nukleotydowej przedstawionej w SEQ ID NO: 3, i obydwu sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 3; (5) przeciwciała monoklonalnego, które wiąże się z epitopem zdolnym do wiązania przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego przez linię komórek hybrydomy 5.9 lub linię komórek hybrydomy 12.12; (6) przeciwciała monoklonalnego, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 10 lub SEQ ID NO: 12; (7) przeciwciała monoklonalnego, które współzawodniczy z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-5.9 lub CHIR w oznaczeniu kompetytywnego wiązania; i (8) przeciwciała monoklonalnego, które jest fragmentem wiążącym antygen przeciwciała monoklonalnego CHIR lub CHIR-5.9 lub powyżej wymienionych przeciwciał monoklonalnych w punktach (1)-(7), przy czym fragment zachowuje zdolność specyficznego wiązania z ludzkim antygenem CD40. [0142] Specjaliści w tej dziedzinie będą wiedzieć, że przeciwciała i fragmenty wiążące antygen tych przeciwciał, opisanych w niniejszym opisie obejmują przeciwciała i ich

102 101 fragmenty wiążące antygen, które są wytwarzane na drodze rekombinacji z zastosowaniem metod dobrze znanych w nauce i opisanych poniżej w niniejszym opisie, i obejmują, na przykład, przeciwciała monoklonalne CHIR-5.9 i CHIR-12.12, które wytworzono rekombinacyjnie. [0143] Dodatkowe antagonistyczne przeciwciała skierowane przeciw CD40 obejmują przeciwciała monoklonalne określane jako 5D12, 3A8 i 3C6, które są wydzielane przez hybrydomy o numerach dostępu ATCC HB 11339, HB i HB 11340, odpowiednio. Patrz, na przykład, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer [0144] Inne antagonistyczne przeciwciała skierowane przeciw CD40 są znane w nauce. Patrz, na przykład, ludzkie przeciwciało skierowane przeciw CD40 wytwarzane przez hybrydomę oznaczoną F4-465 ujawnioną w publikacjach zgłoszeń patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach i F4-465 otrzymane z myszy HAC (Kuroiwa i in. (2000) Nature Biotech. 10: 1086 (2000)) i dlatego zachodzi w nich ekspresja ludzkiego łańcucha lekkiego lambda. Antagonistyczne przeciwciała skierowane przeciw CD40L [0145] W nauce znane są przeciwciała, które wiążą się z CD40L i w ten sposób zakłócają oddziaływania CD40/CD40L lub przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L. Przykłady obejmują, ale nie ograniczają się do tych ujawnionych w publikacji międzynarodowego opisu patentowego numer WO 95/ Konkretne przykłady obejmują, ale nie ograniczają się do antagonistycznych przeciwciał skierowanych przeciw CD40L oznaczonych i 24-31, które są wytwarzane

103 102 przez hybrydomy i 24-31, odpowiednio, zdeponowane z American Type Culture Collection (ATCC), University Blvd., Manassas, Va , po numerami dostępu ATCC HB i HB 11712, odpowiednio. Wytwarzanie przeciwciał [0146] Przeciwciała, na przykład, antagonistyczne przeciwciała skierowane przeciw CD40 ujawnione w niniejszym opisie i dowolne przeciwciało, które specyficznie wiąże się z biomarkerem lub innym będącym przedmiotem zainteresowania klinicznie użytecznym markerem prognostycznym, można wytwarzać stosując dowolną metodę znaną specjalistom w tej dziedzinie. A zatem, surowice poliklonalne można przygotowywać stosując konwencjonalne metody. Ogólnie, roztwór zawierający antygen będący przedmiotem zainteresowania, na przykład, antygen CD40 lub antygen CD40L, stosuje się najpierw do immunizacji odpowiedniego zwierzęcia, korzystnie myszy, szczura, królika lub kozy. Króliki i kozy są preferowane do przygotowywania surowic poliklonalnych ze względu na objętość surowicy jaką można otrzymać, i dostępność znakowanych przeciwciał skierowanych przeciw antygenom króliczym i kozim. [0147] Surowice poliklonalne można przygotowywać w zwierzęciu transgenicznym, korzystnie myszy niosącej loci ludzkich immunoglobulin. W korzystnym rozwiązaniu, komórki Sf9, w których zachodzi ekspresja białka będącego przedmiotem zainteresowania, na przykład, CD40 lub CD40L, stosuje się jako immunogen. Immunizację można również przeprowadzać przez mieszanie lub emulgowanie roztworu zawierającego antygen w soli fizjologicznej, korzystnie w adiuwancie, takim jak

104 103 kompletny adiuwant Freunda, i wstrzykiwanie mieszaniny lub emulsji pozajelitowo (na ogół podskórnie lub domięśniowo). Zazwyczaj wystarczająca jest dawka µg/iniekcję. Immunizację na ogół wzmacnia się 2-6 tygodni później przeprowadzając jedną lub wiej iniekcji białka w soli fizjologicznej, korzystnie stosują niekompletny adiuwant Freunda. Alternatywnie można wytwarzać przeciwciała przez immunizację in vitro, stosując metody znane w nauce, które dla celów tego wynalazku uważa się za równoważne z immunizacją in vivo. Poliklonalne surowice odpornościowe otrzymuje się przez pobieranie krwi od immunizowanego zwierzęcia do szklanego lub plastykowego pojemnika, inkubowanie krwi w temperaturze 25 C przez jedną godzinę, a następnie inkubowanie w temperaturze 4 C przez 2-18 godzin. Surowicę odzyskuje się przez wirowanie (np., 1000 x g przez 10 minut). Od królika można pobierać około ml na pobranie. [0148] Wytwarzanie komórek Sf 9 (Spodoptera frugiperda) ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer W przypadku CD40, w skrócie, sekwencje kodujące ludzki CD40 rekombinowano w bakulowirusie stosując wektory przenoszące. Plazmidy poddawano jednoczesnej transfekcji z dzikim typem DNA bakulowirusa typu dzikiego do komórek Sf 9. Rekombinowane komórki Sf9 zainfekowane bakulowirusem identyfikowano i klonalnie oczyszczano. [0149] Korzystnie w naturze przeciwciało jest monoklonalne. Przez "przeciwciało monoklonalne", w zamierzeniu, rozumie się przeciwciało otrzymane z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, tj., indywidualne przeciwciała tworzące populację są identyczne, z wyjątkiem możliwych naturalnie

105 104 występujących mutacji, które mogą występować w niewielkich ilościach. Termin ten nie jest ograniczony przez gatunek ani źródło przeciwciała. Termin obejmuje całe immunoglobuliny, jak również ich fragmenty, takie jak Fab, F(ab )2, Fv i inne, zachowujące funkcję wiązania antygenu przeciwciała. Przeciwciała monoklonalne są wysoce specyficzne, skierowane przeciw pojedynczym miejscom antygenowym; na przykład, w przypadku przeciwciała skierowanego przeciw CD40 lub przeciwciała skierowanego przeciw CD40L, wobec antygenu CD40 na powierzchni komórki lub antygenu CD40L na powierzchni komórki, odpowiednio. Ponadto, w przeciwieństwie do konwencjonalnych (poliklonalnych) preparatów przeciwciał, które zazwyczaj obejmują różne przeciwciała skierowane przeciw różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne jest skierowane przeciwko pojedynczej determinancie na antygenie. Określenie "monoklonalne" wskazuje na charakter przeciwciała jako otrzymanego z zasadniczo homogennej populacji przeciwciał, i nie oznacza ono wymagania wytwarzania przeciwciała jakąkolwiek określoną metodą. Na przykład, przeciwciała monoklonalne do stosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem mogą być przygotowane metodą z zastosowaniem hybrydomy, po raz pierwszy opisaną przez Kohlera i in (1975) Nature 256: 495, lub mogą być przygotowane za pomocą metod rekombinacji DNA (patrz, np., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer ). "Przeciwciała monoklonalne" można także izolować z fagowych bibliotek przeciwciał, stosując techniki opisane w, na przykład, Clackson i in (1991) Nature 352: ; Marks i in. (1991) J. Mol. Biol. 222: , i opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer

106 105 [0150] Przez "epitop", w zamierzeniu, rozumie się część cząsteczki antygenowej przeciw której wytwarzane jest przeciwciało i, z którą przeciwciało będzie się wiązać. Epitopy mogą zawierać liniowe reszty aminokwasowe (tj., reszty w obrębie epitopu są ustawione kolejno jedna za drugą w sposób liniowy), nieliniowe reszty aminokwasowe (określane w opisie jako "nieliniowe epitopy"; te epitopy nie są ustawione kolejno), lub zarówno liniowe, jak i nieliniowe reszty aminokwasowe. [0151] Przeciwciała monoklonalne można przygotowywać stosując metodę Kohlera i in. (1975) Nature 256: , lub jej modyfikację. Zazwyczaj, myszy immunizuje się roztworem zawierającym antygen. Immunizację można przeprowadzać przez mieszanie lub emulgowanie roztworu zawierającego antygen w soli fizjologicznej, korzystnie w adiuwancie, takim jak kompletny adiuwant Freunda, i wstrzykiwanie mieszaniny lub emulsji pozajelitowo. Dowolną metodę immunizacji znaną w nauce można stosować do otrzymywania przeciwciał monoklonalnych według wynalazku. Po immunizacji zwierzęcia, śledzionę (i ewentualnie, kilka dużych węzłów limfatycznych) usuwa się i rozdziela na pojedyncze komórki. Komórki śledziny można przeszukiwać, nakładając zawiesinę komórek na płytkę lub studzienkę opłaszczoną antygenem będącym przedmiotem zainteresowania. Komórki B, w których zachodzi ekspresja związanej z błoną immunoglobuliny specyficznej wobec antygenu, wiążą się z płytką i nie ulegają wypłukaniu. Otrzymane komórki B, lub wszystkie rozdzielone komórki śledziony, indukuje się następnie w celu fuzji z komórkami szpiczaka dla utworzenia hybrydom, i hoduje w podłożu selektywnym. Otrzymane komórki wysiewa się na płytki stosując

107 106 szereg kolejnych rozcieńczeń i ocenia pod względem wytwarzania przeciwciał, które specyficznie wiążą się z antygenem będącym przedmiotem zainteresowania (a, które nie wiążą się z niezwiązanymi antygenami). Wybrane hybrydomy wydzielające przeciwciała monoklonalne (mab) hoduje się następnie albo in vitro (np., w butelkach do hodowli tkankowych lub reaktorach z włóknami cylindrycznymi), bądź in vivo (jako wysięk otrzewnowy u myszy). [0152] Jeśli przeciwciała, na przykład, antagonistyczne przeciwciała skierowane przeciw CD40 lub antagonistyczne przeciwciała skierowane przeciw CD40L, przygotowuje się z zastosowaniem metod rekombinacji DNA, DNA kodujący przeciwciała monoklonalne z łatwością izoluje się i sekwencjonuje przy użyciu konwencjonalnych procedur (np. przy wykorzystaniu sond oligonukleotydowych, które są zdolne do specyficznego wiązania z genami kodującymi łańcuchy ciężkie i lekkie mysich przeciwciał). Opisane w niniejszym opisie komórki hybrydomy służą jako korzystne źródło takiego DNA. Po wyizolowaniu, DNA można umieszczać w wektorach ekspresyjnych, które następnie poddaje się transfekcji do komórek gospodarza, takich jak komórki E. coli, małpie komórki COS, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), lub komórki szpiczaka, które inaczej nie wytwarzają białka immunoglobuliny, w celu uzyskania syntezy przeciwciał monoklonalnych w rekombinowanych komórkach gospodarza. Artykuły przeglądowe dotyczące rekombinacyjnej ekspresji w bakteriach DNA kodującego przeciwciała obejmują Skerra i in. (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5: 256 i Phickthun (1992) Immunol. Revs. 130: 151. Alternatywnie, przeciwciało można wytwarzać w linii komórkowej, takiej jak linia komórek CHO,

108 107 jak ujawniono w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach ; ; oraz W skrócie, linię komórkową transfekuje się wektorami zdolnymi do ekspresji, odpowiednio, łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego. Przez transfekcję obu białek na oddzielnych wektorach, mogą być wytwarzane przeciwciała chimeryczne. Inną korzyścią jest prawidłowa glikozylacja przeciwciała. [0153] Antagonistyczne przeciwciało skierowane przeciw CD40, na przykład przeciwciało monoklonalne CHIR lub CHIR- 5.9, bądź ich fragment wiążący antygen, wytwarza się w komórkach CHO z zastosowaniem układu ekspresji genu GS (Lonza Biologics, Portsmouth, New Hampshire), który wykorzystuje syntetazę glutaminy jako marker. Patrz, również opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach ; ; ; ; ; ; ; oraz [0154] Ponadto, przeciwciała mogą być przeciwciałami chimerycznymi, które mają pożądane właściwości wiązania. Tak więc, na przykład, chimeryczne przeciwciała skierowane przeciw CD40 mogą mieć właściwości wiązania przeciwciał monoklonalnych CHIR-5.9 i CHIR-12.12, opisywanych w niniejszym opisie. Przez przeciwciała "chimeryczne", w zamierzeniu, rozumie się przeciwciała, które najkorzystniej uzyskano przy użyciu technik rekombinacji kwasu deoksyrybonukleinowego i które zawierają zarówno ludzkie (obejmujące immunologicznie "zbliżone" gatunki, np. szympansy) jak i inne niż ludzkie składniki. A zatem, region stały przeciwciała chimerycznego jest najkorzystniej zasadniczo identyczny z regionem stałym naturalnego przeciwciała ludzkiego; region zmienny przeciwciała

109 108 chimerycznego najkorzystniej pochodzi ze źródła innego niż człowiek i wykazuje pożądaną swoistość antygenową w stosunku do antygenu, będącego przedmiotem zainteresowania, na przykład, antygenu CD40 lub CD40L. Źródłem innym niż ludzkie może być dowolny kręgowiec, którego można wykorzystać do wytwarzania przeciwciał skierowanych przeciwko ludzkiemu antygenowi lub materiałowi zawierającemu ludzki antygen CD40. Takie źródła inne niż ludzkie obejmują, ale nie ograniczają się do gryzoni (np. królika, szczura, myszy itp.; patrz, na przykład, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer oraz naczelnych innych niż człowiek (np., makakowate, małpy człekokształtne, itp.; patrz, na przykład, opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach i ). Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie "immunologicznie aktywny", jeśli stosuje się w odniesieniu, na przykład, do chimerycznych przeciwciał skierowanych przeciw CD40 lub chimerycznych przeciwciał skierowanych przeciw CD40L, oznacza chimeryczne przeciwciało, które wiąże się z, odpowiednio, ludzkim CD40 lub ludzkim CD40L. [0155] Przez "humanizowane", w zamierzeniu, rozumie się formy przeciwciał, które zawierają minimalną sekwencję pochodzącą z innych niż ludzkie sekwencje immunoglobulin. W większości, humanizowane przeciwciała są ludzkimi immunoglobulinami (przeciwciało biorcy), w których reszty z regionu hiperzmiennego (znanego również jako region determinującym komplementarność lub CDR) biorcy zastąpiono resztami z regionu hiperzmiennego gatunku innego niż człowiek (dawca przeciwciała), takiego jak mysz, szczur, królik lub naczelny inny niż człowiek, które wykazuje pożądaną specyficzność,

110 109 powinowactwo i zdolność wiązania. Wyrażenie "region determinujący komplementarność" odnosi się do sekwencji aminokwasowych, które wspólnie definiują powinowactwo wiązania i specyficzność naturalnego regionu Fv miejsca wiązania natywnej immunoglobuliny. Patrz, np., Chothia i in. (1987) J. Mol. Biol. 196: ; Kabat i in. (1991) U. S. Dept. of Health and Human Services, publikacja NIH numer ). Wyrażenie "region stały" dotyczy części cząsteczki przeciwciała, która nadaje funkcje efektorowe. We wcześniejszych badaniach ukierunkowanych na wytwarzanie nieimmunogennych przeciwciał do stosowania w terapii chorób u ludzi, mysie regiony stałe podstawiono ludzkimi regionami stałymi. Regiony stałe tych humanizowanych przeciwciał pochodziły z immunoglobulin ludzkich. Jednakże, te humanizowane przeciwciała nadal jednak wywoływały niepożądane i potencjalnie niebezpieczne odpowiedzi immunologiczne u ludzi oraz wykazywały mniejsze powinowactwo. Humanizowane przeciwciała, na przykład, humanizowane przeciwciała skierowane przeciw CD40, do stosowania w metodach według niniejszego wynalazku, wykazują charakterystykę wiązania podobną do tej wykazywanej przez przeciwciało macierzyste będące przedmiotem zainteresowania, na przykład, przeciwciała monoklonalne CHIR-5.9 i CHIR-12.12, opisane w niniejszym opisie. [0156] Humanizację można zasadniczo przeprowadzać zgodnie z metodą Wintera i współpracowników (Jones i in. (1986) Nature 321: ; Riechmann i in. (1988) Nature 332: ; Verhoeyen i in. (1988) Science 239: ), przez podstawienie CDR lub sekwencji CDR gryzonia bądź zmutowanych CDR lub sekwencji CDR gryzonia odpowiednimi sekwencjami

111 110 ludzkich przeciwciał. Patrz również opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach ; ; ; ; W niektórych przypadkach, reszty w regionach zrębu jednego lub więcej regionów zmiennych ludzkiej immunoglobuliny zastępuje się odpowiadającymi resztami innymi niż ludzkie (patrz, na przykład, opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach ; ; ; i ). Ponadto, humanizowane przeciwciała mogą zawierać reszty, które nie występują ani w przeciwciale biorcy, ani w przeciwciale dawcy. Takich modyfikacji dokonuje się w celu dalszego ulepszenia przeciwciała (np., w celu uzyskania pożądanego powinowactwa). Na ogół, humanizowane przeciwciało będzie zawierać zasadniczo wszystkie z co najmniej jednej, a zazwyczaj dwóch domen zmiennych, w których wszystkie lub zasadniczo wszystkie regiony hiperzmienne odpowiadają tym z immunoglobuliny innej niż ludzka i wszystkie lub zasadniczo wszystkie regiony zrębu są tymi z sekwencji immunoglobuliny ludzkiej. Humanizowane przeciwciało ewentualnie będzie również zawierać co najmniej część regionu stałego immunoglobuliny (Fc), zazwyczaj tego z immunoglobuliny ludzkiej. Dla zapoznania się w dalszymi szczegółami patrz Jones i in. (1986) Nature 331: ; Riechmann i in. (1988) Nature 332: ; i Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: Zgodnie z tym, takie "humanizowane" przeciwciała mogą obejmować przeciwciała, w których zasadniczo mniej niż nienaruszona ludzka domena zmienna została zastąpiona odpowiadającą jej sekwencją pochodzącą od gatunku innego niż człowiek. W praktyce, humanizowane przeciwciała są typowo ludzkimi przeciwciałami, w których

112 111 niektóre reszty CDR i niekiedy niektóre reszty zrębu podstawiono resztami pochodzącymi z analogicznych miejsc w przeciwciałach gryzoni. Patrz, na przykład, opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach ; ; ; ; Patrz również opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer , oraz międzynarodowa publikacja numer WO 01/27160, gdzie ujawniono humanizowane przeciwciała oraz techniki wytwarzania humanizowanych przeciwciał wykazujących ulepszone powinowactwo dla wcześniej określonego antygenu. [0157] Metody według niniejszego wynalazku można również stosować w praktyce wykorzystując ksenogeniczne lub modyfikowane przeciwciała wytwarzane w gospodarzu będącym ssakiem innym niż człowiek, w szczególności myszy transgenicznej, charakteryzującej się inaktywowanymi endogennymi loci (Ig). W takich transgenicznych zwierzętach, kompetentne endogenne geny dla ekspresji podjednostek lekkich i ciężkich immunoglobulin gospodarza unieczynnia się i podstawia analogami loci ludzkich immunoglobulin. Te zwierzęta transgeniczne wytwarzają przeciwciała ludzkie w zasadzie przy braku lekkich lub ciężkich podjednostek immunoglobuliny gospodarza. Patrz, na przykład, opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach i [0158] W pełni ludzkie przeciwciała skierowane przeciw CD40, na przykład, uzyskuje się przez immunizację transgenicznych myszy. Jedną z takich myszy uzyskuje się za pomocą technologii XenoMouse (Abgenix; Fremont, California), i ujawniono ją w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach , i W celu

113 112 wytwarzania ujawnionych w niniejszym opisie przeciwciał, myszy transgeniczne, pod względem locus łańcucha ciężkiego ludzkiej Ig G1 i locus ludzkiego łańcucha lekkiego κ, immunizuje się komórkami Sf 9, w których zachodzi ekspresja ludzkiego CD40. Myszy mogą być również transgeniczne pod względem innych izotypów. W pełni ludzkie przeciwciała skierowane przeciw CD40 użyteczne w metodach według niniejszego wynalazku cechują się właściwościami wiązania podobnymi do ujawnionych w niniejszym opisie przeciwciał monoklonalnych CHIR-5.9 i CHIR [0159] Fragmenty danego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania, na przykład, przeciwciała skierowanego przeciw CD40 lub przeciwciała skierowanego przeciw CD40L, są odpowiednie do stosowania w metodach według wynalazku, tak długo, jak długo zachowują pożądane powinowactwo przeciwciała pełnej długości. Tak więc, na przykład, fragment przeciwciała skierowanego przeciw CD40 będzie zachowywał zdolność do wiązania się z antygenem powierzchniowym CD40 komórek B. Takie fragmenty cechują się właściwościami podobnymi do odpowiadającego im przeciwciała pełnej długości. A zatem, na przykład, fragment pełnej długości przeciwciała antagonistycznego skierowanego przeciw CD40 będzie specyficznie wiązać ludzki antygen CD40 ulegający ekspresji na powierzchni komórki ludzkiej i jest wolny od znaczącej aktywności agonistycznej, ale wykazuje aktywność antagonistyczną po związaniu z antygenem CD40 na ludzkiej komórce, w której zachodzi ekspresja CD40. Takie fragmenty określane są w niniejszym opisie jako fragmenty "wiążące antygen". [0160] Odpowiednie wiążące antygen fragmenty przeciwciała

114 113 zawierają część przeciwciała pełnej długości, na ogół część wiążącą antygen lub jej region zmienny. Przykłady fragmentów przeciwciał obejmują, ale nie są ograniczone do, fragmentów Fab, F(ab ) 2 i Fv oraz jednołańcuchowych cząsteczek przeciwciał. Przez "Fab", w zamierzeniu, rozumie się monowalentny, wiążący antygen fragment immunoglobuliny, złożony z łańcucha lekkiego i części łańcucha ciężkiego. Przez F(ab ) 2, w zamierzeniu, rozumie się biwalentny, wiążący antygen fragment immunoglobuliny, zawierający oba łańcuchy lekkie i część obu łańcuchów ciężkich. Przez fragmenty przeciwciał "jednołańcuchowe Fv" lub "sfv", w zamierzeniu, rozumie się fragmenty zawierające domeny V H i V L przeciwciała, przy czym domeny te występują w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym. Patrz, na przykład, opisy patentowe US nr , , i Ogólnie, polipeptyd Fv zawiera ponadto łącznik polipeptydowy pomiędzy domenami V H i V L, umożliwiający sfv na utworzenie pożądanej struktury do wiązania antygenu. Dla zapoznania się z przeglądem sfv patrz Pluckthun (1994) w The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, tom 113, wyd. Rosenburg and Moore (Springer-Verlag, New York), str Fragmenty wiążące antygen z antagonistycznych przeciwciał skierowanych przeciw CD40, ujawnionych w niniejszym opisie, mogą być również sprzężone z cytotoksyną, powodując efekt zabijania komórek docelowych, jak opisano poniżej w niniejszym opisie. [0161] Przeciwciała lub fragmenty przeciwciał można izolować z fagowych bibliotek przeciwciał, utworzonych z zastosowaniem technik opisanych w, na przykład, McCafferty i in. (1990) Nature 348: (1990) i opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer Clackson i in. (1991)

115 114 Nature 352: oraz Marks i in. (1991) J. Mol. Biol. 222: opisali izolowanie przeciwciał, odpowiednio, mysich i ludzkich, z zastosowaniem bibliotek fagowych. Kolejne publikacje opisują wytwarzanie ludzkich przeciwciał o wysokim powinowactwie (zakres nm) przez tasowanie łańcuchów (Marks i in. (1992) Bio/Technology 10: ), jak również infekcję kombinatoryczną i rekombinację in vivo jako strategię konstruowania bardzo dużych bibliotek fagowych (Waterhouse i in. (1993) Nucleic. Acids Res. 21: ). A zatem, techniki te stanowią dobre alternatywy dla tradycyjnych technik hybrydom przeciwciał monoklonalnych do izolowania przeciwciał monoklonalnych. [0162] Opracowano różne techniki dla wytwarzania fragmentów przeciwciał. Tradycyjnie fragmenty te pochodziły z trawienia proteolitycznego nienaruszonych przeciwciał (patrz, np., Morimoto i in. (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: (1992) oraz Brennan i in. (1985) Science 229: 81). Jednakże, obecnie fragmenty te mogą być wytwarzane bezpośrednio przez rekombinowane komórki gospodarza. Na przykład, fragmenty przeciwciał można izolować z fagowych bibliotek przeciwciał omówionych powyżej. Alternatywnie, fragmenty Fab -SH można bezpośrednio odzyskiwać z E. coli i chemicznie sprzęgać z utworzeniem fragmentów F(ab ) 2 (Carter i in. (1992) Bio/Technology 10: ). Zgodnie z innym podejściem, fragmenty F(ab ) 2 można izolować bezpośrednio z hodowli rekombinowanych komórek gospodarza. Inne techniki wytwarzania fragmentów przeciwciał będą oczywiste dla specjalisty. [0163] Antagonistyczne przeciwciała skierowane przeciw CD40 do stosowania w metodach obejmują, ujawnione w niniejszym

116 115 opisie, przeciwciała monoklonalne CHIR-5.9 i CHIR-12.12, jak również przeciwciała różniące się od tych przeciwciał, ale zachowujące regiony CDR; oraz przeciwciała z jedno lub więcej aminokwsową addycją(jami), delecją(jami), lub podstawieniem(niami), przy czym aktywność antagonistyczną mierzy się przez hamowanie proliferacji i/lub różnicowania komórek B. Objęte są również deimmunizowane przeciwciała, szczególnie deimmunizowane antagonistyczne przeciwciała skierowane przeciw CD40, które można wytwarzać w sposób opisany w, na przykład, publikacjach WO 98/52976 i WO W tym sposobie, reszty w obrębie antagonistycznych przeciwciał skierowanych przeciw CD40 według wynalazku są zmodyfikowane w taki sposób, aby spowodować, że przeciwciała nie są immunogenne lub są mniej immunogenne dla ludzi, przy jednoczesnym zachowaniu ich aktywności antagonistycznej wobec ludzkich komórek, w których zachodzi ekspresja CD40, przy czym taką aktywność mierzy się stosując oznaczenia opisane w innym miejscu niniejszego opisu. Objęte są również białka fuzyjne zawierające przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania, na przykład, antagonistyczne przeciwciało skierowane przeciw CD40 lub antagonistyczne przeciwciało skierowane przeciw CD40L, lub jego fragment, które to białka fuzyjne można syntetyzować lub uzyskiwać ich ekspresję z odpowiednich wektorów polinukleotydowych, jak jest znane w nauce. Takie białka fuzyjne opisano w odniesieniu do sprzęgania przeciwciał, jak opisano w innych miejscach w opisie. [0164] Wszystkie znane przeciwciała wykazujące specyficzność wiązania, będącą przedmiotem zainteresowania, mogą zawierać warianty sekwencji wytworzone metodami opisanymi w, na

117 116 przykład, publikacjach patentowych o numerach EP A1, WO 00/34317 i WO 98/ Na przykład, wykazano, że sekwencje w obrębie CDR mogą powodować wiązanie się przeciwciała z MHC klasy II i wywoływać niepożądaną odpowiedź pomocniczych komórek T. Podstawienie konserwatywne może umożliwić, że przeciwciało zachowuje aktywność wiązania, jednak traci zdolność do wyzwalania niepożądanej odpowiedzi komórek T. Wszelkie takie konserwatywne lub niekonserwatywne podstawienia można dokonywać za pomocą znanych w tej dziedzinie metod, takich jak te opisane w innych miejscach niniejszego opisu, a uzyskane przeciwciała można również stosować w metodach. Warianty przeciwciał można rutynowo badać pod względem określonej aktywności, na przykład, aktywności antagonistycznej, powinowactwa i specyficzności, stosując metody opisane w niniejszym opisie. [0165] Jeśli czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 jest antagonistyczne przeciwciało skierowane przeciw CD40, antagonistyczne przeciwciało skierowane przeciw CD40 wytworzone którąkolwiek z metod opisanych powyżej, lub dowolną inną metodą nie ujawnioną w niniejszym opisie, można go stosować w sposób podobny do przeciwciała CHIR lub CHIR-5.9, jeśli posiada co najmniej jedną z następujących biologicznych aktywności: in vitro i/lub in vivo: hamowanie wydzielania immunoglobulin przez prawidłowe ludzkie komórki B krwi obwodowej stymulowane przez komórki T; hamowanie przeżywalności i/lub proliferacji prawidłowych ludzkich komórek B krwi obwodowej, stymulowanych przez komórki wykazujące ekspresję CD40L lub rozpuszczalnego ligandu CD40 (scd40l); hamowanie przeżywalności i/lub proliferacji prawidłowych ludzkich komórek B krwi obwodowej stymulowanych

118 117 przez komórki Jurkat T; hamowanie "przetrwania" antyapoptotycznych sygnałów międzykomórkowych w dowolnej komórce stymulowanej przez scd40l lub CD40L fazy stałej; oraz, hamowanie transdukcji sygnału CD40 w dowolnej komórce po ligacji z scd40l lub CD40L fazy stałej, delecji, energii i/lub tolerancji indukcji komórek docelowych, niosących CD40 lub komórek niosących ligandy pokrewne do CD40 obejmujące, ale bez ograniczeń, komórki T i komórki B, indukcji ekspansji lub aktywacji regulatorowych komórek T CD4+CD25+ (patrz na przykład, odrzucanie specyficznej alloantygenowo tkanki dawcy przez zakłócanie CD40-CD40L, van Maurik i in. (2002) J. Immunol. 169: ), cytotoksyczności przez dowolny mechanizm (obejmujący, ale nie ograniczający się do, zależnej od przeciwciał cytotosyczności komórkowej (ADCC), zależnej od dopełniacza cytotoksyczności (CDC), regulacji zmniejszającej proliferację i/lub apoptozę w komórkach docelowych), modulację wydzielania cytokin przez komórki docelowe i/lub ekspresję cząsteczek powierzchniowych komórki, oraz ich kombinacji. Oznaczenia takich aktywności biologicznych można przeprowadzać jak opisano w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym numer PCT/US2004/ opublikowanym jako światowy opis patentowy numer WO2005/ (numer akt pełnomocnika PP (035784/282916)), zatytułowanym "Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use," złożonym 4 listopada Patrz również oznaczenia opisane w Schultze i in. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: ; Denton i in. (1998) Pediatr: Transplant. 2: 6-15; Evans i in. (2000) J. Immunol. 164: ; Noelle (1998) Agents Actions Supl. 49: 17-22; Lederman i in. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3: 77-86; Coligan i in.

119 118 (1991) Current Protocols in Immunology 13: 12; Kwekkeboom i in. (1993) Immunology 79: ; i opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach oraz [0166] Reprezentatywnym oznaczeniem do wykrywania antagonistycznych przeciwciał skierowanych przeciw CD40 specyficznych względem zidentyfikowanych w niniejszym opisie epitopów antygenu CD40 jest "oznaczenie wiązania kompetytywnego". Oznaczenia wiązania kompetytywnego są oznaczeniami serologicznymi, w których nieznane substancje są wykrywane i ilościowo określane na podstawie ich zdolności do hamowania wiązania, wyznakowanego znanego ligandu ze swoistym dla niego przeciwciałem. Określa je także jako oznaczenie hamowania kompetytywnego W reprezentatywnym oznaczeniu wiązania kompetytywnego, wyznakowany polipeptyd CD40 jest wytrącany przez będące kandydatami przeciwciała w próbce, na przykład, w połączeniu z przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko jednemu lub więcej epitopom przeciwciał monoklonalnych według wynalazku. Przeciwciała skierowane przeciw CD40, które specyficznie reagują z epitopem będącym przedmiotem zainteresowania, można identyfikować przez przeszukiwanie serii przeciwciał wytworzonych przeciw białku CD40 lub fragmentowi białka zawierającego określony epitop będącego przedmiotem zainteresowania białka CD40. Na przykład, dla ludzkiego CD40 epitopy będące przedmiotem zainteresowania obejmują epitopy zawierające liniowe i/lub nieliniowe reszty aminokwasowe krótkiej izoformy ludzkiego CD40 (patrz numer dostępu GenBank NP_690593) przedstawione w SEQ ID NO: 10, kodowane przez sekwencję przedstawioną w SEQ ID NO: 9; patrz również numer dostępu NM_152854), lub długiej izoformy ludzkiego CD40

120 119 (patrz numery dostępu GenBank CAA43045 i NP_001241, przedstawionej w SEQ ID NO: 12, kodowanej przez sekwencję przedstawioną w SEQ ID NO: 11; patrz numery dostępu GenBank X60592 i NM_001250). Alternatywnie, oznaczenia wiązania kompetytywnego z wcześniej zidentyfikowanymi odpowiednimi antagonistycznymi przeciwciałami skierowanymi przeciw CD40 można stosować do selekcjonowania przeciwciał monoklonalnych porównywalnych do wcześniej zidentyfikowanych przeciwciał. [0167] Przeciwciała stosowane w takich oznaczeniach immunologicznych mogą być znakowane lub nieznakowane. Przeciwciała nieznakowane można stosować w aglutynacji; przeciwciała znakowane można stosować w wielu rozmaitych oznaczeniach, z wykorzystaniem rozmaitych znaczników. Wykrywanie tworzenia się kompleksów przeciwciało-antygen pomiędzy przeciwciałem skierowanycm przeciw CD40 a będącym przedmiotem zainteresowania epitopem można ułatwić przez przyłączenie wykrywalnej substancji do przeciwciała. Odpowiednie sposoby wykrywania obejmują stosowanie znaczników, takich jak radionuklidy, enzymy, koenzymy, czynniki fluorescencyjne, czynniki chemiluminescencyjne, chromogeny, substraty lub ko-faktory enzymów, inhibitory enzymów, kompleksy grup prostetycznych, wolne rodniki, cząstki, barwniki i podobne. Przykłady odpowiednich enzymów obejmują peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, β- galaktozydazę lub acetylocholinesterazę; przykłady odpowiednich kompleksów grup prostetycznych obejmują streptawidynę/biotynę i awidynę/biotynę; przykłady odpowiednich materiałów fluorescencyjnych obejmują umbeliferon, fluoresceinę, izotiocyjanian fluoresceiny, rodaminę, dichlorotriazynyloamina fluoresceiny, chlorek

121 120 dansylu lub fikoerytrynę; przykładem materiału luminescencyjnego jest luminol; przykłady materiałów bioluminescencyjnych obejmują lucyferazę, lucyferynę i ekworynę; a przykłady odpowiednich materiałów radioaktywnych obejmują 125 J, 131 J, 35 S, lub 3 H. Takie wyznakowane odczynniki można stosować w wielu dobrze znanych oznaczeniach, takich jak oznaczenia radioimmunologiczne, enzymatyczne oznaczenia immunologiczne, np. ELISA, fluorescencyjne oznaczenia immunologiczne i tym podobne. Patrz na przykład, opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach ; ; ; i [0168] Każde z wcześniej opisanych przeciwciał, na przykład, antagonistyczne przeciwciała skierowane przeciw CD40 lub fragmenty tych przeciwciał, można sprzęgać przed użyciem w metodach. Metody wytwarzania sprzężonych przeciwciał są znane w nauce. Tak więc, przeciwciało można znakować, stosując znakowanie pośrednie albo podejście ze znakowaniem pośrednim. Przez "znakowanie pośrednie" albo "podejście ze znakowaniem pośrednim", w zamierzeniu, rozumie się, że czynnik chelatujący jest kowalencyjnie związany z przeciwciałem i co najmniej jeden radionuklid jest wstawiony do czynnika chelatującego. Patrz, na przykład, czynniki chelatujące i radionuklidy opisane w Srivagtava i Mease (1991) Nucl. Med. Bio. 18: Odpowiednie znaczniki obejmują fluorofory, chromofory, atomy radioaktywne (w szczególności 32 P i 125 J), odczynniki o dużej gęstości elektronowej, enzymy i ligandy mające specyficznych partnerów wiążących. Enzymy zazwyczaj wykrywa się na podstawie ich aktywności. Na przykład, peroksydazę chrzanową zwykle wykrywa się na podstawie jej zdolności do przekształcania 3,3,5,5 -tetrametylobenzydyny

122 121 (TMB) do niebieskiego barwnika, który można oznaczać ilościowo za pomocą spektrofotometru. "Specyficzny partner wiążący" odnosi się do białka zdolnego do wiązania cząsteczki ligandu z wysoką swoistością, jak na przykład w przypadku antygenu i specyficznego dla niego przeciwciała monoklonalnego. Do innych specyficznych partnerów wiążących należą biotyna i awidyna lub streptawidyna, IgG i białko A oraz liczne pary receptor-ligand znane w tej dziedzinie. Należy rozumieć, że powyższy opis nie oznacza podziału różnych znaczników na odrębne klasy, ponieważ ten sam znacznik można wykorzystywać w wielu różnych sposobach. Na przykład, 125 J może służyć jako znacznik radioaktywny lub jako odczynnik o dużej gęstości elektronowej. HRP może służyć jako enzym lub jako antygen dla przeciwciała monoklonalnego mab. Ponadto, można łączyć różne znaczniki dla uzyskania pożądanego efektu. Na przykład, przeciwciała monoklonalne mab i awidyna także wymagają znaczników w praktycznym wykorzystywaniu tego wynalazku: a zatem, można wyznakować przeciwciało monoklonalne mab biotyną i wykrywać jego obecność awidyną znakowaną 125 J lub przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciw biotynie wyznakowanym HRP. Inne odmiany i możliwości będą oczywiste dla specjalisty w tej dziedzinie, i uważa się je za równoważne w zakresie niniejszego wynalazku. [0169] Alternatywnie, przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania, na przykład, przeciwciało skierowane przeciw CD40, można znakować za pomocą "znakowania bezpośredniego" lub "podejścia znakowania bezpośredniego", w którym radionuklid jest przyłączony kowalencyjnie bezpośrednio do przeciwciała (zazwyczaj poprzez resztę aminokwasową).

123 122 Korzystne radionuklidy przedstawiono w Srivagtava i Mease (1991) supra. Szczególnie korzystne jest podejście z zastosowaniem znakowania pośredniego. Patrz również, na przykład, międzynarodowe publikacje o numerach WO 00/52031 i WO 00/52473, gdzie stosuje się łącznik do przyłączenia znacznika radioaktywnego do przeciwciał; oraz znakowane formy przeciwciał skierowanych przeciw CD40 opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer Warianty przeciwciał [0170] Metody można przeprowadzać stosując warianty przeciwciał znane w nauce. Takie warianty będą zachowywać pożądane właściwości wiązania przeciwciała macierzystego. A zatem, na przykład, jeśli testowanym czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 jest antagonistyczne przeciwciało skierowane przeciw CD40, wariant przeciwciała będzie zachowywać właściwości wiązania macierzystego antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40, na przykład, przeciwciała CHIR lub CHIR-5.9. Metody przygotowywania wariantów przeciwciał są ogólnie dostępne w nauce. Chociaż poniższa dyskusja dotyczy wariantów antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40, metody są powszechnie stosowane do dowolnego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania, na przykład, przeciwciała, które specyficznie wiąże się z biomarkerem lub klinicznie użytecznym markerem prognostycznym ujawnionym w niniejszym opisie. [0171] Na przykład, warianty sekwencji aminokwasowej antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40, na przykład, opisywanego w niniejszym opisie przeciwciała monoklonalnego CHIR-5.9 lub CHIR-12.12, można przygotowywać

124 123 przez mutacje w sklonowanej sekwencji DNA, kodującej przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania. Metody mutagenezy i zmian sekwencji nukleotydowej są dobrze znane w nauce. Patrz, na przykład, Walker i Gaastra, red. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: ; Kunkel i in. (1987) Methods Enzymol. 154: ; Sambrook i in. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York); opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer ; i pozycje literaturowe w nich cytowane. Wskazówki co do odpowiednich podstawień aminokwasowych, które nie wpływają na aktywność biologiczną polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania, można znaleźć w modelu Dayhoff i in. (1978) w Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.). Podstawienia konserwatywne, takie jak zamiana jednego aminokwasu na inny o podobnych właściwościach, mogą być korzystne. Przykłady podstawień konserwatywnych obejmują, ale nie ograniczają się do, Gly<=>Ala, Val<=>Ile<=>Leu, Asp Glu, Lys<=>Arg, Asn<=>Gln, oraz Phe Trp Tyr. [0172] W konstruowaniu wariantów przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania, na przykład, polipeptydu antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40 będącego przedmiotem zainteresowania, dokonuje się takich modyfikacji, aby warianty nadal wykazywały pożądaną aktywność, tj. podobne powinowactwo wiązania i, w przypadku antagonistycznych przeciwciał skierowanych przeciw CD40, są zdolne do specyficznego wiązania się z ludzkim antygenem CD40 ulegającym ekspresji na powierzchni komórki ludzkiej i są

125 124 wolne od znaczącej aktywności agonistycznej, ale wykazują aktywność antagonistyczną po związaniu z antygenem CD40 na ludzkiej komórce, w której zachodzi ekspresja CD40. Oczywiście, wszelkie mutacje dokonywane w DNA kodującym wariant polipeptydu nie mogą umieszczać sekwencji poza ramkę odczytu i korzystnie, nie będą tworzyć regionów komplementarnych, które mogłyby wytworzyć drugorzędową strukturę mrna. Patrz publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego numer [0173] Ponadto, region stały przeciwciała, na przykład, antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40 można poddawać mutacji na wiele sposobów, aby zmienić funkcję efektorową. Na przykład, patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer B1 i publikacja zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 2004/ A1, które ujawniają mutacje Fc, które optymalizują wiązanie przeciwciała z receptorami Fc. [0174] Korzystnie, warianty przeciwciała referencyjnego, na przykład, antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40, mają sekwencje aminokwasowe, które wykazują co najmniej 70% lub 75% identyczność sekwencji, korzystnie co najmniej 80% lub 85% identyczność sekwencji, korzystniej co najmniej 90%, 91%, 92%, 93%, 94% lub 95% identyczność sekwencji z sekwencją aminokwasową przeciwciała, na przykład, referencyjnego, na przykład, cząsteczki antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40, na przykład, opisanego w niniejszym opisie przeciwciała monoklonalnego CHIR-5.9 lub CHIR-12.12, lub z krótszą częścią cząsteczki przeciwciała referencyjnego. Korzystniej, cząsteczki wykazują co najmniej 96%, 97%, 98% lub 99% identyczność sekwencji.

126 125 Procent identyczności sekwencji określa się stosując algorytm poszukiwania homologii Smith-Watermana wykorzystujący afiniczne wyszukiwanie przerw, z karą za otwarcie przerwy równą 12 i karą za przedłużenie przerwy równą 2, macierz BLOSUM 62. Algorytm poszukiwania homologii Smith-Watermana opisano w Smith i Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: Wariant może na przykład różnić się od przeciwciała referencyjnego, na przykład, antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40, o tak mało jak 1 do 15 reszt aminokwasowych, tak mało jak 1 do 10 reszt aminokwasowych, tak jak 6-10, tak mało jak 5, tak mało jak 4, 3, 2 lub nawet o 1 resztę aminokwasową. [0175] W odniesieniu do optymalnego dopasowania dwóch sekwencji aminokwasowych, ciągły odcinek sekwencji aminokwasowej wariantu może zawierać dodatkowe reszty aminokwasowe lub delecję reszt aminokwasowych w odniesieniu do referencyjnej sekwencji aminokwasowej. Ciągły odcinek stosowany do porównania z referencyjną sekwencją aminokwasową będzie obejmował co najmniej 20 ciągłych reszt aminokwasowych, i może wynosić 30, 40, 50 lub więcej reszt aminokwasowych. Można dokonywać korekty identyczności sekwencji związanej z podstawieniami reszt konserwatywnych lub przerw (patrz algorytm poszukiwania homologii Smith- Watermana). Metody terapii [0176] Oznaczenia prognostyczne ex vivo opisane w niniejszym opisie można również stosować w metodach terapii osobników potrzebujących leczenia choroby zapalnej i/lub choroby autoimmunologicznej, które są związane z komórkami, w których zachodzi ekspresja CD40. A zatem, oznaczenie prognostyczne ex vivo przeprowadza się na osobniku będącym

127 126 kandydatem, i jeśli wyniki oznaczenia przewidują korzystną odpowiedź na leczenie z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40, pacjenta leczy się następnie takim czynnikiem terapeutycznym anty-cd40. Jak opisano powyżej w niniejszym opisie, informacje uzyskane z oznaczenia prognostycznego ex vivo można stosować samodzielnie do podejmowania decyzji odnośnie korzyści leczenia z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40. Alternatywnie, oznaczenie prognostyczne ex vivo można stosować w kombinacji z oznaczeniami prognostycznymi, które oceniają przesiewowo pod względem poziomu ekspresji, lub obecności bądź nieobecności ekspresji, jednego lub więcej zidentyfikowanych w niniejszym opisie czynników związanych z CD40; oznaczenia prognostyczne, które przeszukują pod względem poziomu ekspresji, lub obecności bądź nieobecności ekspresji, jednego lub więcej klinicznie użytecznych markerów dla konkretnej choroby zapalnej lub autoimmunologicznej, na przykład, klinicznie użytecznego markera prognostycznego, takiego jak zidentyfikowano w niniejszym opisie, lub obydwu. [0177] W tym sposobie, pacjenta zidentyfikowanego z wykorzystaniem oznaczeń prognostycznych ex vivo według wynalazku, pojedynczym lub w kombinacji z innymi oznaczeniami prognostycznymi opisanymi w niniejszym opisie, można dalej leczyć za pomocą jednej lub więcej terapeutycznie skutecznych dawek czynnika terapeutycznego anty-cd40, który zidentyfikowano w procesie przeszukiwania jako korzystny dla leczenia choroby osobnika będącego kandydatem. "Leczenie" definiuje się, w niniejszym opisie, jako stosowanie lub podawanie czynnika terapeutycznego anty-cd40 pacjentowi, lub stosowanie lub podawanie czynnika terapeutycznego anty-cd40

128 127 do izolowanej tkanki lub linii komórkowej pochodzących z pacjenta, przy czym pacjent jest dotknięty chorobą autoimmunologiczną i/lub chorobą zapalną, posiada objawy związane z chorobą autoimmunologiczną i/lub chorobą zapalną, bądź predyspozycje do rozwoju choroby autoimmunologicznej i/lub choroby zapalnej, gdzie celem jest wyleczenie, złagodzenie, spowolnienie, zmiana, naprawa, polepszenie, poprawa, lub wpływ na chorobę autoimmunologiczną i/lub chorobę zapalną, posiada jakiekolwiek objawy choroby autoimmunologicznej i/lub choroby zapalnej lub predyspozycję do rozwoju choroby autoimmunologicznej i/lub choroby zapalnej. Przez "leczenie", w zamierzeniu, rozumie się również stosowanie lub podawanie pacjentowi kompozycji farmaceutycznej, zawierającej czynnik terapeutyczny anty- CD40, bądź stosowanie lub podawanie kompozycji farmaceutycznej, zawierającej czynnik terapeutyczny anty-cd40 do izolowanej tkanki lub linii komórkowej pochodzących od pacjenta, przy czym pacjent jest dotknięty chorobą autoimmunologiczną i/lub chorobą zapalną, posiada objawy związane z chorobą autoimmunologiczną i/lub chorobą zapalną, bądź predyspozycje do rozwoju choroby autoimmunologicznej i/lub choroby zapalnej, gdzie celem jest wyleczenie, złagodzenie, spowolnienie, zmiana, naprawa, polepszenie, poprawa, lub wpływ na chorobę autoimmunologiczną i/lub chorobę zapalną, posiada jakiekolwiek objawy choroby autoimmunologicznej i/lub choroby zapalnej lub predyspozycje do rozwoju choroby autoimmunologicznej i/lub choroby zapalnej. [0178] Przez "aktywność przeciwzapalną", w zamierzeniu, rozumie się zmniejszenie lub zapobieganie zapaleniu. Leczenie

129 128 z zastosowaniem co najmniej jednego czynnika terapeutycznego anty-cd40, jak zdefiniowano w innym miejscu niniejszego opisu, powoduje odpowiedź fizjologiczną, która jest korzystna w odniesieniu do leczenia choroby autoimmunologicznej i/lub choroby zapalnej, gdzie choroba obejmuje komórki, w których zachodzi ekspresja antygenu CD40. Uważa się, że metody mogą być przydatne w zapobieganiu zmiany fenotypowej w komórkach, takiej jak proliferacja, aktywacja, i tym podobne. [0179] Przez "terapeutycznie skuteczną dawkę lub ilość" bądź "skuteczną ilość", w zamierzeniu, rozumie się ilość czynnika terapeutycznego anty-cd40 która, jeśli się ją poda przynosi pozytywną odpowiedź terapeutyczną w odniesieniu do leczenia pacjenta dotkniętego chorobą autoimmunologiczną i/lub chorobą zapalną. Czynnikiem terapeutycznym anty-cd40 jest antagonistyczne przeciwciało skierowane przeciw CD40, antagonistyczne przeciwciało skierowane przeciw CD40L, lub ich fragment wiążący antygen, a terapeutycznie skuteczna dawka przeciwciała skierowanego przeciw CD40, przeciwciała skierowanego przeciw CD40L, lub ich fragmentu, pozostaje w zakresie od około 0,01 mg/kg do około 40 mg/kg, od około 0,01 mg/kg do około 30 mg/kg, od około 0,1 mg/kg do około 30 mg/kg, od około 1 mg/kg do około 30 mg/kg, od około 3 mg/kg do około 30 mg/kg, od około 3 mg/kg do około 25 mg/kg, od około 3 mg/kg do około 20 mg/kg, od około 5 mg/kg do około 15 mg/kg, lub od około 7 mg/kg do około 12 mg/kg. Uważa się, że metoda leczenia może obejmować jednorazowe podanie skutecznej terapeutycznie dawki lub wielokrotne podawanie terapeutycznie skutecznej dawki czynnika terapeutycznego anty-cd40, na przykład, antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40, antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw

130 129 CD40L lub jego fragmentu wiążącego antygen. [0180] Oznaczenia prognostyczne ex vivo można stosować do ustalania fizjologicznej podstawy dla odpowiedzi lub braku odpowiedzi na leczenie konkretnym czynnikiem terapeutycznym anty-cd40. A zatem, jeśli u pacjenta choroba zapalna lub autoimmunologiczna początkowo odpowiada na leczenie z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40, a komórki, w których zachodzi ekspresja CD40 w tej chorobie rozwiną oporność na tę linię leczenia, to oznaczenia prognostyczne ex vivo można zastosować w celu zdefiniowania, które z oddziaływań CD40L-CD40 ma udział w oporności tych komórek, w których zachodzi ekspresja CD40. [0181] Biomarkery przekazywania sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, czyli biomarkery apoptozy, proliferacji i przeżywalności komórki, markery cytokin przekazywania sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, i czynniki związane z CD40, opisane w niniejszym opisie, można również stosować, pojedynczo lub w dowolnej ich kombinacji, w celu monitorowania skuteczność leczenia z użyciem czynnika terapeutycznego anty-cd40. W tym sposobie, pacjenta, który poddawany jest leczeniu z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40, który mógł być lub nie był uprzednio poddawany testom przesiewowym, pod względem odpowiedniości leczenia z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40, wykorzystującym opisane powyżej oznaczenie prognostyczne, monitoruje się pod względem zmian in vivo w ekspresji co najmniej jednego biomarkera apoptozy komórkowej, proliferacji i przeżywalności komórek i/lub jednego lub więcej szlaków sygnałowych CD40, przy czym ewentualnie monitoruje się wytwarzanie cytokin (w zależności

131 130 od sposobu działania czynnika terapeutycznego anty-cd40) po leczeniu z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40. Alternatywnie, lub dodatkowo, pacjenta można monitorować pod względem zmian in vivo w poziomie ekspresji jednego lub więcej czynników związanych z CD40 wybranych z grupy składającej się z antygenu powierzchniowego CD40 na komórkach, powierzchniowego CD40L na komórkach, poziomu w krążeniu scd40, oraz poziomu w krążeniu scd40l po leczeniu z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40. [0182] W tym sposobie, pierwszą próbkę biologiczną otrzymuje się od osobnika przed leczeniem z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40 będącego przedmiotem zainteresowania i oznacza pod względem poziomu ekspresji jednego lub więcej z tych biomarkerów i/lub czynników związanych z CD40 w celu uzyskania wyjściowego poziomu ekspresji każdego oznaczanego czynnika. Tę pierwszą próbkę biologiczną określa się jako "wyjściową próbkę biologiczną". Jedną lub więcej kolejnych próbek biologicznych, tego samego typu tkanki lub płynu ciała, otrzymuje się od osobnika i oznacza pod względem tego(tych) samego(mych) biomarkera(rów) i/lub czynnika(ków) związanego(nych) z CD40, przy czym kolejną próbkę biologiczną otrzymuje się po podaniu co najmniej jednej dawki czynnika terapeutycznego anty-cd40 będącego przedmiotem zainteresowania. Monitorowanie można przeprowadzać w jednym punkcie czasowym, lub w wielu punktach czasowych dla ustalenia skuteczności każdego danego protokołu leczenia, w których czynnik terapeutyczny anty-cd40 podaje się osobnikowi. W zależności od oznaczanego biomarkera, obniżenie lub wzrost pod względem poziomu biomarkera pomiędzy dwoma punktami czasowymi może wskazywać na skuteczność

132 131 czynnika terapeutycznego anty-cd40 w leczeniu choroby zapalnej lub autoimmunologicznej. Jeśli monitorowanie wykazuje obniżenie poziomu ekspresji co najmniej jednego lub większej liczby czynników związanych z CD40, taki wynik może być wskaźnikiem skuteczności czynnika terapeutycznego anty- CD40 w leczeniu choroby zapalnej lub autoimmunologicznej. [0183] A zatem, skuteczność leczenia pacjenta z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40, który blokuje lub zakłóca przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L monitoruje się przez uzyskanie wyjściowej próbki biologicznej od pacjenta i wykrywanie poziomu ekspresji jednego lub więcej biomarkerów przeżywalności komórek i/lub szlaku sygnałowego CD40, w którym uczestniczy CD40L, opisanych powyżej w opisie; podawanie pacjentowi co najmniej jednej dawki czynnika terapeutycznego, na przykład, antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40, takiego jak CHIR lub CHIR- 5.9 lub jego fragmentu wiążącego antygen; otrzymywanie kolejnej próbki biologicznej od osobnika, na przykład, w ciągu około 30 minut do około 24 godzin, obejmując około 30 minut do około 12 godzin, około 30 minut do około 6 godzin, około 30 minut do około 4 godzin, i około 1 godzinę do około 4 godzin; i wykrywanie poziomu ekspresji biomarkera(rów) przeżywalności komórek i/lub szlaku sygnałowego CD40, w którym uczestniczy CD40L, w kolejnej próbce biologicznej; przy czym zmniejszenie poziomu ekspresji w kolejnej próbce biologicznej w porównaniu z poziomem ekspresji wyjściowej próbki biologicznej jest wskaźnikiem skuteczności leczenia z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40. Wykrywanie można przeprowadzać stosując dowolne znane w nauce metody, obejmujące te metody, które ujawniono w innych miejscach

133 132 niniejszego opisu. W niektórych przykładach, poziom ekspresji jest zmniejszony o co najmniej około 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, lub 100% w stosunku do tego wykrytego w wyjściowej próbce biologicznej. Procentowa zmiana w stosunku do poziomu wyjściowego o co najmniej 25% (tj., co najmniej 25% zmniejszenie w stosunku do wyjściowej próbki biologicznej) wskazuje na skuteczność czynnika terapeutycznego anty-cd40, przy czym na umiarkowaną odpowiedź wskazuje zmiana procentowa wynosząca co najmniej 30% lub co najmniej 40%. Korzystnie, zmiana procentowa w stosunku do poziomu wyjściowego wynosi co najmniej 50% (tj., co najmniej 50% zmniejszenie w stosunku do wyjściowej próbki biologicznej) lub więcej. [0184] Skuteczność leczenia pacjenta z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40, który blokuje lub zakłóca przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L monitoruje się przez uzyskanie wyjściowej próbki biologicznej od pacjenta i wykrywanie poziomu ekspresji markerów cytokinowych szlaku sygnałowego CD40, w którym uczestniczy CD40L, opisanych powyżej w niniejszym opisie; podawanie pacjentowi co najmniej jednej dawki czynnika terapeutycznego, na przykład, antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40, takiego jak CHIR lub CHIR-5.9 lub jego fragmentu wiążącego antygen; otrzymywanie kolejnej próbki biologicznej od osobnika, na przykład, w ciągu około 24 godzin do około 3 tygodni, obejmując około 48 godzin, około 72 godzin, około 1 tydzień, lub około 2 tygodnie, po podaniu dawki; i wykrywanie poziomu ekspresji biomarkera(rów) przeżywalności komórek i/lub szlaku sygnałowego CD40, w którym uczestniczy CD40L, w kolejnej próbce biologicznej;

134 133 przy czym zmniejszenie poziomu ekspresji w kolejnej próbce biologicznej w porównaniu z poziomem ekspresji wyjściowej próbki biologicznej jest wskaźnikiem skuteczności leczenia z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40. Wykrywanie można przeprowadzać stosując dowolne znane w nauce metody, obejmujące te metody, które ujawniono w innych miejscach niniejszego opisu. Ponadto, cytokiny, które nie wpływają na przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L (na przykład, IL-1b, GM-CSF, i IL-12; patrz część Eksperymentalna poniżej w niniejszym opisie) można stosować jako kontrolę do normalizacji danych. W niektórych rozwiązaniach, poziom ekspresji jest zmniejszony o co najmniej około 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, lub 100% w stosunku do tego wykrytego w wyjściowej próbce biologicznej. Procentowa zmiana w stosunku do poziomu wyjściowego wynosząca co najmniej 20% (tj., co najmniej 20% zmniejszenie w stosunku do wyjściowej próbki biologicznej) lub więcej wskazuje na skuteczność czynnika terapeutycznego anty-cd40. Wyjściowe próbki biologiczne, zawierające surowicę lub ekstrakt surowicy zamrażano dla dalszych analiz markerów cytokinowych. [0185] Skuteczność leczenia pacjenta z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40, który blokuje lub zakłóca przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, lub który posiada ADCC jako swój sposób działania, monitoruje się przez uzyskanie wyjściowej próbki biologicznej od pacjenta i wykrywanie poziomu ekspresji jednego lub więcej biomarkerów apoptozy, opisanych powyżej w niniejszym opisie; podawanie pacjentowi co najmniej jednej dawki czynnika terapeutycznego, na przykład, antagonistycznego przeciwciała skierowanego

135 134 przeciw CD40, takiego jak CHIR lub CHIR-5.9 lub jego fragmentu wiążącego antygen; otrzymywanie kolejnej próbki biologicznej od pacjenta, na przykład, w ciągu około 8 godzin, 12 godzin, 24 godzin, 36 godzin, 48 godzin, lub 72 godzin po podaniu dawki i, ewentualnie, ponownie około 1 tydzień, około 2 tygodnie, lub około 3 tygodnie po podaniu dawki; i wykrywanie poziomu ekspresji biomarkera(rów) apoptozy w kolejnej(nych) próbce(kach) biologicznej(nych); przy czym wzrost poziomu ekspresji w kolejnej(nych) próbce(kach) biologicznej(nych) w porównaniu z poziomem ekspresji wyjściowej próbki biologicznej jest wskaźnikiem skuteczności leczenia z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40. Wykrywanie można przeprowadzać stosując dowolne znane w nauce metody, obejmujące te metody, które ujawniono w innych miejscach niniejszego opisu. W niektórych przykładach, poziom ekspresji jest większy o co najmniej około 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 200%, 250%, 300%, lub więcej, w stosunku do tego wykrytego w wyjściowej próbce biologicznej. Procentowa zmiana w stosunku do poziomu wyjściowego wynosząca co najmniej 20% (tj., co najmniej 20% wzrost w stosunku do wyjściowej próbki biologicznej) lub więcej wskazuje na skuteczność czynnika terapeutycznego anty-cd40. [0186] W jeszcze innym przykładzie, skuteczność leczenia pacjenta z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40, który blokuje lub zakłóca przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, moduluje ADCC lub obydwa, monitoruje się przez uzyskanie wyjściowej próbki biologicznej od pacjenta i wykrywanie poziomu ekspresji jednego lub więcej

136 135 czynników związanych z CD40, opisanych powyżej w opisie, (tj., powierzchniowych CD40 i/lub CD40L na komórkach, i/lub poziomów w krążeniu scd40 i/lub scd40l); podawanie pacjentowi co najmniej jednej dawki czynnika terapeutycznego, na przykład, antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40, takiego jak CHIR lub CHIR-5.9 lub jego fragmentu wiążącego antygen; otrzymywanie kolejnej próbki biologicznej od pacjenta, na przykład, w ciągu około 1 dnia (tj., 24 godzin), 2 dni, 3 dni, 4 dni, lub 1 tygodnia; i wykrywanie poziomu ekspresji czynnika związanego z CD40; przy czym zmniejszenie poziomu ekspresji w kolejnej próbce biologicznej w porównaniu z poziomem ekspresji wyjściowej próbki biologicznej jest wskaźnikiem skuteczności leczenia z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40. W niektórych przykładach, poziom ekspresji jest zmniejszony o co najmniej około 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, lub 100% w stosunku do tego wykrytego w wyjściowej próbce biologicznej. [0187] Uważa się, że jedno z tych oznaczeń lub ich kombinację można przeprowadzać w celu monitorowania skuteczności leczenia pacjenta dotkniętego chorobą zapalną lub autoimmunologiczną z zastosowaniem będącego przedmiotem zainteresowania czynnika terapeutycznego anty-cd40, w zależności od sposobu jego działania. Jeśli wykazano skuteczność, kolejne dawki czynnika terapeutycznego anty-cd40 można podawać zgodnie z zalecanym schematem dawkowania, na przykład, raz dziennie, co drugi dzień, trzy razy w tygodniu, dwa razy w tygodniu, raz w tygodniu, raz na dwa tygodnie, co miesiąc, i tym podobne. Alternatywnie, in vivo poziom ekspresji będącego(cych) przedmiotem zainteresowania

137 136 markera(rów) (tj., biomarkera(rów) proliferacji i przeżywalności komórkowej, biomarkera(rów) szlaków sygnałowych CD40, w którym uczestniczy CD40L, markera(rów) cytokinowych, czynnika(ków) związanego(nych) z CD40, oraz ich dowolne kombinacje mogą służyć jako wskazówka co do częstości dawkowania, oraz mogą również służyć jako wskazówka co do skutecznej dawki terapeutycznej, która ma być podawana. W tym sposobie, jeśli kolejne próbki biologiczne nadal wykazują akceptowalne zmniejszenie lub wzrost pod względem poziomu ekspresji odpowiedniego(nich) markera(rów) będącego(cych) przedmiotem zainteresowania, dalsze dawkowanie czynnika terapeutycznego anty-cd40 może być opóźnione do czasu osiągnięcia poziomu ekspresji odpowiedniego(nich) markera(rów) obserwowanego w wyjściowej próbce biologicznej. Ponieważ niektóre biomarkery mogą wykazywać fluktuacje niezależnie od efektów czynnika terapeutycznego, które również mogą się różnić w czasie półtrwania i czasie przebywania, korzystnie bierze się pod uwagę co najmniej dwa kolejne pomiary (na przykład, w okresie godzin) przy wykorzystywaniu poziomu ekspresji markera (tj. biomarkera apoptozy, przeżywalności komórkowej, szlaku sygnałowego CD40, markera cytokinowego i/lub czynnika związanego z CD40) jak wskazówki co do częstości dawkowania. [0188] Jeżeli wyniki tych oznaczeń w dalszym ciągu będą wykazywać pożądaną regulację zmniejszającą przekazywania sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L w odniesieniu do spadku ekspresji jednego lub więcej biomarkerów przeżywalności komórkowej, jednego lub więcej biomarkerów szlaku sygnałowego CD40 i/lub jednego lub więcej czynników związanych z CD40, i zwiększenia ekspresji jednego lub więcej

138 137 markerów apoptozy komórek, dalsze leczenie z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd40 jest uzasadnione. Próbki biologiczne mogą być zbierane w różnych przedziałach czasowych w trakcie trwania leczenia, jak opisano powyżej w niniejszym opisie, w celu umożliwienia monitorowania skuteczności leczenia w czasie, oraz w celu określenia, czy należy kontynuować leczenie czy je przerwać. [0189] Poniższe przykłady przedstawiono w celu ilustracyjnym, a nie ograniczania. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA Wprowadzenie [0190] Antagonistycznymi przeciwciałami skierowanymi przeciw CD40 w przykładach poniżej są CHIR-5.9 i CHIR Przeciwciała skierowane przeciw CD40 CHIR-5.9 i CHIR są ludzkimi przeciwciałami monoklonalnymi (mab) subtypu IgG1 skierowanymi przeciw ludzkiemu CD40, utworzonymi przez immunizację myszy transgenicznych niosących locus łańcucha ciężkiego ludzkiej IgG 1 i locus ludzkiego łańcucha lekkiego κ (technologia XenoMouse (Abgenix; Fremont, California)). Jako immunogen stosowano komórki owadzie SF9, w których zachodzi ekspresja zewnąrzkomórkowej domeny CD40. [0191] W skrócie, utworzono fuzję splenocytów z immunizowanych myszy z mysimi komórkami szpiczaka SP 2/0 lub P3 x 63Ag8.653 w stosunku 10:1 1 stosując 50% glikol polietylenowy, jak wcześniej opisali de Boer i in. (1988) J. Immunol. Meth. 113: 143. Połączone komórki ponownie zawieszano w kompletnym podłożu IMDM, uzupełnionym hipoksantyną (0,1 mm), aminopteryną (0,01 mm), tymidyną (0,016 mm), i 0,5 ng/ml hil-6 (Genzyme, Cambridge, Massachusetts). Połączone komórki rozmieszczano następnie w studzienkach 96-studzienkowej płytki do hodowli tkankowych, tak aby każda studienka zawierała średnio 1 rosnącą

139 138 hybrydomę. [0192] Po dniach, supernatanty populacji hybrydomy przeszukiwano pod względem wytwarzania specyficznych przeciwciał. W celu przeszukiwania pod względem wytwarzania specyficznych przeciwciał przez klony hybrydomy, supernatanty z każdej studzienki łączono i testowano pod względem specyficznej aktywności skierowanej przeciw CD40, najpierw stosując ELISA. Próbki pozytywne stosowano następnie do barwienia fluorescencyjnego komórek B stransformowanych EBV, wykorzystując standardowe oznaczenie FACS. Pozytywne komórki hybrydomy klonowano dwukrotnie przez graniczne rozcieńczenia w IMDM/FBS zawierającym 0,5 ng/ml hil-6. [0193] W całości utworzono fuzje 31 mysich śledzion z mysimi komórkami szpiczaka SP2/0, tworząc 895 przeciwciał, które rozpoznają rekombinowane CD40 w ELISA. Średnio w przybliżeniu 10% hybrydom utworzonych przy wykorzystaniu technologii Abgenix XenoMouse (Abgenix; Fremont, California) może zawierać mysi łańcuch lekki lambda, zamiast ludzkiego łańcucha kappa. Wyselekcjonowano przeciwciała zawierające mysi łańcuch lekki lambda. Do dalszych analiz wyselekcjonowano subzestaw 260 przeciwciał, które wykazywały również wiązanie z CD40 powierzchni komórkowej. Stabilne hybrydomy wyselekcjonowane przez serie procedur subklonowania stosowano do dalszej charakterystyki w oznaczeniach wiązania i oznaczeniach funkcjonalnych. Dla zapoznania się z dalszymi szczegółami procesu selekcji, patrz publikacja PCT/US2004/ opublikowana jako światowy opis patentowy numer WO2005/ (numer akt pełnomocnika PP (035784/282916)), zatytułowany "Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use," złożony 4

140 139 listopada 2004 i opublikowany jako światowy opis patentowy numer WO 2005/ [0194] Kolony z 7 innych hybrydom zidentyfikowano jako wykazujące aktywność antagonistyczną. Opierając się na ich względnej sile działania antagonistycznego i aktywnościach ADCC, dwa klony hybrydomy wybrano do dalszej oceny (Tabela 1 poniżej). Nazwano je 131.2F8.5.9 (5.9) oraz 153.8E2.D10.D (12.12). Tabela 1. Podsumowanie początkowego zestawu danych na temat przeciwciał IgG1 skierowanych przeciw CD40, CHIR-5.9 i CHIR Hybrydoma Klon hybrydomy wiązanie z Antagonista ADCC CDC CMCC# sekwencja macie- powierzchnią DNA rzysta komórki regionu V 131.2F F tak 153.8E E2D10D tak [0195] Mysią linię hybrydom 131.2F8.5.9 (CMCC#12047) i linię hybrydomy 153.8E2.D10.D (CMCC#12056) zdeponowano w American Type Culture Collection (ATCC; University Blvd., Manassas, Virginia (USA)) pod numerem depozytu patentowego PTA-5542 i PTA-5543, odpowiednio. [0196] cdna kodujące regiony zmienne przeciwciał, będących kandydatami, zamplifikowano metodą PCR, sklonowano i zsekwencjonowano. Sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego przeciwciała CHIR przedstawiono w SEQ ID NO: 2 (łańcuch lekki przeciwciała monoklonalnego mab CHIR-12.12) i SEQ ID NO: 4 (łańcuch ciężki przeciwciała monoklonalnego CHIR-12.12). Wariant łańcucha ciężkiego przeciwciała monoklonalnego mab CHIR przedstawiono w

141 140 SEQ ID NO:5, która różni się od SEQ ID NO: 4 tym, że posiada resztę seryny podstawioną w miejsce reszty alaniny w pozycji 153 SEQ ID NO: 4. Sekwencję nukleotydową kodującą łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała CHIR przedstawiono w SEQ ID NO: 1 (sekwencja kodująca dla łańcucha lekkiego przeciwciała monoklonalnego mab CHIR-12.12) i SEQ ID NO: 3 (sekwencja kodująca dla łańcucha ciężkiego przeciwciała monoklonalnego mab CHIR-12.12). Sekwencje aminokwasowe łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego przeciwciała CHIR-5.9 przedstawiono w SEQ ID NO: 6 (lekki łańcuch przeciwciała monoklonalnego CHIR-5.9) i SEQ ID NO: 7 (ciężki łańcuch przeciwciała monoklonalnego mab CHIR-5.9). Wariant ciężkiego łańcucha przeciwciała monoklonalnego mab CHIR-5.9 przedstawiono w SEQ ID NO: 8, która różni się od SEQ ID NO: 7 tym, że posiada resztę seryny podstawioną w miejsce reszty alaniny w pozycji 158 SEQ ID NO: 7. [0197] Jak oczekiwano dla przeciwciał pochodzących od niezależnych hybrydom, istnieje znaczące zróżnicowanie sekwencji nukleotydowych w regionach determinujących komplementarność (CDR). Różnorodność w regionie CDR3 VH uważa się za najbardziej znaczącą dla determinowania specyficzności przeciwciała. [0198] Jak wykazano przez analizę FACS, CHIR-5.9 i CHIR wiążą się specyficznie z ludzkim CD40 i mogą zapobiegać wiązaniu liganda CD40. Oba przeciwciała monoklonalne mab mogą współzawodniczyć z ligandem CD40 uprzednio związanym z CD40 powierzchni komórkowej. Powinowactwo wiązania CHIR-5.9 z ludzkim CD40 wynosi 1,2x10-8 M, a powinowactwo wiązania CHIR z ludzkim CD40 wynosi 5x10-10 M. [0199] Przeciwiciała monoklonalne CHIR i CHIR-5.9 są

142 141 silnymi antagonistami i hamują in vitro zachodzącą za pośrednictwem liganda CD40 proliferację normalnych komórek B, jak również hamują in vitro zachodzącą za pośrednictwem liganda CD40 proliferację komórek rakowych od pacjentów NHL i CLL. Przeciwciało monoklonalne CHIR bezpośrednio hamuje przeżywalność i szlaki sygnałowe, w których pośredniczy ligand CD40 (CD40L) w normalnych ludzkich limfocytach B. In vitro, obywa przeciwciała zabijają pierwotne komórki nowotworowe, pochodzące od pacjentów NHL, przez ADCC. Zależną od dawki aktywność przeciwnowotworową obserowowano w modelu ksenoprzeszczepu ludzkiego chłoniaka. Dla zapoznania się z bardziej szczegółowym opisem wyników i oznaczeń stosowanych do ich uzyskania, patrz międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer PCT/US2004/ opublikowane jako światowy opis patentowy numer WO2005/ (numer akt pełnomocnika PP (035784/282916)), również zatytułowany "Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use," złożony 4 listopada Przykład 1: CHIR blokuje komórkowe przekazywanie sygnałów zachodzące za pośrednictwem CD40L [0200] Rozpuszczalny ligand CD40 (CD40L) aktywuje komórki B i indukuje różne aspekty odpowiedzi funkcjonalnych, obejmujących wzmocnienie przeżywalności i proliferacji, oraz aktywację NF-κB, ERK/MAPK, PI3K/AKT, i szlaków sygnałowych p38. Ponadto, stymulacja CD40 za pośrednictwem CD40L zapewnia sygnały przeżycia przez redukcję rozszczepionej PARP i indukcję białek antyapoptotycznych, XIAP i Mcl-1, w normalnych komórkach B. Stymulacja CD40 za pośrednictwem

143 142 CD40L rekrutuje również TRAF2 i TRAF3 do wiązania cytoplazmatycznej domeny CD40. [0201] Poniższe badania wykazały, że CHIR bezpośrednio hamuje wszystkie efekty tych stymulacji na normalnych ludzkich komórkach B. Na przykład, leczenie CHIR powodowało zwiększone rozszczepianie kaspazy-9, kaspazy-3, i PARP, jak również zmniejszenie ilości XIAP i Mcl-1 w sposób zależny od czasu i dawki, przywracając apoptozę komórek B. Leczenie CHIR hamowało również fosforylację kinazy IκB (IKK) α i β (szlak NF-κB), ERK, AKT, oraz p38 w odpowiedzi na stymulację CD40 za pośrednictwem CD40L. Ponadto, stwierdzono, że CHIR nie wyzwala tych apoptotycznych efektów bez początkowej stymulacji CD40 za pośrednictwem CD40L. CHIR hamowało przeżywalność, w której pośredniczy ligand CD40, przez indukcję rozszczepienia PARP [0202] W tych eksperymentach, 0,6 x 10 6 normalnych ludzkich komórek B od zdrowych dawców (procent czystości pomiędzy 85-95%) stymulowano stosując 1 g/ml scd40l (Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire, UK). Następnie dodawano CHIR (10 g/ml) i kontrolną IgG. Komórki zbierano w czasie 0, 20 minut, 2 godziny, 6 godzin, 18 godzin, i 26 godzin. Rozszczepioną kaspazę-9, rozszczepioną kaspazę-3, rozszczepioną PARP, oraz kontrole β-aktyny wykrywano w lizatach komórkowych przez Western blotting. [0203] W skrócie, obserwowano, że stymulacja CD40 za pośrednictwem CD40L zapewnia sygnały przeżycia, ponieważ nie powoduje zwiększania ilości rozszczepionej kaspazy-9, rozszczepionej kaspazy-3, lub rozszczepionej PARP w czasie,

144 143 wskazując, że komórki nie przechodzą apoptozy. Jednakże, leczenie z zastosowaniem CHIR powoduje wzrost ilości tych rozszczepionych produktów, wskazując, że leczenie za pomocą CHIR znosi efekty wiązania CD40L odnośnie przekazywania sygnałów przeżycia w stymulowanych scd40l normalnych komórkach B, przywracając apoptozę komórek B (dane nie przedstawione). CHIR hamuje ekspresję antyapoptotycznych białek "przeżycia". [0204] W tych eksperymentach, 0,6 x 10 6 normalnych ludzkich komórek B od zdrowych dawców (procent czystości pomiędzy 85-95%) stymulowano stosując 1 g/ml scd40l (Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire, UK). Następnie dodawano CHIR (10 g/ml) i kontrolną IgG. Komórki zbierano w czasie 0, 20 minut, 2 godziny, 6 godzin, 18 godzin, i 26 godzin. Mcl-1, XIAP, CD40, oraz kontrole β-aktyny wykrywano w lizatach komórkowych metodą Western blotting. W skrócie, stymulacja scd40l, powodowała trwałą ekspresję Mcl-1 i XIAP w czasie. Jednakże, traktowanie komórek stymulowanych scd40l za pomocą CHIR powodowało obniżenie ekspresji tych białek w czasie (dane nie przedstawione). Ponieważ Mcl-1 i XIAP są sygnałami "przeżycia" zdolnymi do blokowania szlaku apoptotycznego, wyniki te wskazują, że traktowanie CHIR usuwa blokadę apoptozy w stymulowanych scd40l normalnych komórkach B. Leczenie za pomocą CHIR hamuje fosforylację IKKα (Ser180) i IKKβ (Ser 181) w normalnych komórkach B. [0205] W tych eksperymentach, 1,0 x 10 6 normalnych ludzkich komórek B od zdrowych dawców (procent czystości pomiędzy 85-

145 144 95%) stymulowano stosując 1 g/ml scd40l (Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire, UK). Następnie dodawano CHIR (10 g/ml) i kontrolną IgG. Komórki zbierano w czasie 0 i 20 minut. Fosforylowaną IKKα (Ser180) i IKKβ (Ser 181) oraz całkowite kontrole IKKβ wykrywano w lizatach komórkowych metodą Western blotting. [0206] W skrócie, stymulacja przez scd40l powodowała fosforylację IKKα (Ser180) i IKKβ (Ser 181) w czasie; jednaże, leczenie za pomocą CHIR znosiło tę odpowiedź na stymulację scd40l w prawidłowych komórkach B (dane nie przedstawione). Leczenie za pomocą CHIR hamowało przeżywalność, w której pośredniczył ligand CD40, w sposób zależny od dawki. [0207] W tych eksperymentach, 0,6 x 10 6 normalnych ludzkich komórek B od zdrowych dawców (o 85-95% czystości) stymulowano stosując 1 g/ml scd40l (Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire, UK). Następnie dodawano CHIR (0,01, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 g/ml) i kontrolną IgG. Komórki zbierano w 24 godzinie. Rozszczepioną PARP, oraz kontrole β-aktyny wykrywano w lizatach komórkowych metodą Western blotting. [0208] W skrócie, leczenie za pomocą CHIR powodowało zwiększenie ilości rozszczepionej PARP w komórkach stymulowanych scd40l, w sposób zależny od dawki i w ten sposób znosiło sygnały szlaku przeżycia w stymulowanych scd40l normalnych komórkach B (dane nie przedstawione). CHIR hamowało ekspresję antyapoptotycznych białek "przeżycia" w sposób zależny od dawki.

146 145 [0209] W tych eksperymentach, 0,6 x 10 6 normalnych ludzkich komórek B od zdrowych dawców (o 85-95% czystości) stymulowano stosując 1 g/ml scd40l (Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire, UK). Następnie dodawano CHIR (0,5, 2 i 10 g/ml) i kontrolną IgG. Komórki zbierano w 22 godzinie. Mcl-1, XIAP, CD40, oraz kontrole β-aktyny wykrywano w lizatach komórkowych metodą Western blotting. [0210] W skrócie, leczenie za pomocą CHIR zmniejsza ekspresję Mcl-1 i XIAP oraz zwiększa ekspresję rozszczepionej PARP w komórkach stymulowanych scd40l, w sposób zależny od dawki i w ten sposób znosiło te blokady szlaku apoptotycznego w stymulowanych scd40l normalnych komórkach B. (dane nie przedstawione). CHIR nie wpływał na ekspresję białek antyapoptotycznych, rozszczepionej-parp oraz XIAP, przy nieobecności przekazywania sygnałów za pośrednictwem rozpuszcalnego CD40L. [0211] W tych eksperymentach, 1,0 x 10 6 normalnych ludzkich komórek B od zdrowych dawców (o 85-95% czystości) traktowano CHIR (10 g/ml) i jedynie kontrolną IgG (tj., komórek nie stymulowano wstępnie scd40l przed dodaniem przeciwciała). Komórki zbierano w 0, 4, 14, i 16 godzinie. XIAP, rozszczepioną PARP, i kontrole β-aktyny wykrywano w lizatach komórkowych metodą Western blotting. [0212] W skrócie, wyniki pokazują, że bez stymulacji scd40l, w komórkach zachodzi ekspresja podwyższonych stężeń rozszczepionej PARP, podczas gdy ekspresja XIAP pozostaje na stałym poziomie, zarówno w komórkach kontrolnych traktowanych

147 146 IgG, jaki komórkach traktowanych CHIR (dane nie przedstawione). Dane te wskazują, że CHIR nie wyzwala apoptozy w normalnych komórkach B bez stymulacji CD40L. CHIR hamuje fosforylację IKKα (Ser180) i IKKβ (Ser181), AKT, ERK, oraz p38 w normalnych komórkach B. [0213] W tych eksperymentach, 1,0 x 10 6 normalnych ludzkich komórek B od zdrowych dawców (o 85-95% czystości) głodzono przez pozbawienie surowicy w 1% FBS i stymulowano stosując 1 g/ml scd40l (Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire, UK). Hodowle traktowano CHIR (1 i 10 g/ml) i kontrolną IgG. Komórki zbierano w czasie 0 i 20 minut. Fosfo-IKKα, fosfo-ikkβ, całkowitą IKKβ, fosfo-erk, całkowitą ERK, fosfo- AKT, całkowitą AKT, fosfo-p38 oraz całkowitą p38 wykrywano w lizatach komórkowych metodą Western blotting. [0214] W skrócie, stymulacja scd40l powoduje wzrost fosforylacji IKKα/β, fosforylacji ERK, fosforylacji AKT i fosforylacji p38, prowadząc w ten sposób do przeżycia i/lub proliferacji komórek. Traktowanie komórek CHIR znosi efekty stymulacji scd40l na te szlaki sygnałowe w normalnych komórkach B (dane nie przedstawione). CHIR hamuje multipleksowe szlaki sygnałowe, takie jak PI3K i MEK /ERK w kaskadzie przekazywania sygnałów przez CD40. [0215] W tych eksperymentach, 1,0 x 10 6 normalnych ludzkich komórek B od zdrowych dawców (o 85-95% czystości) głodzono przez pozbawienie surowicy w 1% FBS i stymulowano stosując 1 g/ml scd40l (Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire,

148 147 UK). Hodowle traktowano również CHIR (1 i 10 g/ml), Wortmanin, (inhibitorem PI3K/AKT; 1 i 10 M), LY (inhibitorem PI3K/AKT; 10 i 30 M), oraz PD98095 (inhibitorem MEK; 10 i 30 g/ml). Komórki zbierano w czasie 0 i 20 minut. Fosfo-ERK, fosfo-akt, całkowitą AKT, fosfo-ikkα/β oraz całkowitą, wykrywano w lizatach komórkowych metodą Western blotting. [0216] W skrócie, wyniki pokazują, że CHIR znosi fosforylację wszystkich cząsteczek sygnałowych, podczas gdy inhibitory transdukcji sygnałów wykazały jedynie specyficzne znoszenie przenoszenia sygnałów, wskazując, że CHIR prawdopodobnie hamuje przepływ tych cząsteczek sygnałowych, za pośrednictwem stymulacji CD40L (dane nie przedstawione). CHIR hamuje wiązanie cząsteczek sygnałowych TRAF2 i TRAF3 z cytoplazmatyczną domeną CD40 w normalnych komórkach B. [0217] W tych eksperymentach, 4,0 x 10 6 normalnych ludzkich komórek B od zdrowych dawców (o 85-95% czystości) głodzono przez pozbawienie surowicy w 1% FBS przez 4 godziny i stymulowano stosując 1 g/ml scd40l (Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire, UK) przez 20 minut. Komórki zbierano w czasie 0 i 20 minut. CD40 poddawano immunoprecypitacji, stosując przeciwciała poliklonalne skierowane przeciw CD40 (Santa Cruz Biotechnology, CA), i testowano sondą metodą Western blottingu, stosując przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw TRAF2 (Santa Cruz Biotechnology, CA), przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw TRAF3 (Santa Cruz Biotechnology, CA), i przeciwciało

149 148 monoklonalne skierowane przeciw CD40 (Santa Cruz Biotechnology, CA). [0218] W skrócie, wyniki pokazują, że TRAF2 i TRAF3 koprecypituje z CD40 po stymulacji scd40l. W przeciwieństwie, traktowanie CHIR znosi tworzenie kompleksu sygnałowego CD40-TRAF2/3 w stymulowanych scd40l normalnych komórkach B. Nie było zmian pod względem ekspresji CD40 (dane nie przedstawione). [0219] Bez wiązania się teorią, wyniki tych doświadczeń i wyniki z podanych powyżej przykładów wskazują, że przeciwciało CHIR wykazuje podwójne działanie antagonistycznego, przeciwciała monoklonalnego anty CD40 posiadając unikalną kombinacją cech. To w pełni ludzkie przeciwciało monoklonalne blokuje szlaki sygnałowe CD40, w których uczestniczy CD40L, dla przeżywalności i proliferacji komórek B; ten antagonizm prowadzi ostatecznie do śmierci komórki. CHIR pośredniczy również w rozpoznawaniu i wiązaniu przez komórki efektorowe, inicjując zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową (ADCC). Po związaniu CHIR z komórkami efektorowymi, uwalniają się enzymy cytolityczne, prowadząc do apoptozy komórek B i lizy. CHIR jest silniejszym przeciwciałem przeciwnowotworowym niż rituximab, jeśli porównuje się w preklinicznych modelach nowotworów. Przykład 2: Ocena indukowanego ligandem CD40 wydzielania cytokin w komórkach CD40+ [0220] Stymulacja CD40 za pomocą jego liganda dostarcza sygnały przyżycia i proliferacji normalnym komórkom B. Antagonistyczne przeciwciało skierowane przeciw CD40, CHIR , nie indukuje proliferacji ludzkich limfocytów krwi obwodowej, ale hamuje indukowaną CD40L proliferację

150 149 limfocytów. Przekazywanie sygnałów przez CD40 również indukuje komórki do wytwarzania różnych cytokin. W tym przykładzie, badano zdolność CHIR do modulowania wytwarzania cytokin przez normalne komórki B i monocyty. [0221] Komórki (1x10 5 komórek na studzienkę) hodowano w 96- studzienkowej płytce w obecności lub nieobecności CD40L (transfekowane CD40, utrwalane formaldehydem komórki CHO, 2x10 5 na studzienkę). Komórki inkubowano z huigg1 (kontrola) lub CHIR w stężeniu 10 g/ml w temperaturze 37 C przez 24 godziny, i zbierano supernatanty. Wytwarzanie hil-6, hil- 8, hil-10, htnf-α, hgmcsf, hil-1b, hil-12p70, MCP-1, i MIP-1β beta mierzono wykorzystując Meso Scale Discovery multi-array system (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland). [0222] Komórki hodowane z samym CHIR przy nieobecności CD40L nie wytwarzały cytokin powyżej poziomów wyjściowych, sugerując, że CHIR nie wykazuje aktywności agonistycznej pod względem wytwarzania cytokin. W przeciwieństwie, CD40L indukowało wytwarzanie hil-10, htnf-α, hil-8, hil-6, MCP-1 i MIP-1β w normalnych komórkach B (n=3) (Tabela 2). Dodanie CHIR do tych hodowli hamuje wytwarzanie wszystkich cytokin (patrz Tabela 3). Tabela 2: Indukowane CD40L wydzielanie cytokin przez normalne komórki B (wartości są wielokrotnościami indukcji ponad tło). Cytokina Dawca 1 Dawca 2 Dawca3 hil-1b brak indukcji brak indukcji brak indukcji hil-12p70 brak indukcji nie określano brak indukcji hil-10 3,6 nie określano 3,6 hgm-csf brak indukcji nie określano brak indukcji

151 150 htnf-α 3,7 4,8 22,8 hil-8 7,7 14,7 49,3 hil-6 5,7 3,8 20,5 MCP-1 5,5 nie badano 1,7 MIP-1β 2,2 2,6 17,8 Tabela 3: CHIR hamuje wydzielanie przez normalne komórki B wszystkich cytokin indukowanych przez CD40L (wartości są % hamowania). Cytokina Dawca 1 Dawca 2 Dawca3 hil-1b brak indukcji brak indukcji brak indukcji hil-12p70 brak indukcji nie określano brak indukcji hil-10 90,5 nie określano 94,4 hgm-csf brak indukcji nie określano brak indukcji htnf-α 92,8 97,4 98,5 hil-8 98,2 84,7 99,5 hil-6 92,2 99,9 99,3 MCP-1 55,3 nie badano 25,7 MIP-1β 54, ,5 [0223] CHIR hamuje indukowane CD40L wytwarzanie przez monocyty hil-10, htnf-α hil-8, hil-6, MCP-1 i MIP-1β (n=1) (Tabela 4 wobec Tabeli 5). Tabela 4: Indukowane CD40L wydzielanie cytokin przez monocyty (wartości są wielokrotnościami indukcji ponad tło). Cytokina Dawca 1 hil-1b brak indukcji

152 151 hil-12p70 brak indukcji hil-10 4,2 hgm-csf brak indukcji htnf-α 13,8 hil-8 123,5 hil-6 77,9 MCP-1 289,9 MIP-1β 161,9 Tabela 5: CHIR hamuje wydzielanie wszystkich cytokin przez monocyty indukowane przez CD40L (wartości są % hamowania). Cytokina Dawca 1 hil-1b hil-12p70 brak indukcji brak indukcji hil-10 58,5 hgm-csf brak indukcji htnf-α 60,1 hil-8 43,7 hil-6 64,9 MCP-1 92,6 MIP-1β 32,4 [0224] Razem, dane te pokazują, że CHIR jest silnym anatagonistą dla zależnej od ligandu CD40 przeżywalności, proliferacji i wytwarzania cytokin. [0225] Ligacja CD40 może również indukować ekspresję VEGF w normalnych komórkach śródbłonkowych i monocytach (Melter i

153 152 in. (2000) Blood 96(12): ; Flaxenburg i in. (2004) J. Immunol. 172: ), jak również fibroblastach reumatoidalnej błony maziowej (Cho i in. (2000) J. Immuno. 164: Uważa się, że przekazywanie sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L, w miejscach stanu zapalnego stymuluje fibroblasty i wytwarzanie VEGF tkankowych monocytów/makrofagów, prowadząc do angiogenezy, co sprzyja i powoduje utrzymywanie przewlekłych procesów zapalnych (patrz, na przykład, Monaco i in. (2004) Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy 3(1): 35-42). W związku z tym, zmiany poziomów VEGF mogą stanowić użyteczny marker cytokinowy przekazywania sygnałów przez CD40 za pośrednictwem CD40L. Ponieważ VEGF jest białkiem wydzielanym, zmiany w ekspresji białka VEGF można łatwo wykrywać w supernatantach hodowli komórkowych i w osoczu próbek krwi pobranych od pacjenta, stosując techniki takie jak Western blotting i ELISA. Alternatywnie można je wykrywać z mrna otrzymanego z próbek komórek/tkanki, stosując dowolną z wielu technik, takich jak Northern blotting lub ilościowa RT-PCR. W innym doświadczeniu, indukowane CD40L wytwarzanie VEGF w monocytach sprawdza się w sposób podobny do tego opisanego powyżej. Stwierdzono, że dodatek CHIR do tych hodowli komórkowych hamuje indukowane CD40L wytwarzanie VEGF. Przykład 3: Biomarkery i markery prognostyczne [0226] Oznaczenia prognostyczne ex vivo i dodatkowe oznaczenia prognostyczne do stosowania w metodach wymagają przeszukiwania próbek biologicznych pod względem poziomu ekspresji biomarkerów, dla których sekwencje dojrzałego

154 153 białka i sekwencje nukleotydowe są znane w nauce. Patrz na przykład, informacje przedstawione Tabelach 2 i 3 poniżej. Uważa się, że sondy do wykrywania tych biomarkerów, albo na poziomie białka (na przykład, sondy będące przeciwciałami) albo na poziomie kwasu nukleinowego (na przykład, sondy PCR), można projektować w oparciu o te informacje na temat sekwencji, i że sondy można projektować do wykrywania wariantów sekwencji ujawnionych w niniejszym opisie. Tabela 6. Sekwencje aminokwasowe i sekwencje nukleotydowe dla biomarkerów. Nazwa biomarkera Numer dostępu Numer dostępu AKT-1 NM_ NP_ AKT-2 NM_ NP_ AKT-3 AF AAD24196 PI3K Y13892 CAA74194 PDK1 BC AAH06339 IKKα AF AAC51662 IKKβ AF AAC64675 IκB BT Q15653 NF-κB NM_ NP_ MEK1 MEK2 L11284 NM_ L11285 NM_ NP_ NP_ MEK3 NM_ NP_ MEK6 U49732 AAB05035 ERK1 NM_ NP_ ERK2 NM_ NP_002736

155 154 p38 L35253 AAA74301 kaspaza-3 NM_ NP_ kaspaza-7 BT AAP35329 kaspaza-9 BT AAP35557 PARP NM_ NP_ Bcl-2 M14745 AAA35591 Bcl-x1 Z23115 CAA80661 Mcl-1 AF AAD13299 XIAP U45880 AAC50373 ciap1 U45879 AAC50372 surwiwina U75285 AAC51660 TRAF-1 NM_ NP_ Ki67 X65550 CAA46519 Tabela 7. Sekwencje aminokwasowe i nukleotydowe dla CD40 i CD40L. Sekwencja nukleotydowa Sekwencja aminokwasowa Nazwa Numer Identyfikator Numer Identyfikator dostępu sekwencji dostępu sekwencji krótka izoforma CD40 NM_ SEQ ID NO: 9 NP_ SEQ ID NO:10 długa izo- X60592 SEQ ID NO: 11 CAA43045 SEQ ID NO: 12 forma CD40 CD40L NM_ SEQ ID NO: 13 NP_ SEQ ID NO: 14 rozpuszczalny CD40L NM_ SEQ ID NO: 15 (nukleotydy SEQ ID NP_ SEQ ID NO: 16 (reszty SEQ ID NO: 14)

156 155 NO: 13 Przykład 4: Oznaczenia antagonistycznej aktywności czynnika terapeutycznego anty-cd40 [0227] Poniższe oznaczenia można stosować do oceny aktywności antagonistycznej przeciwciała skierowanego przeciw CD40. Ludzkie komórki B do tych oznaczeń można uzyskiwać, na przykład, przez izolowanie z migdałków uzyskanych od pacjentów poddanych usunięciu migdałków, zasadniczo jak to opisano w in De Groot i in. (1990) Lymphokine Research (1990) 9: 321. W skrócie, tkankę rozdrabnia się za pomocą skalpela, komórki fagocytarne i NK usuwa się przez traktowanie 5 mm estrem metylowym L-leucyny, a komórki T usuwa się przez jeden cykl tworzenia rozet z erytrocytami krwi baraniej (SRBC) traktowanymi bromkiem 2-aminoetyloizotiouroniowym. Czystość otrzymanych preparatów limfocytów B można sprawdzać przez pośrednie znakowanie immunofluorescencyjne z przeciwciałem monolonalnym mab B1 skierowanym przeciw (CD20) (Coulter Clone, Hialeah, FA) lub przeciwciałem monolonalnym OKT3 skierowanym przeciw (CD3) (Ortho, Raritan, NJ) oraz skoniugowany z FITC fragment F(ab ) 2 króliczego przeciwciała skierowanego przeciw mysiej Ig (Zymed, San Francisco, CA), i analizę FACS. Oznaczenie proliferacji komórek B. [0228] Komórki B (4 x 10 4 na studzienkę) hodowano w 200 l IMDM uzupełnionego 10% płodową surowicą cielęcą w płaskodennych 96-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania. Komórki B stymulowano przez dodawanie

157 156 przeciwciał skierowanych przeciw IgM (Immunobeads; 5 g/ml; BioRad, Richmond, California). Jeśli było to pożądane, dodawano 100 U/ml rekombinowanej IL-2. Różne stężenia badanych przeciwciał monoklonalnych (mab) dodawano na początku na mikrohodowli i proliferację oceniano w 3 dniu przez pomiar wprowadzania (3H)-tymidyny po 18 godzinach wytrząsania pulsacyjnego. [0229] Antagonistyczne przeciwciało skierowane przeciw CD40 nie wykazuje znaczącej kostymulacji proliferacji ludzkich komórek B w obecności immobilizowanego przeciwciała skierowanego przeciw IgM lub w obecności immobilizowanego przeciwciała skierowanego przeciw IgM i IL-2. Oznaczenie profiferacji komórek B według Banchereau. [0230] Do testowania zdolności przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw CD40 do stymulacji proliferacji komórek B w układzie hodowlanym analogicznym do tego opisanego przez Banchereau i in. (1991) Science (1991) 251: 70, stosuje się mysie komórki transfektanta 3T6, w których zachodzi ekspresja allelicznej formy HR ludzkiego FeγRII. Komórki B (2 x 10 4 na studzienkę) hodowano w płaskodennych mikrostudzienkach w obecności 1 x 10 4 stransfekowanych komórek (napromieniowanych 5000 Rad) w 200 l IMDM uzupełnionego 10% płodową surowicą cielęcą i 100 U/ml rekombinowanej IL-4. Przed dodaniem komórek B, komórkom 3T6 pozostawiono przez co najmniej 5 godzin aby umożliwić adhezję komórek do podłoża. Dodawano przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw CD40 w stężeniu wahającym się od 15 ng/ml do 2000 ng/ml i oceniano proliferację komórek B przez pomiar inkorporacji (3H)-

158 157 tymidyny w dniu 7, po 18 godzinach wstrząsania pulsacyjnego z [3H] tymidyną. Hamowanie stymulowanej S2C6 proliferacji komórek B przy wykorzystaniu antagonistycznych przecziwciał monoklonalnych skierowanych przeciw CD40. [0231] Antagonistyczne przeciwciała monoklonalne (mab) skierowane przeciw CD40 można również charakteryzować przez ich zdolność do hamowania stymulacji proliferacji komórek B przez przeciwciało skierowane przeciw CD40, takie jak S2C6 (znane również jako SGN-14, co do którego donoszono, że jest agonistą stymulacji przez CD40 proliferacji normalnych komórek B; Francisco i in. (2000) Cancer Res. 60: ), stosowane w opisanym powyżej oznaczeniu proliferacji komórek B. Komórki B z ludzkich migdałków (4 x 10 4 na studzienkę) hodowano w 200 l w mikrostudzienkach w obecności przeciwciała skierowanego przeciw IgM, sprzężonego z perełkami Sepharose (5 g/ml) i skierowanego przeciw CD40 przeciwciała monoklonalnego S2C6 (1,25 g/ml). Dodawano różne stężenia przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciw CD40, będącego przedmiotem zainteresowania, i po 3 dniach oznaczano inkorporację [3H]-tymidyny. Jako kontrolę, można dodawać w podobnych stężeniach przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw glukocerebrozydazie, 8E4. Bameveld i in. (1983) Eur. J. Biochem. 134: 585. Antagonistyczne przeciwciało skierowane przeciw CD40 może hamować kostymulację, indukowanej przeciwciałem skierowanym przeciw IgM, proliferacji ludzkich komórek B przez przeciwciało monoklonalne S2C6, na przykład, o co najmniej 75% lub więcej

159 158 (tj., stymulowana przez S2C6 proliferacja w obecności antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40 jest nie większa niż 25% tej obserwowanej w nieobecności antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40). W przeciwieństwie, żadnego znaczącego hamowania nie obserowowano przy rownoważnych ilościach niezwiązanego przeciwciała monoklonalnego 8E4, skierowanego przeciw β- glukocerebrozydazie. Barneveld i in., supra. Taki wynik mógłby wskazywać, że przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw CD40 nie dostarczają sygnałów stymulujących dla proliferacji ludzkich komórek B, ale, odwrotnie, mogą hamować sygnały stymulujące wysyłane przez CD40, wyzwalane przez inne przeciwciało monoklonalne. Oznaczenie aktywacji komórek B za pomocą komórek EL4B5. [0232] Zubler i in. (1985) J. Immunol. (1985) 134: 3662 zauważyli, że zmutowany subklon linii mysiej grasicy EL-4, znany jako EL4B5, może in vitro silnie stymulować komórki B, zarówno pochodzenia mysiego, jaki ludzkiego, do proliferacji i różnicowania w komórki plazmatyczne wydzielające immunoglobuliny. Stwierdzono, że ta aktywacja jest niezależna od antygenu i nie ograniczona MHC. Dla optymalnej stymulacji ludzkich komórek B, potrzebana jest obecność supernatantu z aktywowanych komórek T, ale odpowiedź komórek B występowała również kiedy komórki EL4B5 aktywowano uprzednio 12- mirystynianem-13-octanem forbolu (PMA) lub IL-1. Zubler i in. (1987) Immunological Reviews 99: 281; oraz Zhang i in. (1990) J. Immunol. 144: Aktywacja komórek B w tym układzie hodowlanym jest skuteczna eksperymenty z zastosowaniem

160 159 rozcieńczeń granicznych wykazały, że większość ludzkich komórek B można aktywować do proliferacji i różnicowania w komórki wydzielające przeciwciała. Wen i in. (1987) Eur. J. Immunol. 17: 887. [0233] Komórki B (1000 na studzienkę) hodowano razem z naświetlanymi (5000 Rad) komórkami EL4B5 (5 x 10 4 na studzienkę) w płaskodennych płytkach do mikromiareczkowania w 200 l IMDM uzupełnionego 10% inaktywowaną płodową surowicą cielęcą, z 5 ng/ml 12- mirystynianem-13-octanem forbolu (Sigma) i 5% supernatantem ludzkich komórek T. Przeciwciała monoklonalne dodaje się w różnych stężeniach na początku hodowli i inkorporację tymidyny ocenia się w 6 dniu po 18- godzinnym wytrząsaniu pulsacyjnym z [3H] tymidyną. W celu otrzymania supernatantu komórek T, oczyszczone komórki T hoduje się do otrzymania gęstości 10 6 /ml przez 36 godzin w obecności 1 g/ml PHA i 10 ng/ml PMA. Wen i in. (1987) Eur. J. Immunol. (1987) 17: 887. Supernatant komórek T otrzymuje się przez wirowanie komórek i następnie przechowuje się w temperaturze -20 C. Skuteczność supernatantów komórek T we wzmacnianiu proliferacji ludzkich komórek B w hodowlach komórek B EL4B5 testuje się i najskuteczniejsze supernatanty zbiera się do stosowania w eksperymentach. Kiedy ocenia się wpływ przeciwciała skierowanego przeciw CD40 na indukowaną EL4B5 proliferację ludzkich komórek B, można dodać jako kontrolę przeciwciało monoklonalne, takie jak MOPC-141 (IgG2b). [0234] Antagonistyczne przeciwciało skierowane przeciw CD40 może hamować proliferację komórek B, stymulowaną przez linię komórkową EL4BS, na przykład, o co najmniej 75% lub więcej (tj., indukowana EL4B5 proliferacja komórek B w obecności

161 160 antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40 stanowi nie więcej niż 25% tej obserwowanej w nieobecności antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40). W przeciwieństwie, przeciwciało kontrolne, takie jak MOPC-141, nie będzie mieć znaczącego wpływu na indukowaną EL4B5 proliferację komórek B. Oznaczenie ludzkich komórek T pomocniczych dla wytwarzania przeciwciał przez komórki B. [0235] Antagonistyczne przeciwciało skierowane przeciw CD40 może działać jako antagonista wytwarzania immunoglobulin przez komórki B. Przeciwciało skierowane przeciw CD40 można testować pod względem aktywności antagonistycznej tego typu przez oznaczanie zdolności przeciwciała do hamowania wytwarzania immunoglobulin przez komórki B, które stymulowano w sposób zależny od kontaktu stosując aktywowane limfocyty T w oznaczeniu ludzkich limfocytów T pomocniczych. W tym sposobie, 96-studzienkowe płytki do hodowli tkankowych opłaszcza się rozcieńczonym w stosunku 1:500 wysiękowym płynem otrzewnowym zawierającym skierowane przeciw CD3 przeciwciało monoklonalne CLB-T3/3 (CLB, Amsterdam, Holandia). Jak wskazano, dodano ko-stymulujące przeciwciała monoklonalne: skierowane przeciw CD2 przeciwciała monoklonalne CLB-T11.1/1 i CLB-T11.2/1 (CLB, Amsterdam, Holandia), obydwa wysiękowe płyny otrzewnej w stosunku 1:1000 i skierowane przeciw CD28 przeciwciało monoklonalne CLB-28/1 (CLB, Amsterdam, Holandia). Następnie, dodawano limfocyty T pochodzące z migdałków (naświetlane, 3000 Rad; 10 5 studzienkę), komórki B pochodzące z migdałków (10 4 na na

162 161 studzienkę), oraz ril-2 (20 U/ml). Końcowa objętość każdej hodowli wynosiła 200 l. Po 8 dniach, komórki odwirowywano i zbierano supernatant wolny od komórek. Stężenia ludzkiej IgM i IgG w (rozcieńczonych) próbkach oceniano stosując ELISA, jak opisano poniżej. [0236] Ludzkie komórki B pochodzące z migdałków (10 4 /studzienkę) hodowano razem z naświetlonymi oczyszczonymi komórkami T (3000 rad, 10 5 /studzienkę) w 96-studzienkowych płytkach, opłaszczonych przeciwciałem monoklonalnych skierowanym przeciw CD3 z lub bez innych przeciwciał monoklonalnych do ko-stymulacji limfocytów T. Po 8 dniach hodowli supernatanty zbierano do określania wytwarzania immunoglobulin przez komórki B. Wytwarzanie immunoglobulin przez komórki B określano stosując opisne poniżej oznaczenie ELISA. Będące przedmiotem zainteresowania przeciwciało skierowane przeciw CD40 dodaje się w różnych stężeniach na początku hodowli. Jako kontrolę, dodaje się przeciwciało monoklonalne MOPC-141. [0237] Antagonistyczne przeciwciało skierowane przeciw CD40 może hamować wytwarzanie przeciwciał IgG i IgM przez komórki B stymulowane przez ludzkie limfocyty T o co najmniej 50% lub więcej (tj., indukowane limfocytami T wytwarzanie przeciwciał przez komórki B w obecności antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40 stanowi nie więcej niż 50% tego obserwowanego przy nieobecności antagonistycznego przeciwciała skierowanego przeciw CD40). W przeciwieństwie, kontrolne przeciwciało, takie jak MOPC-141 nie będzie mieć znaczącego wpływu na indukowane limfocytami T wytwarzanie przeciwciał przez komórki B.

163 162 Oznaczenia ELISA do ilościowego określania immunoglobulin. [0238] Stężenia ludzkich IgM i IgG oceniano stosując ELISA. 96-studzienkowe płytki do ELISA opłaszczono 4 g/ml mysiego przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciw ludzkiej IgG, MH (CLB, Amsterdam, Holandia) lub 1,2 g/ml mysiego przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciw ludzkiej IgM, 4102 (Tago, Burlingame, CA) w 0,05 M buforze węglanowym (ph = 9,6), przez inkubację przez 16 godzin w temperaturze 4 C. Płytki płukano 3 razy stosując PBS-0,05% Tween-20 (PBS-Tween) i nasycano BSA przez 1 godzinę. Po 2 płukaniach płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37 C z różnymi rozcieńczeniami próbek testowych. Po 3 płukaniach, związaną Ig wykrywano przez inkubację przez 1 godzinę w temperaturze 37 C z 1 g/ml znakowanego peroksydazą chrzanową mysiego przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciw ludzkiej IgG, MH (CLB) lub mysiego przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciw ludzkiej IgM, MH (CLB). Płytki płukano 4 razy i związaną aktywność peroksydazy ujawniano przez dodanie O-fenylenodiaminy, jako substratu. Standardową ludzką surowicę (H00, CLB) stosowano do ustalenia krzywej standardowej dla każdego oznaczenia. Przykład 5: Leczenie CHIR blokuje przeżywalność i szlaki sygnałowe CD40 działające za pośrednictwem liganda CD40 w normalnych ludzkich komórkach B [0239] Aktywacja CD40 przez ligand CD40 (CD40L) może regulować przeżywalność, proliferację i różnicowanie normalnych limfocytów B. W komórkach B, ligacja CD40 prowadzi

164 163 do jego wiązania z czynnikami związanymi z receptorem czynnika nekrozy nowotworów (TRAF), a następnie aktywacji kolejnych wielu szlaków sygnałowych biorących udział w proliferacji i przeżywalności komórek. Aktywację tego szlaku można wykazać ex vivo, gdzie dodanie CD40L do hodowli normalnych komórek B sprzyja ich przeżyciu i proliferacji. Dodatkowe, opisane poniżej, badania przeprowadzono w celu charakterystyki wpływów przeciwciała monoklonalnego CHIR na przeżywalność i szlaki sygnałowe CD40 działające za pośrednictwem liganda CD40 w normalnych ludzkich komórkach B. [0240] Normalne ludzkie komórki B oczyszczano z krwi obwodowej przez selekcję negatywną, wykorzystując zestaw do izolacji komórek B MACS II (Miltenyi Biotech INC, Auburn, CA) i hodowano przez 24 godziny z lub bez 2 g/ml rekombinowanego ludzkiego rozpuszczalnego CD40L (rhscd40l) w obecności 10 g/ml CHIR lub izotypu kontrolnego higg1. Komórki lizowano w pełne lizaty komórkowe rozdzielano przez SDS-PAGE i Western blotting, stosując przeciwciała specyficzne wobec ludzkich cparp, Mcl-1, Bcl-x1, p-akt, i p-p38 MAPK. Wszystkie membrany podzielono i ponownie badano sondami pod względem albo β-aktyny albo całkowitego białka Akt lub p38 MAPK, jak było właściwe. Wyniki przedstawiono na Figurze 1. [0241] Stymulacja CD40L normalnych ludzkich komórek B obniżała poziomy markera apoptotycznego (cparp) i zwiększała ekspresję markerów antyapoptotycznych (Mcl-1, Bcl-xl), a zatem indukowała proliferację/przeżywanie tych komórek. Ponadto, indukowana CD40L przeżywalność komórek B wiązała się z fosforylacją Akt i p38 MAPK. W przeciwieństwie, traktowanie CHIR stymulowanych CD40L normalnych komórek B ex vivo hamowało ekspresję białek antyapoptotycznych Mcl-1 i Bcl-xl,

165 164 jak również hamowało fosforylację dalszych białek sygnałowych, ostatecznie prowadząc do apoptozy komórek B.

166 165 Lista sekwencji <110> Aukerman, Lea Jallal, Bahija Luqman, Mohammad <120> Metody diagnostyki i leczenia chorób posiadających składnik autoimmunologiczny i/lub zapalny <130> PP (311608) <150> 60/749,336 <151> <150> 60/682,575<151> <160> 16 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 720 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja kodująca lekkiego łańcucha ludzkiego przeciwciała anti-cd40 <221> CDS <222> (1)...(720) <400> 1

167 166

168 <210> 2 <211> 239 <212> PRT 167 <213> sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja kodująca lekkiego łańcucha ludzkiego przeciwciała anty-cd40 <400> 2 <210> 3 <211> 2016 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja kodująca lekkiego łańcucha ludzkiego przeciwciała (z intronami) <400> 3

169 168 <210> 4 <211> 469 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220> <223> Łańcuch ciężki ludzkiego przeciwciała anty-cd40 <400> 4

170 169

171 170 <210> 5 <211> 469 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220> <223> Łańcuch ciężki wariantu ludzkiego przeciwciała anty-cd40 <400> 5

172 171

173 <210> 6 <211> <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220> <223> łańcuch lekki 5.9 ludzkiego przeciwciała anty-cd40 <400> 6 <210> 7 <211> 474 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220> <223> Łańcuch ciężki ludzkiego przeciwciała 5.9 anty-cd40 <400> 7

174 173

175 <210> 8 <211> <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220> <223> Łańcuch ciężki wariantu 5.9 ludzkiego przeciwciała anty-cd40 <400> 8

176 <210> 9 <211> 612 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(612) <221> misc_feature 175

177 176 <222> (0)...(0) <223> Sekwencja kodująca dla krótkiej izoformy ludzkiego CD40 <400> 9

178 177 <210> 10 <211> 203 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 <210> 11 <211> 834 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(834) <221> misc_feature <222> (0)...(0) <223> Sekwencja kodująca dla długiej izoformy ludzkiej CD40 <400> 11

179 178

180 179 <210> 12 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12

181 180 <210> 13 <211> 786 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(786) <221> misc_feature <222> (0)...(0) <223> CD40L <400> 13

182 181

183 <210> 14 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens 182 <400> 14 <210> 15 <211> 648 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(648) <221> misc_feature <222> (0)...(0) <223> rozpuszczalny CD40L <400> 15

184 183

185 184 <210> 16 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16

186 EP B /PE/13 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób identyfikowania pacjenta dotkniętego chorobą zapalną lub autoimmunologiczną, który odpowiada na leczenie czynnikiem terapeutycznym anty-cd40, obejmujący: a) zapewnianie testowej próbki biologicznej i kontrolnej próbki biologicznej otrzymanej od pacjenta, gdzie testowa próbka biologiczna i kontrolna próbka biologiczna zawierają komórki, w których zachodzi ekspresja CD40 i które stymulowano ligandem CD40; b) zapewnianie kontaktu testowej próbki biologicznej ze skuteczną ilością czynnika terapeutycznego anty-cd40; c) wykrywanie poziomu co najmniej jednego biomarkera w testowej próbce biologicznej, przy czym biomarker wybiera się z grupy składającej się z: (i) biomarkera apoptozy komórkowej, przy czym rzeczony biomarker apoptozy wybiera się z grupy składającej się z rozszczepionego białka kaspazy, rozszczepionej polimerazy poli ADP-rybozy (PARP), ekspresji fosfatydyloseryny (PS) na powierzchni komórki, fragmentacji genomowego DNA, oraz ich dowolnych kombinacji; (ii) biomarkera szlaku sygnałowego CD40, w którym uczestniczy CD40L, przy czym szlak sygnałowy CD40, w którym uczestniczy CD40L wybiera się z grupy składającej się ze szlaku sygnałowego AKT, szlaku sygnałowego NF-κB, oraz szlaku sygnałowego kinazy białkowej aktywowanego mitogenem (MAPK), i biomarker szlaku sygnałowego CD40, w którym uczestniczy CD40L wybiera się z grupy składającej

187 186 się z białka fosfo-pi3k, fosfo-pdk1, fosfo-akt, fosfo- MEK, fosfo-erk, fosfo-p38, fosfo-ikkα/β, fosfo-iκb oraz aktywowanego NF-κB; i (iii) biomarkera przeżywalności komórek, przy czym biomarker przeżywalności komórek wybiera się z grupy składającej się z białka antyapoptotycznego, które jest członkiem rodziny Bcl-2, białka inhibitora apoptozy IAP, oraz czynnika-1 związanego z receptorem TNF (TRAF-1); i d) porównywanie poziomu co najmniej jednego biomarkera w testowej próbce biologicznej z poziomem co najmniej jednego biomarkera w kontrolnej próbce biologicznej, gdzie kontrolna próbka biologiczna nie kontaktuje się z czynnikiem terapeutycznym anty-cd40, w którym (i) wzrost poziomu co najmniej jednego z biomarkerów apoptozy; i/lub (ii) redukcja poziomu co najmniej jednego z biomarkerów co najmniej jednego ze szlaków sygnałowych CD40, w których uczestniczą CD40L; i/lub (iii) redukcja poziomu co najmniej jednego z biomarkerów przeżywalności komórek; w testowej próbce biologicznej w stosunku do kontrolnej próbki biologicznej wskazuje pacjenta, który mógłby odnieść korzyść z leczenia czynnikiem terapeutycznym anty-cd40, i w której czynnik terapeutyczny anty-cd40 jest antagonistą przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciw CD40 lub jego fragmentem wiążącym antygen, który jest zdolny do specyficznego wiązania z ludzkim antygenem CD40 ulegającym ekspresji na powierzchni ludzkiej komórki B, i który jest wolny od znaczącej aktywności agonistycznej kiedy wiąże się z antygenem CD40 ulegającym ekspresji na powierzchni komórki B.

188 Sposób według zastrz. 1, w którym komórki, w których zachodzi ekspresja CD40 stymuluje się ex vivo ligandem CD40 przed etapem kontaktu. 3. Sposób według zastrz. 2, w którym ligand CD40 wybiera się z grupy składającej się rozpuszczalnego CD40L i związanego z błoną CD40L. 4. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, w którym antagonistyczne przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw CD40 lub jego część wiążąca antygen jest wolne od znaczącej aktywności agonistycznej w jednej odpowiedzi komórkowej. 5. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, w którym antagonistyczne przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw CD40 lub jego część wiążąca antygen jest wolna od znaczącej aktywności agonistycznej w oznaczeniach więcej niż jednej odpowiedzi komórkowych. 6. Sposób według zastrz. 4 albo 5, w którym antagonistyczne przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw CD40 lub jego część wiążąca antygen działa jako antagonista co najmniej jednej z odpowiedzi komórek B, wybranych z grupy składającej się z proliferacji komórek B, różnicowania komórek B, wytwarzania przeciwciał, adhezji międzykomórkowej, tworzenia komórek B pamięci, przełączania izotypów, regulacji zwiększającej ekspresję na powierzchni komórki MHC klasy II i CD80/86, oraz sekrecji pro-zapalnych cytokin. 7. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, w którym rozszczepione białko kaspazy wybiera się z grupy składającej się z rozszczepionej kaspazy-3, rozszczepionej kaspazy-7, i rozszczepionej kaspazy Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, w którym powierzchniową PS wykrywa się przez barwienie aneksyną V

189 188 oraz, że fragmentację genomowego DNA wykrywa się przez barwienie TUNEL. 9. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, w którym szlak sygnałowy MAPK wybiera się z grupy składającej się ze szlaku sygnałowego MEK/ERK i szlaku sygnałowego MEK/p Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, w którym członka rodziny Bcl-2 wybiera się z grupy składającej się z Bcl-xl i Mcl Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3 albo zastrz. 10, w którym białko inhibitora apoptozy IAP wybiera się z grupy składającej się z surwiwiny, XIAP i ciap Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, ponadto obejmujący wykrywanie w testowej próbce biologicznej i kontrolnej próbce biologicznej poziomu co najmniej jednego markera cytokinowego przekazywania sygnałów przez CD Sposób według zastrz. 12, w którym marker cytokinowy wybiera się z grupy składającej się z czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), interleukin (IL)-6, IL-8, IL- 10, czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i monocytów (GM-CSF), czynnika nekrozy nowotworów α (TNF-α), białka chemotaktycznego dla monocytów-1 (MCP-1) i makrofagowego białka zapalenia-1β (MIP-1β). 14. Sposób według zastrz. 12 albo 13, w którym zmniejszenie poziomu co najmniej jednego z markerów cytokinowych w testowej próbce biologicznej w stosunku do kontrolnej próbki biologicznej jest wskaźnikiem osobnika, który mógłby odnieść korzyść z leczenia z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, w którym przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw CD40 jest

190 189 zdolne do specyficznego wiązania z ludzkim antygenem CD40, na powierzchni komórek, w których zachodzi ekspresja CD40, modulując w ten sposób aktywność zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej (ADCC) oraz, że biomarker jest biomarkerem apoptozy. 16. Sposób według zastrz. 15, w którym wzrost poziomu co najmniej jednego z biomarkerów apoptozy w rzeczonej testowej próbce biologicznej w stosunku do kontrolnej próbki biologicznej jest wskaźnikiem pacjenta, który mógłby odnieść korzyść z leczenia z zastosowaniem czynnika terapeutycznego anty-cd Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, znamienny tym, że ponadto obejmuje wykrywanie w próbce biologicznej pacjenta poziomu ekspresji CD40 na powierzchni komórki, poziomu ekspresji CD40L na powierzchni komórki, lub obydwu, na komórkach, w których zachodzi ekspresja CD40 w próbce biologicznej. 18. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, ponadto obejmujący wykrywanie poziomu rozpuszczalnego CD40 w obiegu lub rozpuszczalnego CD40L w obiegu w biologicznej próbce pobranej od pacjenta. 19. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, w którym wykrywanie poziomu rzeczonego biomarkera obejmuje stosowanie przeciwciała do wykrywania ekspresji białka biomarkera. 20. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, w którym wykrywanie poziomu biomarkera obejmuje hybrydyzację kwasów nukleinowych.

191 Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, w którym wykrywanie poziomu biomarkera obejmuje przeprowadzenie ilościowego RT-PCR. 22. Sposób według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym przeciwciało skierowane przeciw CD40 lub jego fragment wiążący antygen wybiera się z grupy składającej się z: a) przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID NO:10 lub SEQ ID NO:12; oraz b) przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID NO:10 lub SEQ ID NO: Sposób według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym antagonistyczne przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw CD40 lub jego fragment wiążący antygen wybiera się z grupy składającej się z: (i) przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen, które obejmuje domenę zmienną łańcucha lekkiego, zawierającą reszty regionu determinującego komplementarność (CDR) SEQ ID NO: 2 oraz domenę zmienną łańcucha ciężkiego, zawierającą reszty regionu determinującego komplementarność (CDR) SEQ ID NO: 4; oraz (ii) przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen, które obejmuje domenę zmienną łańcucha lekkiego, zawierającą reszty regionu determinującego komplementarność (CDR) SEQ ID NO: 6 oraz domenę zmienną łańcucha ciężkiego, zawierającą reszty regionu determinującego komplementarność (CDR) SEQ ID NO: 7.

192 Sposób według zastrz. 23, w którym przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z: (i) SEQ ID NO: 2; (ii) SEQ ID NO: 4; (iii) SEQ ID NO: 5; (iv) SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO: 4; (v) SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:5 (vi) SEQ ID NO: 6; (vii) SEQ ID NO: 7 (viii) SEQ ID NO: 8 (ix) SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 7; oraz (x) SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 8, lub jego fragmentu wiążącego antygen, przy czym fragment zachowuje zdolność do specyficznego wiązania ludzkiego antygenu CD Sposób według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym fragment wiążący antygen przeciwciała skierowanego przeciw CD40 wybiera się z grupy składającej się z fragmentu Fab, fragmentu F(ab )2, fragmentu Fv, oraz jednołańcuchowego fragmentu Fv. 26. Sposób według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym chorobę zapalną lub chorobę autoimmunologiczną wybiera się z grupy składającej się z tocznia rumieniowatego układowego (SLE), tocznia rumieniowatego przewlekłego, toczniowego zapalenia nerek, sarkoidozy, młodzieńczego zapalenia stawów, reumatoidalnego zapalenia stawów, łuszczycowego zapalenia stawów, zespołu Reitera, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, dnawego zapalenia stawów, odrzucania przeszczepionego narządu lub

193 192 tkanki, choroby przeszczep przeciw gospodarzowi, stwardnienia rozsianego, zespołu hiper IgE,,guzkowatego zapalenia tętnic, pierwotnej żółciowej marskości wątroby, choroby zapalnej jelit, choroby Crohna, celiakii (enteropatii związanej z wrażliwością na gluten), autoimmunologicznego zapalenia wątroby, niedokrwistości złośliwej, autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej, łuszczycy, twardziny skóry, miastenii, autoimmunologicznej plamicy małopłytkowej, autoimmunologicznego zapalenia tarczycy, choroby Grave a, zapalenia tarczycy Hasimoto, choroby kompleksów immunologicznych, zespołu przewlekłego zmęczenia i dysfunkcji immunologicznych (CFIDS), zapalenia wielomięśniowego i zapalenia skórno-mięśniowego, krioglobulinemii, trombolizy, kardiomiopatii, pęcherzycy zwykłej, śródmiąższowego zwłókniającego zapalenia płuc, sarkoidozy, cukrzycy typu I i typu II, nadwrażliwości późnej typu 1, 2, 3 i 4, alergii lub zaburzeń alergicznych, astmy, zespołu Churg-Straussa (ziarniniaka alergicznego), atopowego zapalenia skóry, kontaktowego zapalenia skóry alergicznego i z podrażnienia, pokrzywki, alergii z udziałem IgE, miażdżycy, zapalenia naczyń, idiopatycznych zapalnych miopatii, choroby hemolitycznej, choroby Alzheimera, przewlekłej zapalnej polineuropatii demielinizacyjnej.

194 EP B /PE/13 Fig. 1

195 EP B /PE/13 DOKUMENTY PRZYTOCZONE W OPISIE Lista przytoczonych przez Zgłaszającego dokumentów została zamieszczona wyłącznie do informacji czytelnika i nie stanowi części składowej europejskiego dokumentu patentowego. Została ona zestawiona z największą starannością; EUP nie ponosi jednakże żadnej odpowiedzialności za ewentualne błędy lub braki. Literatura patentowa przytoczona w opisie

196 195

197 196 Literatura niepatentowa przytoczona w opisie

198 197

199 198