ANALIZA MOLEKULARNA BIOCENOZ BAKTERYJNYCH Ćwiczenia 2017/18

Transkrypt

1 ANALIZA MOLEKULARNA BIOCENOZ BAKTERYJNYCH Ćwiczenia 2017/18 A. Rybotypowanie bakterii w osadzie czynnym techniką ARDRA (ang. Amplified rdna Restriction Analysis) Informacje dotyczące analizowanych prób: Oznaczenie próbek: oraz Oczyszczalnia ścieków:. Stężenie izolatów: oraz Inne istotne informacje:.. Ćwiczenie 1 ( ) Amplifikacja fragmentu genu 16S rrna metodą PCR Sekwencje starterów stosowanych w reakcji: 27F: 5 -GAG TTT GAT CCT GGC TCA G R: 5 -TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3, gdzie Y oznacza C lub T Skład mieszaniny reakcyjnej: Składnik Stężenie początkowe Objętość Stężenie końcowe woda - - bufor Taq 10x 1x MgCl2 25 mm 2,5 mm dntps 2 mm 0,2 mm primer 27F 10 µm 0,1 µm primer 1492R 10 µm 0,1 µm polimeraza Taq 5 U/µl 1 U/reakcję DNA genomowe 30 ng/µl 30 ng/reakcję 20 µl Profil termiczny reakcji: 95ºC- 2 93ºC 1 53ºC 45 x 30 72ºC 2 72ºC 10 Każdą próbkę wykonaj w 2 powtórzeniach oraz przygotuj kontrolę czystości reakcji (mieszanina bez DNA). 1

2 Ćwiczenie 2 ( ) Elektroforeza agarozowa produktów amplifikacji 1. Przygotuj 50 ml 1,2% żelu agarozowego: Analiza molekularna biocenoz bakteryjnych odważ g agarozy i zawieś w 50 ml 1x buforu TBE (90 mm Tris base, 90 mm kw. borowy, 1 mm EDTA ph 8,0). 2. Rozpuść na płycie grzejnej, doprowadź do wrzenia. Przygotuj aparat do elektroforezy. 3. Po delikatnym schłodzeniu żelu dodaj do niego 2 µl barwnika EuroSafe. 4. Wylej roztwór do aparatu. Pozostaw do stężenia (ok. 30 min.). 5. Przygotuj próbki do nałożenia na żel: na kawałek parafilmu odpipetuj po 1 µl buforu obciążającego, dodaj 5 µl produktu PCR, wymieszaj (by nie powstały pęcherzyki powietrza) i nanieś do studzienki żelu. Do jednej ze studzienek dodaj 4 µl markera wielkości GeneRuler 100 bp Plus. 6. Rozdzielaj w polu elektrycznym przy napięciu ok. 100 V. 7. Oceń długość produktu amplifikacji i czystość przygotowanej mieszaniny reakcyjnej. (miejsce na elektroforegram) Wynik amplifikacji fragmentu genu 16S rrna: Obecność amplimeru:.. Długość produktu reakcji: Czystość mieszaniny reakcyjnej: Hydroliza enzymatyczna amplimerów 1. Sporządź na lodzie mieszaninę reakcyjną o składzie: Składnik Stężenie początkowe Objętość Stężenie końcowe woda - - FastDigest Green Buffer 10x 1x endonukleaza FD - 1 µl - DNA (produkt PCR) - 10 µl - 20 µl 2

3 2. Przygotuj po jednej mieszaninie reakcyjnej dla każdej z prób osadu czynnego, jedną kontrolę negatywną trawienia (mieszanina bez enzymu) i jedną kontrolę czystości reakcji (mieszanina bez DNA). 3. Zworteksuj, krótko zwiruj. 4. Umieść w termocyklerze: hydroliza: 37 C - min. inaktywacja: - min. Ćwiczenie 3 ( ) Elektroforeza poliakrylamidowa produktów hydrolizy enzymatycznej amplimerów 1. Przygotuj 8% żel poliakrylamidowy: do probówki o pojemności 15 ml dodaj następujące odczynniki we wskazanej kolejności. Pamiętaj o ostrożnej pracy (związki toksyczne)! odczynnik akrylamid : N,N -metylenobisakrylamid (29:1) TBE stężenie wyjściowe 30% 5x objętość gliceryna - 1 kropla woda - 3,8 ml APS 10% 90 µl zakręć probówkę i dokładnie wymieszaj! TEMED - 6 µl 6 ml 2. Pobierz pipetą (automatyczną lub pasteurowską) całą objętość mieszaniny (lub pobierz ją w dwóch porcjach) i niezwłocznie wlej pomiędzy szyby. Poziom żelu powinien sięgać krawędzi krótszej szyby. Włóż grzebień uważając, aby w żelu nie powstały pęcherzyki (zwłaszcza pod zębami grzebienia). 3. Pozostaw żel do spolimeryzowania na ok. 30 min. 4. W międzyczasie przygotuj bufor TBE 1x. 5. Umieść żel w aparacie do elektroforezy, napełnij go buforem i przepłucz nim studzienki żelu. 6. Nałóż mieszaniny reakcyjne na żel (nie ma potrzeby dodawania buforu obciążającego tę funkcję pełni FD Green Buffer). Do kolejnej studzienki dodaj 4 µl markera wielkości GeneRuler 100 bp Plus (pamiętaj, że musi również musi zawierać Green FD Buffer). 7. Zamknij aparat, podłącz do zasilacza i prowadź rozdział przy ok V do momentu aż dolny barwnik osiągnie ok 2/3 długości żelu. 8. Po skończonym rozdziale ostrożnie rozdziel szyby i przenieś żel do naczynia z roztworem barwnika (3x GelRed w 1x buforze TBE). 9. Po ok min. zlej roztwór barwnika a żel przepłucz wodą destylowaną. Oglądaj żel w świetle UV. Wynik hydrolizy restrykcyjnej amplimeru 16S rrna: Kontrola czystości:.. Kontrola trawienia: 3

4 Wynik rozdziału dla prób osadu czynnego: Ilość i długość produktów hydrolizy enzymatycznej dla poszczególnych prób osadu czynnego: o o (miejsce na elektroforegram) Wnioski (dotyczące wyników analizy osadu czynnego metodą ARDRA): 4

5 B. Analiza osadu czynnego techniką hybrydyzacji DNA Analiza molekularna biocenoz bakteryjnych Ćwiczenie 4 ( ) Synteza i znakowanie sond molekularnych Każda z podgrup syntetyzuje sondę molekularną dwiema spośród trzech testowanych metod: PCR + nick translation lub PCR + oligolabeling NICK TRANSLATION Skład mieszaniny reakcyjnej: odczynnik stęż. początkowe objętość [µl] stężenie końcowe woda - - bufor DNA Polymerase I 10 x 1 x dntps Mixture (datp, dctp, dgtp) 1 mm 0,05 mm (50 nm) dntp znakowany 1 mm 60 µm polimeraza I DNA 10 U/µl 5 U/reakcję DNaza I 0,002 U/µl 0,002 U/reakcję matryca DNA 250 ng 25 µl Inkubacja: 15 C przez min. Inhibicja: dodać 1 µl 0,5 M EDTA (ph 8,0) OLIGOLABELING Biotin DecaLabel DNA Labeling Kit (Fermentas) 1. Do probówki (1,5 ml) dodać: matryca DNA (100 ng 1 µg) 10 µl Decanucleotide in 5x Reaction Buffer 10 µl woda do 44 µl 2. Zworteksować i krótko zwirować. Inkubować w łaźni z wrzącą wodą przez 5-10 min. i schłodzić na lodzie. Krótko zwirować. 3. Następnie dodać: Biotin Labeling Mix 5 µl Klenow fragment, exo - (5 U) 1 µl 4. Wstrząsnąć i krótko zwirować. 5. Inkubować godzinę w 37 C lub do 20 godz. w celu zwiększenia wydajności znakowania. 6. Zatrzymać reakcję dodając 1 µl 0,5 M EDTA (ph 8,0). 7. Przechowywać w -20 C. 5

6 ZNAKOWANIE W CZASIE PCR Sekwencje starterów stosowanych w reakcji: chflex_f: 5 -CTC GTG TCG TGA GAT GTT GG-3 chflex_r: 5 -GGG AAC GTA TTC AAC GCA GT-3 Skład mieszaniny reakcyjnej: odczynnik stężenie początkowe objętość [µl] stężenie końcowe woda - - bufor Taq 10x 1x MgCl2 25 mm 1,0 mm datp 1 mm 0,12 mm dctp 1 mm 0,12 mm dgtp 1 mm 0,12 mm dttp 1 mm 60 µm Biotin-11-dUTP 1 mm 60 µm primer chflex_f 10 µm 0,2 µm primer chflex_r 10 µm 0,2 µm polimeraza Taq 5 U/µl 1 U/reakcję Profil termiczny reakcji: 95ºC- 2 93ºC 30 56ºC 45 x 30 72ºC 40 72ºC 10 DNA 1 20 µl Przygotuj próbę badaną oraz kontrolę czystości reakcji (mieszanina bez DNA). Ćwiczenie 5 ( ) Rozdział elektroforetyczny sond molekularnych 1. Przygotuj próbki do nałożenia na żel: do każdej probówki dodaj odpowiednią ilość buforu obciążającego (6x) do końcowego stężenia 1x. 2. Na wcześniej przygotowany żel agarozowy o stężeniu 1,2% nałóż roztwory sond DNA. 3. Do jednej ze studzienek dodaj 4 µl markera wielkości GeneRuler 100 bp Plus. 4. Rozdzielaj w polu elektrycznym przy napięciu ok. 100 V. 5. Oceń długość produktów i czystość przygotowanych mieszanin reakcyjnych. 6. Odetnij nadmiar żelu (zgodnie z zaleceniami prowadzącego zajęcia). 6

7 Przeniesienie sond DNA z żelu agarozowego na membranę hybrydyzacyjną poprzez elektrotransfer 1. Umieść żel w naczyniu. Dodaj ok. 10 objętości buforu denaturującego (1,5 M NaOH, 0,5 M NaCl) i delikatnie mieszaj na kołysce przez 30 min. 2. W międzyczasie przygotuj fragment membrany dokładnie odpowiadający wymiarom żelu. Membranę trzymaj za pomocą pęset (nie dotykaj jej palcami) i pisz po niej jedynie ołówkiem. 3. Zlej bufor. Przepłucz żel wodą destylowaną. Zlej wodę. 4. Dodaj ok. 10 objętości buforu neutralizującego (1,5 M NaCl), mieszaj przez 15. Wymiana roztworu, Ekwilibracja: zalej żel 1x buforem TBE (tak, by cały żel był zakryty), delikatnie wytrząsaj przez Przygotuj zestaw do elektrotransferu wg poniższego schematu: Zwilż membranę w buforze TBE i dokładnie przyłóż ją do żelu. Nie przesuwaj! Dokładnie dociśnij membranę do żelu używając szklanej bagietki. Dołącz pozostałe komponenty zestawu. Umieść je w kasetce i szczelnie zamknij. Umieść kasetkę w aparacie z 1x buforem TBE. Zwróć szczególną uwagę na prawidłowe ułożenie żelu i membrany względem elektrod! 7. Blotting 200 ma/noc. 8. Namocz membranę w 6x buforze SSC (0,9 M NaCl, 30 mm cytrynian sodu), 5. Ćwiczenie 6 ( ) Ocena siły i czystości znakowania sond molekularnych Biotin Chromogenie Detection Kit (Fermentas) 1. Płukanie 15 ml Blocking/Washing Buffer przez 5 min. w RT na kołysce (wszystkie etapy przeprowadzać na kołysce w RT) 2. Blokowanie 15 ml Blocking Solution przez 20 min. 3. Przygotować 10 ml rozcieńczonego koniugatu Streptavidin-AP. 4. Inkubacja 10 ml roztworu koniugatu przez 20 min. 7

8 5. Płukanie: a. 30 ml Blocking/Washing Buffer przez 10 min. Powtórzyć płukanie. b. 20 ml Detection Buffer przez 10 min. 6. Przygotować 15 ml Substrate Solution. 7. Reakcja enzymatyczna 15 ml Substrate Solution, w RT w ciemności. Niebiesko-fioletowe precypitaty pojawią się po min. inkubacji. Analiza molekularna biocenoz bakteryjnych 8. Zatrzymanie reakcji zlać Substrate Solution i kilka sekund płukać membranę wodą. 9. Wysuszyć membranę. Miejsce na elektroforegram i zdjęcie membrany Wynik syntezy i znakowania sond: Znakowanie w PCR: Obecność produktu PCR:.. Długość produktu reakcji: Czystość mieszaniny reakcyjnej:... Znakowanie metodą : Obecność produktu:.. Długość produktu reakcji: Wnioski: 8

9 Wykrywanie mikroorganizmów nitkowatych w osadzie czynnym hybrydyzacja dot blot 1. Wyciąć fragment membrany hybrydyzacyjnej o wymiarach ok. 2 x 4 cm. W prawym górnym rogu za pomocą igły umieścić oznaczenie swojej grupy. 2. Nanieść po 1 µg genomowego DNA (te same izolaty, które przydzielone zostały poszczególnym grupom na pierwszych ćwiczeniach). 3. Zapiec w 80 C przez 20 min. 4. Zdenaturować wodny roztwór Salmon sperm DNA (10 mg/ml) w 100 C przez 5 minut, a potem umieścić na lodzie. Dodać go do buforu prehybrydyzacyjnego do końcowego stężenia 50 μg/ml. 5. Umieścić membranę w cylindrze, zalać buforem prehybrydyzacyjnym (0,2 ml/cm 3 ) (~ 5 ml) i inkubować w 42 C przez 2-4 godziny. Skład buforu prehybrydyzacyjnego: SSC 6x, Denhardt s Solution 5x, SDS 0,5%, formamid 50% 6. Przygotować roztwór hybrydyzacyjny zdenaturować sondę znakowaną biotyną w 100 C przez 5 min. i umieścić na lodzie. Dodać do roztworu prehybrydyzacyjnego do końcowego stężenia ng/ml. 7. Zlać roztwór prehybrydyzacyjny i dodać hybrydyzacyjny (~ 5 ml). Inkubować 42 C przez noc. 8. Płukania: Roztwór I (2x SSC, 0,1% SDS) dwukrotnie: 10 min. w RT Roztwór II (0,1x SSC, 0,1% SDS) dwukrotnie 20 min. w 65 C 9. Wysuszyć membranę. Ćwiczenie 7 ( ) Wykrywanie mikroorganizmów nitkowatych w osadzie czynnym detekcja Membranę po hybrydyzacji poddać, opisanej przy ćwiczeniu 6, procedurze detekcji z użyciem zestawu Biotin Chromogenie Detection Kit (Fermentas). Miejsce na zdjęcie membrany Wyniki i wnioski: 9

10 Molekularna analiza osadu czynnego z zastosowaniem metody ARDRA i hybrydyzacji DNA wnioski: 10