(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy /2 EP B1 (13) (1) T3 Int.Cl. C07K 16/28 (06.01) A61K 39/39 (06.01) C12N 1/13 (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Multispecyficzne deimmunizowane cząsteczki wiążące CD3 (30) Pierwszeństwo: EP (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 06/26 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 11/0 (73) Uprawniony z patentu: Micromet AG, München, DE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 ROBERT HOFMEISTER, Hingham, US BIRGIT KOHLEISEN, München, DE ULLA LENKKERI-SCHÜTZ, Eching, DE CHRISTIAN ITIN, Gräfelfing, DE PATRICK BÄUERLE, Gauting, DE FRANCIS J. CARR, Balmedie, GB ANITA A. HAMILTON, Aberdeen, GB STEPHEN WILLIAMS, Alford, GB (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Agnieszka Marszałek SULIMA-GRABOWSKA-SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. Skr. poczt Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-1482/VAL EP B1 Opis [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy cytotoksycznie aktywnego konstruktu specyficznie wiąŝącego CD3 zawierającego pierwszą domenę specyficznie wiąŝącą ludzki CD3 i drugą domenę wiąŝącą pochodzącą z Ig. Ponadto, dostarcza się sekwencję kwasu nukleinowego kodującą konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według wynalazku. Dalszymi aspektami wynalazku są wektory i komórki gospodarze zawierające tę sekwencję kwasu nukleinowego, sposób wytwarzania konstruktu według wynalazku oraz kompozycja zawierająca ten konstrukt. Wynalazek takŝe dostarcza zastosowanie tych konstruktów do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do leczenia konkretnych chorób oraz zestawu zawierającego konstrukt wiąŝący według wynalazku. [0002] Ludzki CD3 oznacza antygen, który jest eksprymowany na komórkach T jako część wielocząsteczkowego kompleksu komórki T oraz zawiera on trzy róŝne łańcuchy: CD3-ε, CD3-δ i CD3-γ. Zgromadzenie CD3 na komórkach T, np. przez unieruchomione przeciwciała przeciw-cd3, prowadzi do aktywacji komórek T podobnej do tej, w którą zaangaŝowany jest receptor komórki T, ale niezaleŝnej od jej specyficzności typowej dla klonu; patrz WO 99/4440 lub Hoffman (198) J. Immunol. 13:-8. [0003] Przeciwciała specyficznie rozpoznające antygen CD3 opisano w stanie techniki, przykładowo w Traunecker, EMBO J (1991), S6-9 i Kipriyanov, Int. J. Cancer 77 (1998), Niedawno zaproponowano przeciwciała skierowane przeciw CD3 do leczenia róŝnych chorób. Te przeciwciała lub konstrukty przeciwciał działają jako środki obniŝające poziom komórek T lub jako środki mitogenne, jak ujawniono w EP 284. Przeciwciała hybrydowe ludzko/gryzoniowe, które specyficznie wiąŝą kompleks antygenu CD3 ujawniono w WO 00/0268 oraz zaproponowano je jako środki immunosupresyjne, przykładowo do leczenia epizodów odrzucenia organów po alloprzeszczepach nerki, /przegrody i serca. W WO 03/04648 ujawniono bispecyficzne przeciwciało skierowane na CD3 oraz na antygen raka jajnika. Ponadto, Kufer (1997) Cancer Immunol Immunother 4:193-7 dotyczy bispecyficznego przeciwciała specyficznego względem CD3 i EpCAM do leczenia minimalnej resztkowej choroby nowotworowej. [0004] JednakŜe przeciwciała ze stanu techniki skierowane przeciw CD3 pochodzą ze źródeł innych niŝ ludzkie. Prowadzi to do kilku powaŝnych problemów przy stosowaniu takich przeciwciał przeciw-cd3 jako części trybu leczenia u ludzi. [000] Jednym takim problemem jest zespół uwalniania cytokin (ang. cytokine release

3 syndrome; CRS). CRS jest zespołem klinicznym, który obserwowano po podaniu kilku pierwszych dawek przeciwciał przeciw-cd3 i jest związany z faktem, Ŝe wiele przeciwciał skierowanych przeciw CD3 jest mitogennych. In vitro mitogenne przeciwciała skierowane przeciw CD3 wywołują proliferację komórek T i wytwarzanie cytokin. In vivo ta aktywność mitogenna prowadzi do uwalniania cytokin na duŝą skalę, włącznie z cytokinami pochodzącymi z komórek T, w czasie początkowych godzin po pierwszym wstrzyknięciu przeciwciała. Wydajność mitogenna przeciwciał specyficznych względem CD3 jest zaleŝna od monocytów/makrofagów oraz obejmuje ona wytwarzanie IL-6 i IL-1β przez te komórki. [0006] Objawy CRS obejmują zakres od często opisywanych łagodnych objawów podobnych do grypy do rzadziej opisywanych cięŝkich reakcji podobnych do wstrząsu (które mogą obejmować objawy w układzie sercowo-naczyniowym oraz ośrodkowym układzie nerwowym). Objawy te obejmują, między innymi, ból głowy, drŝenie, nudności/wymioty, biegunkę, ból brzucha, złe samopoczucie oraz pobolewanie i ból mięśni/stawów, ogólne osłabienie, incydenty sercowo-oddechowe, a takŝe incydenty neuropsychiatryczne. CięŜki obrzęk płucny wystąpił u pacjentów ze zwiększeniem objętości krąŝącej krwi oraz u tych u których nie stwierdzono zwiększenia objętości krąŝącej krwi. Innym powaŝnym problemem utrudniającym terapeutyczne zastosowanie, w szczególności, mysich przeciwciał monoklonalnych jest wywoływanie humoralnej odpowiedzi immunologicznej przeciw takim przeciwciałom, co powoduje wytwarzanie ludzkich przeciwciał przeciw-mysich ( HAMA ) (Schroff (198) Cancer Res. 4:879-88, Shawler (198) J. Immunol. 13:130-13). HAMA są zazwyczaj wytwarzane podczas drugiego tygodnia leczenia mysim przeciwciałem oraz neutralizują mysie przeciwciała, przez co blokują ich zdolność wiązania ich zamierzonej cząsteczki docelowej. Odpowiedź HAMA moŝe zaleŝeć od mysich regionów stałych ( Fc ) przeciwciała i/lub natury mysich regionów zmiennych ( V ). [0007] Stan techniki dostarcza róŝne rozwiązania mające na celu obniŝenie lub przeciwdziałanie wytwarzaniu HAMA przez modyfikację przeciwciał monoklonalnych nie pochodzących od człowieka. [0008] Jednym rozwiązaniem w obniŝaniu immunogenności takich przeciwciał jest ich humanizacja, jak przykładowo opisano w WO 91/09968 i US Ogólnie, humanizacja wymaga podstawienia sekwencji przeciwciała nie pochodzących od człowieka przez odpowiadające im sekwencje pochodzące od człowieka, tak jak przykładowo w przypadku przeszczepiania CDR. [0009] Innym rozwiązaniem w obniŝaniu immunogenności takich przeciwciał jest ich deimmunizacja, jak przykładowo opisano w WO 00/34317, WO 98/2976, WO 02/07941,

4 WO 02/ i WO 02/ Ogólnie deimmunizacja obejmuje przeprowadzenie podstawień aminokwasów w potencjalnych epitopach dla komórek T. W ten sposób zmniejszone jest prawdopodobieństwo, Ŝe pod wpływem wewnątrzkomórkowej obróbki białek dana sekwencja spowoduje wytworzenie epitopów dla komórek T. Ponadto, WO 92/7 opisuje rozwiązanie, w którym modyfikowane są determinanty antygenowe na białkach. W szczególności białka poddawane są mapowaniu epitopowemu i ich sekwencja aminokwasowa jest zmieniana na drodze inŝynierii genetycznej. [00] JednakŜe, humanizowane przeciwciała często wykazują obniŝone powinowactwo wiązania ze swoją cząsteczką docelową w porównaniu z ich macierzystymi przeciwciałami nie-humanizowanymi oraz często są w pewnym stopniu immunogenne w człowieku jako gospodarzu. [0011] Zatem problemem technicznym niniejszego wynalazku było dostarczenie środków i sposobów leczenia i/lub poprawy chorób nowotworowych, zaburzeń proliferacyjnych, a takŝe chorób związanych z komórkami B przez wywoływanie odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem komórek T. Wspomniane powyŝej środki i sposoby powinny pozwolić przezwycięŝyć wymienione wady znanych terapii opartych na przeciwciałach. [0012] Rozwiązanie tego problemu technicznego osiąga się przez dostarczenie postaci scharakteryzowanych w zastrzeŝeniach. [0013] Zgodnie z tym niniejszy wynalazek dotyczy cytotoksycznie aktywnego konstruktu specyficznie wiąŝącego CD3 zawierającego pierwszą domenę specyficznie wiąŝącą ludzki CD3 i drugą domenę wiąŝącą pochodzącą z Ig, w którym ta pierwsza domena jest deimmunizowana i zawiera region CDR-H1 zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO.: 88, region CDR-H2 zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO.: 90 lub 92 i region CDR-H3 zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO.: 96, 8, 119, 1, 121, 122, 123, 124, 12, 126 lub 127; oraz w którym ta pierwsza domena ponadto zawiera w swoim regionie zrębowym H1 sekwencję VKK (Val-Lys-Lys) oraz w którym sekwencja przejściowa pomiędzy regionem zrębowym H1 a regionem CDR-H1 zawiera sekwencję Ala-Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe (ASGYTF; SEQ ID NO.: 233). [0014] Nieoczekiwanie stwierdzono, Ŝe wymienione powyŝej, specyficzne modyfikacje znanych regionów CDR, a takŝe regionów zrębowych i odpowiadających im sekwencji przejściowych prowadzą do deimmunizacji cząsteczek specyficznie wiąŝących CD3, które wykazują obniŝoną immunogenność, ale zachowują swoją aktywność cytotoksyczną w porównaniu z oryginalnymi, nie-deimmunizowanymi sekwencjami. Odkrycie to było w

5 szczególności zaskakujące, poniewaŝ nie wszystkie moŝliwe protokoły deimmunizujące prowadziły do wytworzenia bioaktywnych, funkcjonalnych konstruktów, które wykazywały by wyraźną aktywność cytotoksyczną; patrz dołączone przykłady. Ponadto, nieoczekiwanie w przypadku deimmunizowanych cytotoksycznie aktywnych cząsteczek wiąŝących CD3 wykazano zwiększoną zdolność wytwarzania. Według tego wynalazku, specyficzne sekwencje nie-deimmunizowanych przeciwciał zastąpiono/zmodyfikowano do sekwencji wymienionych powyŝej. W szczególności, w regionach zrębowych H1 oryginalna sekwencja Leu-Ala-Arg (LAR) została zastąpiona sekwencją Val-Lys-Lys (VKK). Ponadto sekwencję Thr-Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe (TSGYTF) zawartą w regionie przejściowym regionu zrębowego H1 i CDR-H1 niektórych nie-zmodyfikowanych/nie-deimmunizowanych przeciwciał specyficznych względem CD3 zmodyfikowano według wynalazku do Ala-Ser- Gly-Tyr-Thr-Phe (ASGYTF) (SEQ ID NO.: 233) (patrz Fig. 14). PoŜądany, wynalazczy konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 charakteryzuje się tym, Ŝe wykazuje co najmniej dwie specyficzności wiązania, przy czym druga specyficzność wiązania pochodzi z Ig. Ponadto te poŝądane konstrukty charakteryzują się specyficznymi sekwencjami aminokwasowymi przedstawionymi tutaj powyŝej. Jak udokumentowano w dołączonych przykładach dostarczone tutaj konstrukty nadal zachowują bioaktywność w swojej postaci zmodyfikowanej/deimmunizowanej. Przykłady takŝe dokumentują, Ŝe nie wszystkie deimmunizacje prowadzą do cząsteczek bioaktywnych, co wyznacza się sposobami znanymi w dziedzinie (WO 92/7, WO 00/34317, WO 98/2976, WO 02/07941 lub WO 02/012899); patrz w szczególności przykłady 2 i. [001] Stosowane tutaj określenie cytotoksycznie aktywny konstrukt wiąŝący CD3 dotyczy konstruktu specyficznego względem CD3 zdolnego do wiązania ludzkiego kompleksu CD3 eksprymowanego na komórkach T oraz zdolnego do wywołania eliminacji/lizy komórek docelowych. Wiązanie cząsteczek specyficznie wiąŝących CD3 z kompleksu CD3/CD3 (np. przeciwciał, pochodnych przeciwciał lub fragmentów przeciwciał) prowadzi do aktywacji komórek T, jak wiadomo w dziedzinie; patrz WO 99/4440. Zgodnie z tym, wynalazczy konstrukt musi być w stanie wyeliminować/zlizować komórki docelowe in vivo i/lub in vitro. Odpowiednie komórki docelowe obejmują komórki eksprymujące cząsteczkę powierzchniową, która jest rozpoznawana przez drugą domenę wiąŝącą wynalazczych konstruktów pochodzącą z Ig. Takie cząsteczki powierzchniowe scharakteryzowano tutaj poniŝej. Cytotoksyczność moŝna wykrywać sposobami znanymi w dziedzinie oraz sposobami zilustrowanymi tutaj poniŝej oraz w dołączonych przykładach. Zgodnie z tym takie sposoby obejmują, między innymi, fizjologiczne testy in vitro. Takie testy fizjologiczne mogą monitorować śmierć komórkową, przykładowo przez utratę integralności

6 błony komórkowej (np. oparty na FACS test z jodkiem propidyny, test wpływu błękitu trypanu, fotometryczne testy uwalniania enzymów (LDH), radiometryczny test uwalniania 1 Cr, fluorometryczne testy uwalniania europu i uwalniania kalceiny-am). Dalsze testy obejmują monitorowanie Ŝywotności komórek, przykładowo z zastosowaniem fotometrycznych testów MTT, XTT, WST-1 i alamarblue, radiometrycznego testu inkorporacji 3 H-Thd, klonogennego testu mierzącego aktywność podziałów komórkowych oraz fluorometrycznego testu z rodaminą 123 mierzącego mitochondrialny gradient transbłonowy. Ponadto apoptozę moŝna monitorować przykładowo z zastosowaniem opartego na FACS testu ekspozycji fosfatydyloseryny, opartego na ELISA testu TUNEL, testu aktywności kaspazy (fotometrycznego, fluorometrycznego lub opartego na ELISA) lub przez analizę zmienionej morfologii komórek (obkurczenie, pączkowanie błony komórkowej). Korzystne jest analizowanie aktywności cytotoksycznej z zastosowaniem opartych na FACS pomiarów uwalniania barwników fluorescencyjnych. W takim teście fluorescencyjnie wyznakowane komórki, które niosą cząsteczkę wiąŝącą drugą domenę cytotoksycznie aktywnego bispecyficznego konstruktu wiąŝącego CD3 według wynalazku (korzystnie, komórki NALM-6 dla CD19 oraz komórki Kato dla antygenu EpCAM) inkubuje się z PBMC wyizolowanymi od losowych dawców lub ze standaryzowaną linią komórek T w obecności cytotoksycznie aktywnego bispecyficznego konstruktu wiąŝącego CD3 według wynalazku. Po inkubacji uwalnianie barwnika z fluorescencyjnych komórek docelowych do supernatantu wyznacza się z uŝyciem spektrofluorymetru. Cytotoksycznie aktywny, deimmunizowany, bispecyficzny konstrukt wiąŝący CD3 według niniejszego wynalazku charakteryzuje się przez porównanie z wartościami uzyskanymi przez pomiar bioaktywności podobnego konstruktu, który nie jest deimmunizowany lub nie wykazuje specyficzności względem komórek docelowych. [0016] Stosowane w kontekście niniejszego wynalazku określenie wiąŝący/oddziałujący z definiuje wiązanie/oddziaływanie co najmniej dwóch miejsc oddziaływania z antygenem. Określenie miejsce oddziaływania z antygenem definiuje, według niniejszego wynalazku, motyw polipeptydu, który wykazuje zdolność specyficznego oddziaływania ze specyficznym antygenem lub specyficzną grupą antygenów. To wiązanie/oddziaływanie naleŝy rozumieć jako definiujące specyficzne rozpoznawanie. Określenie specyficzne rozpoznawanie oznacza według tego wynalazku, Ŝe cząsteczka przeciwciała jest zdolna do specyficznego oddziaływania z i/lub wiązania co najmniej dwóch aminokwasów kaŝdej ze zdefiniowanych tutaj ludzkich cząsteczek docelowych. Przeciwciała mogą rozpoznawać, oddziaływać z i/lub wiązać róŝne epitopy na tej samej cząsteczce docelowej. To określenie dotyczy specyficzności cząsteczki przeciwciała, tj. jej zdolności do rozróŝnienia

7 pomiędzy specyficznymi regionami zdefiniowanej tutaj ludzkiej cząsteczki docelowej. Specyficzne oddziaływanie miejsca oddziaływania z antygenem z jego specyficznym antygenem moŝe spowodować inicjację sygnału przykładowo ze względu na wywołanie zmiany konformacyjnej antygenu, oligomeryzację antygenu itd. Zatem, specyficzny motyw w sekwencji aminokwasowej miejsca oddziaływania z antygenem oraz antygen wiąŝą się ze sobą ze względu na swoje struktury pierwszorzędowe, drugorzędowe lub trzeciorzędowe, a takŝe w wyniku drugorzędowych modyfikacji tej struktury. [0017] Stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem określenie specyficzne oddziaływanie oznacza, Ŝe konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według wynalazku nie reaguje lub zasadniczo nie reaguje krzyŝowo z (poli)peptydami o podobnych strukturach. Zgodnie z tym konstrukt według wynalazku specyficznie wiąŝe/oddziałuje z ludzkim CD3 oraz jest zdolny, ze względu na drugą domenę pochodzącą z Ig, do oddziaływania z innymi specyficznymi, wybranymi związkami, antygenami, markerami powierzchniowymi komórki, markerami nowotworowymi itd. Specyficzne przykłady takich cząsteczek przeciw którym skierowana jest ta druga domena pochodząca z Ig podano tutaj poniŝej. [0018] Reaktywność krzyŝową zestawu badanych konstruktów moŝna zbadać, przykładowo, oceniając wiązanie tego zestawu bispecyficznych jednołańcuchowych konstruktów w standardowych warunkach (patrz np. Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 oraz Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999) z interesującym (poli)peptydem, a takŝe z pewną liczbą bardziej lub mniej blisko spokrewnionych (strukturalnie i/lub funkcjonalnie) (poli)peptydów. Tylko te konstrukty, (tj. przeciwciała, (bispecyficzne) scfvs i tym podobne), które wiąŝą interesujący (poli)peptyd/białko, ale nie wiąŝą lub zasadniczo nie wiąŝą Ŝanego z innych (poli)peptydów, które są korzystnie eksprymowane przez tą samą tkankę co interesujący (poli)peptyd, np. przez komórki tkanki serca, uznaje się za specyficzne względem interesującego (poli)peptydu/białka i wybiera się do dalszych badań zgodnie z dostarczonym tutaj sposobem oraz zilustrowanym w dołączonych przykładach. Sposoby te mogą obejmować, między innymi, badanie wiązania, badanie blokowania i współzawodnictwa, z cząsteczkami blisko spokrewnionymi strukturalnie i/lub funkcjonalnie. Te badania wiązania obejmują takŝe analizę FACS, powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR, np. z BIAcore ), ultrawirowanie analityczne, izotermiczne miareczkowanie kalorymetryczne, anizotropię fluorescencji, spektroskopię fluorescencyjną lub testy wiązania ligandu znakowanego radioaktywnie. Ponadto moŝna przeprowadzić testy fizjologiczne, takie jak testy cytotoksyczne (jak zilustrowano w przykładach) oraz testy wspomniane powyŝej. Zgodnie z tym przykłady specyficznego oddziaływania miejsca oddziaływania z antyge-

8 nem ze specyficznym antygenem mogą obejmować specyficzność ligandu względem jego receptora. Ta definicja w szczególności obejmuje oddziaływanie ligandów, które wywołują sygnał po związaniu z ich specyficznym receptorem. Przykłady odpowiednich ligandów obejmują cytokiny, które oddziałują z/wiąŝą się ze specyficznymi receptorami cytokin. TakŜe w szczególności tą definicją objęte jest wiązanie miejsca oddziaływania z antygenem z antygenami, takimi jak antygeny z rodziny selektyn, integryny oraz z rodziny czynników wzrostu takich jak EGF. Innym przykładem takiego oddziaływania, które jest w szczególności objęte tą definicją, jest oddziaływanie determinanty antygenowej (epitopu) z miejscem wiązania antygenu przeciwciała. [0019] Określenie wiązanie/oddziaływanie z dotyczy nie tylko liniowego epitopu, ale moŝe takŝe dotyczyć epitopu konformacyjnego, epitopu strukturalnego lub epitopu nieciągłego składającego się z dwóch regionów ludzkich cząsteczek docelowych lub ich części. W kontekście tego wynalazku epitop konformacyjny definiuje się przez dwie lub większą liczbę oddzielnych sekwencji aminokwasowych rozdzielonych w sekwencji pierwszorzędowej, które zbliŝają się na powierzchni cząsteczki, gdy polipeptyd zwija się w natywne białko (Sela, (1969) Science 166, 136 i Laver, (1990) Cell 61, 3-6). [00] W kontekście wynalazku określenie nieciągły epitop oznacza nie-liniowe epitopy, które są złoŝone z reszt z odległych części łańcucha polipeptydowego. Reszty te zbliŝają się na powierzchni, gdy łańcuch polipeptydowy zwija się do struktury trójwymiarowej tak, Ŝe stanowią epitop konformacyjny/strukturalny. [0021] Zakłada się, Ŝe konstrukty według niniejszego wynalazku specyficznie wią- Ŝą/oddziałują z epitopem(-ami) konformacynym(-i)/strukturalnym(-i) złoŝonym(-i) z i/lub zawierającym(-mi) dwa regiony opisanego tutaj ludzkiego kompleksu CD3 lub ich części jak ujawniono tutaj poniŝej. [0022] Zgodnie z tym specyficzność moŝna wyznaczyć doświadczanie sposobami znanymi w dziedzinie oraz sposobami tutaj ujawnionymi i opisanymi. Takie sposoby obejmują, ale nie wyłącznie, analizę Western blot, testy ELISA, RIA, ECL, IRMA oraz przeszukiwanie peptydami (ang. peptide scan ). [0023] Określenie druga domena wiąŝąca pochodząca z Ig dotyczy domeny pochodzącej z immunoglobuliny, w szczególności przeciwciała lub jego fragmentów, jednołańcuchowych przeciwciał, syntetycznych przeciwciał, fragmentów przeciwciał, takich jak fragmenty Fab, F(ab 2 )', Fv lub scfv itd. lub chemicznie zmodyfikowanej pochodnej którejkolwiek z powyŝszych cząsteczek. Te cząsteczki przeciwciał mogą pochodzić z róŝnych gatunków lub mogą być pochodzenia chimerycznego. Najkorzystniej (jak tutaj udokumentowano), tą drugą domenę pochodzącą z Ig zawartą w konstrukcie specyficznie wiąŝącym

9 CD3 według wynalazku stanowi scfv. Przeciwciała, konstrukty przeciwciał, fragmenty przeciwciał, pochodne przeciwciał (z których wszystkie pochodzą z Ig) do zastosowania zgodnie z wynalazkiem oraz odpowiadający(-e) im łańcuch(-y) immunoglobuliny moŝe (mogą) być dalej zmodyfikowane z zastosowaniem standardowych technik znanych w dziedzinie, przykładowo przez zastosowanie delecji, insercji, podstawienia(-ń), addycji aminokwasów i/lub rekombinacji i/lub jakiejkolwiek (jakichkolwiek) innej(-ych) modyfikacji znanej(-ych) w dziedzinie samodzielnie lub w połączeniu. Sposoby wprowadzania takich modyfikacji do sekwencji DNA kodującej sekwencję aminokwasową łańcucha immunoglobuliny są dobrze znane fachowcowi w dziedzinie; patrz, np. Sambrook (1989), patrz niŝej. Określenie domena pochodząca z Ig w szczególności dotyczy konstruktów (poli)peptydowych zawierających co najmniej jeden CDR. Fragmenty lub pochodne wspomnianych domen pochodzących z Ig definiują (poli)peptydy, które są częściami powyŝszych cząsteczek przeciwciała i/lub które są zmodyfikowane metodami chemicznymi/biochemicznymi lub z dziedziny biologii molekularnej. Odpowiednie metody są znane w dziedzinie i opisane między innymi w podręcznikach laboratoryjnych (patrz Sambrook i in.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, wyd. 2, 1989 oraz wyd. 3, 01; Gerhardt i in.; Methods for General and Molecular Bacteriology; ASM Press, 1994; Lefkovits; Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 02). [0024] Stosowane tutaj określenie deimmunizowane dotyczy zidentyfikowanej powyŝej pierwszej domeny wynalazczego konstruktu wiąŝącego CD3, przy czym ta pierwsza domena jest zmodyfikowana w porównaniu z wyjściowym konstruktem typu dzikiego przez sprawienie, Ŝe ten konstrukt typu dzikiego będzie nie-immunogenny lub mniej immunogenny u ludzi. Konstrukty typu dzikiego według wynalazku dotyczą przeciwciał lub ich części (takich jak regiony zrębowe i/lub CDR) nie pochodzących od człowieka. Odpowiednimi przykładami są przeciwciała lub ich fragmenty takie jak opisano w US lub WO 99/4440. Określenie deimmunizowane dotyczy takŝe konstruktów, które wykazują obniŝoną zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T. Zgodnie z tym wynalazkiem określenie obniŝona zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T dotyczy usunięcia epitopów dla komórek T co prowadzi do specyficznej aktywacji komórek T. Ponadto, obniŝona zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T oznacza podstawienie aminokwasów przyczyniających się do wytworzenia epitopów dla komórek T, tj. podstawienie aminokwasów, które są zasadnicze dla wytworzenia epitopu dla komórki T. Innymi słowy, obniŝona zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T dotyczy obniŝo-

10 nej immunogenności lub obniŝonej zdolności do wywoływania niezaleŝnej od antygenu proliferacji komórek T. Ponadto, obniŝona zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T dotyczy deimmunizacji, co oznacza utratę lub zmniejszenie liczby potencjalnych epitopów dla komórek T w sekwencjach aminokwasowych wywołujących niezaleŝną od antygenu proliferację komórek T. Według wynalazku region wiąŝący CD3, który ma obni- Ŝoną zdolność wytwarzania epitopów dla komórek T jest mniej immunogenny lub korzystnie nie-immunogenny w porównaniu z nie-deimmunizowaną cząsteczką, a nadal zachowuje swoją zdolność wiązania CD3, tj. jest to słabo immunogenny lub nie-immunogenny konstrukt przeciwciała wiąŝący CD3. [002] Określenie epitop dla komórek T dotyczy krótkich sekwencji peptydowych, które mogą zostać uwolnione podczas rozkładu peptydów, polipeptydów lub białek w komórkach oraz mogą być następnie prezentowane przez cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) w celu wywołania aktywacji komórek T; patrz, między innymi WO 02/ Dla peptydów prezentowanych przez MHC klasy II taka aktywacja komórek T moŝe następnie spowodować wytworzenie odpowiedzi przeciwciał przez bezpośrednią stymulację komórek T, tak by wytwarzane były te przeciwciała. Zgodnie z tym, deimmunizowana pierwsza domena specyficznie wiąŝąca ludzki CD3 zawiera co najmniej wspomniany powyŝej CDR-H3 zlokalizowany pomiędzy regionami zrębowymi H3 i H4, przy czym ta pierwsza domena wiąŝąca wykazuje obniŝoną zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T w porównaniu z nie-deimmunizowaną pierwszą domeną zawierającą nie zmieniony CDR-H3 typu dzikiego (wt) zlokalizowany pomiędzy regionami zrębowymi H3 i H4. Ponadto, ta deimmunizowana pierwsza domena zawiera co najmniej w regionie przejściowym pomiędzy H1 i CDR-H1 wspomniany powyŝej motyw sekwencji, który zapewnia obniŝoną zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T w porównaniu z niedeimmunizowaną pierwsza domeną zawierającą nie zmieniony region przejściowy wt-h1 pomiędzy regionem zrębowym H1 i CDR-H1. ObniŜoną zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T i/lub deimmunizację moŝna mierzyć technikami znanymi w dziedzinie. Korzystnie, deimmunizację białek moŝna zbadać in vitro w teście proliferacji komórek T. W tym teście PBMC od dawców reprezentujące > 80% alleli HLA-DR występujących na świecie bada się pod względem odpowiedzi proliferacyjnej na peptydy typu dzikiego lub deimmunizowane. W idealnej sytuacji proliferację komórek wykrywa się tylko po załadowaniu komórek prezentujących antygen peptydami typu dzikiego. Inaczej, moŝna badać deimmunizację przez ekspresję tetrametrów HLA-DR reprezentujących wszystkie haplotypy. Te tetramery moŝna badać pod względem wiązania peptydu lub ładować peptydami zastępując komórki prezentujące antygen w testach proliferacyjnych. W celu zbada-

11 nia czy deimmunizowane peptydy są prezentowane na haplotypach HLA-DR moŝna zmierzyć wiązanie np. peptydów znakowanych fluorescencyjnie na PBMC. Ponadto deimmunizację moŝna udowodnić przez wyznaczenie czy po podaniu pacjentom zostały wytworzone przeciwciała przeciw deimmunizowanym cząsteczkom. Szczególnie korzystnym sposobem jest test proliferacji komórek T, taki jak między innymi, przedstwawiony w dołączonym przykładzie 6. [0026] Korzystnie cząsteczki pochodzące z przeciwciał są deimmunizowane w regionach zrębowych oraz większość regionów CDR nie jest zmodyfikowana w celu wytworzenia obniŝonej zdolności wywoływania epitopu dla komórek T tak, Ŝe nie ma to wpływu na powinowactwo wiązania regionów CDR. Nawet eliminacja jednego epitopu dla komórek T wywołuje obniŝoną immunogenność. Korzystnie cząsteczka jest deimmunizowana w regionie CDR2 łańcucha VL, korzystniej w regionie CDR2 łańcucha VH, jeszcze korzystniej w regionie CDR1 łańcucha VL, jeszcze korzystniej w regionie CDR1 łańcucha VH, korzystniej w regionie zrębowym (FR) łańcucha VL, a najkorzystniej w regionie zrębowym (FR) łańcucha VH. [0027] Stosowane tutaj określenie CDR dotyczy regionu determinującego dopasowanie, który jest dobrze znany w dziedzinie. CDR są częściami immunoglobulin oraz receptorów komórek T, które decydują o specyficzności tych cząsteczek oraz wchodzą w kontakt ze specyficznym ligandem. CDR są najbardziej zmienną częścią cząsteczki i przyczyniają się do zmienności tych cząsteczek. W kaŝdej domenie V istnieją trzy regiony CDR: CDR1, CDR2 i CDR3. CDR-H oznacza region CDR części zmiennej łańcucha cięŝkiego, a CDR-L oznacza region CDR części zmiennej łańcucha lekkiego. H oznacza część zmienną łańcucha cięŝkiego oraz L oznacza część zmienną łańcucha lekkiego. Regiony CDR regionu pochodzącego z Ig moŝna wyznaczyć w sposób opisany w Kabat (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd.., Publikacja NIH nr U.S. Department of Health and Human Services, Chothia (1987). J. Mol. Biol. 196, oraz Chothia (1989) Nature, 342, [0028] Ogólnie CDR-L1 składa się z -17 reszt aminokwasowych, rozpoczyna się w przybliŝeniu od reszty 24 pełnej długości regionu VL sekwencji pochodzącej z Ig oraz reszta Cys poprzedza CDR-L1. Korzystnie reszta Trp występuje po CDR-L1. CDR-L2 rozpoczyna się korzystnie od 16 reszty aminokwasowej po CDR-L1 i składa się korzystnie z 7 reszt. Korzystnie CDR-L2 poprzedzają reszty aminokwasowe Ile-Tyr, ale takŝe Val- Tyr, Ile-Lys, Ile-Phe. CDR-L3 rozpoczyna się korzystnie od 33 reszty aminokwasowej po CDR-L2 oraz korzystnie składa się z 7-11 reszt. CDR-L3 korzystnie występuje po reszcie Cys oraz korzystnie reszty Phe-Gly-Xaa-Gly występują bezpośrednio po CDR-L3. CDR-

12 H1 korzystnie składa się z -12 reszt oraz korzystnie rozpoczyna się w przybliŝeniu od reszty 26 od początku regionu VH. Korzystnie po CDR-H1 występuje reszta Trp. CDR-H2 rozpoczyna się, korzystnie od 1 reszty aminokwasowej po końcu CDR-H1 oraz korzystnie składa się 16 do 19 reszt. Korzystnie po CDR-H2 występują reszty Lys/Arg- Leu/Ile/Val/Phe/Thr/ Ala-Thr/Ser/Ile/Ala. CDR-H3 korzystnie rozpoczyna się od 33 reszty aminokwasowej po CDR-H2 oraz ma długość 3-2 reszt aminokwasowych. CDR-H3 występuje po sekwencji Cys-Xaa-Xaa (korzystnie Cys-Ala-Arg) oraz po CDR-H3 występują reszty Trp-Gly-Xaa-Gly. Strukturę regionów CDR opisano na [0029] Wspomniane powyŝej regiony CDR-H1 i CDR-H2 pochodzą z cząsteczek przeciwciała, które są zdolne do specyficznego wiązania/oddziaływania z ludzkim CD3. Takie przeciwciała specyficzne względem CD3 są znane w dziedzinie oraz obejmują w szczególności przeciwciała monoklonalne OKT-3, TR-66 lub X3-3, VIT3, BMA030 (BW264/6), CLB-T3/3, CRIS7, YTH12., F , CLB-T3.4.2, TR-66, WT32, SPv- T3b, 11D8, XIII-141, XIII-46, XIII-87, 12F6, T3/RW2-8C8, T3/RW2-4B6, OKT3D, M- T301, SMC2, F1.01, UCHT-1 lub WT-31. Wszystkie wspomniane przeciwciała przeciw-cd3 są specyficzne względem człowieka oraz zgodnie z tym wynalazkiem moŝliwe jest połączenie róŝnych regionów CDR, w szczególności regionów CDRH przeciwciał. [0030] W korzystniejszej postaci te regiony CDR-H1 i CDR-H2 tej domeny specyficznej względem CD3 o obniŝonej zdolności wytwarzania epitopów dla komórek T pochodzą z konstruktu przeciwciała opisanego w WO 99/4440. Jeszcze korzystniej (oraz jak wykazano w dołączonych przykładach) te regiony CDR-H1 i CDR-H2, a takŝe region CDR-H3, pochodzą z przeciwciała/pochodnej przeciwciała o specyficzności względem cząsteczki CD3 opisanych w Traunecker (1991), EMBO J., Zgodnie z niniejszym wynalazkiem te regiony CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 pochodzą z przeciwciał/pochodnych przeciwciał i tym podobnych, które są zdolne do specyficznego rozpoznawania ludzkiego łańcucha CD3-ε w kontekście innych podjednostek TCR, np. w mysich komórkach transgenicznych względem ludzkiego łańcucha CD3-ε. Te transgeniczne mysie komórki eksprymują ludzki łańcuch CD3-ε w konformacji natywnej lub zbliŝonej do natywnej. [0031] Zgodnie z tym wynalazkiem region zrębowy dotyczy regionu w domenie V (domenie VH lub VL) immunoglobulin i receptorów komórek T, który dostarcza białkowe rusztowanie dla hiperzmiennych regionów determinujących dopasowanie (CDR), które wchodzą w kontakt z antygenem. W kaŝdej domenie V występują cztery regiony zrębowe oznaczone FR1, FR2, FR3 FR4. Region zrębowy 1 obejmuje region od N-końca domeny V do początku CDR1, region zrębowy 2 obejmuje region pomiędzy CDR1 a CDR2, region zrębowy 3 oznacza region pomiędzy CDR2 a CDR3, a region zrębowy 4 obejmuje region od

13 końca CDR3 do C-końca domeny V; patrz między innymi Janeway, Immunobiology, Garland Publishing, 01, wyd.. Zatem regiony zrębowe obejmują wszystkie regiony leŝące na zewnątrz regionów CDR w domenach VH lub VL. Ponadto określenie sekwencja przejściowa pomiędzy regionem zrębowym i regionem CDR dotyczy bezpośredniego połączenia pomiędzy regionem zrębowym a regionem CDR. W szczególności określenie sekwencja przejściowa pomiędzy regionem zrębowym i regionem CDR oznacza sekwencję bezpośrednio zlokalizowaną po stronie N- i C-końcowej regionów CDR lub aminokwasy otaczające regiony CDR. Zgodnie z tym regiony zrębowe mogą takŝe obejmować sekwencje pomiędzy róŝnymi regionami CDR. Fachowiec w dziedzinie jest w stanie łatwo wywnioskować z danej sekwencji regiony zrębowe, CDR, a takŝe odpowiadające im sekwencje przejściowe; patrz Kabat (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd., publikacja NIH nr U.S. Department of Health and Human Services, Chothia (1987). J. Mol. Biol. 196, oraz Chothia (1989) Nature, 342, [0032] Korzystny cytotoksycznie aktywny konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według wynalazku ponadto zawiera w tej pierwszej domenie region zrębowy H3 zawierający sekwencję Met-Glu-Leu-Ser (MELS; SEQ ID NO.: 234). Jeszcze korzystniejszy jest wynalazczy konstrukt, który zawiera w tej pierwszej domenie region zrębowy H3 zawierający sekwencję Ile-Thr-Thr-Asp-Lys (ITTDK; SEQ ID NO.: 23). [0033] Zgodnie z niniejszym wynalazkiem pierwsza domena wynalazczego konstruktu specyficznie wiąŝąca/oddziałująca z ludzkim CD3 oraz wykazująca obniŝoną zdolność wytwarzania epitopów dla komórek T, zawiera regiony CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 jak tutaj zdefiniowano oraz, w korzystnej postaci, regiony zrębowe VH (regiony zrębowe 1, 2, 3, 4) jak zdefiniowano powyŝej, w szczególności jak przedstawiono w którejkolwiek z sekwencji o SEQ ID NO.: 12 lub 13, 16 lub 17, 160 lub 161 i/lub 164 lub 16. Zatem konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według wynalazku zawiera pierwszą domenę, która specyficznie wiąŝe ludzki CDR3 oraz zawiera region zrębowy 1 jak przedstawiono w SEQ ID NO.: 12 lub 13, zawiera region zrębowy 2 jak przedstawiono w SEQ ID NO.: 16 lub 17, region zrębowy 3 jak przedstawiono w SEQ IQ NO.: 160 lub 161 i/lub region zrębowy 4 jak przedstawiono w SEQ ID NO.: 164 lub 16. [0034] Szczególnie korzystne jest tutaj, aby cytotoksycznie aktywny deimmunizowany konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 zawierał w swojej pierwszej domenie (a) CDR-H1 jak przedstawiono w SEQ ID NO.: 88; oraz (b) CDR-H2 jak przedstawiono w SEQ ID NO.: 90 lub 92. [003] Zgodnie z tym zmodyfikowane regiony CDR-H1 i CDR-H2 prowadzą do obniŝonej zdolności do wytwarzania epitopów dla komórek T oraz pochodzą z przeciwciała specy-

14 ficznego względem łańcucha CD3-ε. Najkorzystniej zgodnie z tym wynalazkiem te (macierzyste) przeciwciała powinny być zdolne do specyficznego wiązania epitopów odzwierciedlających strukturę natywną lub zbliŝoną do natywnej lub konformacyjny epitop ludzkiego CD3 prezentowanego w kontekście kompleksu TCR. [0036] Korzystnie konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według wynalazku zawiera region VH przedstawiony w SEQ ID NO.: 74 lub 76. SEQ ID NO.: 74 przedstawia przykładowy deimmunizowany region zmienny łańcucha cięŝkiego oraz, podobnie, SEQ ID NO.: 76 przedstawia przykładowy deimmunizowany region zmienny łańcucha cięŝkiego. [0037] Korzystnie wynalazczy konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 zawiera CDR-L1 przedstawiony w SEQ ID NO.: 98 lub 0, CDR-L2 przedstawiony w SEQ ID NO.: 2 i/lub CDR-L3 przedstawiony w SEQ ID NO.: 4. [0038] Konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według wynalazku zawiera, w korzystnej postaci, region VL w swojej części specyficznej względem CD3, w którym ten region VL jest wybrany z grupy obejmującej SEQ ID NO.: 78, SEQ ID NO.: 80, SEQ ID NO.: 82 i SEQ ID NO.: 112. VL1 charakteryzowany w SEQ ID NO.: 78, VL2 scharakteryzowany w SEQ ID NO.: 80 oraz VL 3 scharakteryzowany w SEQ ID NO.: 82 dotyczą deimmunizowanych regionów VL pełnej długości zgodnie z wynalazkiem oraz mogą być one stosowane w róŝnych połączeniach z opisanymi powyŝej regionami VH. JednakŜe zakłada się tak- Ŝe, Ŝe nie-deimmunizowany region VL moŝna łączyć, zgodnie z wynalazkiem ze zdefiniowanymi powyŝej deimmunizowanymi regionami VH. Odpowiedni nie deimmunizowany region VL korzystnie stosowany w cytotoksycznie aktywnym konstrukcie wiąŝącym CD3 według wynalazku przedstawiono w SEQ ID NO.: 112. Zgodnie z tym nie tylko część łańcucha cięŝkiego wspomnianej powyŝej pierwszej domeny wynalazczego konstruktu CD3 moŝe zostać zmodyfikowana tak, aby wykazywała obniŝoną zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T. Zakłada się, Ŝe ta domena zawiera odpowiednie części zmienne łańcucha lekkiego. Przykładowo SEQ ID NO.: 78, 80 i 82, przedstawiają deimmunizowane regiony VL1, VL2 i VL3 części wiąŝącej CD3 konstruktu ujawnionego w WO 99/4440. [0039] Jak wspomniano powyŝej konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według wynalazku, najkorzystniej zawiera drugą domenę pochodzącą z Ig, którą stanowi scfv. Zgodnie z tym w najkorzystniejszej postaci wynalazku dostarcza się deimmunizowany, bispecyficzny konstrukt jednołańcuchowego przeciwciała o jednej specyficzności względem ludzkiego CD3 oraz dodatkowej specyficzności, która jest pośredniczona przez drugi scfv, skierowanej przeciw/zdolnej do oddziaływania z dodatkową cząsteczką/związkiem. Te dodatkowe cząsteczki/związki mogą obejmować cząsteczki powierzchniowe komórki, markery

15 nowotworowe, antygeny nowotworowe i tym podobne. Takie dodatkowe związki/cząsteczki podano przykładowo tutaj poniŝej oraz specyficzne konstrukty takŝe podano i dostarczono w dołączonych przykładach. [0040] Określenie bispecyficzny konstrukt jednołańcuchowego przeciwciała dotyczy konstruktu zawierającego dwie domeny wiąŝące pochodzące z przeciwciał, korzystnie sc- Fvs. Jedna z tych domen wiąŝących składa się z regionów zmiennych (lub ich części) przeciwciała, fragmentu przeciwciała lub jego pochodnej, zdolne do specyficznego wiązania/oddziaływania z ludzkim antygenem CD3 (cząsteczka docelowa 1). Druga domena wiąŝąca składa się z regionów zmiennych (lub ich części) przeciwciała, fragmentu przeciwciała lub jego pochodnej, zdolnych do specyficznego wiązania/oddziaływania z innym (ludzkim) antygenem (cząsteczka docelowa 2) jak zdefiniowano poniŝej. Zgodnie z tym tą drugą domenę wiąŝącą stanowi, zgodnie z tym wynalazkiem, wymieniona powyŝej druga domena pochodząca z Ig, która zwiera miejsce oddziaływania z antygenem o specyficzności względem cząsteczki powierzchniowej komórki i/lub markera specyficznego dla nowotworów. Te dwie domeny/regiony w konstrukcie bispecyficznym, korzystnie tym bispecyficznym konstrukcie jednołańcuchowego przeciwciała, są korzystnie połączone ze sobą kowalencyjnie w postaci pojedynczego łańcucha. To połączenie moŝna wykonać bezpośrednio (domena 1 [specyficzna względem ludzkiego antygenu CD3, wykazująca obniŝoną zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T oraz zawierająca regiony CDR lub regiony CDR i regiony zrębowe jak zdefiniowano powyŝej] - domena 2 [specyficzna dla cząsteczki powierzchniowej komórki i/lub markera specyficznego dla nowotworu] lub domena 1 [specyficzna dla cząsteczki powierzchniowej komórki i/lub markera specyficznego dla nowotworu] - domena 2 [specyficzna względem ludzkiego antygenu CD3, wykazująca obniŝoną zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T oraz zawierająca regiony CDR lub regiony CDR i regiony zrębowe jak zdefiniowano powyŝej]) lub przez dodatkową polipeptydową sekwencję łącznikową (domena1 sekwencja łącznikowa - domena2). W przypadku, gdy stosowany jest łącznik, łącznik ten korzystnie ma długość oraz zawiera sekwencję wystarczającą do zapewnienia, Ŝe kaŝda spośród pierwszej i drugiej domeny moŝe, niezaleŝnie od siebie, zachować swoje róŝne specyficzności wiązania. Jak wspomniano powyŝej oraz jak udokumentowano w dołączonych przykładach korzystnie konstrukt specyficznie wiąŝący CD3, zawierający co najmniej dwie domeny jak tutaj zdefiniowano, jest bispecyficznym konstruktem jednołańcuchowego przeciwciała, najkorzystniej bispecyficznym jednołańcuchowym Fv (scfv). W szczególności zakłada się, Ŝe ten konstrukt stosuje się w kontekście kompozycji farmaceutycznej. Bispecyficzne jednołańcuchowe cząsteczki są znane w dziedzinie i opisane w WO 99/4440, Mack, J. Immu-

16 nol. (1997), 18, , Mack, PNAS, (199), 92, , Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 4, , Löffler, Blood, (00), 9, 6, 98-23, Brühl, J. Immunol., (01), 166, Szczególnie korzystny format molekularny według wynalazku dostarcza konstrukt polipeptydowy, w którym domena specyficznie wiąŝąca CD3 konstruktu według wynalazku zawiera co najmniej jeden region V H i V L jak zdefiniowano powyŝej. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe oprócz regionu V H tutaj zdefiniowanego oraz wykazującego obniŝoną zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T, ten specyficznie wiąŝący konstrukt moŝe zawierać dodatkowe regiony/domeny o obniŝonej zdolności do wytwarzania epitopów dla komórek T. Jak wspomniano powyŝej takŝe region VL i/lub odpowiadające mu regiony zrębowe mogą zawierać ciągi aminokwasów, które zostały zaprojektowane zgodnie z tym wynalazkiem tak, aby wykazywały obniŝoną zdolność wytarzania epitopu dla komórek T. Orientacja wewnątrzcząsteczkowa domeny V H i domeny V L, które są połączone ze sobą przez domenę łącznikowa, w formacie scfv nie jest decydująca dla dalszych wspomnianych bispecyficznych jednołańcuchowych konstruktów. Zatem, scfv z obydwoma moŝliwymi ustawieniami (domena V H - domena łącznikowa - domena V L ; domena V L - domena łącznikowa - domena V H ) są konkretnymi postaciami wspomnianego bispecyficznego jednołańcuchowego konstruktu. Domena specyficzna względem CD3 moŝe być zlokalizowana na N- lub C-końcu cząsteczki bispecyficznej. Regiony VH i VL kaŝdej domeny mogą zostać ustawione w róŝnej kolejności (V H -V L lub V L -V H ). [0041] Stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem określenie jednołańcuchowy oznacza, Ŝe ta pierwsza i druga domena bispecyficznego jednołańcuchowego konstruktu są połączone kowalencyjnie, korzystnie w postaci współliniowej sekwencji aminokwasowej kodowanej przez pojedynczą cząsteczkę kwasu nukleinowego. [0042] NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe konstrukt według wynalazku moŝe zawierać, oprócz zdefiniowanej tutaj pierwszej domeny i drugiej domeny pochodzącej z Ig, dodatkową(-e) domenę(-y), np. do izolacji i/lub preparowania konstruktów wytwarzanych rekombinacyjnie. [0043] NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe zgodnie z tym wynalazkiem nie tylko opisana powyŝej pierwsza domena specyficznie wiąŝąca ludzki CD3 z wynalazczego konstruktu CD3 moŝe mieć obniŝoną zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T. Zakłada się takŝe, Ŝe druga domena pochodząca z Ig i/lub łączący(-e) region(-y) łącznikowy(-e) są takŝe zmodyfikowane, przykładowo humanizowane i/lub takŝe deimmunizowane. [0044] Jak wspomniano powyŝej sposoby deimmunizacji w szczególności zilustrowano w WO 00/34317, WO 98/2976, WO 02/07941 lub WO 02/ oraz w dołączonych

17 przykładach. Sposoby te obejmują wykonanie podstawień aminokwasów w potencjalnych epitopach dla komórek T. W ten sposób zmniejszone jest prawdopodobieństwo, Ŝe dana sekwencja spowoduje wytworzenie epitopów dla komórek T po wewnątrzkomórkowej obróbce białka. Ponadto WO 92/7 opisuje sposób w którym determinanty antygenowe na białkach są modyfikowane. W szczególności białka mapuje się epitopowo i ich sekwencje aminokwasowe zmienia się poprzez inŝynierie genetyczną. [004] Ponadto sposoby humanizacji są dobrze znane w dziedzinie oraz w szczególności opisane dla cząsteczek przeciwciał, np. cząsteczek pochodzących z Ig. Określenie humanizowane dotyczy humanizowanych postaci przeciwciał nie pochodzących od człowieka (np. mysich) lub ich fragmentów (takich jak Fv, Fab, Fab', F(ab'), scfvs lub inne częściowe sekwencje przeciwciał wiąŝące antygen), które zawierają niewielką część sekwencji pochodzącej z przeciwciała nie pochodzącego od człowieka. Humanizowane przeciwciała obejmują ludzkie immunoglobuliny w których reszty regionu determinującego dopasowanie (CDR) ludzkiej immunoglobuliny zostały zastąpione resztami z CDR pochodzącymi z gatunków innych niŝ człowiek, takich jak mysz, szczur lub królik wykazującymi wymaganą specyficzność wiązania, powinowactwo oraz wydajność. Ogólnie, humanizowane przeciwciało będzie zawierać zasadniczo wszystkie spośród co najmniej jednej oraz ogólnie dwóch domen zmiennych w których wszystkie lub zasadniczo wszystkie regiony CDR odpowiadają tym z immunoglobuliny nie pochodzącej od człowieka oraz wszystkie lub zasadniczo wszystkie regiony FR pochodzą z sekwencji konsensusowej ludzkiej immunoglobuliny. Humanizowane przeciwciało optymalnie będzie takŝe zawierać co najmniej część regionu stałego immunoglobuliny (Fc), zazwyczaj ludzkiej immunoglobuliny; patrz, między innymi,, Jones i in., Nature 321:22-2 (1986), Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:93-96 (1992). Sposoby humanizacji przeciwciał nie pochodzących od człowieka są dobrze znane w dziedzinie. Ogólnie humanizowane przeciwciało zawiera jeden lub większą liczbę wprowadzonych aminokwasów, które pochodzą ze źródła innego ludzkie, aby bardziej przypominało ono ludzkie przeciwciało, nadal zachowując wyjściową aktywność wiąŝącą przeciwciała. Sposoby humanizacji przeciwciał/cząsteczek przeciwciał dalej wyszczególniono w Jones i in., Nature 321:22-2 (1986); Riechmann i in., Nature 332: (1988); oraz Verhoeyen i in., Science 239: (1988). Określone przykłady humanizowanych przeciwciał, przykładowo przeciwciał skierowanych przeciw EpCAM, są znane w dziedzinie, patrz np. (LoBuglio, Proceedings of the American Society of Clinical Oncology (Abstrakt). 1997, 162 oraz Khor, Proceedings of the American Society of Clinical Oncology (Abstrakt), 1997, 847). [0046] Zgodnie z tym w kontekście tego wynalazku dostarcza się w szczególności bispecy-

18 ficzne konstrukty jednołańcuchowego przeciwciała, które są deimmunizowane oraz moŝna je z powodzeniem stosować w kompozycjach farmaceutycznych. [0047] Jak wspomniano powyŝej druga domena pochodząca z Ig opisanego powyŝej konstruktu specyficznie wiąŝącego CD3 moŝe zawierać miejsce oddziaływania z antygenem o specyficzności względem cząsteczki powierzchniowej komórki. [0048] Stosowane tutaj określenie cząsteczka powierzchniowa komórki takŝe oznacza cząsteczki, które są prezentowane na powierzchni komórek. Określenie cząsteczka powierzchniowa komórki dotyczy cząsteczek, które są prezentowane na powierzchni komórek oraz zawierają domeny lub epitopy dostępne (in vitro lub in vivo) dla domen wiąŝących pochodzących z Ig, korzystnie przeciwciał, fragmentów lub pochodnych przeciwciał. Jak zilustrowano powyŝej, najkorzystniej tę domenę pochodzącą z Ig stanowi scfv. Przykładami tych cząsteczek powierzchniowych komórki są białka błonowe lub transbłonowe, cząsteczki przystosowane do tych białek lub powierzchni komórki itd. Zgodnie z dalszą korzystną postacią wynalazku tę cząsteczkę powierzchniową komórki stanowi marker specyficzny dla nowotworu. W kontekście tego wynalazku określenie marker specyficzny dla nowotworu dotyczy cząsteczek, które są prezentowane i/lub zlokalizowane na powierzchni komórek nowotworowych lub które są powszechnie eksprymowane, ale dostępne dla wiązania tylko przez przeciwciała, fragmenty przeciwciał lub pochodne przeciwciał na powierzchni komórek nowotworowych. Przykłady markerów nowotworowych podano tutaj poniŝej oraz obejmują one, ale nie wyłącznie, EpCAM, CD19, HER-2, HER-2 neu, HER-3, HER-4, EGFR, PSMA, CEA, MUC-1 (mucyna), MUC2, MUC3, MUC4, MUC AC, MUC B, MUC7, Lewis-Y, CD, CD33, CD30, CD44v6, Wue-1, antygen komórki plazmatycznej (patrz WO 01/4793), (związaną z błoną) IgE, proteoglikan siarczanu chondroityny z czerniaka (MCSP), STEAP, mezotelinę, antygen komórek macierzystych stercza (PSCA), stn (sialilowany antygen Tn), FAP (antygen aktywacji fibroblastów), EGFRvIII, Igα, Igβ, MT-MMP, antygen Cora, EphA2, L6 oraz CO-29. [0049] Druga domena pochodząca z Ig konstruktu specyficznie wiąŝącego CD3 według wynalazku moŝe takŝe zawierać miejsce oddziaływania z antygenem o specyficzności względem EpCAM. [000] Konstrukty tutaj dostarczone są szczególnie przydatne w zastosowaniu medycznym. Przykładowo choroby nowotworowe i/lub chłoniaki, korzystnie chłoniaka nieziarniczego z komórek B, moŝna leczyć ujawnionym tutaj deimmunizowanym (bispecyficznym) konstruktem skierowanym przeciw ludzkiemu CD3 i CD (CD3xCD lub CDxCD3). Choroby autoimmunizacyjne moŝna leczyć przez podawanie deimmunizowanych (bispecyficznych) konstruktów skierowanych przeciw ludzkiemu CD3 i CD30 lub CD19 (tj.

19 CD3xCD30 lub CD30xCD3 lub CD3xCD19 lub CD19xCD3). Reumatoidalne zapalenie stawów, a takŝe inne choroby zapalne, moŝna leczyć ujawnionym tutaj deimmunizowanym (bispecyficznym) konstruktem skierowanym przeciw ludzkiemu CD3 i CCR (CD3xCCR lub CCRxCD3). Deimmunizowany konstrukt specyficznie wiąŝący CD3, tutaj zdefiniowany i zawierający drugą domenę pochodzącą z Ig skierowaną przeciw/wiąŝącą prekursor TNF-alfa moŝe być takŝe przydatny w leczeniu lub profilaktyce zaburzeń zapalnych. Konstrukty CD3 tutaj dostarczone i zawierające drugą domenę pochodzącą z Ig skierowaną przeciw/wiąŝącą/oddziałującą z EpCAM mogą być szczególne przydatne w interwencji medycznej w chorobach nowotworowych, takich jak rak sutka, rak okręŝnicy, rak stercza, rak głowy i szyi, rak skóry (czerniak), raki układu moczowopłciowego, np. rak jajnika, rak trzonu macicy, rak szyjki macicy oraz rak nerki, rak płuca, rak Ŝołądka, rak jelita cienkiego, rak wątroby, rak trzustki, rak pęcherzyka Ŝółciowego, raki przewodów Ŝółciowych, rak przełyku, rak gruczołów ślinowych oraz rak gruczołu tarczowego oraz inne choroby nowotworowe, takie jak nowotwory hematologiczne, glejaki, mięsaki lub kostniakomięsaki. Podawanie konstruktów wiąŝących CD3 jest takŝe wskazane dla minimalnej choroby resztkowej, korzystnie w przypadku wczesnych guzów litych, zaawansowanych guzów litych lub przerzutowych guzów litych. [001] Jak takŝe wykazano w dołączonych przykładach, szczególnie korzystny konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według wynalazku zawiera powyŝej zdefiniowaną pierwszą domenę o obniŝonej zdolności do wytwarzania epitopów dla komórek T i drugą domenę pochodzącą z Ig, zawierającą miejsce oddziaływania z antygenem o specyficzności względem EpCAM. [002] Cząsteczka adhezyjna komórek nabłonkowych (EpCAM, nazywana takŝe antygenem 17-1A, KSA, EGP40, GA733-2, ks1-4 lub esa) jest związaną z błoną 40-kDa glikoproteiną o 314 aminokwasach o specyficznej ekspresji w pewnych nabłonkach oraz na wielu ludzkich rakach (praca przeglądowa w Balzar, J. Mol. Med. 1999, 77, ). Ep- CAM wykryto, a następnie sklonowano dzięki jego rozpoznaniu przez mysie przeciwciało monoklonalne 17-1A/edrecolomab (Goettlinger, Int J Cancer. 1986; 38, 47-3 oraz Simon, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990; 87, ). EpCAM słuŝy do adhezji komórek nabłonkowych w zorientowany i wysoce uporządkowany sposób (Litvinov, J Cell Biol. 1997, 139, ). Po transformacji złośliwej komórek nabłonkowych szybko rosnące komórki nowotworowe zarzucają wysokie uporządkowanie komórkowe nabłonków. W konsekwencji rozmieszczenie EpCAM na powierzchni staje się mniej ograniczone oraz cząsteczka staje się lepiej eksponowana na komórkach nowotworowych oraz dostępna dla wiązania przez przeciwciała, fragmenty przeciwciała lub pochodne przeciwciała na po-

20 wierzchni komórek nowotworowych. Ze względu na ich pochodzenie nabłonkowe komórki nowotworowe z większości raków nadal eksprymują EpCAM na swojej powierzchni. [003] In vivo ekspresja EpCAM jest związana ze zwiększoną proliferacją nabłonka i ujemnie koreluje z róŝnicowaniem komórki (praca przeglądowa patrz Balzar, 1999, J. Mol. Med. 77, ). Ekspresja EpCAM jest zasadniczo obserwowana we wszystkich głównych rakach (praca przeglądowa patrz Balzar, J Mol Med. 1999, 77, lub jak udokumentowano między innymi w De Bree, Nucl Med Commun. 1994, 1, ; Zhang, Clin Cancer Res. 1998, 4, ). Ze względu na jej rozpowszechnioną ekspresję Ep- CAM jest preferowana jako antygen pan-rakowy. W wielu przypadkach obserwowano, Ŝe komórki nowotworowe eksprymują EpCAM na znacznie wyŝszym poziomie niŝ ich nabłonek macierzysty lub mniej agresywne postaci tych raków. Przykładowo, podwyŝszona ekspresja EpCAM stanowi wczesne wydarzenie w rozwoju raka stercza (Poczatek, J Urol., 1999, 162, ). Ponadto, w większości zarówno raków płaskokomórkowych, jak i raków gruczołowych szyjki macicy silna ekspresja EpCAM koreluje ze zwiększoną proliferacją oraz znikaniem markerów róŝnicowania terminalnego (Litvinov, Am. J. Pathol. 1996, 148, 86-7). W rakach sutka nadekspresja EpCAM na komórkach nowotworowych jest wskaźnikiem pozwalającym przewidywać przeŝycie (Gastl, Lancet. 00, 36, ). EpCAM jest markerem do wykrywania rozsianych komórek nowotworowych u pacjentów cierpiących na raka płaskokomórkowego głowy, szyi i płuca (Chaubal, Anticancer Res 1999, 19, , Piyathilake, Hum Pathol. 00, 31, ). Prawidłowy nabłonek płaski, znajdywany w naskórku, jamie ustnej, nagłośni, gardle, krtani oraz przełyku nie eksprymuje EpCAM w istotnym stopniu (Quak, Hybridoma, 1990, 9, ). Wykazano, Ŝe EpCAM jest eksprymowana na większości pierwotnych, przerzutowych i rozsianych NSCLC (komórek niedrobnokomórkowego raka płuca (Passlick, Int J Cancer, 00, 87, 48-2)), na rakach gruczołowych Ŝołądka i połączenia przełykowo- Ŝołądkowego (Martin, J Clin Pathol 1999, 2, 701-4) oraz w liniach komórkowych pochodzących z raków jelita grubego, trzustki i raków sutka (Szala, Proc Natl Acad Sci U S A 1990, 87, 342-6, Packeisen, Hybridoma, 1999, 18, 37-40). [004] W najkorzystniejszej postaci konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według wynalazku, który zawiera drugą domenę pochodzącą z Ig skierowaną przeciw/wiąŝącą EpCAM, zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej (a) sekwencję aminokwasową przedstawioną w którejkolwiek z SEQ ID NO.: 31, 33, 3, 37, 39, 49,, 8, 61, 63, 6, 67, 237, 239, 241, 243, 24, 247, 249, 21, 23, 2, 27, 29, 261, 263, 26, 267, 269, 271, 273, 27, 277, 279, 281, 283, 28, 287, 289, 291, 293, 29, 297, 299, 301, 303, 30, 307, 309, 311, 313, 31, 317, 319, 321, 323 i

21 ; (b) sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną w którejkolwiek z SEQ ID NO.: 30, 32, 34, 36, 38, 48, 4, 7, 60, 62, 64, 66, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248,, 22, 24, 26, 28, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 3, 312, 314, 316, 318, 3, 322 i 324; oraz (c) sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego, która jest zdegenerowana pod względem kodu genetycznego do sekwencji nukleotydowej (b). [00] Zgodnie z tym niniejszy wynalazek dostarcza, w szczególnie korzystnej postaci, konstrukty specyficzne względem CD3, które zawierają część wiąŝącą/oddziałującą z CD3 ( przeciw-cd3 ), która wykazuje obniŝoną zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T oraz dodatkową część jednołańcuchową (domenę pochodzącą z Ig), która specyficznie oddziałuje z/wiąŝe EpCAM ( przeciw-epcam ). PoniŜsze tabele 1A, 1B, 2A, 2B, 3A, 3B, 4A, 4B, A oraz B dotyczą korzystnych konfiguracji takich konstruktów wiąŝących CD3 i EpCAM. [006] EpCAM 3-1, EpCAM 3-, EpCAM 4-1, EpCAM 4-7 i EpCAM - dotyczą specyficznych jednołańcuchowych przeciwciał przeciw EpCAM wyizolowanych przez prezentację fagową w WO99/2818. [007] KaŜdy konstrukt białkowy w Tabelach 1A, 2A, 3A, 4A i A zawiera 7 oddzielnych modułów białkowych, oznaczonych A-G. Moduły białkowe A-G są bezpośrednio i kowalencyjnie połacząne ze sobą w jeden ciągły łańcuch polipeptydowy przez wiązania peptydowe w kolejności A-B-C-D-E-F-G, z modułem białkowym A na N-końcu oraz modułem białkowym G na C-końcu. Moduły białkowe A, C, E i G oznaczają domeny zmienne przeciwciała, które mogą być domenami VH lub VL przeciwciał o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3 lub EpCAM. Moduły B, D i F stanowią łączniki łączące domeny VH i VL. [008] JeŜeli moduł białkowy A stanowi domenę VH przeciwciała, wtedy moduł białkowy C stanowi domenę białkową VL i na odwrót. JeŜeli moduł białkowy E stanowi domenę VH przeciwciała, wtedy moduł białkowy G stanowi domenę białkową VL i na odwrót. [009] Deimmunizowane domeny VH przeciwciał o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3 moŝna wybrać spośród sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO.: 74 lub 76. Deimmunizowane domeny VL przeciwciał o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3 moŝna wybrać spośród sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO.: 78, 80 lub 82. Domenę białkową VH przeciwciała przeciw ludzkiej EpCAM 3-1, 3-, 4-1, 4-7 i - przedstawiono w odpowiednio w SEQ ID NO.: 137, 141, 14, 149 i 133. Domenę białko-

22 wą VL przeciwciała przeciw ludzkiej EpCAM 3-1, 3-, 4-1, 4-7 i - przedstawiono w odpowiednio w SEQ ID NO.: 139, 143, 147, 11 i 13. [0060] Pary domen zmiennych przeciwciała oznaczone przez pary modułów białkowych A/C i E/G są połączone przez dodatkowe łączące moduły białkowe, przy czym moduł białkowy B słuŝy do bezpośredniego połączenia pary modułów A/C, a moduł białkowy F słuŝy do bezpośredniego połączenia pary modułów E/G. Gdy którąkolwiek z par modułów A/C lub E/G stanowi para deimmunizowanych domen białkowych VH/VL lub VL/VH z przeciwciała o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3, moduł białkowy odpowiednio B lub F ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO.: 3. Gdy którąkolwiek z par modułów A/C lub E/G stanowi para VH/VL lub VL/VH z przeciwciała o specyficzności względem antygenu EpCAM, moduł białkowy odpowiednio B lub F ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO.: 168. Moduł D łączy grupy modułów ABC i EFG. [0061] Połączenie modułów białkowych A-B-C oraz połączenie modułów białkowych E- F-G kaŝde odpowiednio stanowi jeden fragment scfv przeciwciała o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3 lub antygenu EpCAM. JeŜeli moduły A i C zawierają sekwencję wiąŝącą CD3, odpowiednie grupy modułów białkowych A-B-C i E-F-G są połączone ze sobą przez moduł białkowy D o sekwencji przedstawionej w SEQ ID NO.: 176. Z drugiej strony jeŝeli moduły A i C zawierają sekwencję wiąŝącą EpCAM, odpowiednie grupy modułów białkowych A-B-C i E-F-G są połączone ze sobą przez moduł białkowy D o sekwencji przedstawionej w SEQ ID NO.: 174. Zatem dodatkowa seryna moŝe zostać wstawiona po łańcuchu VL do celów klonowania. JednakŜe fachowiec w dziedzinie moŝe takŝe zastosować, zamiast SEQ ID NO.: 176, łącznik przedstawiony w SEQ ID NO.: 174 w celu połączenia domeny VL z kolejną domeną V. Moduł białkowy D słuŝy do połączenia C-końca modułu białkowego C z N-końcem modułu białkowego E. [0062] KaŜdy konstrukt kwasu nukleinowego w Tabelach 1 B, 2B, 3B, 4B i B zawiera 7 osobnych modułów kwasu nukleinowego oznaczonych A-G. Moduły kwasu nukleinowego A-G są bezpośrednio i kowalencyjnie połączone ze sobą w jeden ciągły łańcuch nukleotydowy przez wiązania fosforano-glikozydowe w kolejności A-B-C-D-E-F-G, z modułem kwasu nukleinowego A na -końcu oraz modułem kwasu nukleinowego G na 3 -końcu odpowiedniego konstruktu kwasu nukleinowego. Moduły kwasu nukleinowego A, C, E i G oznaczają regiony kodujące domeny zmienne przeciwciała, które mogą być domenami VH lub VL przeciwciał o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3 lub EpCAM. [0063] JeŜeli moduł kwasu nukleinowego A koduje domenę VH przeciwciała, wtedy moduł kwasu nukleinowego C koduje domenę białkową VL i na odwrót. JeŜeli moduł kwasu

23 nukleinowego E koduje domenę VH przeciwciała, wtedy moduł kwasu nukleinowego G koduje domenę białkową VL i na odwrót. [0064] Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące deimmunizowane domeny VH przeciwciał o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3 moŝna wybrać spośród sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO.: 73 lub 7. Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące deimmunizowane domeny VL przeciwciał o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3 moŝna wybrać spośród sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO.: 77, 79 lub 81. Cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą domenę białkową VH przeciwciała przeciw ludzkiej EpCAM 3-1, 3-, 4-1, 4-7 i - przedstawiono odpowiednio w w SEQ ID NO.: 136, 140, 144, 148 i 132. Cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą domenę białkową VL przeciwciała przeciw ludzkiej EpCAM 3-1, 3-, 4-1, 4-7 i - przedstawiono odpowiednio w SEQ ID NO.: 138, 142, 146, i 134. [006] Pary kwasów nukleinowych kodujących domeny zmienne przeciwciała oznaczone przez pary modułów kwasu nukleinowego A/C i E/G są połączone przez dodatkowe łączące moduły kwasu nukleinowego, przy czym moduł kwasu nukleinowego B słuŝy do bezpośredniego połączenia pary modułów A/C, a moduł kwasu nukleinowego F słuŝy do bezpośredniego połączenia pary modułów E/G. Gdy którakolwiek z par modułów A/C lub E/G oznacza kwas nukleinowy kodujący parę deimmunizowanych domen białkowych VH/VL lub VH z przeciwciała o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3, moduł kwasu nukleinowego odpowiednio B lub F ma sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEQ ID NO.: 2. Gdy którakolwiek z par modułów A/C lub E/G oznacza kwas nukleinowy kodujący parę VH/VL lub VL/VH z przeciwciała o specyficzności względem ludzkiego antygenu EpCAM, moduł kwasu nukleinowego odpowiednio B lub F ma sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEQ ID NO.: 1. [0066] Połączenie modułów kwasu nukleinowego A-B-C oraz połączenie modułów kwasu nukleinowego E-F-G kaŝde odpowiednio stanowi jeden fragment scfv przeciwciała o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3 lub antygenu EpCAM. JeŜeli moduły A i C zawierają sekwencje wiąŝące CD3, odpowiednie grupy modułów kwasu nukleinowego A-B-C i E-F-G są połączone ze sobą przez moduł kwasu nukleinowego D o sekwencji nukleotydowej przedstawionej w SEQ ID NO.: 17. JeŜeli moduły A i C zawierają sekwencje wiąŝące EpCAM, odpowiednie grupy modułów kwasu nukleinowego A-B-C i E-F-G są połączone ze sobą przez moduł kwasu nukleinowego D o sekwencji nukleotydowej przedstawionej w SEQ ID NO.: 173. JednakŜe, jak wspomniano powyŝej, dodatkowy kodon kodujący serynę (w SEQ ID NO.: 17) moŝe zostać wstawiony do celów klonowania. Fachowiec w dziedzinie moŝe połączyć sekwencję nukleotydową kodującą łańcuch VL

24 23 bezpośrednio z kolejną domeną V łącznikiem przedstawionym w SEQ ID NO.: 173 bez dodatkowego kodonu kodującego serynę na '-końcu łącznika. Moduł kwasu nukleinowego D słuŝy do połączenia 3'-końca modułu kwasu nukleinowego C z '-końcem modułu kwasu nukleinowego E. Tabela 1A Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-epcam 3-1: sekwencja aminokwasowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw-cd3 (N -> C) A B C D E F G Ustawienie domen CD3 (VL2/VH) xepcam (3-1) CD3 (VHNL2) xepcam (3-1) CD3 (VL2/VH) xepcam (3-1) CD3 (VH/VL2) xepcam (3-1) EPCAM (3-1) xcd3 (VH/VL2) EPCAM (3-1) xcd3 (VH/VL2) EPCAM (3-1) xcd3 (VL2/VH) EPCAM (3-1) xcd3 (VL2/VH) CD3 (VL2/VH7) xepcam (3-1) LHHL HLHL LHLH HLLH LHHL HLHL LHLH HLLH LHHL CD3 (VH7NL2)xEPCAM(3-1) HLHL CD3 (VL2NH7)xEPCAM(3-1) LHLH CD3 (VH7NL2)xEPCAM(3-1) HLLH EPCAM(3-1)xCD3(VH7NL2) LHHL EPCAM(3-1)xCD3(VH7/VL2) HLHL

25 24 Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-epcam 3-1: sekwencja aminokwasowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw-cd3 (N -> C) A B C D E F G Ustawienie domen EPCAM(3-1)xCD3(VL2/VH7) LHLH EPCAM(3-1)xCD3(VL2/VH7) HLLH Tabela 1B Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-epcam 3-1: sekwencja aminokwasowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw-cd3 (N -> C) A B C D E F G Ustawienie domen CD3 (VL2/VH)xEPCAM(3-1) LHHL CD3 (VH/VL2)xEPCAM(3-1) HLHL CD3 (VL2/VH)xEPCAM(3-1) LHLH CD3 (VH/VL2)xEPCAM(3-1) HLLH EPCAM (3-1) xcd3 (VH/VL2) EPCAM (3-1) xcd3 (VH/VL2) EPCAM (3-1) xcd3 (VL2/VH) EPCAM (3-1) xcd3 (VL2/VH) CD3 (VL2/VH7) xepcam (3-1) CD3 (VH7/VL2) xepcam (3-1) CD3 (VL2/VH7) xepcam (3-1) LHHL HLHL LHLH HLLH LHHL HLHL LHLH

26 2 Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-epcam 3-1: sekwencja aminokwasowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw-cd3 (N -> C) A B C D E F G Ustawienie domen CD3 (VH7/VL2) xepcam (3-1) EPCAM (3-1) xcd3 (VH7NL2) EPCAM (3-1) xcd3 (VH7/VL2) EPCAM (3-1) xcd3 (VL2/VH7) EPCAM (3-1) xcd3(vl2/vh7) HLLH LHHL HLHL LHLH HLLH Tabela 2A Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-epcam 3-: sekwencja aminokwasowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw- CD3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CD3 (VL2NH) xepcam (3- ) CD3 (VH/VL2) xepcam (3-) CD3 (VL2/VH) xepcam (3-) CD3 (VH/VL2) xepcam (3-) EPCAM (3-) xcd3 (VHNL2) EPCAM (3-) xcd3 (VH/VL2) LHHL HLHL LHLH HLLH LHHL HLHL

27 26 Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-epcam 3-: sekwencja aminokwasowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw- CD3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G EPCAM (3-) xcd3 (VL2/VH) EPCAM (3-) xcd3 (VL2/VH) CD3 (VL2/VH7) xepcam (3) CD3 (VH7/VL2) xepcam (3-) CD3 (VL2/VH7) xepcam (3-) CD3 (VH7/VL2) xepcam (3-) EPCAM (3-) xcd3 (VH7/VL2) EPCAM (3-) xcd3 (VH7NL2) EPCAM (3-) xcd3 (VL2/VH7) EPCAM (3-) xcd3 (VL2/VH7) LHLH HLLH LHHL HLHL LHLH HLLH LHHL HLHL LHLH HLLH Tabela 2B Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-epcam 3-: sekwencja nukleotydowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw- CD3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CD3 (VL2/VH) xepcam (3-) LHHL

28 27 Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-epcam 3-: sekwencja nukleotydowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw- CD3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CD3 (VHNL2) xepcam (3- ) CD3 (VL2/VH) xepcam (3-) CD3 (VHNL2) xepcam (3- ) EPCAM (3-) xcd3 (VH/VL2) EPCAM (3-) xcd3 (VH/VL2) EPCAM (3-) xcd3 (VL2NH) EPCAM (3-) xcd3 (VL2/VH) CD3 (VL2/VH7) xepcam (3-) CD3 (VH7NL2) xepcam (3- ) CD3 (VL2/VH7) xepcam (3-) CD3 (VH7NL2) xepcam (3- ) EPCAM (3-) xcd3 (VH7NL2) EPCAM (3-) xcd3 (VH7/VL2) EPCAM (3-) xcd3 (VL2NH7) EPCAM (3-) xcd3 (VL2/VH7) HLHL LHLH HLLH LHHL HLHL LHLH HLLH LHHL HLHL LHLH HLLH LHHL HLHL LHLH HLLH

29 28 Tabela 3A Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-epcam 4-1: sekwencja aminokwasowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw- CD3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CD3 (VL2/VH) xepcam (4-1) CD3 (VH/VL2) xepcam (4-1) CD3 (VL2/VH) xepcam (4-1) CD3 (VH/VL2) xepcam (4-1) EPCAM (4-1) xcd3 (VH/VL2) EPCAM (4-1) xcd3 (VH/VL2) EPCAM (4-1) xcd3 (VL2/VH) EPCAM (4-1) xcd3 (VL2/VH) CD3 (VL2/VH7) xepcam (4-1) CD3 (VH7/VL2) xepcam (4-1) CD3 (VL2/VH7) xepcam (4-1) CD3 (VH7/VL2) xepcam (4-1) EPCAM (4-1) xcd3 (VH7/VL2) EPCAM (4-1) xcd3 (VH7/VL2) EPCAM (4-1) xcd3 (VL2/VH7) LHHL HLHL LHLH HLLH LHHL HLHL LHLH HLLH LHHL HLHL LHLH HLLH LHHL HLHL LHLH

30 29 Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-epcam 4-1: sekwencja aminokwasowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw- CD3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G EPCAM (4-1) xcd3 (VL2/VH7) HLLH Tabela 3B Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-epcam 3-1: sekwencja aminokwasowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw- CD3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CD3 (VL2/VH) xepcam (4-1) CD3 (VH/VL2) xepcam (4-1) CD3 (VL2/VH) xepcam (4-1) CD3 (VH/VL2) xepcam (4-1) EPCAM (4-1) xcd3 (VH/VL2) EPCAM (4-1) xcd3 (VH/VL2) EPCAM (4-1) xcd3 (VL2/VH) EPCAM (4-1) xcd3 (VL2/VH) CD3 (VL2/VH7) xepcam (4-1) CD3 (VH7/VL2) xepcam (4-1) LHHL HLHL LHLH HLLH LHHL HLHL LHLH HLLH LHHL HLHL

31 30 Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-epcam 3-1: sekwencja aminokwasowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw- CD3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CD3 (VL2/VH7) xepcam (4-1) CD3 (VH7/VL2) xepcam (4-1) EPCAM (4-1) xcd3 (VH7/VL2) EPCAM (4-1) xcd3 (VH7/VL2) EPCAM (4-1) xcd3 (VL2/VH7) EPCAM (4-1) xcd3 (VL2/VH7) LHLH HLLH LHHL HLHL LHLH HLLH Tabela 4A Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-epcam 3-1: sekwencja aminokwasowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw- CD3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CD3 (VL2/VH) xepcam (4-7) CD3 (VH/VL2) xepcam (4-7) CD3 (VL2/VH) xepcam (4-7) CD3 (VH/VL2) xepcam (4-7) EPCAM (4-7) xcd3 (VH/VNL2) LHHL HLHL LHLH HLLH LHHL

32 31 Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-epcam 3-1: sekwencja aminokwasowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw- CD3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G EPCAM (4-7) xcd3 (VH/VL2) EPCAM (4-7) xcd3 (VL2/VH) EPCAM (4-7) xcd3 (VL2/VH) CD3 (VL2/VH7) xepcam (4-7) CD3 (VH7/VL2) xepcam (4-7) CD3 (VL2/VH7) xepcam (4-7) CD3 (VH7/VL2) xepcam (4-7) EPCAM (4-7) xcd3 (VH7/VL2) EPCAM (4-7) xcd3 (VH7NL2) EPCAM (4-7) xcd3 (VL2/VH7) EPCAM (4-7) xcd3 (VL2/VH7) HLHL LHLH HLLH LHHL HLHL LHLH HLLH LHHL HLHL LHLH HLLH

33 32 Tabela 4B Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-epcam 4-7: sekwencja nukleotydowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw- CD3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CD3 (VL2/VH) xepcam (4-7) CD3 (VH/VL2) xepcam (4-7) CD3 (VL2/VH) xepcam (4-7) CD3 (VH/VL2) xepcam (4-7) EPCAM (4-7) xcd3 (VH/VL2) EPCAM (4-7) xcd3 (VH/VL2) EPCAM (4-7) xcd3 (VL2/VH) EPCAM (4-7) xcd3 (VL2/VH) CD3 (VL2/VH7) xepcam (4-7) CD3 (VH7/VL2) xepcam (4-7) CD3 (VL2/VH7) xepcam (4-7) CD3 (VH7/VL2) xepcam (4-7) EPCAM (4-7) xcd3 (VH7/VL2) EPCAM (4-7) xcd3 (VH7/VL2) EPCAM (4-7) xcd3 (VL2/VH7) LHHL HLHL LHLH HLLH LHHL HLHL LHLH HLLH LHHL HLHL LHLH HLLH LHHL HLHL LHLH

34 33 Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-epcam 4-7: sekwencja nukleotydowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw- CD3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G EPCAM (4-7) xcd3 (VL2/VH7) HLLH Tabela A Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-epcam -: sekwencja aminokwasowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw- CD3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CD3 (VL2/VH) xepcam (-) CD3 (VH/VL2) xepcam (-) CD3 (VL2/VH) xepcam (-) CD3 (VH/VL2) xepcam (-) EPCAM (-) xcd3 (VH/VL2) EPCAM (-) xcd3 (VH/VL2) EPCAM (-) xcd3 (VL2/VH) EPCAM (-) xcd3 (VL2/VH) CD3 (VL2/VH7) xepcam (-) CD3 (VH7/VL2) xepcam (-) LHHL HLHL LHLH HLLH LHHL HLHL LHLH HLLH LHHL HLHL

35 34 Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-epcam -: sekwencja aminokwasowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw- CD3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CD3 (VL2/VH7) xepcam (-) CD3 (VH7/VL2) xepcam (-) EPCAM (-) xcd3 (VH7/VL2) EPCAM (-) xcd3 (VH7/VL2) EPCAM (-) xcd3 (VL2/VH7) EPCAM (-) xcd3 (VL2/VH7) LHLH HLLH LHHL HLHL LHLH HLLH Tabela B Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-epcam -: sekwencja nukleotydowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw- CD3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CD3 (VL2/VH) xepcam (-) CD3 (VH/VL2) xepcam (-) CD3 (VL2/VH) xepcam (-) CD3 (VHNL2) xepcam (- ) EPCAM (-) xcd3 (VH/VL2) LHHL HLHL LHLH HLLH LHHL

36 3 Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-epcam -: sekwencja nukleotydowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw- CD3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G EPCAM (-) xcd3 (VH/VL2) EPCAM (-) xcd3 (VL2/VH) EPCAM (-) xcd3 (VL2/VH) CD3 (VL2/VH7) xepcam (-) CD3 (VH7NL2) xepcam (- ) CD3 (VL2/VH7) xepcam (-) CD3 (VH7/VL2) xepcam (-) EPCAM (-) xcd3 (VH7/VL2) EPCAM (-) xcd3 (VH7/VL2) EPCAM (-) xcd3 (VL2/VH7) EPCAM (-)xcd3 (VL2/VH7) HLHL LHLH HLLH LHHL HLHL LHLH HLLH LHHL HLHL LHLH HLLH [0067] Najkorzystniej wynalazek dostarcza bispecyficzne konstrukty przeciwciał wykazujące specyficzność wiązania z CD3 i EpCAM oraz zawierające SEQ ID NO.: 30, 31 (konstrukt 2 z Tabeli 1A i 1B), SEQ ID NO.: 48, 49 (konstrukt z Tabeli 1A, 1B), SEQ ID NO.: 64, 6 (konstrukt 2 z Tabeli 2A, 2B), SEQ ID NO.: 4, (konstrukt z Tabeli 2A, 2B), SEQ ID NO.: 66, 67 (konstrukt 2 z Tabeli 3A, 3B), SEQ ID NO.: 32, 33 (konstrukt 2 z Tabeli 4A, 4B), SEQ ID NO.: 34, 3 (konstrukt 4 z Tabeli 4A, 4B), SEQ ID NO.: 60, 61 (konstrukt z Tabeli 4A, 4B), SEQ ID NO.: 36, 37 (konstrukt 2 z Tabeli A, B), SEQ ID NO.: 38, 39 (konstrukt 4 z Tabeli A, B) lub SEQ ID NO.: 62, 63 (konstrukt z Tabeli

37 A, B). [0068] Zgodnie z dostarczonymi tutaj powyŝej konstruktami, szczególnie korzystne konstrukty wiąŝące CD3 i EpCAM według wynalazku, zawierające co najmniej opisaną powyŝej pierwszą domenę o obniŝonej zdolności wytwarzania epitopu dla komórek T oraz o specyficzności względem ludzkiego CD3 i drugą domenę pochodzącą z Ig, która jest specyficzna względem EpCAM przedstawiono w SEQ ID NO.: 31, 33, 3, 37, 39, 49,, 8, 61, 63, 6, 67, 237, 239, 241, 243, 24, 247, 249, 21, 23, 2, 27, 29, 261, 263, 26, 267, 269, 271, 273, 27, 277, 279, 281, 283, 28, 287, 289, 291, 293, 29, 297, 299, 301, 303, 30, 307, 309, 311, 313, 31, 317, 319, 321, 323 i 32. Odpowiadające im cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące te korzystne konstrukty wiąŝące CD3 i EpCAM tutaj zdefiniowane obejmują SEQ ID NO.: 30, 32, 34, 36, 38, 48, 4, 7, 60, 62, 64, 66, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248,, 22, 24, 26, 28, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 3, 312, 314, 316, 318, 3, 322 i 324. [0069] Zgodnie z tym niniejszy wynalazek dostarcza takŝe konstrukty specyficznie wiąŝące CD3 zawierające pierwszą domenę, która specyficznie wiąŝe ludzki CD3 oraz wykazuje obniŝoną zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T i zawierające drugą domenę pochodzącą z Ig skierowaną przeciw/zdolną do wiązania EpCAM, wybrane z grupy obejmującej (a) sekwencję aminokwasową przedstawioną w którejkolwiek z SEQ ID NO.: 31, 33, 3, 37, 39, 49,, 8, 61, 63, 6, 67, 237, 239, 241, 243, 24, 247, 249, 21, 23, 2, 27, 29, 261, 263, 26, 267, 269, 271, 273, 27, 277, 279, 281, 283, 28, 287, 289, 291, 293, 29, 297, 299, 301, 303, 30, 307, 309, 311, 313, 31, 317, 319, 321, 323 lub 32; (b) sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną w którejkolwiek z SEQ ID NO.: 30, 32, 34, 36, 38, 48, 4, 7, 60, 62, 64, 66; 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248,, 22, 24, 26, 28, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 3, 312, 314, 316, 318, 3, 322 lub 324; (c) sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego, która jest zdegenerowana pod względem kodu genetycznego do sekwencji nukleotydowej (b); (d) sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą z nicią komplementarną sekwencji kwasu nukleinowego zdefiniowanej w (b) w ostrych warunkach hybrydyzacji. [0070] Niniejszy wynalazek dostarcza takŝe konstrukty specyficznie wiąŝące CD3 zawie-

38 rające pierwszą domenę, która specyficznie wiąŝe ludzki CD3 oraz wykazuje obniŝoną zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T i zawierające drugą domenę pochodzącą z Ig skierowaną przeciw/zdolną do wiązania EpCAM, które zawierają sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą z nicią komplementarną sekwencji kwasu nukleinowego zdefiniowanej w (b) powyŝej, tj. do sekwencji kwasu nukleinowego przedstawionej w którejkolwiek z SEQ ID NO.: 30, 32, 34, 36, 38, 48, 4, 7, 60, 62, 64, 66, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248,, 22, 24, 26, 28, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 3, 312, 314, 316, 318, 3, 322 lub 324 w ostrych warunkach hybrydyzacji. [0071] Stosowane tutaj określenie hybrydyzująca odnosi się do polinukleotydów/sekwencji kwasu nukleinowego, które są zdolne do hybrydyzacji z polinukleotydami kodującymi zdefiniowane tutaj deimmunizowane konstrukty. Zatem te polinukleotydy mogą być przydatne jako sondy w analizie Northern lub Southern Blot preparatów odpowiednio RNA lub DNA lub mogą być stosowane jako startery oligonukleotydowe w analizie PCR zaleŝnie od ich odpowiedniej wielkości. Korzystnie, te hybrydyzujące polinukleotydy mają długość co najmniej, korzystniej co najmniej 1 nukleotydów, podczas gdy hybrydyzujący polinukleotyd według niniejszego wynalazku do stosowania jako sonda ma korzystnie długość co najmniej 0, korzystniej co najmniej 0 lub najkorzystniej co najmniej 00 nukleotydów. [0072] W dziedzinie dobrze znane jest przeprowadzanie doświadczeń hybrydyzacji z cząsteczkami kwasu nukleinowego, tj. fachowiec w dziedzinie wie jakie warunki hybrydyzacji ma zastosować zgodnie z niniejszym wynalazkiem. Takie warunki hybrydyzacji opisano w standardowych podręcznikach, takich jak Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (01) N.Y. Korzystne, zgodnie z niniejszym wynalazkiem są polinukleotydy, które są zdolne do hybrydyzacji z polinukleotydami według wynalazku, lub ich częściami, w ostrych warunkach hybrydyzacji. [0073] Ostre warunki hybrydyzacji dotyczą mianowicie całonocnej inkubacji w 42 C w roztworze zawierającym 0% formamid, x SSC (70 mm NaCl, 7 mm cytrynian sodu), 0 mm fosforan sodu (ph 7,6), x roztwór Denhardta, % siarczan dekstranu oraz µg/ml denaturowanego, pofragmentowanego DNA nasienia łososia, a następnie płukania filtrów w 0,1 x SSC w około 6 C. RozwaŜa się takŝe cząsteczki kwasu nukleinowego hybrydyzujące z polinukleotydami według wynalazku w warunkach hybrydyzacji o mniejszej ostrości. Zmiany w ostrości hybrydyzacji i wykrycie sygnału głównie osiąga się przez manipulację stęŝeniem formamidu (niŝsze udziały procentowe formamidu powodują obni-

39 Ŝenie ostrości); warunkami stęŝenia soli lub temperaturą. Przykładowo warunki o mniejszej ostrości obejmują inkubację przez noc w 37 C w roztworze zawierającym 6X SSPE (X SSPE = 3M NaCl; 0,2M NaH 2 PO 4 ; 0,02M EDTA, ph 7,4), 0,% SDS, 30% formamid, 0 µg/ml blokujący DNA nasienia łososia; a następnie płukania w 0 C z 1 X SSPE, 0,1% SDS. Ponadto, aby uzyskać nawet jeszcze niŝszą ostrość, płukania przeprowadzane po ostrej hybrydyzacji moŝna przeprowadzić w wyŝszych stęŝeniach soli (np. X SSC). NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe zmiany w powyŝszych warunkach moŝna przeprowadzić przez włączenie i/lub podstawienie zamiennych odczynników blokujących stosowanych w celu zahamowania tła w doświadczeniach z hybrydyzacją. Typowe odczynniki blokujące obejmują odczynnik Denhardta, BLOTTO, heparynę, denaturowany DNA nasienia łososia oraz dostępne w handlu zastrzeŝone preparaty. Włączenie specyficznych odczynników blokujących moŝe wymagać modyfikacji opisanych powyŝej warunków hybrydyzacji, ze względu na problemy z ich zgodnością. [0074] Wymienionymi cząsteczkami kwasu nukleinowego mogą być, np. DNA, cdna, RNA lub syntetycznie wytworzony DNA lub RNA lub rekombinacyjnie wytworzona chimeryczna cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca którykolwiek z tych polinukleotydów samodzielnie lub w połączeniu. [007] Deimmunizowane konstrukty wiąŝące CD3 i EpCAM dostarczone w tym wynalazku są szczególnie przydatne w zastosowaniach medycznych, przykładowo do profilaktyki, leczenia i/lub poprawy chorób nowotworowych, w szczególności raka sutka, raka okręŝnicy, raka stercza, raka głowy i szyi, raka skóry (czerniaka), raków układu moczowopłciowego, np. raka jajnika, raka trzonu macicy, raka szyjki macicy oraz raka nerki, raka płuca, raka Ŝołądka, raka jelita cienkiego, raka wątroby, raka trzustki, raka pęcherzyka Ŝółciowego, raków przewodów Ŝółciowych, raka przełyku, raka gruczołów ślinowych oraz raka gruczołu tarczowego W szczególności deimmunizowane konstrukty wiąŝące CD3 i EpCAM moŝna stosować do leczenia raka nabłonkowego, korzystnie raków gruczołowych lub minimalnej choroby resztkowej, korzystniej wczesnych guzów litych, zaawansowanych guzów litych lub przerzutowych guzów litych. [0076] Opisano tutaj konstrukt specyficznie wiąŝący CD3, który zawiera drugą domenę pochodzącą z Ig, która zawiera miejsce oddziaływania z antygenem o specyficzności względem CCR. [0077] Receptor chemokin CCR jest członkiem duŝej rodziny receptorów sprzęŝonych z białkami G z siedmiona domenami transbłonowymi, który wiąŝe chemokiny prozapalne RANTES, MIP1-α, MIP1-β i MCP-2. Chemokiny działają łącznie z cząsteczkami adhezyjnymi wywołując wynaczynienie leukocytów i kierujac ich migrację w miejsca uszkodzenia

40 tkanki. CCR jest eksprymowany na mniejszej części komórek T i monocytów, a ponadto jest głównym koreceptorem dla M-tropowych szczepów HIV-1, które dominują wcześnie w przebiegu zakaŝenia HIV. [0078] Ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) nie moŝe wejść do ludzkich komórek, chyba, Ŝe najpierw zwiąŝe się z dwiema kluczowymi cząsteczkami na powierzchni komórki, CD4 i koreceptorem. Koreceptorem, który jest początkowo rozpoznawany jest CCR, później w cyklu Ŝyciowym wirusa inny receptor chemokin CXCR4 staje się koreceptorem dla HIV-1 (D'Souza, Nature Med. 2, 1293 (1996); Premack, Nature Med. 2, 1174; Fauci, Nature 384, 29 (1996)). Szczepy HIV-1, które wywołują największą liczbę przypadków przenoszenia wirusów na drodze kontaktów płciowych, są nazywane wirusami M-tropowymi. Te szczepy HIV-1 (takŝe znane jako wirusy pierwotne nie tworzące zespólni (NSI)) mogą replikować w pierwotnych komórkach T CD4+ i makrofagach oraz wykorzystują receptor chemokin CCR (a rzadziej CCR3) jako swój koreceptor. Wirusy T-tropowe (czasami nazywane wirusami pierwotnymi tworzącymi zespólnię (SI)) mogą takŝe replikować się w pierwotnych komórkach T CD4+, ale mogą dodatkowo zakaŝać ustalone linie komórek T CD4+ in vitro, które zakaŝają przez receptor chemokin CXCR4 (fuzyna). Wiele z tych typów szczepów wirusów T-tropowych moŝe stosować CCR dodatkowo oprócz CXCR4 oraz niektóre mogą wchodzić do makrofagów przez CCR, co najmniej w pewnych warunkach in vitro (D'Souza, Nature Med. 2, 1293 (1996); Premack, Nature Med. 2, 1174; Fauci, Nature 384, 29 (1996)). [0079] Fakt czy inne koreceptory przyczyniają się do patogenezy HIV-1 jest nierozwiązany, ale istnienie innego koreceptora dla niektórych szczepów T-tropowych moŝna wywnioskować z badań in vitro. PoniewaŜ M-tropowe szczepy HIV-1 uczestniczą w około 90% przypadków przenoszenia HIV na drodze płciowej, CCR jest dominującym koreceptorem dla wirusa u pacjentów; przenoszenie (lub ustalenie ogólnoustrojowe) szczepów stosujących CXCR4 (T-tropowych) jest rzadkie (D'Souza, Nature Med. 2, 1293 (1996); Premack, Nature Med. 2, 1174; Fauci, Nature 384, 29 (1996), Paxton, Nature Med. 2, 412 (1996); Liu, Cell 86, 367 (1996); Samson, Nature 382, 722 (1996); Dean, Science 273, 186 (1996); Huang, Nature Med. 2, 1240 (1996)). JednakŜe poniewaŝ wirusy SI ewoluują in vivo (lub gdy są przenoszone) są one szczególnie wirulentne i powodują szybszy postęp choroby (D'Souza, Nature Med. 2, 1293 (1996); Premack, Nature Med. 2, 1174; Fauci, Nature 384, 29 (1996), Schuitemaker, J. Virol. 66, 134 (1992); Connor, J. Virol. 67, 1772 (1993); Richman, J. Infect. Dis. 169, 968 (1994); R. I. Connor i in., J. Exp. Med. 18, 621 (1997); Trkola, Nature 384, 184 (1996)). [0080] Liczba i toŝsamość cząsteczek koreceptora na komórkach docelowych oraz zdol-

41 ność szczepów HIV-1 do prawdopodobnego wchodzenia do komórek przez róŝne koreceptory, wydają się być krytycznymi czynnikami warunkującymi postęp choroby. Są to główne czynniki wpływające na zarówno zaleŝne od gospodarza, jak i zaleŝne od wirusa aspekty zakaŝenia HIV-1. Przykładowo, homozygootyczny defekt (delta 32) w CCR silnie koreluje z opornością na zakaŝenie HIV-1 in vivo i in vitro. Osobnicy, którzy są heterozygotami względem allelu z defektem CCR są w najlepszym przypadku słabo chronieni przed zakaŝeniem oraz mają tylko nieco spowolniony postęp choroby (Paxton, Nature Med. 2, 412 (1996); Liu, Cell 86, 367 (1996); Samson, Nature 382, 722 (1996); Dean, Science 273, 186 (1996); Huang i in., Nature Med. 2, 1240 (1996)). JednakŜe inne czynniki mogą wpływać na poziom ekspresji CCR na aktywowanych komórkach T CD4+ oraz w ten sposób wpływać na skuteczność zakaŝenia wirusem HIV-1 in vitro (Trkola, Nature 384, 184 (1996); Bleul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 192 (1997)). [0081] W przypadku stwardnienia rozsianego wykazano, Ŝe CCR i CXCR3 są eksprymowane głównie na komórkach T naciekających demielinujące uszkodzenia w mózgu, a takŝe w krwi obwodowej pacjentów dotkniętych tą chorobą. Eliminacja komórek T zablokuje ramię komórek T w tej chorobie autoimmunizacyjnej. [0082] Wysoką ekspresję CCR3 i CCR obserwowano takŝe w komórkach T i komórkach B węzłów chłonnych pochodzących od pacjentów z ziarnicą złośliwą. [0083] Cukrzycę typu I uwaŝa się za chorobę autoimmunizacyjną w której pośredniczą komórki T. Ekspresja receptora CCR w trzustce była związana z postępem cukrzycy typu I w odpowiednich modelach zwierzęcych (Cameron (00) J. Immunol. 16, 12-11). W szczególności ekspresja CCR była związana z rozwojem cukrzycy insulinozaleŝnej (ang. insulinitis) oraz spontanicznej cukrzycy typu I. [0084] Kilka przeciwciał specyficznie wiąŝących (ludzki) CCR jest znanych w dziedzinie i obejmują one MC-1 (Mack (1998) J. Exp. Med. 187, lub MC- (Blanpain (02) Mol Biol Cell. 13:723-37, Segerer (1999) Kidney Int. 6:2-64, Kraft (01) J Biol Chem : ). Przeciwciała CCR-, w szczególności MC-1 i MC- mogą słu- Ŝyć jako źródło dla drugiej domeny pochodzącej z Ig opisanego tutaj konstruktu specyficznego względem CD3. Zgodnie z tym opisano tutaj bispecyficzny konstrukt, który zawiera co najmniej dwie domeny, przy czym pierwsza domena dostarcza specyficzność względem ludzkiego CD3 oraz wykazuje obniŝoną zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T oraz przy czym ta druga domena pochodząca z Ig pochodzi z przeciwciała specyficznego względem (ludzkiego) CCR. Najkorzystniej, taki konstrukt stanowi zdefiniowany tutaj pojedynczy łańcuch scfv. [008] Wykazano, Ŝe MC-1 wiąŝe specyficznie pierwszą część drugiej pętli zewnątrzko-

42 mórkowej ludzkiego CCR oraz nie reaguje krzyŝowo z CCR pochodzącym z makaków rezusów, jak wykazano w dołączonych przykładach. Zatem korzystne jest, aby opisany tutaj konstrukt specyficzny względem CD3 zawierał, przykładowo, domeny VL i VH przeciwciała (tj. drugiej domeny pochodzącej z Ig) specyficznego względem CCR, korzystnie ludzkiego CCR oraz domeny VH i VL przeciwciała specyficznego względem antygenu CD3. To przeciwciało specyficzne względem ludzkiego CCR jest mysim przeciwciałem MC-1 przeciw-ludzkiemu CCR, opisanym między innymi w Mack (1998), J. Exp. Med. 187, oraz w dołączonych przykładach. Ponadto zakłada się, Ŝe inne przeciwciała przeciw-ccr, takie jak MC- (jak scharakteryzowano w dołączonych przykładach i ujawniono w Blanpain (02) Mol Biol Cell. 13:723-37, Segerer (1999) Kidney Int. 6:2-64 i Kraft (01) J Biol Chem. 14;276: ), moŝna stosować w tym kontekście. [0086] Opisano tutaj konstrukty specyficznie wiąŝące CD3, które zawierają deimmunizowaną domenę skierowana przeciw/wiąŝącą/oddziałującą z ludzkim CD3 i drugą domenę pochodzącą z Ig, która specyficznie wiąŝe/oddziałuje z CCR. Takie konstrukty przedstawiono w Tabeli 6A i 6B. Moduły A-G w Tabelach 6A i 6B moŝna zdefiniować jak wspomniano powyŝej dla Tabel 1-. Deimmunizowane domeny VH przeciwciał o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3 mogą zostać wybrane spośród sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO.: 74 lub 76. Deimmunizowane domeny VL przeciwciał o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3 moŝna wybrać spośród sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO.: 78, 80 lub 82. Domenę białkową VH ludzkiego przeciwciała przeciw CCR przedstawiono w SEQ ID NO.: 129. Domenę białkową VL ludzkiego przeciwciała przeciw CCR przedstawiono w SEQ ID NO.: 131. Gdy którakolwiek z par modułów A/C lub E/G jest parą deimmunizowanych domen białkowych VH/VL lub VL/VH z przeciwciała o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3, moduł białkowy odpowiednio B lub F ma sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO.: 3. Gdy którakolwiek z par modułów A/C lub E/G jest parą VH/VL lub VL/VH z przeciwciała o specyficzności względem antygenu EpCAM moduł białkowy odpowiednio B lub F ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO.: 168. Odpowiednie grupy modułów białkowych A-B-C i E-F-G są połączone ze sobą przez moduł białkowy D o sekwencji przedstawionej w SEQ ID NO.: 174. JednakŜe, jak wspomniano powyŝej, dodatkowa seryna moŝe zostać wprowadzona do celów klonowania (łącznik przedstawiony w SEQ ID NO.: 176) pomiędzy VL a kolejną domenę V. [0087] Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące deimmunizowane domeny VH przeciwciał o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3 moŝna wybrać spośród sekwen-

43 42 1 cji przedstawionych w SEQ ID NO.: 73 lub 7. Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące deimmunizowane domeny VL przeciwciał o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3 moŝna wybrać spośród sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO.: 77, 79 lub 81. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca domenę białkową VH przeciwciał przeciw ludzkiemu CCR jest taka jak przedstawiono w SEQ ID NO.: 128. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca domenę białkową VL przeciwciał przeciw ludzkiemu CCR jest taka jak przedstawiono w SEQ ID NO.: 130. Gdy którakolwiek z par modułów A/C lub E/G oznacza kwas nukleinowy kodujący parę deimmunizowanych domen białkowych VH/VL lub VL/VH z przeciwciała o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3, moduł kwasu nukleinowego odpowiednio B lub F ma sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną w SEQ ID NO.: 2. Gdy którakolwiek z par modułów A/C lub E/G oznacza kwas nukleinowy kodujący parę VH/VL lub VL/VH z przeciwciała o specyficzności względem antygenu CCR, moduł kwasu nukleinowego odpowiednio B lub F ma sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną w SEQ ID NO.: 1. Grupy modułów kwasów nukleinowych A-B-C i E-F-G są połączone ze sobą przez moduł białkowy D o sekwencji przedstawionej w SEQ ID NO.: 173. Do łączenia domeny VL z kolejną domeną V, moŝna takŝe stosować alternatywny łącznik SEQ ID NO.: 17 (zawierający dodatkowy kodon kodujący resztę seryny dla celów klonowania). Tabela 6A Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-ccr: sekwencja aminokwasowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw-cd3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CD3 (VL2/VH) xccr LHHL CD3 (VH/VL2) xccr HLHL CD3 (VL2/VH) xccr LHLH CD3 (VH/VL2) xccr HLLH CCR xcd3 (VH/VL2) LHHL CCR xcd3(vh/vl2) HLHL CCR xcd3 (VL2/VH) LHLH CCR xcd3(vl2/vh) HLLH

44 43 Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw-cd3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CD3 (VL2/VH7) xccr LHHL CD3 (VH7/VL2) xccr HLHL CD3 (VL2/VH7) xccr LHLH CD3 (VH7/VL2) xccr HLLH CCR xcd3 (VH7/VL2) LHHL CCR xcd3(vh7/vl2) HLHL CCR xcd3 (VL2/VH7) LHLH CCR xcd3(vl2/vh7) HLLH Tabela 6B Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-ccr: sekwencja kwasu nukleinowego Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw-cd3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CD3 (VL2/VH) xccr LHHL CD3 (VHNL2) xccr HLHL CD3 (VL2/VH) xccr LHLH CD3 (VHNL2) xccr HLLH CCR xcd3 (VHNL2) LHHL CCR xcd3(vh/vl2) HLHL CCR xcd3 (VL2/VH) LHLH CCR xcd3(vl2/vh) HLLH CD3 (VL2/VH7) xccr LHHL CD3 (VH7NL2) xccr HLHL CD3 (VL2/VH7) xccr LHLH CD3 (VH7/VL2) xccr HLLH

45 44 Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw-cd3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CCR xcd3 (VH7NL2) LHHL CCR xcd3(vh7/vl2) HLHL CCR xcd3 (VL2/VH7) LHLH CCR xcd3 (VL2/VH7) HLLH 1 2 [0088] Korzystnie te konstrukty zawierają sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej (a) sekwencję aminokwasową przedstawioną w którejkolwiek z SEQ ID NO.: 6, 8, 2, 212, 214 lub 216; (b) sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną w którejkolwiek z SEQ ID NO.:, 7, 9, 211, 213 lub 21; oraz (c) sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego, która jest zdegenerowana pod względem kodu genetycznego do sekwencji nukleotydowej (b); (d) i sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą z nicią komplementarną sekwencji kwasu nukleinowego zdefiniowanej w (b) w ostrych warunkach hybrydyzacji. [0089] Konstrukty wiąŝące CCR i CD3 SEQ ID NO.: 6, 8, 2 reprezentujące konstrukt oraz SEQ ID NO.: 212, 214 i 216 reprezentujące konstrukt 13 z Tabeli 6 zawierają trzy róŝne regiony VL (VL1 (SEQ ID NO.: 78), VL2 (SEQ ID NO.: 80) lub VL3 (SEQ ID NO.: 82). [0090] Opisano tutaj konstrukty specyficznie wiąŝące CD3 zawierające pierwszą domenę, która specyficznie wiąŝe ludzki CD3 oraz wykazuje obniŝoną zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T i zawierające drugą domenę pochodzącą z Ig skierowaną przeciw/zdolną do wiązania CCR, które zawierają sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą z nicią komplementarną sekwencji kwasu nukleinowego zdefiniowanej tutaj powyŝej w (b), tj. do sekwencj kwasu nukleinowego przedstawionej w którejkolwiek z SEQ ID NO.:, 7, 9, 211, 213 lub 21 w ostrych warunkach hybrydyzacji. Określenia hybrydyzacja oraz ostre warunki opisano tutaj powyŝej. Odpowiednie definicje i postaci mają tutaj zastosowanie po wprowadzeniu koniecznych zmian.

46 [0091] Opisane tutaj deimmunizowane konstrukty wiąŝące CD3 i CCR są szczególnie przydatne w interwencjach medycznych w chorobach wirusowych, w szczególności zaka- Ŝeniach HIV oraz AIDS lub w chorobach autoimmunizacyjnych i/lub chorobach zapalnych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów. [0092] Opisano tutaj takŝe konstrukty specyficznie wiąŝące CD3 jak zdefiniowano tutaj powyŝej, w których druga domena pochodząca z Ig wynalazczego konstruktu zawiera miejsce oddziaływania z antygenem o specyficzności względem CD19. [0093] Udowodniono, Ŝe CD19 jest bardzo przydatnym celem medycznym. CD19 jest eksprymowany w całej linii komórek B od komórek pro B do dojrzałych komórek B, nie jest on zrzucany, jest on jednorodnie eksprymowany na wszystkich komórkach chłoniaka i jest on nieobecny w komórkach macierzystych (Haagen, Clin Exp Immunol 90 (1992), 368-7; Uckun, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 (1988), ). Terapię skojarzoną, w której stosuje się zarówno przeciwciało skierowane przeciw CD19, jak i dodatkowe przeciwciało immunoregulatorowe, ujawniono do leczenia nowotworów złośliwych z komórek B (WO 02/04021, US006404, US028178) oraz chorób autoimmunizacyjnych (WO 02/22212, US08029). WO 00/6779 ujawnia zastosowanie m.in. przeciwciał skierowanych przeciw CD19 do leczenia postaci o powolnym przebiegu i agresywnych chłoniaków z komórek B, a takŝe ostrych i przewlekłych postaci białaczek limfatycznych. WO 02/80987 ujawnia terapeutyczne zastosowanie immunotoksyn opartych na przeciwciałach przeciw antygenowi CD19 do leczenia takich chorób, jak chłoniak nieziarniczy z komórek B, chłoniak ziarniczy i białaczki z komórek B (np. ostra białaczka limfatyczna z komórek B (B-ALL), (np. białaczki kosmatokomórkowej), ostrej białaczki limfatycznej z komórek prekursorowych B (pre-b-all), przewlekłej białaczki limfatycznej z komórek B (B-CLL)). [0094] Opisane tutaj są takŝe konstrukty specyficznie wiąŝące CD3, które zwierają deimmunizowaną domenę skierowaną przeciw/wiąŝącą/oddziałującą z CD3 i drugą domenę pochodzącą z Ig, która specyficznie wiąŝe/oddziałuje z CD19. Takie konstrukty przedstawiono w Tabelach 7A i 7B. Moduły A-G w Tabelach 7A i 7B moŝna zdefiniować tak jak wspomniano powyŝej w Tabelach 1-. Deimmunizowane domeny VH przeciwciał o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3 moŝna wybrać spośród sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO.: 74 lub 76. Deimmunizowane domeny VL przeciwciał o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3 moŝna wybrać spośród sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO.: 78, 80 lub 82. Domenę białkową VH ludzkiego przeciwciała przeciw CD19 przedstawiono w SEQ ID NO.: 114. Domenę białkową VL ludzkiego przeciwciała przeciw CCR przedstawiono w SEQ ID NO.: 116. Gdy którakolwiek z par mo-

47 dułów A/C lub E/G jest parą deimmunizowanych domen białkowych VH/VL lub VL/VH z przeciwciała o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3, moduł białkowy odpowiednio B lub F ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO.: 3. Gdy którakolwiek z par modułów A/C lub E/G jest parą VH/VL lub VL/VH z przeciwciała o specyficzności względem antygenu CD19 moduł białkowy odpowiednio B lub F ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO.: 168. Odpowiednie grupy modułów białkowych A-B-C i E-F-G są połączone ze sobą przez moduł białkowy D o sekwencji przedstawionej w SEQ ID NO.: 174. JednakŜe, jak wspomniano powyŝej, dodatkowa seryna moŝe zostać wprowadzona do celów klonowania (łącznik przedstawiony w SEQ ID NO.: 176) pomiędzy VL a kolejną domenę V. [009] Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące deimmunizowane domeny VH przeciwciał o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3 moŝna wybrać spośród sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO.: 73 lub 7. Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące deimmunizowane domeny VL przeciwciał o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3 moŝna wybrać spośród sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO.: 77, 79 lub 81. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca domenę białkową VH przeciwciała przeciw ludzkiemu CD19 jest taka jak przedstawiono w SEQ ID NO.: 113. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca domenę białkową VL przeciwciała przeciw ludzkiemu CCR jest taka jak przedstawiono w SEQ ID NO.: 11. Gdy którakolwiek z par modułów A/C lub E/G oznacza kwas nukleinowy kodujący parę deimmunizowanych domen białkowych VH/VL lub VL/VH z przeciwciała o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3, moduł kwasu nukleinowego odpowiednio B lub F ma sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną w SEQ ID NO.: 2. Gdy którakolwiek z par modułów A/C lub E/G oznacza kwas nukleinowy kodujący parę VH/VL lub VL/VH z przeciwciała o specyficzności względem antygenu CD19, moduł kwasu nukleinowego odpowiednio B lub F ma sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną w SEQ ID NO.: 1. Grupy modułów kwasów nukleinowych A-B-C i E-F-G są połączone ze sobą przez moduł białkowy D o sekwencji przedstawionej w SEQ ID NO.: 173. Do łączenia domeny VL z kolejną domeną V moŝna takŝe stosować alternatywny łącznik SEQ ID NO.: 17 (zawierający dodatkowy kodon kodujący resztę seryny dla celów klonowania).

48 47 Tabela 7A Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-cd19: sekwencja aminokwasowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw-cd3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CD3 (VL2/VH) xcd19 LHHL CD3 (VH/VL2) xcd19 HLHL CD3 (VL2/VH) xcd19 LHLH CD3 (VH/VL2) xcd19 HLLH CD19 xcd3 (VH/VL2) LHHL CD19 xcd3 (VH/VL2) HLHL CD19 xcd3 (VL2/VH) LHLH CD19 xcd3 (VL2/VH) HLLH CD3 (VL2/VH7) xcd19 LHHL CD3 (VH7/VL2) xcd19 HLHL CD3 (VL2/VH7) xcd19 LHLH CD3 (VH7NL2) xcd19 HLLH CD19 xcd3 (VH7/VL2) LHHL CD19 xcd3 (VH7/VL2) HLHL CD19 xcd3 (VL2/VH7) LHLH CD19 xcd3 (VL2/VH7) HLLH Tabela 7B Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-cd19: sekwencja kwasu nukleinowego Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw-cd3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CD3 (VL2/VH) xcd19 LHHL CD3 (VH/VL2) xcd19 HLHL

49 48 Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw-cd3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CD3 (VL2VH) xcd19 LHLH CD3 (VHNL2) xcd19 HLLH CD19 xcd3 (VHNL2) LHHL CD19 xcd3 (VH/VL2) HLHL CD19 xcd3 (VL2/VH) LHLH CD19 xcd3 (VL2/VH) HLLH CD3 (VL2/VH7) xcd19 LHHL CD3 (VH7/VL2) xcd19 HLHL CD3 (VL2/VH7) xcd19 LHLH CD3 (VH7NL2) xcd19 HLLH CD19 xcd3 (VH7/VL2) LHHL CD19 xcd3 (VH7/VL2) HLHL CD19 xcd3 (VL2/VH7) LHLH CD19 xcd3 (VL2/VH7) HLLH [0096] Opisano tutaj deimmunizowany konstrukt specyficznie wiąŝący CD3, który zawiera domenę wiąŝącą CD3, jak zdefiniowano powyŝej i drugą domenę pochodzącą z Ig, która specyficznie wiąŝe/oddziałuje z CD19, korzystnie z ludzkim CD19, który to konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej (a) sekwencję aminokwasową przedstawioną w którejkolwiek z SEQ ID NO.: 190, 192, 194, 196, 198, 0, 327, 329, 331, 333, 33, 337, 339, 341, 343, 34, 347, 349, 31, 33, 37, 39, 361, 363, 36, 367, 369, 371, 373, 37, 377; 379, 381, 383, 38, 387, 389, 391, 393, 39, 397, 399, 401, 403, 40, 407 lub 409; (b) sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną w którejkolwiek z SEQ ID NO.: 189, 191, 193, 19, 197, 199, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 30, 32, 34, 36, 38, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406 lub 408; oraz

50 (c) sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego, która jest zdegenerowana pod względem kodu genetycznego do sekwencji nukleotydowej (b); (d) i sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą z nicią komplementarną sekwencji kwasu nukleinowego zdefiniowanej w (b) w ostrych warunkach hybrydyzacji. [0097] Korzystnymi konstruktami wiąŝącymi CD19 i CD3 są SEQ ID NO.: 190, 192, 194 reprezentujące konstrukt oraz SEQ ID NO.: 196, 198 i 0 reprezentujące konstrukt 13 z Tabeli 7 i zawierające trzy róŝne regiony VL (VL1 (SEQ ID NO.: 78), VL2 (SEQ ID NO.: 80) lub VL3 (SEQ ID NO.: 82)). [0098] Opisano tutaj takŝe konstrukty specyficznie wiąŝące CD3 zawierające pierwszą domenę, która specyficznie wiąŝe ludzki CD3 oraz wykazuje obniŝoną zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T i zawierające drugą domenę pochodzącą z Ig skierowaną przeciw/zdolną do wiązania CD19, które zawierają sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą z nicią komplementarną sekwencji kwasu nukleinowego zdefiniowanej tutaj powyŝej w (b), tj. do sekwencji kwasu nukleinowego przedstawionej w którejkolwiek z SEQ ID NO.: 189, 191, 193, 19, 197, 199, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 30, 32, 34, 36, 38, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406 lub 408 w ostrych warunkach hybrydyzacji. Określenia hybrydyzacja oraz ostre warunki opisano tutaj powyŝej. Odpowiednie definicje i postaci mają tutaj zastosowanie po wprowadzeniu koniecznych zmian. [0099] Ujawnione tutaj deimmunizowane konstrukty wiąŝące CD3 i CD19 są szczególnie przydatne do profilaktyki, leczenia lub poprawy choroby proliferacyjnej, choroby nowotworowej, choroby zapalnej, zaburzenia immunologicznego, choroby autoimmunizacyjnej, choroby zakaźnej, choroby wirusowej, reakcji alergicznych, reakcji na pasoŝyty, chorób przeszczep przeciw gospodarzowi, chorób gospodarz przeciw przeszczepowi oraz nowotworów złośliwych z komórek B, w szczególności chłoniaka nieziarniczego z komórek B, chłoniaka ziarniczego i białaczek z komórek B (np. ostrej białaczki limfatycznej z komórek B (B-ALL), (np. białaczki kosmatokomórkowej), ostrej białaczki limfatycznej z komórek prekursorowych B (pre-b-all), przewlekłej białaczki limfatycznej z komórek B (B- CLL)). [00] Opisano tutaj konstrukt specyficznie wiąŝący CD3, jak zdefiniowano powyŝej, zawierający pierwszą domenę, która specyficznie wiąŝe ludzki CD3 oraz wykazuje obniŝoną zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T i drugą domenę, przy czym ta druga domena pochodzi z Ig i zawiera miejsce oddziaływania z antygenem o specyficzności

51 względem CD. [01] CD jest jednym z białek powierzchniowych komórki obecnym na limfocytach B. Antygen CD znaleziono na prawidłowych i złośliwych limfocytach pre-b i dojrzałych B, włącznie z tymi w ponad 90% chłoniaków nieziarniczych z komórek B (NHL). Antygen ten jest nieobecny na hematopoetycznych komórkach macierzystych, aktywowanych limfocytach B (komórki plazmatyczne) i na prawidłowej tkance. Opisano kilka przeciwciał, głównie pochodzenia mysiego: 1 F (Press i in., 1987, Blood 69/2, 84-91), 2B8/C2B8, 2H7, 1H4 (Liu i in., 1987, J Immunol 139, ; Anderson i in., Opis patentowy US nr ; Haisma i in., 1998, Blood 92, ; Shan i in., 1999, J. Immunol 162, ). [02] CD opisano w strategiach immunoterapeutycznych do leczenia nowotworów złośliwych z komórek plazmatycznych z zastosowaniem szczepienia DNA kodującym scfv połączonym z białkiem nośnikowym (Treon i in., 00, Semin Oncol 27(), 98) i w leczeniu immunoterapeutycznym z uŝyciem przeciwciał przeciw CD (IDEC-C2B8) oraz wykazano ich skuteczność w leczeniu chłoniaka nieziarniczego z komórek B. Udowodniono skuteczność oraz tolerancję przeciwciał przeciw CD w chłoniaku nieziarniczym, uzyskując wskaźniki odpowiedzi 73% i 48% odpowiednio we wcześniej nie leczonych lub w nawracających/opornych chłoniakach nieziarniczych o powolnym przebiegu (Montserrat, 03, Semin Oncol 30(1 supl. 2), 34-39). Ponadto przeciwciała przeciw CD stosowano szeroko w leczeniu nawracających lub zaawansowanych stadiów nowotworów z komórek B ze skutecznością około 0%. [03] Opisano tutaj konstrukty specyficznie wiąŝące CD3, które zawierają deimmunizowaną domenę skierowaną przeciw/wiąŝącą/oddziałującą z CD3 i drugą domenę pochodzącą z Ig, która specyficznie wiąŝe/oddziałuje z CD. Takie konstrukty przedstawiono w Tabelach 8A i 8B. Moduły A-G w Tabelach 8A i 8B moŝna zdefiniować jak wspomniano powyŝej w Tabelach 1-. Deimmunizowane domeny VH przeciwciał o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3 moŝna wybrać spośród sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO.: 74 lub 76. Deimmunizowane domeny VL przeciwciał o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3 moŝna wybrać spośród sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO.: 78, 80 lub 82. Domenę białkową VH ludzkiego przeciwciała przeciw CD przedstawiono w SEQ ID NO.: 170. Domenę białkową VL ludzkiego przeciwciała przeciw CD przedstawiono w SEQ ID NO.: 172. Gdy którakolwiek z par modułów A/C lub E/G jest parą deimmunizowanych domen białkowych VH/VL lub VL/VH z przeciwciała o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3, moduł białkowy odpowiednio B lub F ma sekwencję białkową przedstawioną w SEQ ID NO.: 3. Gdy którakolwiek z par modułów

52 1 1 2 A/C lub E/G jest parą VH/VL lub VL/VH z przeciwciała o specyficzności względem antygenu CD, moduł białkowy odpowiednio B lub F ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO.: 168. Odpowiednie grupy modułów białkowych A-B-C i E-F-G są połączone ze sobą przez moduł białkowy D o sekwencji przedstawionej w SEQ ID NO.: 174. JednakŜe, jak wspomniano powyŝej, dodatkowa seryna moŝe zostać wprowadzona do celów klonowania (łącznik przedstawiony w SEQ ID NO.: 176) pomiędzy VL a kolejną domenę V. [04] Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące deimmunizowane domeny VH przeciwciał o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3 moŝna wybrać spośród sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO.: 73 lub 7. Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące deimmunizowane domeny VL przeciwciał o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3 moŝna wybrać spośród sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO.: 77, 79 lub 81. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca domenę białkową VH przeciwciała przeciw ludzkiemu CD jest taka jak przedstawiono w SEQ ID NO.: 169. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca domenę białkową VL przeciwciała przeciw ludzkiemu CD jest taka jak przedstawiono w SEQ ID NO.: 171. Gdy którakolwiek z par modułów A/C lub E/G oznacza kwas nukleinowy kodujący parę deimmunizowanych domen białkowych VH/VL lub VL/VH z przeciwciała o specyficzności względem ludzkiego antygenu CD3, moduł kwasu nukleinowego odpowiednio B lub F ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO.: 2. Gdy którakolwiek z par modułów A/C lub E/G oznacza kwas nukleinowy kodujący parę VH/VL lub VL/VH z przeciwciała o specyficzności względem antygenu CD, moduł kwasu nukleinowego odpowiednio B lub F ma sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną w SEQ ID NO.: 1. Grupy modułów kwasów nukleinowych A-B-C i E-F-G są połączone ze sobą przez moduł kwasu nukleinowego D o sekwencji przedstawionej w SEQ ID NO.: 173. Do łączenia domeny VL z kolejną domeną V moŝna takŝe stosować alternatywny łącznik SEQ ID NO.: 17 (zawierający dodatkowy kodon kodujący resztę seryny dla celów klonowania). Tabela 8A Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-cd: sekwencja aminokwasowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw-cd3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CD3 (VL2/VH) xcd LHHL

53 2 Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw-cd3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CD3 (VHNL2) xcd HLHL CD3 (VL2/VH) xcd LHLH CD3 (VHNL2) xcd HLLH CD xcd3 (VH/VL2) LHHL CD xcd3(vh/vl2) HLHL CD xcd3 (VL2/VH) LHLH CD xcd3 (VL2/VH) HLLH CD3 (VL2/VH7) xcd LHHL CD3 (VH7/VL2) xcd HLHL CD3 (VL2/VH7) xcd LHLH CD3 (VH7/VL2) xcd HLLH CD xcd3 (VH7/VL2) LHHL CD xcd3 (VH7/VL2) HLHL CD xcd3 (VL2/VH7) LHLH CD xcd3 (VL2/VH7) HLLH Tabela 8B Deimmunizowane konstrukty przeciw-ludzkiemu CD3 zawierające regiony zmienne jednołańcuchowego przeciw-cd: sekwencja nukleotydowa Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw-cd3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CD3 (VL2/VH) xcd LHHL CD3 (VHNL2) xcd HLHL CD3 (VL2/VH) xcd LHLH CD3 (VH/VL2) xcd HLLH CD xcd3 (VH/VL2) LHHL

54 3 Konstrukt SEQ ID NO.: w części konstruktu Specyficzność deimmunizowanego konstruktu przeciw-cd3 (N -> C) Ustawienie domen A B C D E F G CD xcd3 (VH/VL2) HLHL CD xcd3 (VL2/VH) LHLH CD xcd3(vl2/vh) HLLH CD3 (VL2/VH7) xcd LHHL CD3 (VH7NL2) xcd HLHL CD3 (VL2/VH7) xcd LHLH CD3 (VH7/VL2) xcd HLLH CD xcd3 (VH7/VL2) LHHL CD xcd3 (VH7/VL2) HLHL CD xcd3 (VL2/VH7) LHLH CD xcd3 (VL2/VH7) HLLH 1 [0] Korzystniej opisane tutaj deimmunizowane konstrukty wiąŝące CD3 i CD zawierają sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej (a) sekwencję aminokwasową przedstawioną w którejkolwiek z SEQ ID NO.: 218, 2, 222, 224, 226 lub 228 ; (b) sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną w którejkolwiek z SEQ ID NO.: 217, 219, 221, 223, 22 lub 227; oraz (c) sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego, która jest zdegenerowana pod względem kodu genetycznego do sekwencji nukleotydowej (b); (d) i sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą z nicią komplementarną sekwencji kwasu nukleinowego zdefiniowanej w (b) w ostrych warunkach hybrydyzacji. [06] Opisano tutaj konstrukty specyficznie wiąŝące CD3 zawierające pierwszą domenę, która specyficznie wiąŝe ludzki CD3 oraz wykazuje obniŝoną zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T oraz zawierające drugą domenę pochodzącą z Ig skierowaną przeciw/zdolną do wiązania CD, która zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą z nicią komplementarną sekwencji kwasu nukleinowego zdefiniowanej tutaj powyŝej w (b), tj. z sekwencją kwasu nukleino-

55 wego przedstawioną w którejkolwiek z SEQ ID NO.: 217, 219, 221, 223, 22 lub 227 w ostrych warunkach hybrydyzacji. Określenia hybrydyzacja oraz ostre warunki opisano tutaj powyŝej. Odpowiednie definicje i postaci mają tutaj zastosowanie po wprowadzeniu koniecznych zmian. [07] Opisane tutaj deimmunizowane konstrukty wiąŝące CD3 i CD są przewidziane do stosowania do leczenia, profilaktyki i/lub poprawy zaburzeń związanych z komórkami B, korzystnie w medycznej interwencji w chłoniaku, korzystniej do leczenia chłoniaka nieziarniczego. [08] Wynalazek takŝe dostarcza sekwencję kwasu nukleinowego kodującą cząsteczkę specyficznie wiąŝącą CD3 według wynalazku. [09] Dla fachowca w dziedzinie oczywiste jest, Ŝe do cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku moŝna dodać sekwencje regulatorowe. Przykładowo moŝna zastosować promotory, wzmacniacze transkrypcji i/lub sekwencje, które umoŝliwiają indukowaną ekspresję polinukleotydu według wynalazku. Odpowiednim układem indukcyjnym jest przykładowo ekspresja genu regulowana tetracykliną opisana np. w Gossen i Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 47-1) oraz Gossen i in. (Trends Biotech. 12 (1994), 8-62) lub układ ekspresji genu indukowanej deksametazonem opisany np. w Crook (1989) EMBO J. 8, [01] Ponadto zakłada się dla dalszych zastosowań, Ŝe cząsteczki kwasu nukleinowego mogą przykładowo zawierać wiązania tioestrowe i/lub analogi nukleotydów. Te modyfikacje mogą być przydatne do stabilizacji cząsteczki kwasu nukleinowego względem endoi/lub egzonukleaz w komórce. Te cząsteczki kwasu nukleinowego mogą być transkrybowane z odpowiedniego wektora zawierającego gen chimeryczny, który umoŝliwia transkrypcję tej cząsteczki kwasu nukleinowego w komórce. Pod tym względem, naleŝy takŝe rozumieć, Ŝe taki polinukleotyd moŝna stosować w sposobach skierowania na gen lub terapii genowej. W innej postaci te cząsteczki kwasu nukleinowego są znakowane. Sposoby wykrywania kwasów nukleinowych są dobrze znane w dziedzinie, np. Southern i Northern blotting, PCR lub wydłuŝanie startera. Postać ta moŝe być szczególnie przydatna w sposobach przeszukiwania słuŝących do potwierdzenia skutecznego wprowadzenia opisanych powyŝej cząsteczek kwasu nukleinowego w sposobach terapii genowej. [0111] Ta (Te) cząsteczka(-ki) kwasu nukleinowego moŝe (mogą) być wytwarzaną rekombinacyjnie chimeryczną cząsteczką kwasu nukleinowego zawierającą którąkolwiek ze wspomnianych powyŝej cząsteczek kwasu nukleinowego samodzielnie lub w połączeniu. Korzystnie, cząsteczka kwasu nukleinowego jest częścią wektora. [0112] Zatem niniejszy wynalazek dotyczy takŝe wektora zawierającego cząsteczkę kwasu

56 nukleinowego opisaną w niniejszym wynalazku. [0113] Fachowcy w dziedzinie biologii molekularnej znają wiele odpowiednich wektorów, których wybór będzie zaleŝeć od wymaganych funkcji oraz które obejmują plazmidy, kosmidy, wirusy, bakteriofagi oraz inne wektory powszechnie stosowane w inŝynierii genetycznej. Do skonstruowania róŝnych plazmidów i wektorów moŝna stosować metody dobrze znane fachowcom w dziedzinie; patrz przykładowo techniki opisane w Sambrook i in. (jak zacytowano powyŝej) oraz Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994). Inaczej, polinukleotydy i wektory według wynalazku moŝna wprowadzać do liposomów w celu dostarczania do komórek docelowych. Jak omówiono bardziej szczegółowo poniŝej, wektor do klonowania zastosowano do wyizolowania poszczególnych sekwencji DNA. Odpowiednie sekwencje moŝna przenosić do wektorów ekspresyjnych, gdy wymagana jest ekspresja konkretnego polipeptydu. Typowe wektory do klonowania obejmują pbluescript SK, pgem, puc9, pbr322 i pgbt9. Typowe wektory eskpresyjne obejmują ptre, pcal-n-ek, pesp-1, pop13cat. Korzystnie ten wektor zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która jest sekwencją regulatorową funkcjonalnie połączoną z tą sekwencją kwasu nukleinowego kodującą zdefiniowane tutaj bispecyficzne konstrukty jednołańcuchowego przeciwciała. [0114] Takie sekwencje regulatorowe (elementy kontrolne) są znane fachowcowi w dziedzinie oraz mogą one obejmować promotor, kasetę splicingową, kodon inicjacji translacji, miejsce translacji i insercji do wprowadzenia insertu do wektora. Korzystnie, ta cząsteczka kwasu nukleinowego jest funkcjonalnie połączona z tymi sekwencjami kontrolnymi ekspresji umoŝliwiającymi ekspresję w komórkach eukariotycznych i prokariotycznych. [011] Zakłada się, Ŝe ten wektor jest wektorem ekspresyjnym zawierającym cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą zdefiniowane tutaj bispecyficzne konstrukty jednołańcuchowego przeciwciała. [0116] Określenie sekwencja regulatorowa dotyczy sekwencji DNA, które są niezbędne do wywołania ekspresji sekwencji kodujących z którymi są one zligowane. Natura takich sekwencji kontrolnych róŝni się zaleŝnie od organizmu gospodarza. U prokariontów sekwencje kontrolne ogólnie obejmują promotor, miejsce wiązania rybosomu oraz terminatory. U eukariontów ogólnie sekwencje kontrolne obejmują promotory, terminatory oraz w niektórych przypadkach wzmacniacze, transaktywatory lub czynniki transkrypcyjne. Określenie sekwencja kontrolna z zamierzenia obejmuje minimalnie wszystkie składniki, których obecność jest niezbędna do ekspresji oraz moŝe takŝe obejmować dodatkowe korzystne składniki. [0117] Określenie funkcjonalnie połączony dotyczy zestawienia, w którym składniki tak

57 opisane są w związku umoŝliwiającym ich działanie w sposób dla nich zamierzony. Sekwencja kontrolna funkcjonalnie połączona z sekwencją kodującą jest zligowana w taki sposób, Ŝe ekspresja sekwencji kodującej jest uzyskiwana w warunkach zgodnych z sekwencją kontrolną. W przypadku, gdy sekwencję kontrolną stanowi promotor, dla fachowca w dziedzinie oczywiste jest, Ŝe korzystnie stosuje się dwuniciowy kwas nukleinowy. [0118] Zatem wspomnianym wektorem jest korzystnie wektor ekspresyjny. Wektor ekspresyjny jest konstruktem, który moŝna stosować do transformacji wybranego gospodarza i zapewnia ekspresję sekwencji kodującej w wybranym gospodarzu. Wektorami ekspresyjnymi mogą być przykładowo wektory do klonowania, wektory binarne lub wektory integracyjne. Ekspresja obejmuje transkrypcję cząsteczki kwasu nukleinowego korzystnie do mrna moŝliwego do translacji. Elementy regulatorowe zapewniające ekspresję w komórkach prokariotycznych i/lub eukariotycznych są dobrze znane fachowcom w dziedzinie. W przypadku komórek eukariotycznych obejmują one normalnie promotory zapewniające inicjację transkrypcji oraz ewentualnie sygnały poli-a zapewniające terminację transkrypcji i stabilizację transkryptu. MoŜliwe elementy regulatorowe umoŝliwiające ekspresję w komórkach prokariotycznych obejmują np. promotor P L, lac, trp lub tac w E. coli, a przykładami elementów regulatorowych umoŝliwiających ekspresję w eukariotycznych komórkach gospodarzach są promotor AOX1 lub GAL1 w droŝdŝach lub promotor CMV, SV40, RSV (wirusa mięsaka Rousa), wzmacniacz CMV, wzmacniacz SV40 lub intron globiny w komórkach ssaczych i innych komórkach zwierzęcych. [0119] Oprócz elementów, które są odpowiedzialne za inicjację transkrypcji, takie elementy regulatorowe mogą takŝe obejmować leŝące w dół od polinukleotydu sygnały terminacji transkrypcji, takie jak miejsce SV40-poli-A lub miejsce tk-poli-a. Ponadto zaleŝnie od zastosowanego układu ekspresyjnego, do sekwencji kodującej wymienionej sekwencji kwasu nukleinowego moŝna dodać sekwencje liderowe zdolne do kierowania polipeptydu do przedziału komórkowego lub wydzielenia go do podłoŝa i są one dobrze znane w dziedzinie; patrz takŝe np. dołączony przykład 1. Sekwencja(-e) liderowa(-e) jest (są) zestawiona(-e) w odpowiedniej fazie z sekwencjami do translacji, inicjacji i terminacji oraz korzystnie sekwencja liderowa jest zdolna do kierowania wydzielaniem białka ulegającego translacji lub jego części do przestrzeni peryplazmatycznej lub środowiska zewnątrzkomórkowego. Ewentualnie sekwencja heterologiczna moŝe kodować białko fuzyjne zawierające N-końcowy peptyd słuŝący do identyfikacji nadający wymagane właściwości, np. stabilizację lub uproszczone oczyszczanie eksprymowanego produktu rekombinowanego; patrz powyŝej. W tym kontekście odpowiednie wektory ekspresyjne są znane w dziedzinie, takie jak wektor ekspresyjny cdna Okayama-Berg pcdv1 (Pharmacia), pcdm8,

58 prc/cmv, pcdna1, pcdna3 (Invitrogene), pef-dhfr, pef-ada lub pef-neo (Raum i in. Cancer Immunol Immunother (01) 0(3), 141-) lub psport1 (GIBCO BRL). [01] Korzystnie sekwencjami kontrolnymi ekspresji będą układy promotorów eukariotycznych w wektorach zdolnych do tranformacji lub transfekcji eukariotycznych komórek gospodarzy, ale moŝna takŝe zastosować sekwencje kontrolne dla prokariotycznych gospodarzy. Po wprowadzeniu wektora do odpowiedniego gospodarza, gospodarz jest utrzymywany w warunkach odpowiednich do wysokiego poziomu ekspresji sekwencji nukleotydowych oraz, gdy jest to wymagane, następnie moŝna przeprowadzić zbieranie i oczyszczanie polipeptydu według wynalazku; patrz np. dołączone przykłady. [0121] Alternatywnym układem ekspresyjnym, który moŝna zastosować jest układ owadzi. W jednym z takich układów stosuje się wirus polihedrozy jądrowej Autographa californica (AcNPV) jako wektor do ekspresji obcych genów w komórkach Spodoptera frugiperda lub w larwach Trichoplusia. Sekwencje kodujące wymienionej cząsteczki kwasu nukleinowego moŝna klonować w nie-niezbędny region wirusa, taki jak gen polihedryny, i umieszczać pod kontrolą promotora polihedryny. Skuteczne wstawienie tej sekwencji kodującej sprawi, Ŝe gen polihedryny będzie nieaktywny i wytworzy rekombinowany wirus bez płaszcza z białek płaszcza. Następnie rekombinowane wirusy stosuje się do zakaŝania komórek S. frugiperda lub larw Trichoplusia, w których białko według wynalazku jest eksprymowane (Smith, J. Virol. 46 (1983), 84; Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994), ). Dodatkowe elementy regulatorowe mogą obejmować wzmacniacze transkrypcji, jak i translacji. Korzystnie opisane powyŝej wektory według wynalazku zawierają marker selekcyjny i/lub dający się oznaczyć. [0122] Geny markerów selekcyjnych przydatnych do selekcji transformowanych komórek oraz np. tkanek roślinnych i roślin są dobrze znane fachowcom w dziedzinie oraz obejmują, przykładowo, oporność na antymetabolity, jako podstawa selekcji względem dhfr, który nadaje oporność na metotreksat (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), ); npt, który nadaje oporność na aminoglikozydy neomycynę, kanamycynę i paromycynę (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), ) oraz hygro, który nadaje oporność na higromycynę (Marsh, Gene 32 (1984), ). Opisano dodatkowe markery selekcyjne, a mianowicie trpb, który umoŝliwia komórkom wykorzystywanie indolu zamiast tryptofanu; hisd, który umoŝliwia komórkom wykorzystywanie histynolu zamiast histydyny (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 (1988), 8047); izomerazę mannozo-6-fosforanu, która umoŝliwia komórkom wykorzystywanie mannozy (WO 94/627) oraz ODC (dekarboksylaza ornityny), która nadaje oporność na inhibitor dekarboksylazy ornityny, 2- (difluorometylo)-dl-ornitynę, DFMO (McConlogue, 1987, W: Current Communications

59 in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) lub deaminazę z Aspergillus terreus, która nadaje oporność na Blastycydynę S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 9 (199), ). [0123] Przydatne markery dające się oznaczać takŝe są znane fachowcom w dziedzinie oraz są one dostępne w handlu. Korzystnie, ten marker stanowi gen kodujący lucyferazę (Giacomin, PI. Sci. 116 (1996), 9-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), białko zielonej fluorescencji (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) lub β-glukuronidazę (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), ). Postać ta znajduje jest szczególnie przydatna do prostego i szybkiego przeszukiwania komórek, tkanek i organizmów zawierających wspomniany wektor. [0124] Jak opisano powyŝej, wspomnianą cząsteczkę kwasu nukleinowego moŝna stosować samodzielnie lub jako część wektora do ekspresji kodowanego konstruktu specyficznego względem CD3 w komórkach, np. do oczyszczania, ale takŝe do celów terapii genowej. Cząsteczki kwasu nukleinowego lub wektory zawierające sekwencję(-e) DNA kodującą(-e) którykolwiek z opisanych powyŝej (bispecyficznych) konstruktów CD3 wprowadza się do komórek, które z kolei wytwarzają interesujący polipeptyd. Terapia genowa, która jest oparta na wprowadzaniu genów terapeutycznych do komórek z uŝyciem technik ex vivo lub in vivo jest jednym z najwaŝniejszych zastosowań przenoszenia genów. Odpowiednie wektory, metody lub układy do dostarczania genów do terapii genowej in vitro lub in vivo są opisane w literaturze i znane fachowcom w dziedzinie; patrz np. Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 34-39; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), ; Anderson, Science 26 (1992), ; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), ; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (199), 77-86; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. (1998), ; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), ; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), ; Wang, Nature Medicine 2 (1996), ; WO 94/29469; WO 97/0097, US 8089; US 89466; lub Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), Wspomniane cząsteczki kwasów nukleinowych i wektory moŝna projektować do bezpośredniego wprowadzania lub wprowadzania przez liposomy lub wektory wirusowe (np. adenowirusowe, retrowirusowe) do komórki. Korzystnie, tę komórkę stanowi komórka linii zarodkowej, komórka embrionalna lub komórka jajowa lub komórka z nich pochodząca, najkorzystniej tę komórkę stanowi komórka macierzysta. Przykładem embrionalnej komórki macierzystej moŝe być, między innymi, komórka macierzysta opisana w Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), [012] Zgodnie z powyŝszym, niniejszy wynalazek dotyczy sposobów uzyskiwania wektorów, w szczególności plazmidów, kosmidów, wirusów i bakteriofagów standardowo sto-

60 sowanych w inŝynierii genetycznej, które zawierają cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą sekwencję polipeptydu zdefiniowanego tutaj bispecyficznego konstruktu jednołańcuchowego przeciwciała. Korzystnie, ten wektor stanowi wektor ekspresyjny i/lub wektor do przenoszenia genów lub skierowany na gen. Wektory ekspresyjne pochodzące z wirusów, takich jak retrowirusy, wirus krowianki, wirus adenosatelitarny, herpeswirusy lub bydlęcy papilomawirus, moŝna stosować do dostarczania wspomnianych polinukleotydów lub wektora do docelowych populacji komórek. Metody dobrze znane fachowcom w dziedzinie moŝna stosować do konstruowania rekombinowanych wektorów; patrz przykładowo techniki opisane w Sambrook i in. (jak zacytowano powyŝej), Ausubel (1989, jak zacytowano powyŝej) lub w innych standardowych podręcznikach. Inaczej, wspomniane cząsteczki kwasu nukleinowego i wektory moŝna wprowadzać do liposomów w celu dostarczania do komórek docelowych. Wektory zawierające cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku moŝna przenosić do komórki gospodarza z uŝyciem dobrze znanych metod, które róŝnią się zaleŝnie od typu komórki gospodarza. Przykładowo transfekcję z zastosowaniem chlorku wapnia stosuje się powszechnie do komórek prokariotycznych, podczas gdy traktowanie fosforanem wapnia lub elektroporację moŝna zastosować do innych komórek gospodarzy; patrz Sambrook, jak wyŝej. [0126] Wspomniany wektor moŝe stanowić między innymi pef-dhfr, pef-ada lub pef-neo. Wektory pef-dhfr, pef-ada i pef-neo opisano w dziedzinie np. w Mack i in. (PNAS (199) 92, ) oraz Raum i in. (Cancer Immunol Immunother (01) 0(3), 141-). [0127] Wynalazek dostarcza takŝe gospodarza transformowanego lub transfekowanego opisanym tutaj wektorem. Tego gospodarza moŝna wytwarzać przez wprowadzenie do gospodarza tego co najmniej jednego z opisanych powyŝej wektorów lub co najmniej jednej z opisanych powyŝej cząsteczek kwasu nukleinowego. Obecność tego co najmniej jednego wektora lub co najmniej jednej cząsteczki kwasu nukleinowego w gospodarzu moŝe prowadzić do ekspresji genu kodującego opisane powyŝej bispecyficzne konstrukty jednołańcuchowego przeciwciała. [0128] Opisana cząsteczka kwasu nukleinowego lub wektor, które są wprowadzone do gospodarza mogą być wintegrowane do genomu gospodarza lub mogą być utrzymywane pozachromosomowo. [0129] Gospodarza moŝe stanowić jakakolwiek komórka prokariotyczna lub eukariotyczna. [0130] Określenie prokariotyczny z zamierzenia obejmuje wszystkie bakterie, które mogą być transformowane lub transfekowane cząsteczkami DNA lub RNA do ekspresji biał-

61 ka według wynalazku. Prokariotyczni gospodarze mogą obejmować bakterie Gram ujemne, jak i Gram dodatnie, takie jak przykładowo E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens i Bacillus subtilis. Określenie eukariotyczny z zamierzenia obejmuje droŝdŝe, rośliny wyŝsze, owady oraz korzystnie komórki ssacze. ZaleŜnie od gospodarza stosowanego w procedurze wytwarzania rekombinacyjnego białko kodowane przez polinukleotyd według niniejszego wynalazku moŝe być glikozylowane lub moŝe być nie glikozylowane. Szczególnie korzystne jest zastosowanie plazmidu lub wirusa zawierającego sekwencję kodującą polipeptyd według wynalazku oraz genetycznie zfuzowany z nią N-końcowy znacznik FLAG i/lub C-końcowy znacznik His. Korzystnie długość tego znacznika FLAG wynosi około 4 do 8 aminokwasów, najkorzystniej około 8 aminokwasów. Opisany powy- Ŝej polinukleotyd moŝna stosować do transformacji lub transfekcji gospodarza z uŝyciem jakiejkolwiek z technik powszechnie znanych przeciętnym fachowcom w dziedzinie. Ponadto, sposoby wytwarzania zfuzowanych, funkcjonalnie połączonych genów oraz ich ekspresji np. w komórkach ssaczych oraz bakteriach są dobrze znane w dziedzinie (Sambrook, jak zacytowano powyŝej). [0131] Korzystnie, tego gospodarza stanowi bakteria, komórka owadzia, grzybowa, roślinna lub ssacza. [0132] W szczególności zakłada się, Ŝe wymienionego gospodarza moŝe stanowić komórka ssacza, korzystniej komórka ludzka lub linia komórek ludzkich. [0133] Szczególnie korzystne komórki gospodarze obejmują komórki CHO, komórki COS, linie komórek czerniaka, takie jak SP2/0 lub NS/0. Jak zilustrowano w dołączonych przykładach, jako gospodarze szczególnie korzystne są komórki CHO. [0134] Zatem w dalszej postaci niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania opisanego powyŝej konstruktu specyficznego względem CD3 obejmującego hodowanie komórki i/lub gospodarza według wynalazku w warunkach odpowiednich do ekspresji tego konstruktu i wyizolowanie konstruktu z komórki lub podłoŝa hodowlanego. [013] Transformowanych gospodarzy moŝna hodować w fermentorach oraz hodować według technik znanych w dziedzinie w celu uzyskania optymalnego wzrostu komórek. Polipeptyd według wynalazku moŝna następnie izolować z podłoŝa hodowlanego, lizatów komórkowych lub frakcji błon komórkowych. Izolację i oczyszczanie np. polipeptydów według wynalazku eksprymowanych w mikroorganizmach moŝna prowadzić z uŝyciem jakichkolwiek standardowych środków, takich jak przykładowo rozdziały metodą preparatywnej chromatografii oraz rozdziały immunologiczne, takie jak te obejmujące zastosowanie przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych skierowanych np. przeciwko znacznikowi polipeptydu według wynalazku lub jak opisano w dołączonych przykładach.

62 [0136] Ponadto wynalazek dostarcza kompozycję zawierającą zdefiniowany tutaj konstrukt specyficznie wiąŝący (ludzki) CD3 lub konstrukt specyficznie wiąŝący (ludzki) CD3 wytworzony ujawnionym tutaj sposobem, cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku, wektor lub gospodarza według wynalazku. Ta kompozycja ewentualnie moŝe takŝe zawierać białkopodobny związek zdolny do zapewnienia sygnału aktywującego dla immunologicznych komórek efektorowych. Najkorzystniej, ta kompozycja stanowi kompozycję farmaceutyczną ewentualnie ponadto zawierającą odpowiednie preparaty nośnika, stabilizatory i/lub zaróbki. [0137] Zgodnie z tym wynalazkiem określenie kompozycja farmaceutyczna dotyczy kompozycji do podawania pacjentowi, korzystnie pacjentowi będącemu człowiekiem. W korzystnej postaci kompozycja farmaceutyczna obejmuje kompozycję do podawania pozajelitowego, przezskórnego, do światła przewodu, dotętniczego, dooponowego lub przez bezpośrednie wstrzyknięcie do tkanki lub guza. W szczególności zakłada się, Ŝe tę kompozycję farmaceutyczną podaje się pacjentowi we wlewie lub zastrzyku. Podawanie odpowiednich kompozycji moŝna prowadzić na róŝnych drogach, np. przez podawanie doŝylne, śródotrzewnowe, podskórne, domięśniowe, miejscowe lub śródskórne. Kompozycja farmaceutyczna według niniejszego wynalazku moŝe ponadto zawierać farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Przykłady odpowiednich nośników farmaceutycznych są dobrze znane w dziedzinie i obejmują one roztwory soli buforowane fosforanami, wodę, emulsje, takie jak emulsje olej/woda, róŝne typy środków zwilŝających, jałowe roztwory itp. Kompozycje zawierające takie nośniki moŝna formułować dobrze znanymi standardowymi metodami. Te kompozycje farmaceutyczne moŝna podawać pacjentowi w odpowiedniej dawce. Sposób dawkowania będzie wyznaczony przez lekarza prowadzącego oraz czynniki kliniczne. Jak dobrze wiadomo w dziedzinie medycyny, dawki dla jakiegokolwiek pacjenta zaleŝą od wielu czynników, włącznie z wielkością pacjenta, powierzchnią ciała, wiekiem, konkretnym podawanym związkiem, płcią, czasem i drogą podawania, ogólnym stanem zdrowia oraz innymi lekami równolegle podawanymi. Ogólnie dawkowanie przy zwykłym podawaniu kompozycji farmaceutycznej powinno być w zakresie 1 µg do g jednostek na dzień. Jakkolwiek korzystniejsza dawka do ciągłego wlewu moŝe być w zakresie 0,01 µg do 2 mg, korzystnie 0,01 µg do 1 mg, korzystniej 0,01 µg do 0 µg, jeszcze korzystniej 0,01 µg do 0 µg, a najkorzystniej 0,01 µg do µgjednostek na kilogram masy ciała na godzinę. Szczególnie korzystne dawki podano tutaj poniŝej. Postęp moŝna monitorować przez okresową ocenę. Dawki będą się róŝnić, ale korzystna dawka do podawania doŝylnego DNA jest od około 6 do 12 kopii cząsteczki DNA. Kompozycje według wynalazku moŝna podawać miejscowo lub ogólnoustrojowo. Podawanie będzie ogólnie pozajeli-

63 towe, np. doŝylne; DNA moŝna takŝe podawać jako skierowane do miejsca docelowego, np. przez podawanie biolistyczne do wewnętrznego lub zewnętrznego miejsca docelowego lub przez cewnik do miejsca w tętnicy. Preparaty do podawania pozajelitowego obejmują jałowe roztwory wodne lub nie-wodne, zawiesiny oraz emulsje. Przykładami nie-wodnych rozpuszczalników są glikol propylenowy, glikol polietylenowy, oleje roślinne, takie jak olej oliwkowy oraz estry organiczne do zastrzyków, takie jak oleinian etylu. Wodne nośniki obejmują wodę, roztwory alkoholowe/wodne, emulsje lub zawiesiny, włącznie z roztworem soli i buforowanymi podłoŝami. PodłoŜa do podawania pozajelitowego obejmują roztwór chlorku sodu, płyn Ringera z dekstrozą, dekstrozę i chlorek sodu, płyn Ringera z mleczanami lub zestalone oleje. PodłoŜa do podawania doŝylnego obejmują preparaty do uzupełniania płynów i środków odŝywczych, preparaty do uzupełniania elektrolitów (takie jak te oparte na płynie Ringera z dekstrozą) i tym podobne. Mogą być takŝe obecne środki konserwujące i inne dodatki, takie jak przykładowo środki przeciwdrobnoustrojowe, przeciwutlenaicze, środki chelatujące oraz gazy obojętne i tym podobne. Ponadto kompozycja farmaceutyczna według niniejszego wynalazku moŝe zawierać nośniki białkowe, takie jak np. albumina surowicza lub immunoglobulina, korzystnie pochodzenia ludzkiego. Rozwa- Ŝa się, Ŝe kompozycja farmaceutyczna według wynalazku moŝe zawierać, oprócz białkowych bispecyficznych konstruktów jednołańcuchowego przeciwciała lub kodujących je cząsteczek kwasu nukleinowego lub wektorów (jak opisano w tym wynalazku), dodatkowe środki czynne biologicznie, zaleŝnie od zamierzonego zastosowania kompozycji farmaceutycznej. Takie środki mogą stanowić leki działające w przewodzie Ŝołądkowo-jelitowym, leki działające jako cytotstatyki, leki przeciwdziałające hiperurykemii, leki hamujące reakcje immunologiczne (np. kortykosteroidy), leki działające na układ krąŝenia i/lub środki, takie jak cząsteczki kostymulujące komórki T lub cytokiny znane w dziedzinie. [0138] MoŜliwymi wskazaniami do podawania kompozycji według wynalazku są choroby nowotworowe, w szczególności raki nabłonkowe, takie jak rak sutka, rak okręŝnicy, rak stercza, rak głowy i szyi, rak skóry (czerniak), raki układu moczowo-płciowego, np. rak jajnika, rak trzonu macicy, rak szyjki macicy oraz rak nerki, rak płuca, rak Ŝołądka, rak jelita cienkiego, rak wątroby, rak trzustki, rak pęcherzyka Ŝółciowego, raki przewodów Ŝółciowych, rak przełyku, rak gruczołów ślinowych oraz rak gruczołu tarczowego oraz inne choroby nowotworowe, takie jak nowotwory hematologiczne, glejaki, mięsaki lub kostniakomięsaki. Podawanie kompozycji według wynalazku jest szczególnie wskazane w minimalnej chorobie resztkowej, w szczególności w przypadku wczesnych guzów litych, zaawansowanych guzów litych lub przerzutowych guzów litych, które charakteryzują się miejscowym lub nie miejscowym nawrotem nowotworu spowodowanym przeŝyciem po-

64 jedynczych komórek. [0139] Wynalazek ponadto rozwaŝa protokoły wspólnego podawania wraz z innymi związkami, np. cząsteczkami zdolnymi do dostarczenia sygnału aktywującego dla immunologicznych komórek efektorowych, do proliferacji komórek lub do stymulacji komórek. Tę cząsteczkę moŝe stanowić np. dodatkowy główny sygnał aktywujący dla komórek T (np. dodatkowa cząsteczka kostymulująca: cząsteczki z rodziny B7, Ox40L, 4.1 BBL) lub dodatkowa cytokina: interleukina (np. IL-2) lub związek angaŝujący NKG-2D. [0140] Opisana powyŝej kompozycja według wynalazku moŝe stanowić takŝe kompozycję diagnostyczną ewentualnie ponadto obejmującą środki i sposoby do wykrywania. [0141] Dostarczone tutaj konstrukty specyficzne względem CD3 są takŝe odpowiednie do stosowania w testach immunologicznych, w których mogą być one stosowane w fazie płynnej lub w postaci związanej z nośnikiem w fazie stałej. Przykładami testów immunologicznych, w których moŝna stosować polipeptyd według wynalazku są kompetycyjne i nie kompetycyjne testy immunologiczne w postaci bezpośredniej lub pośredniej. Przykładami takich testów immunologicznych są test immunoenzymosorbcyjny (ELISA), test immunoenzymatyczny (EIA), test radioimmunologiczny (RIA), test typu sandwich (test immunometryczny) oraz test Western blot. [0142] Konstrukty specyficznie wiąŝące CD3 według wynalazku moŝna związać z wieloma róŝnymi nośnikami i stosować je do izolacji komórek specyficznie związanych z tymi polipeptydami. Przykłady dobrze znanych nośników obejmują szkło, polistyren, polichlorek winylu, polipropylen, polietylen, poliwęglan; dekstrynę, nylon, amylozy, naturalne i modyfikowane celulozy; poliakryloamidy, agarozy i magnetyt. Nośnik moŝe być z natury rozpuszczalny lub nierozpuszczalny, np. w postaci kulek, dla celów wynalazku. [0143] Istnieje wiele róŝnych znaczników oraz sposobów znakowania znanych przeciętnym fachowcom w dziedzinie. Przykłady typów znaczników, które mogą być stosowane w niniejszym wynalazku obejmują enzymy, izotopy promieniotwórcze, metale koloidalne, związki fluorescencyjne, związki chemiluminescencyjne oraz związki bioluminescencyjne; patrz takŝe postaci omówione tutaj powyŝej. [0144] W najkorzystniejszej postaci niniejszego wynalazku rozwaŝa się zastosowanie cząsteczki specyficznie wiąŝącej CD3 według wynalazku, wektora lub gospodarza według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej. Ta kompozycja farmaceutyczna moŝe być stosowana do profilaktyki, leczenia lub poprawy choroby proliferacyjnej, choroby nowotworowej, choroby zapalnej, zaburzenia immunologicznego, choroby autoimmunizacyjnej, choroby zakaźnej, choroby wirusowej, reakcji alergicznych, reakcji na pasoŝyty, chorób przeszczep przeciw gospodarzowi lub chorób gospodarz przeciw przeszczepo-

65 wi. [014] Ponadto deimmunizowane konstrukty zawierające domeny wiąŝące CD19 i CD3, korzystnie SEQ ID NO.: 190, 192, 194, 196, 198, 0, 327, 329, 331, 333, 33, 337, 339, 341, 343, 34, 347, 349, 31, 33, 37, 39, 361, 363, 36, 367, 369, 371, 373, 37, 377, 379, 381, 383, 38, 387, 389, 391, 393, 39, 397, 399, 401, 403, 40, 407 lub 409, moŝna stosować do leczenia zaburzeń immunologicznych (róŝnych nowotworów złośliwych z komórek B) lub chorób autoimmunizacyjnych, deimmunizowane konstrukty zawierające domeny wiąŝące CCR i CD3, korzystnie SEQ ID NO.: 6, 8, 2, 212, 214 lub 216, moŝna stosować do leczenia róŝnych chorób wirusowych (HIV), chorób autoimmunizacyjnych i/lub chorób zapalnych (jak reumatoidalne zapalenie stawów), deimmunizowane konstrukty zawierające domeny wiąŝące CD i CD3, korzystnie SEQ ID NO.: 218, 2, 222, 224, 226, 228, moŝna stosować do leczenia chorób nowotworowych, korzystnie chłoniaka, korzystniej chłoniaka nieziarniczego z komórek B, a deimmunizowane konstrukty zawierające domeny wiąŝące EpCAM i CD3, korzystnie SEQ ID NO.: 31, 33, 3, 37, 39, 49,, 8, 61, 63, 6, 67, 237, 239, 241, 243, 24, 247, 249, 21, 23, 2, 27, 29, 261, 263, 26, 267, 269, 271, 273, 27, 277, 279, 281, 283, 28, 287, 289, 291; 293, 29, 297, 299, 301, 303, 30, 307, 309, 311, 313, 31, 317, 319, 321, 323 lub 32 moŝna stosować do leczenia chorób nowotworowych, korzystnie raków nabłonkowych. [0146] Opisano tutaj takŝe sposób profilaktyki, leczenia lub poprawy choroby proliferacyjnej, choroby nowotworowej, choroby zapalnej, zaburzenia immunologicznego, choroby autoimmunizacyjnej, choroby zakaźnej, choroby wirusowej, reakcji alergicznych, reakcji na pasoŝyty, chorób przeszczep przeciw gospodarzowi lub chorób gospodarz przeciw przeszczepowi obejmujący podawanie (bispecyficznej) cząsteczki specyficznie wiąŝącej CD3 według wynalazku lub (bispecyficznej) cząsteczki specyficznie wiąŝącej CD3 wytwarzanej opisanymi tutaj sposobami, cząsteczki kwasu nukleinowego, wektora lub gospodarza według wynalazku, osobnikowi badanemu wymagającemu takiej profilaktyki, leczenia lub poprawy. Korzystnie tego osobnika badanego stanowi człowiek. [0147] Opisany tutaj sposób profilaktyki, leczenia lub poprawy moŝe takŝe, dodatkowo, obejmować podawanie białkopodobnego związku zdolnego do dostarczania sygnału aktywującego dla immunologicznych komórek efektorowych. Ten białkopodobny związek moŝna podawać równocześnie lub nie równocześnie z cząsteczką wiąŝącą CD3, cząsteczką kwasu nukleinowego, wektorem lub gospodarzem według wynalazku. Białkopodoby związek moŝna wybrać, między innymi, z grupy obejmującej dodatkową cząsteczkę kostymulującą: cząsteczki z rodziny B7, Ox40L, 4.1 BBL lub dodatkową cytokinę: interleukinę (np. IL-2) lub związki angaŝujące NKG-2D.

66 [0148] Ostatecznie wynalazek dostarcza zestaw zawierający cząsteczkę specyficznie wią- Ŝącą CD3, cząsteczkę kwasu nukleinowego, wektor lub gospodarza według wynalazku. [0149] Ten zestaw jest szczególnie przydatny do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej według niniejszego wynalazku oraz moŝe, między innymi, składać się z pojemnika przydatnego w zastrzykach lub wlewach. Korzystnie, zestaw według niniejszego wynalazku ponadto ewentualnie zawiera bufor(y), roztwory do przechowywania i/lub pozostałe odczynniki lub materiały wymagane do spełnienia medycznych lub naukowych celów. Ponadto części zestawu według wynalazku mogą być zapakowane pojedynczo we fiolkach lub butelkach lub w połączeniu w pojemnikach lub jednostkach wielopojemnikowych. Zestaw według niniejszego wynalazku moŝna korzystnie stosować, między innymi, do przeprowadzania sposobu według wynalazku oraz moŝna stosować w róŝnych opisanych tutaj zastosowaniach, np. jako narzędzia badawcze lub narzędzia medyczne. Wytwarzanie zestawów korzystnie wykonuje się według standardowych procedur znanych fachowcowi w dziedzinie. [0] Te oraz inne postaci są ujawnione oraz objęte przez opis i w Przykłady niniejszego wynalazku. Dalszą literaturę dotyczącą któregokolwiek z przeciwciał, sposobów, zastosowań i związków do zastosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem moŝna uzyskać z publicznych bibliotek i baz danych, przykładowo z zastosowaniem urządzeń elektronicznych. Przykładowo moŝna wykorzystać bazę Medline publicznie dostępną w Internecie, przykładowo pod adresem Dalsze bazy danych i adresy, takie jak tools.html, są znane fachowcowi w dziedzinie i moŝna je takŝe uzyskać z zastosowaniem np. [011] Rysunki przedstawiają: Figura 1. Sekwencje DNA i aminokwasowa nie-deimmunizowanej kasety przeciw- CD3 (SEQ ID NO.: 1 i 2). Figura 2. A) Sekwencje aminokwasowe odpowiednio łańcuchów cięŝkich VH2 (SEQ ID NO.: 70), VH3 (SEQ ID NO.: 72), VH (SEQ ID NO.: 74) i VH7 (SEQ ID NO.: 76) oraz łańcuchów lekkich VL1 (SEQ ID NO.: 78), VL2 (SEQ ID NO.: 80) i VL3 (SEQ ID NO.: 82), B) Sekwencje nukleotydowe odpowiednio łańcuchów cięŝkich VH2 (SEQ ID NO.: 69), VH3 (SEQ ID NO.: 71), VH (SEQ ID NO.: 73) i VH7 (SEQ ID NO.: 7) oraz łańcuchów lekkich VL1 (SEQ ID NO.: 77), VL2 (SEQ ID NO.: 79) i VL3 (SEQ ID NO.: 81), C) Sekwencje aminokwasowe CDR 1, 2 i 3 łańcuchów cięŝkich niedeimmunizowanego przeciw-cd3 (odpowiednio SEQ ID NO.: 84, 90, 96), VH2 (odpowiednio SEQ ID NO.: 86, 94, 96), VH3 (odpowiednio SEQ ID NO.: 86, 94, 96), VH

67 (odpowiednio SEQ ID NO.: 88, 92, 96) oraz VH7 (odpowiednio SEQ ID NO.: 88, 90, 96) oraz łańcuchów lekkich nie-deimmunizowanego przeciw-cd3 (odpowiednio SEQ ID NO.: 98, 2, 4), łańcuchów VL1 (odpowiednio SEQ ID NO.: 0, 2, 4), VL2 (odpowiednio SEQ ID NO.: 0, 2, 4) oraz VL3 (odpowiednio SEQ ID NO.: 98, 2, 4) oraz D) Sekwencje nukleotydowe CDR 1, 2 i 3 łańcuchów cięŝkich niedeimmunizowanego przeciw-cd3 (odpowiednio SEQ ID NO.: 83, 89, 9), VH2 (odpowiednio SEQ ID NO.: 8, 93, 9), VH3 (odpowiednio SEQ ID NO.: 8, 93, 9), VH (odpowiednio SEQ ID NO.: 87, 91, 9) oraz VH7 (odpowiednio SEQ ID NO.: 87, 89, 9) oraz łańcuchów lekkich nie-deimmunizowanego przeciw-cd3 (odpowiednio SEQ ID NO.: 97, 1, 3), łańcuchów VL1 (odpowiednio SEQ ID NO.: 99, 1, 3), VL2 (odpowiednio SEQ ID NO.: 99, 1, 3) oraz VL3 (odpowiednio SEQ ID NO.: 97, 1, 3). Figura 3. A) Sekwencja nukleotydowa przeciw-cd3 (VH2/VL1) (SEQ ID NO.: 4) B) Sekwencja aminokwasowa przeciw-cd3 (VH2/VL1) (SEQ ID NO.: ) C) Sekwencja nukleotydowa przeciw-cd3 (VH2/VL2) (SEQ ID NO.: 6) D) Sekwencja aminokwasowa przeciw-cd3 (VH2/VL2) (SEQ ID NO.: 7) E) Sekwencja nukleotydowa przeciw- CD3 (VH2/VL3) (SEQ ID NO.: 8) F) Sekwencja aminokwasowa przeciw-cd3 (VH2NL3) (SEQ ID NO.: 9). Figura 4. A) Sekwencja nukleotydowa przeciw-cd3 (VH3/VL1) (SEQ ID NO.: ) B) Sekwencja aminokwasowa przeciw-cd3 (VH3/VL1) (SEQ ID NO.: 11) C) Sekwencja nukleotydowa przeciw-cd3 (VH3/VL2) (SEQ ID NO.: 12) D) Sekwencja aminokwasowa przeciw-cd3 (VH3/VL2) (SEQ ID NO.: 13) E) Sekwencja nukleotydowa przeciw-cd3 (VH3/VL3) (SEQ ID NO.: 14) F) Sekwencja aminokwasowa przeciw-cd3 (VH3/VL3) (SEQ ID NO.: 1). Figura. A) Sekwencja nukleotydowa przeciw-cd3 (VH/VL1) (SEQ ID NO.: 16) B) Sekwencja aminokwasowa przeciw-cd3 (VH/VL1) (SEQ ID NO.: 17) C) Sekwencja nukleotydowa przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 18) D) Sekwencja aminokwasowa przeciw-cd3 (VHxVL2) (SEQ ID NO.: 1) E) Sekwencja nukleotydowa przeciw- CD3 (VH/VL3) (SEQ ID NO.: ) F) Sekwencja aminokwasowa przeciw-cd3 (VH/VL3) (SEQ ID NO.: 21). Figura 6. A) Sekwencja nukleotydowa przeciw-cd3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO.: 22) B) Sekwencja aminokwasowa przeciw-cd3 (VH7xVL1) (SEQ ID NO.: 23) C) Sekwencja nukleotydowa przeciw-cd3 (VH7/VL2) (SEQ ID NO.: 24) D) Sekwencja aminokwasowa przeciw-cd3 (VH7xVL2) (SEQ ID NO.: 2) E) Sekwencja nukleotydowa przeciw-cd3 (VH7/VL3) (SEQ ID NO.: 26) F) Sekwencja aminokwasowa przeciw-cd3

68 (VH7/VL3) (SEQ ID NO.: 27). Figura 7. Wiązanie bispecyficznych konstruktów przeciw-cd19 z róŝnymi deimmunizowanymi częściami przeciw-cd3: przeciw-cd3 (VH2/VL1) (SEQ ID NO.: 178), przeciw-cd3 (VH2/VL2) (SEQ ID NO.: 180), przeciw-cd3 (VH2/VL3) (SEQ ID NO.: 182), przeciw-cd3 (VH3/VL1) (SEQ ID NO.: 184), przeciw-cd3 (VH3/VL2) (SEQ ID NO.: 186), przeciw-cd3 (VH3/VL3) (SEQ ID NO.: 188), przeciw-cd3 (VH/VL1) (SEQ ID NO.: 190), przeciw-cd3 (VH/VK2) (SEQ ID NO.: 192), przeciw-cd3 (VH/VL3) (SEQ ID NO.: 194), przeciw-cd3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO.: 196), przeciw-cd3 (VH7/VL2) (SEQ ID NO.: 198), przeciw-cd3 (VH7/VL3) (SEQ ID NO.: 0) A) CD3 oraz B) CD19. Wiązanie zmierzono z zastosowaniem testu opartego na FACS z zastosowaniem PMBC wzbogaconych w CD3 (A) lub CD19-pozytywnych komórek NALM (B). CD3 i drugorzędowe przeciwciało przeciw mysiej Ig znakowane FITC zastosowano jako kontrolę negatywną w (A) oraz CD19 i drugorzędowe przeciwciało przeciw mysiej Ig znakowane FITC zastosowano jako kontrolę negatywną w (B). Konstrukty przeciw-cd19 x przeciw-cd3 i przeciw-epcam (M79) x przeciw-cd3 zastosowano jako kontrole. MFI oznacza średnią intensywność fluorescencji. Figura 8: Reprezentatywny układ wymywania frakcji białkowej deimmunizowanego wariantu przeciw-cd19 x przeciw-cd3 z kolumny HCIC przy 280 nm. Dolna linia pokazująca główny pik przy 700 ml wskazuje teoretyczny gradient buforu wymywającego zawierającego mm octan, ph 3,. Wysoka adsorpcja przy 280 nm była spowodowana białkami nie związanymi we frakcji, która przepłynęła przez kolumnę. Strzałka przy 8,98 ml wskazuje wymytą frakcję deimmunizowanego przeciw-cd3. Figura 9: Reprezentatywny układ wymywania frakcji białkowej deimmunizowanego wariantu przeciw-cd19 x przeciw-cd3 z kolumny Ni-Chelating His Trap przy 280 nm. Dolna linia pokazująca pierwszy pik przy 8 ml oraz długi główny pik przy 90 ml wskazuje teoretyczny gradient buforu wymywającego (linia kropkowana). Strzałka przy 93,16 ml wskazuje wymytą frakcję białkową zawierającą konstrukt przeciw-cd19 x przeciw-cd3. Figura : Reprezentatywny układ wymywania białka z kolumny do filtracji Ŝelowej Sephadex S0. Frakcje zebrano od czasu retencji ml. Pik białka przy 80,44 ml odpowiada MW około 2 kd oraz zawiera deimmunizowany konstrukt przeciw-cd19 x przeciw-cd3. Figura 11: A) Analiza SDS-PAGE frakcji białkowych deimmunizowanych wariantów przeciw-cd19 x przeciw-cd3. ŚcieŜka M: Znacznik masy cząsteczkowej; ŚcieŜka 1: przepływ przez kolumnę HClC; ścieŝka 2: supernatant hodowli komórkowej; ścieŝka 3:

69 eluat HClC; ścieŝka 4: przepływ przez kolumnę IMAC; ścieŝka : przemycie IMAC; ścieŝka 6: eluat IMAC; ścieŝka 7: eluat z filtracji Ŝelowej; B) analiza Western blot oczyszczonych frakcji białkowych deimmunizowanych wariantów przeciw-cd19 x przeciw-cd3. Analizę Western blot oczyszczonego bispecyficznego białka przeprowadzono z przeciwciałami skierowanymi przeciw znacznikowi His (PentaHis, Qiagen) oraz kozim przeciwciałem przeciw-mysiej-ig znakowanym fosfatazą zasadową. ŚcieŜka M: Znacznik masy cząsteczkowej; ŚcieŜka 1: przepływ przez kolumnę HClC; ścieŝka 2: supernatant hodowli komórkowej; ścieŝka 3: eluat HClC; ścieŝka 4: przepływ przez kolumnę IMAC; ścieŝka : przemycie IMAC; ścieŝka 6: eluat IMAC; ścieŝka 7: eluat z filtracji Ŝelowej; Figura 12. Wiązanie oczyszczonych konstruktów bispecyficznych przeciw-cd19 z róŝnymi deimmunizowanymi częściami przeciw-cd3: przeciw-cd3 (VH/VL1) (SEQ ID NO.: 190), przeciw-cd3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO.: 196), przeciw-cd3 (VH7/VL2) (SEQ ID NO.: 198) i przeciw-cd3 (VH7/VL3) (SEQ ID NO.: 0) z A) CD3 oraz B) CD19 w porównaniu z konstruktem przeciw-cd19 x przeciw-cd3 typu dzikiego. Wiązanie zmierzono z zastosowaniem testu opartego na FACS stosując PBMC wzbogacone w CD3 (A) lub CD19-pozytywne komórki NALM (B). Przeciwciało drugorzędowe z komórkami CD3-pozytywnymi zastosowano jako kontrolę negatywną w (A) oraz przeciwciało drugorzędowe z komórkami CD19-pozytywnymi zastosowano jako kontrolę negatywną w (B). Konstrukty przeciw-cd19 x przeciw-cd3 oraz przeciw-epcam (M79) x przeciw-cd3 zastosowano jako kontrole. Test przeprowadzono ze stęŝeniami 1 µg/ml i µg/ml. MFI oznacza średnią intensywność fluorescencji. Figura 13. Test cytotoksyczności konstruktów bispecyficznych przeciw-cd19 z róŝnymi deimmunizowanymi częściami przeciw-cd3: przeciw-cd3 (VH/VL1) (SEQ ID NO.: 190), przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 192), przeciw-cd3 (VH/VL3) (SEQ ID NO.: 194), przeciw-cd3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO.: 196), przeciw-cd3 (VH7/VL2) (SEQ ID NO.: 198) oraz przeciw-cd3 (VH7/VK3) (SEQ ID NO.: 0) w porównaniu z kontrolą. Figura 14. Porównanie sekwencji części zmiennej łańcucha cięŝkiego niedeimmunizowanego przeciwciała przeciw-cd3, VH (SEQ ID NO.: 74), VH7 (SEQ ID NO.: 76), VH2 (SEQ ID NO.: 70) i VH3 (SEQ ID NO.: 72). Przedstawiono region zrębowy 1 (FR1), region determinujący dopasowanie 1 (CDR1), region zrębowy 1 (FR1), region determinujący dopasowanie 2 (CDR2), region zrębowy 3 (FR3), region determinujący dopasowanie 3 (CDR3) oraz region zrębowy 4 (FR4). Sekwencje LAR i VKK w FR1, sekwencje ASGYTF i ASGYTA w regionie przejściowym pomiędzy regionem

70 zrębowym 1 a regionem CDR1 oraz sekwencje LTTDK, ITTDK i MTTDT w FR3 i sekwencje MQLS, MELS i LQMN w FR3 obwiedziono ramką. Porównanie przeprowadzono z zastosowaniem programu AlingnX z Vector NTI Advance (Informax, Inc., USA). Figura 1. Analiza wiązania konstruktów bispecyficznych przeciw-epcam z róŝnymi deimmunizowanymi częściami przeciw-cd3: przeciw-cd3 (VH/VL2)x- (SEQ ID NO.: 37) (A), deimmunizowane przeciw-cd3 (VH/VL2)x4-7 (SEQ ID NO.: 33), (B) deimmunizowane przeciw-cd3 (VH/VL2)x3-1 (SEQ ID NO.: 31) (C), deimmunizowane przeciw-cd3 (VH/VL2)x4-7 (VL-VH) (SEQ ID NO.: 3) (D) oraz deimmunizowane przeciw-cd3 (VH/VL2)x- (VL-VH) (SEQ ID NO.: 39) (E) w CD3- pozytywnych komórkach Jurkat oraz EpCAM-pozytywnych komórkach Kato III z zastosowaniem testu opartego na FACS. Przesunięcie w prawo oznacza wiązanie. W komórkach Jurkat kropkowana linia wskazuje przesunięcie kontroli negatywnej (tylko przeciwciało drugorzędowe), kreskowana linia przedstawia wiązanie kontrolnego przeciwciała przeciw-epcam-przeciw-cd3, wytłuszczona linia przedstawia interesujący konstrukt bispecyficzny. W teście wiązania z zastosowaniem EpCAM-pozytywnych komórek Kato III jako kontrole pozytywną zamiast przeciwciała monoklonalnego przeciw CD3 zastosowano przeciwciało monoklonalne przeciw EpCAM. Figura 16. Analiza wiązania konstruktów bispecyficznych przeciw-epcam z róŝnymi deimmunizowanymi częściami przeciw-cd3: 3-1 x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 49) (A) oraz - x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 63) (B) w CD3- pozytywnych komórkach Jurkat oraz w EpCAM-pozytywnych komórkach Kato z zastosowaniem testu opartego na FACS. Przesunięcie w prawo oznacza wiązanie. Figura 17. Test cytotoksyczności konstruktów EpCAM z deimmunizowanymi częściami przeciw-cd3 (di-przeciw-cd3) w N-końcowej pozycji przeciw-cd3 (VH/VL2) x 3-1 (SEQ ID NO.: 31), przeciw-cd3 (VH/VL2) x - (SEQ ID NO.: 37) oraz przeciw-cd3 (VH/VL2) x 4-7 (SEQ ID NO.: 33) w porównaniu z odpowiednimi konstruktami nie-deimmunizowanymi. Zastosowano klon komórek T CB1 oraz komórki CHO-EpCAM w proporcji E:T :1. Komórki CHO-EpCAM wybarwiono barwnikiem PKH26 oraz komórki zliczono po inkubacji z bispecyficznym jednołańcuchowym przeciwciałem z zastosowaniem analizy FACS. Figura 18. Test cytotoksyczności konstruktów EpCAM z deimmunizowanymi częściami przeciw-cd3 w C-końcowej pozycji 3-1 x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 49) i - x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 63) w porównaniu z odpowiednimi konstruktami nie-deimmunizowanymi typu dzikiego. Test cytotoksyczności

71 przeprowadzono identycznie jak dla Fig. 17. [012] PoniŜsze przykłady ilustrują wynalazek: W poniŝszych przykładach pewną liczbę jednołańcuchowych przeciwciał przeciw ludzkiemu CD3 zmodyfikowano tak, aby wykazywały obniŝoną immunogenność w organizmie człowieka. RóŜne deimmunizowane przeciwciała przeciw-ludzkiemu CD3 zawierają 12 połączeń 4 róŝnych VH (VH2 (SEQ ID NO.: 69, 70), VH3 (SEQ ID NO.: 71, 72), VH (SEQ ID NO.: 73, 74) i VH7 (SEQ ID NO.: 7, 76)) oraz 3 róŝnych regionów VL (VL1 (SEQ ID NO.: 77, 78), VL2 (SEQ ID NO.: 79, 80) i VL3 (SEQ ID NO.: 81, 82)) połączonych ze sobą. Sekwencje aminokwasowe i kwasu nukleinowego wspomnianych powyŝej regionów VH i VL przedstawiono na Fig Przykładowo, deimmunizowane jednołańcuchowe przeciwciała przeciw-cd3 połączono z jednołańcuchowym przeciwciałem przeciw-cd19 lub z jednołańcuchowym przeciwciałem przeciw- EpCAM w celu wytworzenia produktu bispecyficznego. Przykład 1. Klonowanie i ekspresja deimmunizowanych konstruktów przeciw-cd3 1.1.Przeniesienie cdna kodującego jednołańcuchowe przeciwciało [013] DNA kodujący jednołańcuchowe przeciwciało przeciw-cd3, które zdeimmunizowano, nazwano tutaj kasetą przeciw-cd3. Ta kaseta przeciw-cd3 zawiera łącznik SGGGGS (SEQ ID NO.: 176), region VH przeciw-cd3 (SEQ ID NO.: 1), 14- aminokwasowy łącznik GS (łącznik VEGGSGGSGGSGGSGGVD (SEQ ID NO.: 68)) oraz region łańcuchów VL przeciw-cd3 (SEQ ID NO.: 112), a następnie 6 reszt histydyny. Wspomniany powyŝej DNA wklonowano do wektora p-pcr-script-amp SK(+) (Stratagene) w miejsce Srf1. Sekwencje DNA i aminokwasową kasety przeciw-cd3 przedstawiono w SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 2 i na Fig Analiza komputerowa sekwencji immunogennych epitopów dla komórek T oraz zaprojektowanie sekwencji deimmunizowanego jednołańcuchowego przeciwciała [014] Sekwencję aminokwasową kasety przeciw-cd3 (SEQ ID NO.: 2) analizowano z uŝyciem programu do przewlekania (ang. threading ) peptydów w celu zidentyfikowania potencjalnych epitopów dla komórek T z uŝyciem metody opisanej w WO 98/2976. SEQ ID NO.: 3 przedstawia deimmunizowaną sekwencję łącznikową, a SEQ ID NO.: 68 przedstawia wyjściową sekwencje łącznikową. 1.3 Konstrukcja deimmunizowanych sekwencji jednołańcuchowego przeciwciała [01] Deimmunizowane wersje kasety przeciw-cd3 skonstruowano przez zastosowanie metody rekombinacji z nachodzącymi na siebie fragmentami PCR. Kasetę przeciw-cd3 (SEQ ID NO.: 1, 2) w ppcr-s-amp SK+ zastosowano jako matrycę do mutagenezy do wymaganych sekwencji deimmunizowanych. Zsyntetyzowano zestawy mutagennych par

72 71 starterów obejmujących regiony, które miały być zmienione. Wytworzone deimmunizowane sekwencje, zawierające 4 róŝne VH i 3 róŝne regiony VL, wklonowano jako fragmenty Not1 do Hind111 do wektora ppcr-s-amp SK+ oraz potwierdzono prawidłowość całej sekwencji DNA. 4 róŝne regiony VH i 3 róŝne regiony VK połączono we wszystkich kombinacjach (całkowita liczba 12), metodą PCR lub z uŝyciem unikalnego miejsca BstE11 wprowadzonego na 3'-końcu regionu VH. Potwierdzono prawidłowość całej sekwencji DNA kaŝdej kombinacji. RóŜne deimmunizowane regiony VH (SEQ ID NO.: 70, 72, 74 i 76) oraz regiony VL (SEQ ID NO.: 78, 80 i 82) z odpowiadającymi im wyjściowymi sekwencjami nie-deimmunizowanymi (VH:SEQ ID NO.: 1; VL:SEQ ID NO.: 112) konstruktów przeciw-cd3 podsumowano w Tabeli 9. Aminokwasowa Deimmunizowany VH2 Deimmunizowany VH3 Deimmunizowany VH Deimmunizowany VH7 VH niedeimmunizowanego CD3 VH niedeimmunizowanego CD3 z mutacją Cys Ser Deimmunizowany VL1 Tabela 9. SEQ ID NO.: deimmunizowanych regionów VH i VL SEQ ID NO.: SEQ ID NO.: CDR1 SEQ ID NO.: CDR2 SEQ ID NO.: CDR Kwasu nukleinowego Aminokwasowa nukle- Kwasu inowego Aminokwasowa nukle- Kwasu inowego Aminokwasowa nukle- Kwasu inowego

73 Aminokwasowa Deimmunizowany VL2 Deimmunizowany VL3 VL niedeimmunizowanego CD3 SEQ ID NO.: 72 SEQ ID NO.: CDR1 SEQ ID NO.: CDR2 SEQ ID NO.: CDR Kwasu nukleinowego Aminokwasowa nukle- Kwasu inowego Aminokwasowa nukle- Kwasu inowego Aminokwasowa nukle- Kwasu inowego Przeniesienie deimmunizowanych genów jednołańcuchowego przeciwciała do wektora ekspresyjnego [016] Deimmunizowane kasety przeciw-cd3 wycięto z ppcr-s-amp-sk+ z uŝyciem BspE1 i Sal1 i wklonowano do wektora ekspresyjnego pef zawierającegovl CD19 -VH CD19 - VH CD3 -VL CD3. Część CD3 wektora pef-dhfr zastąpiono kaŝdą z deimmunizowanych kaset przeciw-cd3 od miejsca BspE1 do miejsca Sal1, w wyniku czego otrzymano 12 poniŝszych konstruktów: pef przeciw-cd19 x przeciw-cd3 (VH2/VL1) (SEQ ID NO.: 177, 178) pef przeciw-cd19 x przeciw-cd3 (VH2/VL2) (SEQ ID NO.: 179, 180) pef przeciw-cd19 x przeciw-cd3 (VH2/VL3) (SEQ ID NO.: 181, 182) pef przeciw-cd19 x przeciw-cd3 (VH3/VL1) (SEQ ID NO.: 183, 184) pef przeciw-cd19 x przeciw-cd3 (VH3/VL2) (SEQ ID NO.: 18, 186) pef przeciw-cd19 x przeciw-cd3 (VH3/VL3) (SEQ ID NO.: 187, 188) pef przeciw-cd19 x przeciw-cd3 (VH/VL1) (SEQ ID NO.: 189, 190) pef przeciw-cd19 x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 191, 192) pef przeciw-cd19 x przeciw-cd3 (VH/VL3) (SEQ ID NO.: 193, 194) pef przeciw-cd19 x przeciw-cd3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO.: 19, 196) pef przeciw-cd19 x przeciw-cd3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO.: 197, 198) pef przeciw-cd19 x przeciw-cd3 (VH7NL3) (SEQ ID NO.: 199, 0). [017] Konstrukty ponadto zawierają sekwencję liderową łańcucha cięŝkiego mysiej IgG w celu umoŝliwienia wydzielania białka. Sekwencje DNA deimmunizowanych kaset przeciw-cd3 w wektorze ekspresyjnym potwierdzono z uŝyciem starterów do sekencjonowania (SEQ ID NO.: 28 i 29). Sekwencje DNA i aminokwasowe 12 deimmunizowanych ka-

74 set przeciw-cd3 w wektorze pef od miejsca BspE1 do miejsca Sal1 przedstawiono w SEQ ID NO.: Wytwarzanie konstruktów przeciwciał [018] Po transformacji wektora do E. coli K12 przygotowano DNA róŝnych wektorów ekspresyjnych o jakości nadającej się do transfekcji. Wydzielane białka wytworzono w komórkach CHO-dhfr-. W celu przejściowego wytwarzania supernatanty z hodowli komórkowych zebrano 2 dni po transfekcji, w celu wytworzenia komórek stabilnie transfekowanych, komórki umieszczono w podłoŝu selekcyjnym dwa dni po transfekcji. Po pięciu pasaŝach uzyskano stabilne pule. Następnie, pojedyncze klony zidentyfikowano z zastosowaniem ograniczających rozcieńczeń. Aby ułatwić proces oczyszczania komórki adaptowano do podłoŝa wolnego od surowicy. Konstrukty przeciwciał oczyszczono z około 1 litra supernatantu. [019] Poziomy wytarzania zbadano metodą ELISA. Nie zaobserwowano większych róŝnic w poziomach wydzielanych przeciwciał pomiędzy róŝnymi konstruktami obejmującymi konstrukty przeciw-cd19 i deimmunizowane przeciw-cd3. Przykład 2: Testy wiązania [0160] W celu zbadania wydajności wiązania deimmunizowanych konstruktów z CD3 i CD19 przeprowadzono test oparty na FACS. Początkowo surowe supernatanty zbadano pod względem wiązania na PBMC wzbogaconych w CD3 lub CD19-pozytywnych komórkach NALM-6. Komórki inkubowano z nie rozcieńczonymi supernatantami przez 30 minut w 8 C. Po dwóch etapach płukania komórki wyznakowano przeciwciałem przeciw-his (Qiagen) w tych samych warunkach. Po kolejnych etapach płukania wiązanie konstruktów wykryto z uŝyciem sprzęŝonego z FITC owczego przeciwciała przeciw-mysiego (Sigma). Komórki analizowano z uŝyciem cytometru FACS Caliber (B&D). Jako kontrole włączono supernatanty przeciw-cd19 x przeciw-cd3 i komórki transfekowane GFP. CD3 i drugorzędowe przeciwciało zastosowano jako kontrolę negatywną i wykazały one średnią intensywność fluorescencji (MFI) ok. 3,. Dla konstruktów przeciw-cd19 x przeciw-cd3 zawierających przeciw-cd3 (VH/VL1) (SEQ ID NO.: 190), przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 192), przeciw-cd3 (VH/VL3) (SEQ ID NO.: 194), przeciw-cd3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO.: 196), przeciw-cd3 (VH7NL2) (SEQ ID NO.: 198) i przeciw- CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NO.: 0) uzyskano MFI co najmniej 90, a zatem wiązały one około 2-krotnie silniej. Dla kontroli pozytywnej, którą był nie-deimmunizowany konstrukt przeciw-cd19 x przeciw-cd3 uzyskano MFI około 60, co pokazuje, Ŝe deimmunizowane konstrukty zawierające przeciw-cd3 (VH/VL1) (SEQ ID NO.: 190), przeciw- CD3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 192), przeciw-cd3 (VH/VL3) (SEQ ID NO.: 194), prze-

75 ciw-cd3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO.: 196), przeciw-cd3 (VH7/VL2) (SEQ ID NO.: 198) i przeciw-cd3 (VH7/VL3) (SEQ ID NO.: 0) wiąŝą CD3 z wyjątkowo wysoką wydajnością. W drugim doświadczeniu poniŝsze konstrukty zawierające przeciw-cd19 i przeciw- CD3: przeciw-cd3 (VH2/VL1) (SEQ ID NO.: 178), przeciw-cd3 (VH2NL2) (SEQ ID NO.: 180), przeciw-cd3 (VH2/VL3) (SEQ ID NO.: 182, przeciw-cd3 (VH3/VL1) (SEQ ID NO.: 184), przeciw-cd3 (VH3NL2) (SEQ ID NO.: 186) i przeciw-cd3 (VH3NL3) (SEQ ID NO.: 188) wykazywały podobne wiązanie jak kontrola negatywna (MFI ok. 6). [0161] Oparty na FACS test wiązania przeprowadzono takŝe dla CD19. W tym doświadczeniu CD19 i drugorzędowe przeciwciało słuŝyły za kontrolę negatywną. W tym doświadczeniu dla wszystkich zbadanych konstruktów uzyskano MFI co najmniej 80, podczas gdy MFI dla kontroli negatywnej wynosiła ok. 3. [0162] Zatem konstrukty zawierające przeciw-cd3 (VH/VL1) (SEQ ID NO.: 190), przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 192), przeciw-cd3 (VH/VL3) (SEQ ID NO.: 194), przeciw-cd3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO.: 196), przeciw-cd3 (VH7/VL2) (SEQ ID NO.: 198) i przeciw-cd3 (VH7NL3) (SEQ ID NO.: 0) okazały się wiązać CD3 i CD19 tak, jak nie zmodyfikowany przeciw-cd19 x przeciw-cd3 (SEQ ID NO.: 4). JednakŜe konstrukty przeciw-cd3 (VH2/VL1) (SEQ ID NO.: 178), przeciw-cd3 (VH2NL2) (SEQ ID NO.: 180), przeciw-cd3 (VH2NL3) (SEQ ID NO.: 182), przeciw-cd3 (VH3/VL1) (SEQ ID NO.: 184), przeciw-cd3 (VH3NL2) (SEQ ID NO.: 186), przeciw-cd3 (VH3NL3) (SEQ ID NO.: 188) całkowicie straciły zdolność wiązania przeciw-cd3, podczas gdy wiązanie CD19 było całkowicie zachowane (Figura 7). [0163] Zatem wykazano, Ŝe deimmunizowane łańcuchy cięŝkie zdominowały specyficzność i siłę wiązania. W związku z tym konstrukty przeciw-cd3 z grupami VH i VH7 oczyszczono i analizowano pod względem aktywności cytotoksycznej. Przykład 3. Ekspresja i oczyszczanie wariantów wykazujących wysokie powinowactwo wiązania [0164] Deimmunizowane białka przeciw-cd19 x przeciw-cd3, przeciw-cd3 (VH/VL1) (SEQ ID NO.: 190), przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 192), przeciw-cd3 (VH/VL3) (SEQ ID NO.: 194), przeciw-cd3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO.: 196), przeciw- CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID NO.: 198) i przeciw-cd3 (VH7/VL3) (SEQ ID NO.: 0) eksprymowano w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO). [016] W celu oczyszczenia bispecyficznych jednołańcuchowych konstruktów zawierających deimmunizowaną część przeciw-cd3, komórki CHO-CD19 hodowano w butelkach do wytrząsarki obrotowej z podłoŝem DMEM w modyfikacji HiClone CHO (HiQ) przez 7 dni przed zebraniem. Komórki usunięto przez odwirowanie i supernatant, zawierający

76 eksprymowane białko, przechowywano w - C. [0166] Do chromatografii zastosowano Äkta FPLC System (Pharmacia) i Unicorn Software. Wszystkie odczynniki były jakości analitycznej i zakupiono je z Sigma (Deisenhofen) lub Merck (Darmstadt). [0167] Chromatografię hydrofobową z indukowaniem ładunku przeprowadzono na ośrodku MEP Hypercel wprowadzonym do kolumny XK16/60 (Pharmacia), którą zrównowa- Ŝono buforem A1 ( mm Tris ph 7,2). 00 ml supernatantu z hodowli komórkowej naniesiono na kolumnę ( ml) przy natęŝeniu przepływu 3 ml/min. Nie związaną próbkę wymyto buforem A1, a związane białko wyeluowano 0% buforem B1 ( mm octan ph 3,). Wyeluowane frakcje białkowe połączono do dalszego oczyszczania. [0168] IMAC przeprowadzono z uŝyciem kolumny HisTrap (Pharmacia), do której wprowadzono NiSO 4 zgodnie z protokołem producenta. Kolumnę zrównowaŝono buforem A2 ( mm NaP ph 7,, 0,4 M NaCl) i próbkę rozcieńczono 2:1 w buforze A2 do uzyskania ph 7. Próbkę naniesiono na kolumnę (2 ml) przy natęŝeniu przepływu 1 ml/min i kolumnę przemyto buforem A2 w celu usunięcia nie związanej próbki. Związane białko wyeluowano z zastosowaniem 2-stopniowego gradientu buforu B2 ( mm NaP ph 7,, 0,4 M NaCl, 0, M Imidazol) Etap 1: % buforu B2 w objętościach kolumny; Etap 2: 0% buforu B2 w objętościach kolumny. Wyeluowane frakcje białkowe połączono do dalszego oczyszczania. [0169] Chromatografię z filtracją na Ŝelu przeprowadzono na kolumnie Sephadex S0 HiPrep (Pharmacia) zrównowaŝonej PBS (Gibco). Wyeluowane próbki białka (natęŝenie przepływu 1 ml/min) poddano SDS-PAGE i Western Blot w celu wykrywania (Fig. 11). Kolumnę wcześniej kalibrowano do wyznaczania masy cząsteczkowej (zestaw znaczników masy cząsteczkowej, Sigma MW GF-0). [0170] Deimmunizowane warianty białka przeciw-cd19 x przeciw-cd3 izolowano z zastosowaniem procesu trójetapowego oczyszczania obejmującego chromatografię hydrofobową z indukowaniem ładunku (HCIC) (Figura 8), chromatografię powinowactwa do unieruchomionych jonów metalu (IMAC) (Figura 9) oraz filtrację Ŝelową (Figura ). Bispecyficzny konstrukt miał masę cząsteczkową 2 kda w warunkach natywnych, co wyznaczono metodą filtracji Ŝelowej w PBS. [0171] Oczyszczone bispecyficzne białko analizowano metodą SDS-PAGE w warunkach redukujących stosując gotowe Ŝele 4-12% Bis-Tris (Invitrogen). Przygotowanie i naniesienie próbki przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta. Masę cząsteczkową wyznaczono z zastosowaniem wzorca białkowego MultiMark (Invitrogen). śel wybarwiono koloidalnym Coomassie (protokół Invitrogen). Czystość wyizolowanego białka wynosiła

77 76 >9% (Fig. 11 a), a cząsteczka miała wielkość 2 kd. [0172] Ponadto, deimmunizowane warianty białka przeciw-cd19 x przeciw-cd3 specyficznie wykrywano metodą Western Blot. Western Blot przeprowadzono z uŝyciem membrany Optitran BA-S83 oraz Invitrogen Blot Module zgodnie z protokołem producenta. Zastosowanymi przeciwciałami były Penta His (Quiagen) oraz kozie-przeciw-mysiej-ig wyznakowane fosfatazą zasadową (AP) (Sigma), roztworem do wybarwiania był płyn BCIP/NBT (Sigma). Wykazano, Ŝe główny sygnał odpowiadał głównemu prąŝkowi na SDS-PAGE przy 2kD (Figura 11 b). [0173] StęŜenia białek wyznaczono z uŝyciem barwnika do badania białka (MicroBCA, Pierce) i IgG (Biorad) jako wzorca białkowego. Podsumowanie ostatecznych wydajności oczyszczania wariantów białkowych podano w Tabeli pokazującej wysoką zdolność wytwarzania wszystkich konstruktów oraz bardzo dobrą wydajność konstruktu przeciw- CD3 (VH/VL1) (SEQ ID NO.: 190) wynoszącą 924,8 µg. 1 Tabela. Wydajności białka deimmunizowanych konstruktów przeciw-cd19- przeciw-cd3 Deimmunizowany konstrukt CD3 Wydajność [µg/supernatant] CD19 x przeciw-cd3 (VH/ VL1) (SEQ ID NO.: 190) 924,8 CD19 x przeciw-cd3 (VH/ VL2) (SEQ ID NO.: 192) 446,7 CD19 x przeciw-cd3 (VH/ VL3) (SEQ ID NO.: 194) 218,4 CD19 x przeciw-cd3 (VH7/ VL1) (SEQ ID NO.: 196) 268, CD19 x przeciw-cd3 (VH7/VL2) (SEQ ID NO.: 198) 3,4 CD19 x przeciw-cd3 (VH7/VL3) (SEQ ID NO.: 0) 477,3 [0174] Zdolność wytwarzania konstruktów CD19 x przeciw-cd3 (VH/ VL2) i CD19 x przeciw-cd3 (VH7/VL2) porównano z odpowiadającymi im nie-deimmunizowanymi konstruktami. Wyniki przedstawiono w Tabeli 11. Tabela 11. Wydajności deimmunizowanego bispecyficznego konstruktu w porównaniu z odpowiadającym mu nie-deimmunizowanym konstruktem Konstrukt Wydajność (µg/l) CD19 x przeciw-cd3 62 CD19 x przeciw-cd3 (VHNL2) 4 CD19 x przeciw-cd3 (VH7/VL2) 3 [017] Tabela 11 wyraźnie pokazuje, Ŝe zdolność wytwarzania bispecyficznych konstruk-

78 tów zawierających deimmunizowaną domenę wiąŝącą CD3 była znacznie wyŝsza (co najmniej trzykrotnie) niŝ odpowiadającego im nie-deimmunizowanego konstruktu. Przykład 4. Oparte na FACS testy wiązania konstruktów przeciw-cd3 [0176] Wiązanie wybranych oczyszczonych konstruktów przeciwciał zawierających przeciw-cd19 i przeciw-cd3 wykryto w sposób opisany powyŝej w Przykładzie 2 w róŝnych stęŝeniach. W teście wiązania CD3 w kontroli negatywnej dla przeciwciała drugorzędowego (przeciw-his, sprzęŝone z FITC), które inkubowano z komórkami CD3-pozytywnymi uzyskano MFI około 2,, a w kontroli pozytywnej dla deimmunizowanego bispecyficznego jednołańcuchowego przeciwciała przeciw-cd19 x przeciw-cd3 około 70 przy stęŝeniu 1 µg/ml oraz 0 przy stęŝeniu µg/ml (Figura 12A). Przy stęŝeniu 1 µg/ml dla deimmunizowanych bispecyficznych przeciwciał przeciw-cd3 (VH/VL1) (SEQ ID NO.: 190), przeciw-cd3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO.: 196), przeciw-cd3 (VH7/VL2) (SEQ ID NO.: 198) i przeciw-cd3 (VH7/VL3) (SEQ ID NO.: 0) uzyskano wartości MFI -; przy czym dla przeciw-cd3 (VH/VL1) (SEQ ID NO.: 190) uzyskano najwyŝszą wartość (). Przy stęŝeniu µg/ml przeciw-cd3 (VH7/VL2) (SEQ ID NO.: 198) uzyskano MFI 2, podczas gdy dla przeciw-cd3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO.: 196), przeciw-cd3 (VH7/VL3) (SEQ ID NO.: 0) i przeciw-cd3 (VH/VL1) (SEQ ID NO.: 190) uzyskano MFI co najmniej 40, co oznacza, Ŝe wykazują one taką samą skuteczność wiązania jak niedeimmunizowana kontrola pozytywna. Przy stęŝeniu µg/ml silnie wiąŝące się konstrukty z deimmunizowaną częścią przeciw-cd3 VH/VL1 (SEQ ID NO.: 190), VH7/VL1 (SEQ ID NO.: 196), VH7/VL2 (SEQ ID NO.: 198), VH7/VL3 (SEQ ID NO.: 0) wiązały CD3 równie dobrze jak nie-deimmunizowany przeciw-cd19 x przeciw-cd3 (SEQ ID NO.: 4). [0177] Wszystkie konstrukty przeciwciał wiązały CD19 z wysoką skutecznością, która wynosiła około 0 MFI, podczas gdy dla nie-deimmunizowanego konstruktu przeciw- CD19 x przeciw-cd3 (SEQ ID NO.: 4) uzyskano MFI 80. Nie zaobserwowano róŝnic w wiązaniu CD19 w badanych stęŝeniach dla róŝnych konstruktów (Figura 12B). Przykład. Testy cytotoksyczności [0178] Przeciw-CD19 x przeciw-cd3 pośredniczy w cytotoksyczności zaleŝnej od komórek T względem CD19-pozytywnych komórek docelowych. Analizowano to in vitro w celu wyznaczenia biologicznej siły działania przeciw-cd19 x przeciw-cd3. [0179] W tym celu fluorescencyjnie znakowane CD19-pozytywne komórki docelowe NALM-6 inkubowano z PBMC wyizolowanymi od losowych dawców lub komórkami T CB1 (standaryzowana linia komórek T) jako komórkami efektorowymi w obecności przeciw-cd19 x przeciw-cd3. Po inkubacji przez 4 h w 37 C w inkubatorze z nawilŝa-

79 78 niem uwalnianie barwnika fluorescencyjnego z komórek docelowych do supernatantu wyznaczono z uŝyciem spektrofluorymetru. Komórki docelowe inkubowane bez przeciw- CD19 x przeciw-cd3 i komórki docelowe zlizowane całkowicie przez dodanie saponiny pod koniec inkubacji słuŝyły jako kontrole odpowiednio negatywna i pozytywna. Specyficzną cytotoksyczność pośredniczoną w pewnym stęŝeniu przeciw-cd19 x przeciw-cd3 moŝna obliczyć z następującego wzoru: RFU (próbki) -Średnia RFU (kontroli) Specyficzn a Cytotoksyczność [%] = 0 Średnia RFU (całkowita liza) -Średnia RFU (kontroli) [0180] Odpowiedź na dawkę analizowano od 0,4 pg/ml przeciw-cd19 x przeciw-cd3 do 0 ng/ml przeciw-cd19 x przeciw-cd3 w celu określenia wartości EC0. Pomimo, Ŝe wartość EC0 opisuje biologiczną siłę działania przeciw-cd19 x przeciw-cd3, wartość absolutna znacznie się zmienia zaleŝnie od źródła komórek efektorowych. Zatem względną siłę działania oblicza się w porównaniu z materiałem odniesienia przeciw-cd19 x przeciw-cd3 według niniejszego wzoru: Względna siła działania = EC0 próbki EC0 odniesienia 1 [0181] Aktywności cytotoksyczne konstruktów zawierających przeciw-cd19 i deimmunizowany przeciw-cd3 przedstawiono na Figurze 13. Oczyszczone nie-deimmunizowane przeciw-cd19 x przeciw-cd3 zastosowano jako kontrolę. Wartości EC0 deimmunizowanych konstruktów były w zakresie 21,9-81,6 pg/ml, podczas gdy wartość EC0 dla niedeimmunizowanego konstruktu przeciw-cd19 x przeciw-cd3 wynosiła 22,7 pg/ml. Zatem dla wszystkich deimmunizowanych konstruktów uzyskano wartości EC0 porównywalne z cząsteczką nie-deimmunizowaną. Przykład 6. Test proliferacji komórek T [0182] Dwudziestu zdrowych dawców wybrano do przeszukiwania w testach z komórkami T opartych na typowaniu HLA-DR (Tabela 12). UmoŜliwiło to przeszukiwanie peptydów w teście z komórkami T względem ponad 80% alleli DR eksprymowanych w populacji na świecie.

80 79 Tabela 12: Haplotypy HLA DR zdrowych dawców stosowane do zbadania immunogenności peptydów uzyskanych z deimmunizowanych i nie-deimmunizowanych jednołańcuchowych przeciwciał (scab) przeciw-cd3. Allotyp HLA DR 1 DRB1*07, DRB1*1, DRB4*01, DRB 2 DRB1*03, DRB1*04, DRB3, DRB4*01 3 DRB1*04, DRB1*07 i DRB4*01 4 DRB1*07, DRB1*11, DRB4*01 DRB1*04, DRB1*07, DRB4*01 6 DRB1*01, DRB1*04, DRB4*01 7 DRB1*03, DRB1*07, DRB3, DRB4*01 8 DRB1*07, DRB1*11, DRB3, DRB4*01 9 DRB1*12, DRB1*1, DRB3, DRB DRB1*01, DRB1*09, DRB4*01 11 DRB1*03, DRB1*1, DRB3, DRB 12 DRB1*, DRB1*13, DRB3 13 DRB1*03, DRB1*1, DRB3, DRB 14 DRB1*04, DRb1*1, DRB4*01, DRB 1 DRB1*04, DRB1*13, DRB3, DRB4*01 16 DRB1*01, DRB1*13, DRB3 17 DRB1*01, DRB1*04, DRB4*01 18 DRB1*07, DRB1*13, DRB3, DRB4*01 19 DRB1*07, DRB1*16, DRB4*01, DRB DRB1*04, DRB1*1, DRB4*01, DRB 6.1 Test proliferacji komórek T [0183] Peptydy uzyskano z Pepscan (Holandia) o czystości wyŝszej niŝ 90%. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) od wybranych zdrowych dawców (Tabela 12) zastosowano do przeszukiwania poszczególnych peptydów w trzech powtórzeniach w studzienkach przy stęŝeniu 1 i µm. Do testu włączono dwa peptydy kontroli pozytywnej (C32 i C49) i hemocyjaninę skałoczepa (KLH). Po 7 dniach inkubacji komórek i peptydów zastosowano 18-godzinny impuls 3H-tymidyną przy 1µCi/studzienkę w celu oszacowania proliferacji komórek T. Dane te wyraŝono jako wskaźnik stymulacji, w którym: Wskaźnik stymulacji = CPM badanego peptydu / CPM nie traktowanej kontroli [0184] Epitop dla komórek T zdefiniowano jako peptyd dla którego uzyskuje się wskaźnik stymulacji (SI) wyŝszy niŝ 2. Wyniki dwóch niezaleŝnych prób wykazały, Ŝe z 22 pepty-

81 80 1 dów wiąŝących MHC w nie-deimmunizowanej sekwencji przeciw-cd3 miało zdolność do wywoływania proliferacji ludzkich komórek T (SI>2). W odróŝnieniu od tego Ŝadna z odpowiadających im cząsteczek deimmunizowanych nie wywoływała proliferacji komórek T. W Tabeli 13 podsumowano wyniki testu proliferacji komórek T przedstawiając średnie wartości SI z dwóch niezaleŝnych prób. [018] Dane takŝe pokazują działanie zaleŝne od stęŝenia w którym kaŝda z niedeimmunizowanych cząsteczek wiąŝących wykazywała SI > 2 tylko w jednym z dwóch stosowanych stęŝeń (1 µm lub µm). RóŜnica w odpowiedzi w róŝnych stęŝeniach jest wyjaśniona przez fakt, Ŝe poszczególne peptydy będą mieć optymalne stęŝenia w których będą wywoływać proliferację komórek T. JeŜeli to stęŝenie zostanie przekroczone proliferacja moŝe zmaleć (wyŝsze stęŝenia peptydów mogą mieć działanie hamujące na proliferację komórek T). Wyjaśnia to dlaczego, w niektórych przypadkach, proliferacja jest obserwowana w niŝszym stęŝeniu, ale nie w wyŝszym. Z doświadczenia proliferację komórek T będzie się obserwować w jednym lub dwóch stosowanych stęŝeniach peptydu jeŝeli peptyd zawiera epitop dla komórek T. Dane te wykazały, Ŝe deimmunizacja skutecznie usunęła epitopy dla komórek T z przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 19) i przeciw-cd3 (VH7/VL2) (SEQ ID NO.: 2). Fakt, Ŝe około 7% peptydów wiąŝących MHC z niedeimmunizowanej sekwencji przeciw-cd3 nie wywoływało proliferacji komórek T moŝna wyjaśnić przez tolerancję ludzkiego układu immunologicznego względem tych peptydów lub niezdolność repertuaru ludzkich komórek T do rozpoznania tych konkretnych peptydów. Tabela 13: Podsumowanie danych porównujących pozytywne (SI>2) mysie peptydy i odpowiadające im peptydy deimmunizowane. Nie-deimmunizowane Przeciw-CD3 Deimmunizowane Przeciw-CD3 Peptyd Allotyp StęŜenie Średni SI Średni SI Region (µm) 6-2,1 0, ,2 0,97 0, ,21 0,6 1, ,24 0,90

82 81 Nie-deimmunizowane Przeciw-CD3 Deimmunizowane Przeciw-CD3 Peptyd Allotyp StęŜenie Średni SI Średni SI Region (µm) 0, ,23 0,83 0, ,82 0, ,12 1,03 1 Przykład 7. Porównanie pod względem homologii przeciw-cd3 (VH), przeciw-cd3 (VH7), przeciw-cd3 (VH2) i przeciw-cd3 (VH3) z VH nie-deimmunizowanego przeciw-cd3 [0186] Region zmienny łańcucha cięŝkiego nie-deimmunizowanego przeciwciała CD3, VH (SEQ ID NO.: 74), VH7 (SEQ ID NO.: 76), VH2 (SEQ ID NO.: 70) i VH3 (SEQ ID NO.: 72) porównano z uŝyciem programu AlingnX Vector NTI Advance (Informax, Inc., USA). Zastosowany algorytm Clustal W opisano w Nucleic Acid Research, 22 (22): , Porównanie przedstawiono na Figurze 14. Z porównania moŝna zaobserwować, Ŝe regiony zmienne VH i VH7, które wykazują zaskakująco dobre wiązanie, mają sekwencję ASGYTF w regionie przejściowym pomiędzy regionem zrębowym 1 a CDR1. Ponadto, regiony VH nie wykazujące wiązania (VH2 (SEQ ID NO.: 70) i VH3 (SEQ ID NO.: 72)) zawierają sekwencję ASGYTA w regionie przejściowym pomiędzy regionem zrębowym 1 a CDR1. Zatem dla uzyskania konstruktu o obniŝonej zdolności do wytwarzania epitopów dla komórek T oraz wiąŝącego CD3, konstrukt musi zawierać sekwencję ASGYTF w regionie przejściowym pomiędzy regionem zrębowym 1 a CDR1. Nieoczekiwanie, regiony zmienne łańcucha cięŝkiego wiąŝące CD3 oraz wykazujące obniŝoną zdolność do wytwarzania epitopów dla komórek T zawierające wspomnianą powyŝej sekwencję ASGYTF wykazują dobre wiązanie. Przykład 8. Klonowanie konstruktów zawierających deimmunizowane przeciw-cd3 i przeciw-epcam [0187] W celu wykazania, Ŝe deimmunizowany polipeptyd przeciw-cd3 według wynalazku moŝe być częścią funkcjonalnego konstruktu z innymi cząsteczkami docelowymi wytworzono kilka bispecyficznych konstruktów zawierających deimmunizowane przeciw- CD3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 19) oraz róŝne jednołańcuchowe przeciwciała przeciw-

83 EpCAM (3-1 (SEQ ID NO.: 137, 139), 3- (SEQ ID NO.: 141, 143), 4-1 (SEQ ID NO.: 14, 147), 4-7 (SEQ ID NO.: 149, 11), - (SEQ ID NO.: 133, 13)). 8.1 Klonowanie cząsteczek wiąŝących EpCAM na C-końcu zawierających deimmunizowaną część przeciw-cd3 (SEQ ID NO.: 30, 31, 32, 33, 34, 3, 36, 37, 38 i 39) Amplifikacja deimmunizowanego przeciw-cd3 z konstruktu przeciw-cd19 x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 192) [0188] N-koniec deimmunizowanego przeciw-cd3 (VH/VL2) uzyskano metodą PCR z uŝyciem deimmunizowanych CD19 x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 192) jako matrycy oraz poniŝszych starterów (DI CD3-2 VH BsrGI AGGTGTACACTCCGA- CGTCCAACTGGTGCAGTCAG (SEQ ID NO.: 40), DI CD3-2 VL BspEI AATCC- GGATTTGATCTCCACCTTGGTCCCG (SEQ ID NO.: 41)) Klonowanie i ekspresja deimmunizowanych konstruktów przeciw-cd3 x przeciw-epcam w orientacji VH CD3 -VL CD3 x VH EpCAM -VL EpCAM [0189] Wspomniany powyŝej produkt PCR zawierający deimmunizowane przeciw-cd3 przecięto enzymami restrykcyjnymi BsrG1 i BspE1, a następnie wklonowano do wektora bluescript KS (Stratagene, La Jolla, CA), zawierającego sekwencję aminokwasową eukariotycznego sygnału wydzielniczego (peptyd liderowy) jako fragment EcoRI/BsrGI. Po strawieniu tego konstruktu EcoRI i BspEI powstały fragment DNA zawierający odpowiedni scfv przeciw-cd3 z peptydem liderowym wklonowano do strawionego EcoRI/BspEI plazmidu zawierającego scfv przeciw-epcam 3-1, 4-7 lub - w pozycji C-końcowej wektora pef-dhfr-. Po potwierdzeniu sekwencji kodującej bispecyficzny pojedynczy łańcuch przez sekwencjonowanie (Sequiserve, Vaterstetten) plazmid transfekowano do komórek CHO z deficytem DHFR w celu ekspresji eukariotycznej. Ekspresję eukariotycznych białek w komórkach CHO z deficytem DHFR przeprowadzono w sposób opisany w Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 18, 37-66) Klonowanie i ekspresja deimmunizowanych konstruktów przeciw-cd3 x przeciw-epcam w orientacji VH CD3 -VL CD3 x VL EpCAM -VH EpCAM [0190] Przeciw-EpCAM 4-7 w orientacji VL-VH zawierający 1-aminokwasowy standardowy łącznik (SEQ ID NO.: 168) uzyskano metodą PCR. Region 4-7 VH i region 4-7 VL osobno amplifikowano z uŝyciem następujących starterów (4-7 VL: 4-7 VL BspEI FOR CTGAAATCCGGAGGTGGTGGATCCGAGCTCGTGATGACCCAGACTCC (SEQ ID NO.: 117), 4-7 VL GS1 REV GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCA CCACCTTT- GATCTCAAGCTTGGTCCCC (SEQ ID NO.: 118); 4-7 VH: 4-7 VH GS1. FOR GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGAGGTGCAGCTGCTCGAGCAG (SEQ ID NO.: 42), 4-7 VH SalI REV TTTTAAGTCGACCTAATGAT-

84 GATGATGATGATGTGAGGAGACGGTGACCGTGG (SEQ ID. NO.:43)). Pokrywające się komplementarne sekwencje wprowadzone do produktów PCR uŝyto do wytworzenia sekwencji kodującej 1-aminokwasowy łącznik (G 4 S 1 ) 3 (jednoliterowy kod aminokwasów) (standardowy łącznik) (SEQ ID NO.: 168) podczas kolejnej fuzyjnej reakcji PCR. Etap amplifikacji wykonano z parą starterów 4-7 VL BspEI FOR o 4-7 VH SalI REV (SEQ ID NO.: 42 i 43). [0191] Przeciw-EpCAM - w orientacji VL-VH zawierający 1-aminokwasowy standardowy łącznik ((G 4 S 1 ) 3 ) uzyskano metodą PCR. Region - VH oraz region - VL osobno amplifikowano z uŝyciem następujących starterów (- VL: - VL BspEI FOR CTGAAATCCGGAGGTGGTGGATCCGAGCTCGTGATGACACAGTCTCCAT (SEQ ID NO.: 44), - VL GS1 REV GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCTT- TGATCTCAAGCTTGGTCCCAG; (SEQ ID NO.: 4) - VH: - VH GS1 FOR GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGAGGTGCAGCTGCTCGAGC (SEQ ID NO.: 46), - VH SalI REV TTTTAAGTCGACCTAATGATGATGATGATGAT- GTGAGGAGACGGTGACCGTGG (SEQ ID NO.: 47). Pokrywające się komplementarne sekwencje wprowadzone do produktów PCR uŝyto do wytworzenia sekwencji kodującej 1-aminokwasowy łącznik (G 4 S 1 ) 3 (jednoliterowy kod aminokwasów) (standardowy łącznik) (SEQ ID NO.: 168) podczas kolejnej fuzyjnej reakcji PCR. Ten etap amplifikacji wykonano z parą starterów - VL BspEI FOR i - VH SalI REV. [0192] Produkty PCR - VL-VH i 4-7 VL-VH) wklonowano do wektora pef-dhfr zawierającego konstrukt przeciw-cd3 (VHNL2). Po potwierdzeniu sekwencji kodującej bispecyficznego jednołańcuchowego przeciwciała przez sekwencjonowanie, plazmid transfekowano do komórek CHO z deficytem DHFR w celu uzyskania eukariotycznej ekspresji. Eukariotyczną ekspresję białka w komórkach CHO z deficytem DHFR przeprowadzono w sposób opisany w Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 18, 37-66) Wiązanie deimmunizowanych konstruktów przeciw-cd3 x przeciw-epcam z EpCAM i CD3 [0193] Wiązanie bispecyficznych jednołańcuchowych cząsteczek z częścią przeciw-cd3 w N-końcowej orientacji z EpCAM i CD3 potwierdzono z uŝyciem analizy FACS. W tym celu zastosowano EpCAM-pozytywną linię komórek raka Ŝołądka Kato III (ATCC HTB- 3). Wiązanie części przeciw-cd3 wykazano na komórkach Jurkat (ATCC TIB 12). [0194] Komórki hodowano według zaleceń dostawcy i liczbę 0000 komórek inkubowano z µg/ml konstruktu w 0 µl PBS z 2% FCS (płodowej surowicy cielęcej). Wiązanie konstruktu wykryto z uŝyciem przeciwciała przeciw-his (przeciwciało Penta-His, uzyskane z Qiagen, Hilden, FRG) przy 2 µg/ml w PBS z 2% FCS. W drugim etapie zastosowano

85 sprzęŝony z R-fikoerytryną, oczyszczony z uŝyciem powinowactwa F(ab') 2 pochodzący z koziego przeciwciała przeciw-mysiej IgG, rozcieńczonego 1:0 w 0 µl PBS z 2% FCS (Dianova, Hamburg, FRG). Próbki zmierzono z uŝyciem FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, FRG). [019] Wyniki analizy FACS przedstawiono na Fig. 1. Wszystkie konstrukty zawierające deimmunizowaną część przeciw-cd3 wykazywały silniejsze wiązanie niŝ nie-deimmunizowane bispecyficzne jednołańcuchowe przeciwciało przeciw-epcam (M79) x przeciw- CD3 na EpCAM-pozytywnych komórkach KatoIII. 8.2 Klonowanie cząsteczek wiąŝących EpCAM na N-końcu zawierających deimmunizowaną część przeciw-cd Klonowanie konstruktów przeciw-epcam x przeciw-cd Klonowanie deimmunizowanego konstruktu 3-1 x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 48, 49): [0196] Deimmunizowany konstrukt 3-1 x przeciw-cd3 (VHNL2) (SEQ ID NO.: 48) pochodził z nie-deimmunizowanego konstruktu przeciw-epcam (3-1) x przeciw-cd3. Regiony VH i VL przeciwciała przeciw-epcam 3-1 przedstawiono w SEQ ID NO.: 137 i 139. Plazmidy pef-dhfr-3-1 x przeciw-cd3 i pef przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 192) strawiono BspEI i SalI (Biolabs) w celu wyizolowania odpowiednio wektora i insertu przeciw-cd3 (VH/VL2). Wektor strawiony BspEI-SalI defosforylowano i oczyszczono w 0,7% Ŝelu agarozowym, podczas gdy insert oczyszczono w 1,% Ŝelu agarozowym. [0197] Następnie oczyszczony fragment (BspEI-SalI) wklonowano w odpowiednie miejsca wektora pef-ohfr. Końcowy konstrukt 3-1 x przeciw-cd3 (VHNL2) (SEQ ID NO.: 48, 49) potwierdzono przez trawienie restrykcyjne i sekwencjonowanie DNA całego insertu. Klonowanie nie-deimmunizowanego konstruktu 3-1 x przeciw-cd3: [0198] W celu sklowania konstruktu 3-1 x przeciw-cd3 (VHNL2) odpowiedni konstrukt nie-deimmunizowany wytworzono w następujący sposób. [0199] C-koniec 3-1 w orientacji VH-VL uzyskano metodą PCR w celu skonstruowania nie-deimmunizowanej cząsteczki 3-1 x przeciw-cd3. Fragmenty I i II zawierające 3-1 VH-VL w dwóch częściach amplifikowano metodą PCR stosując pary starterów odpowiednio me 91 a (SEQ ID NO.: 3) /me 90 (SEQ ID NO.: 2) i me 83 (SEQ ID NO.: 0) /me 84 (SEQ ID NO.: 1). PCR typu Hot Start przeprowadzono z uŝyciem Expand High Fidelity System z Roche Diagnostics. cykli (94 C/30 s; 60 C/1min; 72 C/1min) zastosowano do przeprowadzenia amplifikacji, a następnie wykonano jeden cykl 3 min w 72 C.

86 [00] Fragmenty PCR I i II poddano elektroforezie w 1,% Ŝelu agarozowym. Fragmenty zmieszano (kaŝdy w ilości 1 ng) i zastosowano jako matrycę w kolejnej reakcji PCR z parą starterów me 91a (SEQ ID NO.: 3) i me 84 (SEQ ID NO.: 1) do amplifikacji fragmentu III zawierającego cały 3-1. PCR przeprowadzono w sposób opisany powyŝej, ale z temperaturą hybrydyzacji 68 C. Fragment III oczyszczono w Ŝelu agarozowym i strawiono Bsr- GI i BspEI (Biolabs), oczyszczono, a następnie wklonowano w odpowiednie miejsca konstruktu pef-dhfr-przeciw-epcam (M79) X przeciw-cd3. Sklonowany region potwierdzono przez trawienie restrykcyjne i sekwencjonowanie DNA. Zastosowane sekwencje i startery: [01] Me 83: '- GGT TCT GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGT TCT GAG GTG CAG CTG CTC GA CAG TCT G -3' (SEQ ID NO.: 0) Me 84: '- GTG CTC CGG AGG AGA CGG TGA CCG TGG TCC CTT GGC CCC AG -3' (SEQ ID NO.: 1) Me 90: '- CCG GAG CCG CCG CCG CCA GAA CCA CCA CCA CCT TTG ATC TCA AGC TTG GTC CC -3' (SEQ ID NO.: 2) Me 91a: '- GGA TTG TAC A CTCC GA GCT CGT CAT GAC CCA GTC TCC ATC TTA TCT TGC TGC -3' (SEQ ID NO.: 3) Klonowanie deimmunizowanego konstruktu 3- x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 4, ): [02] C-koniec 3- w orientacji VH-VL uzyskano metodą PCR w celu skonstruowania cząsteczki 3- x przeciw-cd3. Regiony VH i VL przeciwciała przeciw-epcam 3- przedstawiono w SEQ ID NO.: 141 i 143. Plazmidy pef-dhfr-3- x przeciw-cd3 i pef przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 192) strawiono EcoRI i BspEI (Biolabs) w celu wyizolowania odpowiednio insertu (3-) oraz wektora. Defosforylowany wektor (strawiony EcoRI i BspEI) i insert oczyszczono metodą elektroforezy w Ŝelu agarozowym. [03] Następnie oczyszczony fragment (EcoRI-BspEI) wklonowano w odpowiednie miejsca wektora pef-dhfr. Końcowy konstrukt 3- x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 4) potwierdzono przez trawienie restrykcyjne. Klonowanie nie-deimmunizowanego konstruktu 3- x przeciw-cd3: [04] W celu sklonowania konstruktu 3- x przeciw-cd3 (VH/VL2) wytworzono odpowiedni konstrukt nie-deimmunizowany w następujący sposób. [0] Fragmenty I i II zawierające 3- w dwóch częściach zamplifikowano metodą PCR według warunków opisanych dla 3-1 x przeciw-cd3 stosując pary starterów odpowiednio me 81 (SEQ ID NO.: 6) /me 90 (SEQ ID NO.: 2) i me 83 (SEQ ID NO.: 0) /me 84

87 (SEQ ID NO.: 1). Fragmenty z Ŝelu agarozowego zawierające fragmenty PCR I i II ponownie zamplifikowano z parą starterów me 81 (SEQ ID NO.: 6) i me 84 (SEQ ID NO.: 1) w celu amplifikacji fragmentu III zawierającego cały 3-. PCR przeprowadzono w sposób opisany powyŝej. Fragment III oczyszczono w Ŝelu agarozowym i strawiono Bss- HII i BspEI (Biolabs), oczyszczono, a następnie wklonowano w odpowiednie miejsca wektora do klonowania pef-dhfr. Sklonowany region potwierdzono przez trawienie restrykcyjne i sekwencjonowanie DNA. Sekwencja startera Me81 (SEQ ID NO.: 6): [06] Me 81: '- GGA TGC GCG CGA GCT CGT GAT GAC CCA GAC TCCA CTC TCC -3' Klonowanie deimmunizowanego konstruktu 4-1 x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 7, 8): [07] C-koniec 4-1 w orientacji VH-VL uzyskano metodą PCR w celu skonstruowania cząsteczki 4-1 x przeciw-cd3. Regiony VH i VL przeciwciała przeciw-epcam 4-1 przedstawiono w SEQ ID NO.: 14 i 147. Plazmidy pef-dhfr-4-1 x przeciw-cd3 i pef przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 192) strawiono EcoRI i BspEI (Biolabs) w celu wyizolowania odpowiednio insertu (4-1) i wektora. Defosforylowany wektor (strawiony EcoRI i BspEI) i insert oczyszczono metodą elektroforezy w Ŝelu agarozowym. [08] Oczyszczony fragment (EcoRI-BspEI) następnie wklonowano w odpowiednie miejsca wektora. Końcowy konstrukt 4-1 x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 7) potwierdzono przez trawienie restrykcyjne. Klonowanie nie-deimmunizowanego konstruktu 4-1 x przeciw-cd3: [09] W celu sklonowania konstruktu 4-1 x przeciw-cd3 (VH/VL2) wytworzono odpowiedni nie-deimmunizowany konstrukt w następujący sposób. [02] Fragmenty I i II zawierające 4-1 w dwóch częściach zamplifikowano metodą PCR stosując parę starterów odpowiednio me 91 a (SEQ ID NO.: 3) /me 90 (SEQ ID NO.: 42) i me 83 (SEQ ID NO.: 0) /me 84 (SEQ ID NO.: 1) we wspomnianych powyŝej warunkach. [0211] Fragmenty z Ŝelu agarozowego zawierające fragmenty PCR I i II ponownie zamplifikowano z parą starterów me 92a (SEQ ID NO.: 9) i me 84 (SEQ ID NO.: 1) w celu amplifikacji fragmentu III zawierającego cały 4-1. PCR przeprowadzono w sposób opisany powyŝej, ale hybrydyzację przeprowadzono w 68 C. Fragment III oczyszczono w Ŝelu agarozowym i strawiono BsrGI i BspEI (Biolabs), oczyszczono, a następnie wklonowano w odpowiednie miejsca konstruktu wektora do klonowania pef-dhfr-przeciw-epcam (M79) X przeciw-cd3. Sklonowany region potwierdzono przez trawienie restrykcyjne i

88 sekwencjonowanie DNA. Sekwencja startera Me92a (SEQ ID NO.: 9): [0212] Me 92a: '- GGA TTG TAC A CTCC GA GCT CGT GAT GAC ACA GTCTCC ATC CTC C -3' Klonowanie deimmunizowanego konstruktu 4-7 x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 60, 61): [0213] C-koniec 4-7 w orientacji VH-VL uzyskano metodą PCR w celu skonstruowania cząsteczki 4-7 x przeciw-cd3. Regiony VH i VL przeciwciała przeciw-epcam 4-7 przedstawiono w SEQ ID NO.: 149 i 11. Plazmidy pef-dhfr-4-7 x przeciw-cd3 i pef przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 192) strawiono EcoRI i BspEI (Biolabs) w celu wyizolowania odpowiednio insertu (4-7) i wektora. Defosforylowany wektor (strawiony EcoRI i BspEI) i insert oczyszczono metodą elektroforezy w Ŝelu agarozowym. [0214] Oczyszczony fragment (EcoRI-BspEI) następnie wklonowano w odpowiednie miejsca wektora pef-dhfr. Końcowy konstrukt 4-7 x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 60) potwierdzono przez trawienie restrykcyjne. Klonowanie nie-deimmunizowanego konstruktu 4-7 x przeciw-cd3: [021] W celu sklonowania konstruktu 4-7 x przeciw-cd3 (VH/VL2) wytworzono odpowiedni nie-deimmunizowany konstrukt w następujący sposób. [0216] Fragmenty I i II zawierające 4-7 w dwóch częściach zamplifikowano metodą PCR stosując pary starterów odpowiednio me 81 (SEQ ID NO.: 6) /me 90 (SEQ ID NO.: 2) i me 83 (SEQ ID NO.: 0) /me 84 (SEQ ID NO.: 1) we wspomnianych powyŝej warunkach. Fragmenty z Ŝelu agarozowego zawierające fragmenty PCR I i II ponownie zamplifikowano z parą starterów me 81 (SEQ ID NO.: 6) i me 84 (SEQ ID NO.: 1) w celu amplifikacji fragmentu III zawierającego cały łańcuch VH i VL 4-7. PCR przeprowadzono w sposób opisany powyŝej. Fragment III oczyszczono w Ŝelu agarozowym i strawiono BssHII i BspEI (Biolabs), oczyszczono, a następnie wklonowano w odpowiednie miejsca wektora do klonowania pef-dhfr. Sklonowany region potwierdzono przez trawienie restrykcyjne i sekwencjonowanie DNA Klonowanie deimmunizowanego konstruktu - x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 62, 63): [0217] C-koniec - w orientacji VH-VL uzyskano metodą PCR w celu skonstruowania cząsteczki - x przeciw-cd3. Regiony VH i VL przeciwciała przeciw-epcam - przedstawiono w SEQ ID NO.: 133 i 13. Plazmidy pef-dhfr-- x przeciw-cd3 i pef przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 192) strawiono EcoRI i BspEI (Biolabs) w

89 celu wyizolowania odpowiednio insertu (-) i wektora. Defosforylowany wektor (strawiony EcoRI i BspEI) i insert oczyszczono metodą elektroforezy w Ŝelu agarozowym. [0218] Oczyszczony fragment (EcoRI-BspEI) następnie wklonowano w odpowiednie miejsca wektora pef-dhfr. Końcowy konstrukt - x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 62) potwierdzono przez trawienie restrykcyjne i sekwencjonowanie DNA. Klonowanie nie-deimmunizowanego konstruktu - x przeciw-cd3: [0219] W celu sklonowania konstruktu - x przeciw-cd3 (VH/VL2) wytworzono odpowiedni nie-deimmunizowany konstrukt w następujący sposób. [02] Fragmenty I i II zawierające - w dwóch częściach zamplifikowano metodą PCR stosując pary starterów odpowiednio me 92a (SEQ ID NO.: 9) /me 90 (SEQ ID NO.: 2) i me 83 (SEQ ID NO.: 0) /me 84 (SEQ ID NO.: 1) we wspomnianych powyŝej warunkach. Fragmenty z Ŝelu agarozowego zawierające fragmenty PCR I i II ponownie zamplifikowano z parą starterów me 92a (SEQ ID NO.: 9) i me 84 (SEQ ID NO.: 1) w celu amplifikacji fragmentu III zawierającego cały -. PCR przeprowadzono w sposób opisany powyŝej, ale hybrydyzację przeprowadzono w 68 C. Fragment III oczyszczono w Ŝelu agarozowym i strawiono BsrGI i BspEI (Biolabs), oczyszczono, a następnie wklonowano w odpowiednie miejsca wektora do klonowania pef-dhfr-przeciw-epcam (M79) x przeciw-cd3. Sklonowany region potwierdzono przez trawienie restrykcyjne i sekwencjonowanie DNA Ekspresja cząsteczek przeciw-epcam x deimmunizowany-przeciw-cd3 z przeciw-epcam w pozycji N-końcowej: [0221] Komórki CHO bez genu DHFR utrzymywano w podłoŝu alfa MEM (Life Technologies, nr kat.: 3261) uzupełnionym % płodowej surowicy cielęcej (Life Technologies, inaktywowana termicznie w 6 C przez 30 minut) z HT (Hypoksantyna i Tymidyna; Life Technologies). Komórki transfekowano pef-dhfr-3-1 x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 48) i pef-dhfr-- x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 62) stosując Lipofectamine 00 kit (Invitrogen) według instrukcji dostarczonych przez producenta. Po 48 godzinach przeprowadzono selekcję w podłoŝu selekcyjnym (podłoŝe alfa MEM zawierające % inaktywowanej termicznie dializowanej płodowej surowicy cielęcej (Life Technologies). Po 3-4 tygodniach supernatant hodowli komórkowej zebrano i odwirowano w 4 C przez minut przy 300 g w celu usunięcia komórek i resztek komórek. Supernatant zawierający bispecyficzne przeciwciało przechowywano w - C do czasu dalszej analizy Testy wiązania bispecyficznych wariantów przeciw-epcam x przeciw-cd3: [0222] 000 komórek Jurkat (do wiązania CD3) i komórek Kato (do wiązania EpCAM)

90 niezaleŝnie inkubowano z supernatantami z hodowli komórkowych (0 µl) zawierającymi bispecyficzny konstrukt (odpowiednio pef-dhfr-3-1 x przeciw-cd3 (VH/VL2) (Nr 0, SEQ ID NO.: 48) i pef-dhfr-- x przeciw-cd3 (VH/VL2) (Nr 4) (SEQ ID NO.: 62)) przez 4 min w 4 C. Następnie komórki przepłukano dwukrotnie buforem FACS (roztwór soli buforowany fosforanami zawierający 1% płodową surowicę cielęcą (FCS) i 0,0% azydek sodu) oraz inkubowano z mysim przeciwciałem przeciw-his (Dianova, DIA9) przez 60 min w 4 C. Etapy płukania przeprowadzono w sposób opisany powyŝej. [0223] Komórki ostatecznie inkubowano z kozim przeciwciałem przeciw-mysiej Ig sprzę- Ŝonym z FITC (BD 0003) lub przeciw-mysiej IgG sprzęŝonym z PE (Sigma, P847). Po etapach płukania 000 zdarzeń analizowano z zastosowaniem FACS Calibur (B&D). Wyniki testów wiązania przedstawiono na Figurze 16. Konstrukty 3-1 x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 49) i - x przeciw-cd3 (SEQ ID NO.: 63) wykazywały silne wiązanie CD3 na komórkach Jurkat oraz CD19 na komórkach Kato. Przykład 8.3. Oczyszczanie bispecyficznych konstruktów przeciw-epcam z deimmunizowana częścią przeciw-cd3 [0224] Konstrukty zawierające deimmunizowany region przeciw-cd3 i region specyficzny względem EpCAM oczyszczono z zastosowaniem dwuetapowego procesu oczyszczania obejmującego chromatografię powinowactwa do unieruchomionych jonów metalu (IMAC) i filtrację Ŝelową. Chromatografię powinowactwa do metalu (IMAC) i filtrację Ŝelową przeprowadzono w sposób przedstawiony w Przykładzie 3.2. [022] Dalszą wysokorozdzielczą chromatografię kationowymienną przeprowadzono na kolumnie MiniS (Amersham), zrównowaŝonej mm buforem MES ph,. Próbkę rozcieńczono 1:3 tym samym buforem przed naniesieniem na kolumnę. Związane białko wyeluowano 0-30% gradientem 1 M NaCl w buforze do równowaŝenia. Wyeluowane frakcje białkowe zbadano w teście bioaktywności. Tabela 14 przedstawia wydajności oczyszczonych deimmunizowanych konstruktów EpCAM. Wszystkie konstrukty moŝna było skutecznie wytworzyć. Nieoczekiwanie konstrukt - x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 63) wytworzono z wyjątkowo wysoką wydajnością 20 µg/l. Konstrukt Tabela 14. Wydajności deimmunizowanych konstruktów EpCAM Wydajność monomeru [µg oczyszczonego białka na litr hodowli] przeciw-cd3 (VHNL2) x 4-7 (SEQ ID NO.: 33) 112, 3-1 x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 49) 87, przeciw-cd3 (VHNL2) x 3-1 (SEQ ID NO.: 31) 442,

91 Konstrukt 90 Wydajność monomeru [µg oczyszczonego białka na litr hodowli] - x przeciw-cd3 (VH/VL2) (SEQ ID NO.: 63) 20 anti-cd 3 (VH/VL2) x - (SEQ ID NO.: 37) Przykład 8.4 Test cytotoksyczności bispecyficznych konstruktów przeciw-epcam z deimmunizowaną częścią przeciw-cd3 [0226] W celu potwierdzenia wysokiej bioaktywności bispecyficznych przeciwciał według wynalazku przeprowadzono test oparty na FACS. Komórki CHO transfekowano cząsteczką adhezyjną komórek nabłonkowych (EpCAM). Klon komórek pochodzący z tej transfekcji nazwany komórkami CHO-EpCAM zastosowano w doświadczeniach. [0227] Do testu cytotoksyczności komórki CHO-EpCAM (1,x 7 ) przepłukano dwukrotnie PBS wolnym od surowicy i inkubowano z barwnikiem PKH26 (Sigma-Aldrich Co.) według instrukcji producenta. Po wybarwieniu komórki przepłukano dwukrotnie RPMI/% FACS. [0228] Komórki zliczono i zmieszano z komórkami efektorowymi CB1. Klon komórek T CD4-pozytywnych CB1 uzyskano dzięki uprzejmości Dr. Fickenscher, University of Erlangen/Nuemberg, Niemcy. Komórki hodowano w sposób zalecany przez dostawców. Powstała zawiesina komórek zawierała komórek docelowych i 2 x 6 efektorowych na ml. UŜyto po 0 µl na studzienkę w 96-studzienkowej płytce ze studzienkami o okrągłym dnie. [0229] Przeciwciała rozcieńczono w RPMI/% FCS do wymaganego stęŝenia i 0 µl tego roztworu dodano do zawiesiny komórek. Standardową reakcję inkubowano przez 16 h w 37 C/% CO 2. Jodek propidyny dodano do końcowego stęŝenia 1 µg/ml. Po minutach inkubacji w temperaturze pokojowej komórki analizowano z zastosowaniem FACS. Fluorescencję PKH26 zastosowano do pozytywnej identyfikacji komórek docelowych. Cytotoksyczność zmierzono jako stosunek komórek pozytywnych względem PI do wszystkich komórek docelowych. [0230] Z sigmoidalnych krzywych odpowiedzi na dawkę zazwyczaj uzyskiwano wartości R2 >0,97, co wyznaczono z uŝyciem oprogramowania Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). Wyniki testów cytotoksyczności przedstawiono na Figurach 17 i 18. Przykład 8.. Porównanie zdolności wytwarzania bispecyficznych cząsteczek zawierających część wiąŝącą EpCAM i deimmunizowaną część wiąŝącą CD3 w komórkach CHO [0231] W celu wyznaczenia zdolności wytwarzania deimmunizowanego konstruktu prze-

92 prowadzono ELISA z białkiem L. Dane dotyczące zdolności wytwarzania obliczono z hodowli w podłoŝu płynnym Hodowla komórkowa [0232] Linie komórkowe CHO wytwarzające konstrukt deimmunizowany (CHO-DHFR-) i nie-deimmunizowany (CHO-DHFR- lub CHO-K1) hodowano w podłoŝu HyQ PF CHO LS + 4 mm L-Glutamina w inkubatorze CO 2 w 37 C i % CO 2. Liczby komórek i Ŝywotność wyznaczono z uŝyciem błękitu trypanu. Gęstość komórek ustawiono na 1-2 komórek/ml. [0233] Komórki przeniesiono do butelek do hodowli z mieszadłem i w związku z tym dostosowano do warunków hodowli z mieszaniem. Ustawienia parametrów działania wynosiły 80 obr./min, 37 C i % CO 2 z podawaniem gazu w inkubatorze CO 2. Objętość hodowli była w zakresie 0-00 ml, a gęstość komórek w momencie zaszczepienia była w zakresie 1-2 komórek/ml. Tak jak w przypadku subhodowli w butelkach typu T, przy kaŝdym pasaŝu hodowle odwirowywano i ponownie zawieszano w świeŝym wcześniej podgrzanym podłoŝu. Gęstość ustawiono przy 1-2 komórek/ml. [0234] W celu analizy danych dotyczacych zdolności wytwarzania (Tabela 1) komórki hodowano do 14 dni (d) bez jakiegokolwiek dodania lub wymiany podłoŝa. Liczby komórek i ich Ŝywotność wyznaczano codziennie przez barwienie błękitem trypanu. StęŜenia produktów w supernatancie analizowano z zastosowaniem ELISA z białkiem L ELISA z białkiem L [023] Ilościowe wiązanie bispecyficznych cząsteczek przeprowadzono z uŝyciem płytek do mikromianowania powlekanych r-białkiem L. r-białko L jest rekombinowaną postacią wiąŝącego białka L wiaŝącego immunoglobuliny wytwarzanego przez Peptostreptococcus magnus. Zawiera ono cztery domeny wiąŝące i wiąŝe immunoglobuliny przez łańcuch lekki (κ). Cząsteczki bispecyficzne, które zawierają domeny zmienne z dwóch róŝnych łańcuchów lekkich odpowiednich przeciwciał macierzystych są takŝe wiązane przez r-białko L. [0236] Płytki do mikromianowania powleczono r-białkiem L w buforze PBS (2 µg r-białka L/ml buforu PBS) przez noc w 2-8 C. Po powleczeniu pozostałe miejsca adsorpcji zablokowano buforem blokującym (2% BSA w buforze PBS). Następnie, płytki zamroŝono i przechowywano w 18 C. Przed uŝyciem płytki rozmroŝono i przepłukano buforem do płukania (0,0% Tween w buforze PBS) w celu usunięcia mieszaniny roztworu powlekającego i buforu blokującego. [0237] Analizowano kolejne rozcieńczenia wolnego od komórek supernatantu z hodowli komórkowych w 1% BSA + 0,01% Tween w PBS (bufor do rozcieńczania). Bispecyficzne przeciw-epcam(m79) x przeciw-cd3 zastosowano jako kontrolę pozytywną w

93 92 porównywalnych rozcieńczeniach. [0238] Inkubację przeprowadzono przez noc w 2-8 C. [0239] Po przepłukaniu dodano królicze przeciwciało przeciw-mysiej IgG (1:000 w buforze do rozcieńczania) i inkubowano przez 60 min w temperaturze pokojowej. Po przepłukaniu dodano kozie przeciwciało przeciw-króliczej IgG znakowane fosfatazą zasadową (1:00 w buforze do rozcieńczania; 60 min w temperaturze pokojowej). Dodano roztwór substratu pnpp i reakcję zatrzymano przez dodanie 3 M NaOH. Absorbancję zmierzono z uŝyciem czytnika ELISA przy 40 nm (filtr odniesienia 492 nm). Tabela 1. Zdolność wytwarzania deimmunizowanego konstruktu przeciw-epcam Konstrukt M79 x przeciw-cd3 - x przeciw-cd3 (VH/VL2) Podstawowa linia komórkowa CHO-K1 CHO-dhfr- CHO-dhfr- Właściwa zdolność wytwarzania 0,2-0,6 pg/komórkę na dzień 1-3 pg/komórkę na dzień 1- pg/komórkę na dzień Maksymalna gęstość komórek 3x 6 komórek/ml 1,2-1,8x 6 komórek/ml 1,x 6 komórek/ml Czas podwojenia 17- h 2-30 h 2-30 h [0240] Zatem w przypadku wynalazczego konstruktu - x przeciw-cd3 (VHNL2) wykazano znacznie wyŝszą właściwą zdolność wytwarzania (co najmniej pięciokrotnie wyŝszą) niŝ w przypadku bispecyficznego nie-deimmunizowanego przeciwciała wiąŝącego EpCAM i CD3 ze stanu techniki. ZastrzeŜenia patentowe 1 1. Cytotoksycznie aktywny konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 zawierający pierwszą domenę specyficznie wiąŝącą ludzki CD3 i drugą domenę wiąŝącą pochodzącą z Ig, w którym ta pierwsza domena jest deimmunizowana i zawiera region CDR-H1 zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO.: 88, region CDR-H2 zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO.: 90 lub 92 i region CDR-H3 zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO.: 96, 8, 119, 1, 121, 122, 123, 124, 12, 126 lub 127; oraz w którym ta pierwsza domena ponadto zawiera w swoim regionie zrębowym H1

94 sekwencję VKK oraz w którym sekwencja przejściowa między regionem zrębowym H1 i regionem CDRH1 zawiera sekwencję Ala-Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe (ASGYTF; SEQ ID NO.: 233). 2. Cytotoksycznie aktywny konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według zastrzeŝenia 1 ponadto zawierający w tej pierwszej domenie region zrębowy H3 zawierający sekwencję Met-Glu-Leu-Ser (MELS; SEQ ID NO.: 234). 3. Cytotoksycznie aktywny konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według zastrzeŝenia 1 albo 2 ponadto zawierający w tej pierwszej domenie region zrębowy H3 zawierający sekwencję Ile-Thr-Thr-Asp-Lys (ITTDK; SEQ ID NO.: 23). 4. Konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 do 3, w którym ta pierwsza domena, która specyficznie wiąŝe ludzki CD3, zawiera region zrębowy H1 przedstawiony w SEQ ID NO.: 12 lub 13.. Konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 do 4, w którym ta pierwsza domena, która specyficznie wiąŝe ludzki CD3, zawiera region zrębowy H2 przedstawiony w SEQ ID NO.: 16 lub Konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 do, w którym ta pierwsza domena, która specyficznie wiąŝe ludzki CD3, zawiera region zrębowy H3 przedstawiony w SEQ ID NO.: 160 lub Konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 do 6, w którym ta pierwsza domena, która specyficznie wiąŝe ludzki CD3, zawiera region zrębowy H4 przedstawiony w SEQ ID NO.: 164 lub Konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 do 7, który to konstrukt zawiera region V H przedstawiony w SEQ ID NO.: 74 lub Konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 do 8, który to konstrukt zawiera CDR-L1 przedstawiony w SEQ ID NO.: 98 lub 0.. Konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 do 9, który to konstrukt zawiera CDR-L2 przedstawiony w SEQ ID NO.: Konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 do, który to konstrukt zawiera CDR-L3 przedstawiony w SEQ ID NO.: Konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 do 11 zawierający region V L w swojej części specyficznej względem CD3, w którym ten region V L jest wybrany z grupy obejmującej SEQ ID NO.: 78, SEQ ID NO.: 80, SEQ ID NO.: 82 i SEQ ID NO.: Konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 do 12, w którym tą drugą domenę pochodzącą z Ig stanowi scfv.

95 Konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 do 13, w którym ta druga domena pochodząca z Ig i/lub (a) łączący(-e) region(-y) łącznikowy(-e) jest/są humanizowane i/lub deimmunizowane. 1. Konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 do 14, w którym ta druga domena pochodząca z Ig zawiera miejsce oddziaływania z antygenem o specyficzności względem cząsteczki powierzchniowej komórki. 16. Konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według zastrzeŝenia 1, w którym ta cząsteczka powierzchniowa komórki jest markerem specyficznym dla nowotworu. 17. Konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 do 16, w którym ta druga domena wiąŝąca pochodząca z Ig zawiera miejsce oddziaływania z antygenem o specyficzności względem EpCAM. 18. Konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według zastrzeŝenia 17, który to konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej (a) sekwencję aminokwasową przedstawioną w którejkolwiek z SEQ ID NO.: 31, 33, 3, 37, 39, 49,, 8, 61, 63, 6, 67, 237, 239, 241, 243, 24, 247, 249, 21, 23, 2, 27, 29, 261, 263, 26, 267, 269, 271, 273, 27, 277, 279, 281, 283, 28, 287, 289, 291, 293, 29, 297, 299, 301, 303, 30, 307, 309, 311, 313, 31, 317, 319, 321, 323 i 32; (b) sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną w którejkolwiek z SEQ ID NO.: 30, 32, 34, 36, 38, 48, 4, 7, 60, 62, 64, 66, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248,, 22, 24, 26, 28, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 3, 312, 314, 316, 318, 3, 322 i 324; oraz (c) sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego, która jest zdegenerowana pod względem kodu genetycznego do sekwencji nukleotydowej (b); (d) i sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą z nicią komplementarną sekwencji kwasu nukleinowego zdefiniowanej w (b) w ostrych warunkach hybrydyzacji. 19. Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 do 18.. Wektor zawierający sekwencję kwasu nukleinowego według zastrzeŝenia Wektor według zastrzeŝenia, który ponadto zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która jest sekwencją regulatorową funkcjonalnie połączoną z tą sekwen-

96 cją kwasu nukleinowego według zastrzeŝenia Wektor według zastrzeŝenia albo 21, który to wektor stanowi wektor ekspresyjny. 23. Gospodarz transformowany lub transfekowany wektorem według któregokolwiek z zastrzeŝeń do Sposób wytwarzania konstruktu specyficznie wiąŝącego CD3 według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 do 18, który to sposób obejmuje hodowanie gospodarza według zastrzeŝenia 23 w warunkach umoŝliwiających ekspresję konstruktu polipeptydowego i odzyskanie wytworzonego konstruktu polipeptydowego z hodowli. 2. Kompozycja zawierająca konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 do 18 lub wytworzony sposobem według zastrzeŝenia 24, cząsteczkę kwasu nukleinowego według zastrzeŝenia 19, wektor według któregokolwiek z zastrzeŝeń do 22 lub gospodarza według zastrzeŝenia 23 oraz ewentualnie białkopodobny związek zdolny do dostarczenia sygnału aktywującego dla immunologicznych komórek efektorowych. 26. Kompozycja według zastrzeŝenia 2, która stanowi kompozycję farmaceutyczną ewentualnie ponadto zawierającą odpowiednie preparaty nośnika, stabilizatory i/lub zaróbki. 27. Kompozycja według zastrzeŝenia 2, która stanowi kompozycję diagnostyczną ewentualnie ponadto obejmującą środki i sposoby do wykrywania. 28. Zastosowanie konstruktu specyficznie wiąŝącego CD3 według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 do 18 lub wytworzonego sposobem według zastrzeŝenia 24; cząsteczki kwasu nukleinowego według zastrzeŝenia 19; wektora według któregokolwiek z zastrzeŝeń do 22 lub gospodarza według zastrzeŝenia 23, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do profilaktyki, leczenia lub poprawy choroby proliferacyjnej, choroby nowotworowej, choroby zapalnej, zaburzenia immunologicznego, choroby autoimmunizacyjnej, choroby zakaźnej, choroby wirusowej, reakcji alergicznych, reakcji na pasoŝyty, chorób przeszczep przeciw gospodarzowi lub chorób gospodarz przeciw przeszczepowi. 29. Zastosowanie według zastrzeŝenia 28, w którym kompozycję farmaceutyczną podaje się równocześnie lub nie równocześnie z białkopodobnym związkiem zdolnym do dostarczenia sygnału aktywującego dla immunologicznych komórek efektorowych. 30. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 do 18 lub wytworzony sposobem według za-

97 96 1 strzeŝenia 24; cząsteczkę kwasu nukleinowego według zastrzeŝenia 19; wektor według któregokolwiek z zastrzeŝeń do 22 lub gospodarza według zastrzeŝenia 23, do zastosowania do profilaktyki, leczenia lub poprawy choroby proliferacyjnej, choroby nowotworowej, choroby zapalnej, zaburzenia immunologicznego, choroby autoimmunizacyjnej, choroby zakaźnej, choroby wirusowej, reakcji alergicznych, reakcji na pasoŝyty, chorób przeszczep przeciw gospodarzowi lub chorób gospodarz przeciw przeszczepowi. 31. Kompozycja farmaceutyczna według zastrzeŝenia 30, którą to kompozycję farmaceutyczną podaje się równocześnie lub nie równocześnie z białkopodobnym związkiem zdolnym do dostarczenia sygnału aktywującego dla immunologicznych komórek efektorowych. 32. Zestaw zawierający konstrukt specyficznie wiąŝący CD3 według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 do 18 lub wytworzony sposobem według zastrzeŝenia 24; cząsteczkę kwasu nukleinowego według zastrzeŝenia 19; wektor według któregokolwiek z zastrzeŝeń do 22 lub gospodarza według zastrzeŝenia 23. Uprawniony: Pełnomocnik: Micromet AG mgr inŝ. Agnieszka Marszałek Rzecznik patentowy

98 97

99 98

100 99

101 0

102 1

103 2

104 3

105 4

106

107 6

108 7

109 8

110 9

111 1

112 111

113 112

114 113

115 114

116 11

117 116

118 117