(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2010/12 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: Nowotworowe peptydy antygenowe pochodzące z WT1 (30) Pierwszeństwo: JP (13) T3 (51) Int. Cl. C12N15/09 C12P21/02 A61K38/00 A61K35/12 C07K14/82 A61P35/00 A61K39/00 G01N33/574 A61K48/00 G01N33/53 C12N5/10 C12N5/07 C07K16/32 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2006/50 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 08/2010 (73) Uprawniony z patentu: International Institute of Cancer Immunology, Inc., Suita-shi, JP PL/EP T3 (72) Twórca (y) wynalazku: SUGIYAMA Haruo, Minoo-shi, JP (74) Pełnomocnik: Polservice Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o. rzecz. pat. Bartnik Urszula Warszawa skr. poczt. 335 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 3 Opis Dziedzina techniki [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania nowotworowych peptydów antygenowych pochodzących z WT1. Stan techniki [0002] Stwierdzono, że gen WT1 (gen 1 guza Wilmsa) jest jednym z genów powodujących guz Wilmsa, to znaczy nowotwór nerek wieku dziecięcego (Cell 60: 509, 1990, Nature 343: 774, 1990). Gen WT1 koduje czynnik transkrypcyjny WT1 i WT1 odgrywa ważną rolę w wielu procesach, takich jak proliferacja, różnicowanie i apoptoza komórek oraz rozwój tkanek (Int. Rev. Cytol. 181: 151, 1998). Gen WT1 definiowano pierwotnie jako gen supresorowy nowotworzenia. Późniejsze badania wykazały jednak, że gen WT1 ulega ekspresji w białaczce i różnych litych guzach nowotworowych, między innymi w raku płuca i raku sutka, co wskazuje, że gen WT1 wywiera raczej działanie onkogenne, sprzyjające rozwojowi nowotworu. Ponadto, w badaniach in vitro wykazano, że po pobudzeniu jednojądrzastych komórek krwi obwodowej HLA-A*0201- lub HLA-A*2402-dodatnich peptydami pochodzącymi z WT1 dochodzi do indukcji swoistych dla peptydów cytotoksycznych limfocytów T (CTL), które zabijają komórki białaczki lub komórki guza litego, wykazujące endogenną ekspresję WT1. Wyniki te dowodzą, że WT1 jest obiecującą cząsteczką docelową w immunoterapii chorób nowotworowych (Int. J. Hematol 76: 127, 2002). Nie wyjaśniono jednak, czy WT1 zawiera część lub części peptydu zdolne do wiązania się z anty-

3 4 genem HLA-A26 ani nie donoszono o istnieniu takiego peptydu (peptydów). Dodatkowo, jakkolwiek wydedukowano sekwencje wiążące dla nowotworowego peptydu antygenowego, zdolne do wiązania się z HLA-A*0201 (należącym do antygenów HLA-A2) (WO 00/ 18795), jak dotąd dowiedziono skuteczności tylko kilku nowotworowych peptydów antygenowych (WO 00/06602 i WO 00/026249). Ujawnienie wynalazku [0003] Ujawniono nowotworowe peptydy antygenowe pochodzące z WT1, ich zastosowanie jako substancji indukującej CTL i podobne. Zakres ochrony jest zdefiniowany w zastrzeżeniach. [0004] Twórcy wynalazku przeprowadzili intensywne badania, mające na celu zidentyfikowanie nowych nowotworowych peptydów antygenowych pochodzących z WT1. W wyniku tych badań wykryto, że peptydy przedstawione w SEQ ID nr 2, 8 i 9 mogą indukować CTL ograniczone do HLA-A26. Oznacza to, że twórcy niniejszego wynalazku po raz pierwszy stwierdzili, że WT1 zawiera część lub części nowotworowego peptydu antygenowego, wiążące się z antygenem HLA-A26, spośród wielu podklas antygenów HLA, i rozpoznawane przez CTL. Ta obserwacja doprowadziło do opracowania nowej terapii pod postacią szczepionki nowotworowej, która może indukować CTL swoiste dla WT1 u pacjentów z rakiem HLA-A26-dodatnich. [0005] Wspomniany powyżej nowotworowy peptyd antygenowy pochodzący z WT1 i kodujący go polinukleotyd oraz tym podobne, ujawniane w niniejszym zgłoszeniu, można stosować skutecznie jako substancję indukującą CTL, a

4 5 mianowicie jako szczepionkę nowotworową. Dodatkowo, nowotworowe peptydy antygenowe ujawniane w niniejszym zgłoszeniu można stosować skutecznie jako składnik środka wykrywającego CTL swoiste dla WT1. Niniejszy wynalazek opracowano na podstawie tych obserwacji. Przedmiotem niniejszego wynalazku są zatem: (1). Zastosowanie peptydu o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w dowolnej z SEQ ID nr 2, 8 i 9 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia lub zapobiegania rakowi u pacjenta HLA-A26-dodatniego. (2). Zastosowanie według (1), w którym kompozycja farmaceutyczna jest szczepionką nowotworową. (3). Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w dowolnej z SEQ ID nr 2, 8 i 9 do leczenia lub zapobiegania rakowi u pacjenta HLA-A26-dodatniego. (4). Kompozycja farmaceutyczna według (3), używana jako substancja indukująca CTL. (5). Kompozycja farmaceutyczna według (3), stosowana jako szczepionka nowotworowa. (6). Komórka prezentująca antygen, na której prezentowany jest kompleks między peptydem opisanym w (1) a antygenem HLA-A26. (7). CTL rozpoznający kompleks między peptydem opisanym w (1) a antygenem HLA-A26. (8). Monomer, dimer, tetramer lub pentamer HLA, zawierający peptyd opisany w (1) wraz z antygenem HLA-A26. (9). Odczynnik do wykrywania CTL swoistych dla wiążącego się z HLA-A26 nowotworowego peptydu antygenowego

5 6 pochodzącego z WT1, zawierający jako składnik monomer, dimer, tetramer lub pentamer HLA opisany w (8). [0006] W kontekście niniejszego wynalazku ujawnia się zatem: (1) Peptyd pochodzący z sekwencji aminokwasowej ludzkiego WT1 przedstawionej w SEQ ID nr 1, wykazujący aktywność wiążącego się z HLA-A26 nowotworowego peptydu antygenowego; (2) Peptyd według w (1) powyżej, zawierający jako jeden z elementów lub w całości składający się z 8-11 ciągłych aminokwasów w sekwencji aminokwasowej ludzkiego WT1 przedstawionej w SEQ ID nr 1; (3) Peptyd według w (1) lub (2) powyżej, zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID nr 2, SEQ ID nr 8 lub SEQ ID nr 9; (4) Nowotworowy peptyd antygenowy składający się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID nr 2, SEQ ID nr 8 lub SEQ ID nr 9; (5) Peptyd epitopowy, zawierający peptyd opisany w dowolnym z powyższych punktów od (1) do (4); (6) Polinukleotyd kodujący peptyd opisany w dowolnym z powyższych punktów od (1) do (5); (7) Wektor ekspresyjny, zawierający polinukleotyd opisany w powyższym punkcie (6); (8) Komórkę zawierającą wektor ekspresyjny opisany w powyższym punkcie (7); (9) Sposób wytwarzania peptydu opisany w dowolnym z powyższych punktów od (1) do (5), obejmujący hodowlę ko-

6 7 mórki opisanej w powyższym punkcie (8) w warunkach umożliwiających ekspresję peptydu; (10) Przeciwciało swoiście wiążące się z peptydem opisanym w dowolnym z powyższych punktów od (1) do (4); (11) Komórkę prezentującą antygen, na której prezentowany jest kompleks między wiążącym się z HLA-A26 nowotworowym peptydem antygenowym pochodzącym z sekwencji aminokwasowej ludzkiego WT1 przedstawionej w SEQ ID nr 1, przy czym peptyd ten jest opisany w dowolnym z powyższych punktów od (2) do (4), i antygenem HLA-A26; (12) CTL rozpoznający kompleks między wiążącym się z HLA-A26 nowotworowym peptydem antygenowym pochodzącym z sekwencji aminokwasowej ludzkiego WT1 przedstawionej w SEQ ID nr 1, przy czym peptyd ten jest opisany w dowolnym z powyższych punktów od (2) do (4), i antygen HLA-A26; (13) Kompozycję farmaceutyczną, zawierającą peptyd opisany w dowolnym z powyższych punktów od (1) do (5), wektor ekspresyjny opisany w powyższym punkcie (7), komórkę opisaną w powyższym punkcie (8), komórkę prezentującą antygen opisaną w powyższym punkcie (11) lub CTL opisany w powyższym punkcie (12), wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem; (14) Kompozycję farmaceutyczną opisaną w powyższym punkcie (13), stosowaną jako substancja indukująca CTL; (15) Kompozycję farmaceutyczną opisaną w powyższym punkcie (13) powyżej, stosowaną jako szczepionka nowotworowa;

7 8 (16) Monomer, dimer, tetramer lub pentamer HLA, zawierający wiążący HLA-A26 nowotworowy peptyd antygenowy pochodzący z sekwencji aminokwasowej ludzkiego WT1, przedstawiony w SEQ ID nr 1, przy czym peptyd ten jest opisany w dowolnym z punktów od (2) do (4), wraz z antygenem HLA-A26; (17) Odczynnik do wykrywania CTL swoistych dla wiążącego się z HLA-A26 nowotworowego peptydu antygenowego pochodzącego z WT1, przy czym odczynnik zawiera jako składnik monomer, dimer, tetramer lub pentamer HLA opisany w powyższym punkcie (16); [0007] Niniejszy wynalazek dostarcza nowotworowych peptydów antygenowych pochodzących z WT1, kodujących je polinukleotydów, zawierających je substancji indukujących CTL i tym podobne. Substancja indukująca CTL według niniejszego wynalazku jest użyteczna jako szczepionka nowotworowa. Szczepionkę nowotworową według niniejszego wynalazku można stosować u wielu chorych na raka, którzy są HLA-A26-dodatni. Krótki opis rysunków [0008] Fig. 1 To wykres przedstawiający wyniki doświadczeń, w których badano aktywność cytotoksyczną CTL indukowanych przez pobudzenie peptydem o SEQ ID nr 3 na komórkach docelowych T2 traktowanych pulsowo (kółka zamalowane) lub nie traktowanych (kółka niezamalowane) peptydem. Na rysunku oś pionowa odpowiada swoistej aktywności cytotoksycznej (% lizy swoistej), a oś odciętych - stosunkowi E/T, czyli stosunkowi liczby komórek efektorowych (E) do liczby komórek docelowych (T).

8 9 Fig. 2 To wykres przedstawiający wyniki doświadczeń, w których badano aktywność cytotoksyczną CTL indukowanych przez pobudzenie peptydem o SEQ ID nr 3 linii komórkowej TF-1 (kółka zamalowane), HLA-A* 0201-dodatniej i wykazującej ekspresję WT1, lub linii komórkowej JY (kółka niezamalowane), HLA-A* 0201-dodatniej i niewykazującej ekspresji WT1. Na rysunku oś pionowa odpowiada swoistej aktywności cytotoksycznej (% lizy swoistej), a oś odciętych - stosunkowi E/T. Fig.3 To wykres przedstawiający wyniki doświadczeń, w których badano aktywność cytotoksyczną CTL indukowanych przez pobudzenie peptydem o SEQ ID nr 2 komórek docelowych B-LCL poddanych impulsacji (słupek zamalowany) lub niepoddanych impulsacji (słupek niezamalowany) peptydem. Na rysunku oś pionowa odpowiada swoistej aktywności cytotoksycznej (% lizy swoistej). Fig. 4 To wykres przedstawiający wyniki doświadczeń, w których badano aktywność cytotoksyczną CTL indukowanych przez pobudzenie peptydem o SEQ ID nr 2, 8 lub 9 komórek docelowych B-LCL traktowanych pulsowo (słupek zamalowany) lub nie traktowanych (słupek niezamalowany) peptydem. Na rysunku oś pionowa odpowiada swoistej aktywności cytotoksycznej (% lizy swoistej). Najlepszy sposób wykonywania wynalazku [0009] Ujawnia się peptyd pochodzący z sekwencji aminokwasowej ludzkiego WT1 przedstawiony w SEQ ID nr 1 i wykazujący aktywność wiążącego się z HLA-A26 nowotworowego peptydu antygenowego. Sekwencja aminokwasowa ludzkiego WT1 przedstawiona w SEQ ID nr 1 jest sekwencją znaną (Cell, 60: 509, 1990,

9 10 numery dostępu bazy danych NCBI XP_ i P19544). Tę sekwencję aminokwasową ludzkiego WT1 przedstawiono w SEQ ID nr 1. Jako antygeny HLA-A26 znane są HLA-A*2601, HLA-A*2602, HLA-A*2603 i tym podobne. Niniejszy wynalazek dotyczy konkretnego antygenu HLA-A26, a mianowicie HLA-A*2601. W Japonii około 20% populacji posiada HLA- A26 jako jeden z antygenów HLA. [0010] Po raz pierwszy stwierdzono, że sekwencja aminokwasowa WT1 zawiera części nowotworowego peptydu antygenowego zdolne do wiązania się z antygenem HLA-A26 i rozpoznawane przez CTL, co doprowadziło do ujawnienia niniejszego wynalazku. W kontekście niniejszego wynalazku, termin wykazywać/wykazuje aktywność wiążącego się z HLA-A26 nowotworowego peptydu antygenowego oznacza, że peptyd wykazuje aktywność wiązania się z antygenem HLA-A26 i jest rozpoznawany przez cytotoksyczne limfocyty T (CTL); określenie to jest synonimiczne z wiązaniem się z antygenem HLA-A26 i indukowaniem CTL (wykazywaniem aktywności indukowania CTL) lub wiązaniem się z antygenem HLA-A26 i aktywowaniem CTL (wykazywaniem aktywności aktywowania CTL). Nowotworowy peptyd antygenowy, określony w zastrzeżeniach, można identyfikować poprzez zsyntetyzowanie peptydu częściowego (peptydu), kandydata złożonego z 8-11 ciągłych aminokwasów z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID nr 1, i badania, czy peptyd wykazuje aktywności czy nie wykazuje wiążącego się z HLA- A26 nowotworowego peptydu antygenowego. [0011] Synteza peptydów można zatem prowadzić sposobem ogólnie stosowanym w dziedzinie chemii peptydów. Sposób

10 11 taki można znaleźć w piśmiennictwie, na przykład w Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, t. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Maruzen, Inc., 1975; Peptide-Gosei no Kiso to Jikken, Maruzen, Inc., 1985; i Iyakuhin no Kaihatsu (Zoku), t. 14, Peptide Synthesis, Hirokawasyoten, [0012] To, czy peptyd - kandydat jest wiążącym się z HLA-A26 nowotworowym peptydem antygenowym, można badać na przykład sposobem opisanym w Tissue Antigen 61: 136, 2003, lub sposobem opisanym w poniższych przykładach roboczych. Podobnie można również badać, czy peptyd - kandydat jest peptydem o aktywności wiążącego się z HLA-A26 nowotworowego peptydu antygenowego. [0013] Konkretnie, najpierw od osób dodatnich pod względem antygenu HLA-A26 izoluje się komórki jednojądrzaste z krwi obwodowej o (PBMC) i hoduje się po dodaniu peptydu - kandydata (traktowanie pulsowe). Po hodowli, hodowlę wielokrotnie stymuluje się przez dodawanie co kilka dni peptydu celem powielenia CTL swoistych dla tego peptydu. Następnie wykrywa się swoistą dla peptydu reakcję CTL poprzez oznaczanie cytokin, takich jak IFN-γ, wytwarzanych przez CTL, lub aktywności cytotoksycznej CTL. Aktywność cytotoksyczną można oznaczać na przykład testem uwalniania 51 Cr (Int. J. Cancer, 58:317, 1994) lub tym podobnymi testami. Do przykładów komórek docelowych, które można zastosować w tym teście, należą wyznakowane 51 Cr komórki WT-dodatnie i HLA-A26-dodatnie. Konkretne przykłady obejmują wyznakowane 51 Cr komórki uzyskiwane przez wprowadzenie genu kodującego HLA-A26 (na przykład, numer dostepu D14350)

11 12 do linii komórek białaczki, WT1-dodatniej i HLA-A26- ujemnej. Gdy wyniki powyższego testu pokazują, że CTL zabijają komórki docelowe lub wytwarzają cytokiny, taki peptyd - kandydat identyfikuje się jako wiążący się z HLA-A26 nowotworowy peptyd antygenowy lub peptyd o aktywności takiej, jak wiążący się z HLA-A26 nowotworowy peptyd antygenowy. Niniejszy wynalazek ujawnia peptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID nr 2, 8 lub 9. Nie ma ograniczeń co do długości takiego peptydu pod warunkiem, że taki peptyd wykazuje aktywność wiązania się z antygenem HLA-A26 i jest rozpoznawany przez CTL. Wiadomo jednak, że peptyd (nowotworowy peptyd antygenowy) wykazujący aktywność wiązania z antygenem HLA zwykle składa się z 8-11 aminokwasów. Zgodnie z tym, częścią peptydu o aktywności nowotworowego peptydu antygenowego w peptydzie ujawnianym w kontekście niniejszego wynalazku zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID nr 2, 8, lub 9, jest peptyd korzystnie złożony z 9-11 aminokwasów, korzystniej, 9-10 aminokwasów. Jeszcze korzystniej, jest to nowotworowy peptyd antygenowy składający się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID nr 2, 8 lub 9 albo, najkorzystniej, nowotworowy peptyd antygenowy składający się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID nr 2, 8 lub 9. [0014] Peptydy ujawniane w kontekście niniejszego wynalazku można odpowiednio zmieniać w takim zakresie, aby utrzymać aktywność. W rozumieniu niniejszego opisu

12 13 zmiana reszty aminokwasowej oznacza podstawienie, delecję i/lub addycję reszty lub reszt aminokwasowych (addycja obejmuje addycję aminokwasu/aminokwasów na końcu N i/lub C peptydu). Korzystne jest podstawienie reszty lub reszt aminokwasowych. Gdy zmiana obejmuje podstawienie reszty lub reszt aminokwasowych, można zastąpić dowolną liczbę reszt aminokwasowych w dowolnej pozycji, pod warunkiem, że zachowana jest aktywność nowotworowego peptydu antygenowego. Jednakże, jako że peptyd wiążący się z antygenem HLA ma zwykle długość około 8-11 aminokwasów, zmiana korzystnie obejmuje jeden do kilku aminokwasów. [0015] Niniejszy wynalazek ujawnia również peptyd (tak zwany peptyd epitopowy), zawierający peptyd według niniejszego wynalazku wraz z peptydem pomocniczym lub innym nowotworowym peptydem antygenowym. [0016] Niedawno wykazano, że peptyd ( peptyd epitopowy ), złożony z wielu połączonych ze sobą epitopów CTL (peptydów antygenowych) wykazuje aktywność skutecznego indukowania CTL. Doniesiono na przykład, że peptyd (około 30-mer), w którym każdy z połączonych ze sobą epitopów dla CTL był ograniczony do HLA-A2-, -A3, -All lub B53 i pochodził z nowotworowego białka antygenowego PSA, indukuje in vivo CTL swoiste dla odpowiednich epitopów dla CTL (Journal of Immunology 1998, 161: ). [0017] Dodatkowo wykazano, że peptyd (peptyd epitopowy), w którym epitop (epitopy) dla CTL i epitop (epitopy) pomocnicze są powiązane ze sobą, skutecznie indukuje CTL. W tym kontekście epitop pomocniczy

13 14 oznacza peptyd zdolny do aktywowania CD4-dodatnich limfocytów T (Immunity, 1:751, 1994); do ich przykładów należy HBVc , pochodzący z wirusa zapalenia wątroby typu B, TT pochodzący z toksyny tężca. Limfocyty T CD4+, aktywowane przez epitop pomocniczy, wykazują różne aktywności, w tym indukowanie i podtrzymywanie CTL, różnicowanie i aktywacja efektorów, takich jak makrofagi itd., uważa się zatem, że są ważne w immunologicznej odpowiedzi przeciwnowotworowej. Jako konkretny przykład peptydu, w którym epitop (epitopy) pomocnicze i epitop (epitopy) dla CTL są połączone razem, można podać doniesienie, że DNA (minigen) kodujący peptyd złożony z pochodzących z HBV, ograniczonych do HLA-A2 peptydów antygenowych (6 peptydów), ograniczonych do HLA-A11 peptydów antygenowych (3 peptydy) i epitopu pomocniczego skutecznie indukuje in vivo CTL ukierunkowane na odpowiednie epitopy (Journal of Immunology 1999, 162: ). W praktyce, peptyd, w którym epitop dla CTL (nowotworowy peptyd antygenowy odpowiadający pozycjom antygenu czerniaka gp100) i epitop pomocniczy (pochodzący z toksyny tężca epitop pomocniczy T) są połączone ze sobą, poddano badaniu klinicznemu (Clinical Cancer Res., 2001, 7: ). [0018] Zgodnie z tym, do peptydów określonych w zastrzeżeniach należą również peptydy epitopowe, w których liczne epitopy, w tym wyżej wymienione peptydy według niniejszego wynalazku, są połączone ze sobą i które wykazują aktywność indukowania CTL. Gdy epitopem, który ma być połączony z nowotworowym peptydem antygenowym ujawnianym w kontekście

14 15 niniejszego wynalazku jest epitop dla CTL (nowotworowy peptyd antygenowy), do przykładów epitopów dla CTL, które można zastosować, należą pochodzące z WT1 epitopy dla CTL zdolne do wiązania się z HLA-A*0201, -A*0204, - A*0205, -A*0206, -A*0207,-A11, -A24, -A31, - A*6801, - B7, -B8, -B*2705, -B37, -Cw*0401 lub -Cw*0602 (Int. J. Hematol 76: 127, 2002; Int. J. Hematol 78: 56, 2003, WO 00/06602, WO 00/18795). Wiele takich epitopów dla CTL może być połączonych ze sobą; długość jednego epitopu dla CTL może wynosić około 8-14 aminokwasów, co stwierdza się na podstawie analizy peptydów antygenowych związanych z różnymi cząsteczkami HLA (Immunogenetics, 41: 178, 1995). [0019] Gdy epitopem, który ma być połączony z nowotworowym peptydem antygenowym ujawnianym w kontekście niniejszego wynalazku jest epitop pomocniczy, do przykładów epitopów pomocniczych, które można zastosować, należą wyżej wspomniany HBVc pochodzący z wirusa zapalenia wątroby B, TT pochodzący z toksyny tężcowa, epitop pomocniczy pochodzący z WT1 (Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His, SEQ ID nr 5) i tym podobne. Epitop pomocniczy może mieć długość około aminokwasów, korzystnie, około aminokwasów. [0020] Konkretnie, peptydami epitopowymi ujawnianymi w kontekście niniejszego wynalazku są peptyd epitopowy przedstawiony w SEQ ID nr 2, 8 lub 9 i peptyd pomocniczy. Bardziej szczegółowo, do przykładów należy peptyd epitopowy, zawierający peptyd złożony z sekwencji amino-

15 16 kwasowej przedstawionej w SEQ ID nr 2, 8 lub 9 i peptyd złożony z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID nr 5; peptyd epitopowy, zawierający peptyd złożony z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID nr 2, 8 lub 9 i peptyd pomocniczy pochodzący z toksyny tężcowej (na przykład, Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu, SEQ ID nr 6) oraz peptyd epitopowy, zawierający peptyd złożony z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID nr 2, 8 lub 9 i peptyd (Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu, SEQ ID nr 7; Clinical Cancer Res., 2001, 7: ). [0021] Peptyd (peptyd epitopowy), w którym znajdują się liczne, połączone ze sobą epitopy, można wytwarzać zwykłym sposobem syntezy peptydów, jak opisano powyżej. Można go również wytwarzać zwykłym sposobem syntezy DNA i inżynierii genetycznej na podstawie informacji o sekwencji polinukleotydu kodującego peptyd epitopowy, w którym liczne epitopy są ze sobą połączone. Konkretnie, peptyd epitopowy, w którym liczne epitopy są ze sobą połączone, można wytwarzać przez wprowadzenie polinukleotydu do znanego wektora ekspresyjnego, transformację komórki gospodarza uzyskanym rekombinowanym wektorem ekspresyjnym, hodowlę uzyskanych transformowanych komórek i odzyskiwanie z hodowli takiego peptydu epitopowego, w którym wiele epitopów jest ze sobą połączonych. Procesy te można prowadzić na przykład sposobem opisanym w piśmiennictwie (Molecular Cloning, T. Maniatis i wsp., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning; DM. Glover, IRL PRESS (1985)) lub sposobem opisanym poniżej.

16 17 [0022] Indukującą CTL aktywność tak wytworzonego peptydu epitopowego, w którym wiele epitopów jest ze sobą połączonych, można zbadać na przykład przez poddanie go wspomnianemu wyżej testowi uwalniania 51 Cr. [0023] Wyżej opisane peptydy (w tym peptydy epitopowe), ujawniane w kontekście niniejszego wynalazku, można modyfikować na grupie aminowej aminokwasu N-końcowego i/lub na grupie karboksylowej aminokwasu C-końcowego. Peptydy, w których N-końcowa i/lub C-końcowa reszta aminokwasowa jest zmodyfikowana, są zatem takimi peptydami jak ujawnione w kontekście niniejszego wynalazku. [0024] Do przykładów grup do modyfikacji grupy aminowej aminokwasu N-końcowego należy od jednej do 3 grup dobranych spośród grupy C 1-6 -alkilowej, fenylowej, cykloalkilowej i acylowej. Do grup acylowych należy grupa C 1-6 -alkanoilowa, grupa C 1-6 -alkanoilowa podstawiona grupą fenylową, grupa karbonylowa podstawiona grupą C cykloalkilową, grupa C 1-6 -alkilosulfonylowa, grupa fenylosulfonylowa, grupa C 2-6 -alkoksykarbonylowa, grupa alkoksykarbonylowa podstawiona grupą fenylową, grupa karbonylowa podstawiona grupą C 5-7 -cykloalkoksylową, grupa fenoksykarbonylowa i tym podobne. [0025] Do przykładów peptydów zmodyfikowanych na grupie karboksylowej aminokwasu C-końcowego należą estry i amidy. Do estrów należą estry C 1-6 -alkilowe, estry C 0-6 alkilowe podstawione grupą fenylową, estry C 5-7 -cykloalkilowe i tym podobne. Do amidów należą konkretne amidy, amidy podstawione jedną lub dwiema grupami C 1-6 -alkilowymi, amidy podstawione jedną lub dwiema grupami C 0-6 -

17 18 alkilowymi, podstawionymi grupą fenylową, amidy tworzące 5-7-członowe azacykloalkany, zawierające atom azotu grupy amidowej i tym podobne. [0026] Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również polinukleotyd kodujący wyżej wymieniony peptyd. Polinukleotyd kodujący peptyd ujawniany w kontekście niniejszego wynalazku może mieć postać DNA lub RNA. Polinukleotydy ujawniane w kontekście niniejszego wynalazku można łatwo wytwarzać na podstawie informacji o sekwencji aminokwasowej peptydu według niniejszego wynalazku lub sekwencji polinukleotydowej DNA kodującego ten peptyd. Szczegółowo, syntezę można przeprowadzić zwykłym sposobem syntezy DNA lub poprzez powielenie metodą PCR. Przedmiotem niniejszego wynalazku są także polinukleotydy kodujące peptyd epitopowy, zawierający peptyd złożony z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID nr 2, 8 lub 9 i epitop pomocniczy. Polinukleotyd kodujący peptyd epitopowy, w skład którego wchodzi peptyd złożony z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID nr 2, 8 lub 9 i peptyd złożony z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID nr 5; polinukleotyd kodujący peptyd epitopowy, w skład którego wchodzi peptyd złożony z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID nr 2, 8 lub 9 i peptyd pomocniczy pochodzący z toksyny tężcowej (na przykład, Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu, SEQ ID nr 6); i polinukleotyd kodujący peptyd epitopowy, w skład którego wchodzi peptyd złożony z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID nr 2, 8 lub 9 i peptyd (Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile

18 19 Thr Glu Leu, SEQ ID nr 7; Clinical Cancer Res., 2001, 7: ). [0027] Rekombinowany wektor ekspresyjny do ekspresji peptydu ujawnianego w kontekście niniejszego wynalazku można wytwarzać przez włączanie polinukleotydu wytwarzanego w powyższy sposób do wektora ekspresyjnego. Odpowiedni wektor ekspresyjny można dobrać w zależności od wykorzystywanego gospodarza, celu i tym podobnych czynników; mogą to być plazmidy, wektory fagowe, wektory wirusowe i tym podobne. [0028] Gdy gospodarzem jest Escherichia coli, do przykładów wektorów należą wektory plazmidowe, takie jak puc118, puc119, pbr322, pcr3 i tym podobne; i wektory fagowe, takie jak λzapii, λgt11 i tym podobne. Gdy gospodarzem są drożdże, do przykładów wektorów należą pyes2, pyeura3 i tym podobne. Gdy gospodarzem są komórki owadzie, do przykładów wektorów należą pacsghisnt-a i tym podobne. Gdy gospodarzem są komórki zwierzęce, do przykładów wektorów należą wektory plazmidowe, takie jak pkcr, pcdm8, pgl2, pcdna3.1, prc/rsv, prc/cmv i tym podobne; wektory wirusowe, takie jak wektor retrowirusowy, wektor adenowirusowy, wektor wirusa związanego z adenowirusami i tym podobne. [0029] Powyższe wektory ekspresyjne mogą ewentualnie zawierać czynnik lub czynniki, takie jak promotor zdolny do indukowania ekspresji (promotor indukujący ekspresję), gen kodujący sekwencję sygnałową, gen markerowy do selekcji, terminator i tym podobne. Ponadto wektor ekspresyjny może zawierać dodatkową sekwencję do ekspresji peptydu w postaci białka fuzyjnego

19 20 z tioredoksyną, znacznikiem His, GST (S-transferaza glutationu) lub tym podobne, celem ułatwienia izolowania i oczyszczania. Wektory, użyteczne w takim przypadku, obejmują wektory dla białka fuzyjnego GST, zawierające odpowiedni promotor (lac, tac, trc, trp, CMV, promotor wczesny SV40 itd.), działające w komórkach gospodarza, takie jak pgex4t; wektory zawierające sekwencję znacznika (Myc, His, etc), takie jak pcdna3.1/myc-his i wektory zdolne do ekspresji białka fuzyjnego z tioredoksyną i znacznikiem His, takie jak pet32a. [0030] Transformowane komórki, zawierające wektor ujawniany w kontekście niniejszego wynalazku, można wytwarzać przez transformację komórek gospodarza wektorem ekspresyjnym wytwarzanym w sposób omówiony powyżej. Do komórek gospodarza nadających się do wykorzystania według niniejszego wynalazku należą komórki Escherichia coli, komórki drożdży, komórki owadzie i komórki zwierzęce. Do przykładów Escherichia coli należą szczepy E. coli K-12, takie jak HB101, C600, JM109, DH5α i AD494 (DE3). Do przykładów drożdży należą Saccharomyces cerevisiae. Do przykładów komórek zwierzęcych należą komórki L929, BALB/c3T3, C127, CHO, COS, Vero i HeLa. Do przykładów komórek owadzich należą sf9. [0031] Wprowadzenie wektora ekspresyjnego do komórek gospodarza można przeprowadzić sposobem konwencjonalnym, nadającym się do zastosowania w odpowiednich, wymienionych powyżej komórkach gospodarza. Konkretnie, wprowadzenie można przeprowadzić metodą z fosforanem wapnia, metodą z DEAE-dekstranem, metodą elektroporacji

20 21 i metodą z zastosowaniem lipidów do transfery genów (Lipofectamine, Lipofectin; Gibco-BRL). Transformowane komórki zawierające wektor ekspresyjny można selekcjonować poprzez hodowanie komórek gospodarza po wprowadzeniu w konwencjonalnej pożywce, zawierającej marker selekcyjny. [0032] Peptyd ujawniany w kontekście niniejszego wynalazku można wytwarzać przez hodowanie transformowanych komórek w odpowiednich warunkach (warunkach, w których peptydy mogą ulegać ekspresji). Uzyskany peptyd można poddawać następnie izolowaniu i oczyszczaniu standardowymi, biochemicznymi metodami oczyszczania. Do metod o- czyszczania należą: wysalanie, chromatografia jonowymienna, chromatografia absorpcyjna, chromatografia powinowactwa, chromatografia żelowa filtracyjna i tym podobne. Gdy polipeptyd według niniejszego wynalazku ulega ekspresji jako peptyd fuzyjny z tioredoksyną, znacznikiem His, GST lub tym podobnymi, jak wspomniano powyżej, peptyd można izolować i oczyszczać odpowiednimi metodami oczyszczania z wykorzystaniem charakterystyki białka fuzyjnego lub znaczników. [0033] Niniejszy wynalazek ujawnia przeciwciało swoiście wiążące się z peptydem ujawnianym w kontekście niniejszego wynalazku. Przeciwciało ujawniane w kontekście niniejszego wynalazku nie jest ograniczone do żadnej postaci i może być przeciwciałem poliklonalnym lub monoklonalnym, wzbudzonym przeciwko peptydowi ujawnianemu w kontekście niniejszego wynalazku jako antygenowi.

21 22 Jak wspomniano powyżej, nie ma ograniczeń co do przeciwciała ujawnianego w kontekście niniejszego wynalazku pod warunkiem, że swoiście wiąże się ono z peptydem u- jawnianym w kontekście niniejszego wynalazku. Przykładami przeciwciała według niniejszego wynalazku są przeciwciała swoiście wiążące się z peptydem złożonym z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID nr 2, 8 lub 9. [0034] Sposoby wytwarzania przeciwciał są dobrze znane w tej dziedzinie; przeciwciała według niniejszego wynalazku można wytwarzać takimi konwencjonalnymi sposobami (Current Protocols in Molecular Biology, wyd. Ausubel i wsp. (1987) wyd. John Wiley and Sons, rozdz , Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D. i wsp., wyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1989). [0035] Konkretnie, przeciwciała można wytwarzać przez immunizację zwierzęcia innego niż człowiek, na przykład królika, peptydem ujawnianym w kontekście niniejszego wynalazku jako antygenem, i odzyskiwanie w konwencjonalny sposób przeciwciał z surowicy immunizowanego zwierzęcia. Z drugiej strony, przeciwciała monoklonalne można wytwarzać przez immunizację zwierzęcia innego niż człowiek, na przykład myszy, peptydem ujawnianym w kontekście niniejszego wynalazku, poddawanie uzyskanych splenocytów fuzji komórkowej z komórkami szpiczaka i odzyskiwanie przeciwciał z uzyskanych komórek hybrydomy (Current Protocols in Molecular Biology (wyd.), Ausubel i wsp. (1987) wyd. John Wiley and Sons, rozdz ).

22 23 [0036] Przeciwciała przeciwko peptydowi ujawnianemu w kontekście niniejszego wynalazku można również wytwarzać ze zwiększaniem odpowiedzi immunologicznej przy zastosowaniu różnych adiuwantów, zależnie od gospodarza. Do przykładów adiuwantów należą adiuwanty Freunda, żele mineralne, takie jak wodorotlenek glinu, środki powierzchniowo czynne, takie jak lizolecytyna, poliol Pluronic, polianion, peptyd, emulsja olejowa, hemocyjanina Megathura crenulata (ang. keyhole limpet) i dinitroenol; adiuwanty ludzkie, takie jak BCG (pałeczka Calmette a-guérina) lub Corynebacterium, i tym podobne. [0037] Jak wspomniano powyżej, przeciwciała rozpoznające peptyd ujawniany w kontekście niniejszego wynalazku i przeciwciała zobojętniające jego aktywność można łatwo uzyskać przez odpowiednią immunizację zwierzęcia peptydem według niniejszego wynalazku w konwencjonalny sposób. Przeciwciała można stosować w chromatografii powinowactwa, immunologicznych metodach diagnostycznych i tak dalej. Immunologiczna metoda diagnostyczna może być odpowiednio dobrana spośród następujących: analiza Western, test radioimmunologiczny (RIA), enzymatyczny test immunoabsorpcyjny (ELISA), test fluorescencyjny lub luminescencyjny i tym podobne. Immunologiczna metoda diagnostyczna jest skuteczna w diagnostyce raka przebiegającego ze zwiększeniem ekspresji WT1, na przykład nowotworów krwi takich jak białaczka, zespół mielodysplastyczny, szpiczak mnogi i chłoniak złośliwy, i litych guzów nowotworowych, takich jak rak żołądka, rak jelita grubego, rak płuca, rak sutka, rak zarodkowy, rak wątroby, rak skóry, rak pęcherza moczo-

23 24 wego, rak prostaty, rak macicy, rak szyjki macicy i rak jajnika. [0038] Niniejszy wynalazek dostarcza komórki prezentującej antygen, które prezentuje kompleks między peptydem według niniejszego wynalazku a antygenem HLA-A26. Jak przedstawiono w poniższych przykładach, pobudzenie peptydem według zastrzeżeń w kontekście niniejszego wynalazku indukuje CTL, co wskazuje na istnienie komórek prezentujących antygeny, prezentujących kompleks między peptydem ujawnianym w kontekście niniejszego wynalazku a antygenem HLA-A26 i na to, że doszło do indukcji CTL swoiście rozpoznających te komórki prezentujące antygen. Takie komórki prezentujące antygen prezentujące kompleks między peptydem według niniejszego wynalazku a antygenem HLA-A26 stosuje się skutecznie w terapii komórkowej (terapii DC), jak opisano poniżej. [0039] Do komórek prezentujących antygen według niniejszego wynalazku należą dowolne komórki prezentujące kompleks antygenu HLA-A26 i nowotworowego peptydu antygenowego według niniejszego wynalazku, przy czym kompleks między peptydem składającym się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID nr 2, 8 lub 9 a antygenem HLA-A26 jest prezentowany na powierzchni komórek dendrytycznych. [0040] Komórki prezentujące antygen, stosowane w terapii komórkowej (terapii DC) można wytwarzać przez izolowanie od pacjenta z nowotworem komórek zdolnych do prezentowania antygenów, traktowanie komórek pulsowo in vitro zastrzeganym peptydem lub wprowadzanie do komórek

24 25 polinukleotydu lub zawierającego go wektora ekspresyjnego, ujawniono w kontekście niniejszego wynalazku, i jak umożliwienie prezentacji przez komórki na powierzchni komórek kompleksu między antygenem HLA-A26 a zastrzeganym nowotworowym peptydem antygenowym. Termin komórki zdolne do prezentowania antygenów nie jest ograniczony do konkretnych komórek: mogą to być dowolne komórki wykazujące ekspresję antygenu HLA-A26, zdolne do prezentacji peptydu według niniejszego wynalazku na powierzchni komórek; korzystne są jednak komórki dendrytyczne, o których wiadomo, że mają szczególnie dużą zdolność do prezentowania antygenów. Ponadto, substancją stosowaną do traktowania pulsowego wyżej omówionych komórek o zdolności do prezentacji antygenu może być peptyd według niniejszego wynalazku, polinukleotyd kodujący peptyd według niniejszego wynalazku lub zawierający go wektor ekspresyjny. [0041] Zastrzegane komórki prezentujące antygen, można wytwarzać na przykład przez izolowanie komórek o zdolności do prezentowania antygenu od pacjenta z rakiem, traktowanie pulsowe komórek in vitro peptydem ujawnianym w kontekście niniejszego wynalazku (to znaczy nowotworowym peptydem antygenowym składającym się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID nr 2, 8 lub 9), przez co powstaje kompleks między antygenem HLA-A26 a peptydem według niniejszego wynalazku (Cancer Immunol. Immunother., 46:82, 1998, J. Immunol., 158:str. 1796, 1997, Cancer Res., 59: p1184, 1999). Gdy używa się komórek dendrytycznych, komórki prezentujące antygen według niniejszego wynalazku można wytwarzać na przykład przez izolowanie limfocytów z

25 26 krwi obwodowej pacjenta z rakiem metodą z zastosowaniem Ficollu, usunięcie komórek, które nie uległy adhezji, inkubację komórek, które uległy adhezji w obecności GM- CSF i IL-4 celem zaindukowania komórek dendrytycznych i pulsowe traktowanie komórek dendrytycznych poprzez inkubację z peptydem według niniejszego wynalazku. [0042] W przypadku, gdy komórki prezentujące antygen według niniejszego wynalazku wytwarza się przez wprowadzenie polinukleotydu kodującego peptyd zastrzegany (to znaczy polinukleotydu kodującego peptyd epitopowy, zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID nr 2, 8 lub 9) lub zawierającego go wektora ekspresyjnego do wyżej wymienionych komórek, wykazujących zdolność do prezentacji antygenu, wytwarzanie można prowadzić z odniesieniem się do metody opisanej w Cancer Res., 56: str. 5672, 1996, J. Immunol., 161:str. 5607, 1998 lub tym podobnych, gdy polinukleotyd stanowi DNA. Wytwarzanie komórek prezentujących antygen można przeprowadzić z zastosowaniem zarówno RNA, jak i DNA, w podobny sposób, odnosząc się do J. Exp. Med., 184: p465, 1996, lub innym podobnym sposobem. [0043] Niniejszy wynalazek dostarcza również CTL rozpoznających kompleks między nowotworowym peptydem antygenowym według niniejszego wynalazku a antygenem HLA- A26. Jak przedstawiono w poniższych przykładach, stymulacja zastrzeganym peptydem powoduje aktywność indukującą CTL. Wskazuje to na istnienie komórek prezentujących antygen, prezentujących kompleks między peptydem

26 27 ujawnianym w kontekście niniejszego wynalazku a antygenem HLA-A26 i na to, że dochodzi do indukowania CTL swoiście rozpoznających te komórki prezentujące antygen. Takie CTL, swoiście rozpoznające kompleks między antygenem HLA-A26 a peptydem ujawnianym w kontekście niniejszego wynalazku można stosować skutecznie w opisanej poniżej immunoterapii adoptywnej. [0046] CTL według niniejszego wynalazku mogą mieć dowolną postać pod warunkiem, że rozpoznają swoiście kompleks zastrzeganego peptydu z antygenem HLA-A26 i obejmują CTL monoklonalne i mieszaninę (populację) CTL, zawierającą klony różnego rodzaju. W szczególności, do przykładów należą CTL swoiście rozpoznające kompleks peptydu złożonego z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID nr 2, 8 lub 9 z antygenem HLA- A26. [0044] CTL stosowane w immunoterapii adoptywnej można wytwarzać przez izolowanie od pacjenta limfocytów krwi obwodowej, stymulowanie komórek in vitro zastrzeganym peptydem (to znaczy nowotworowym peptydem antygenowym składającym się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID nr 2, 8 lub 9), polinukleotydem kodującym zastrzegany peptyd (to znaczy polinukleotydem kodującym peptyd epitopowy, zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID nr 2, 8 lub 9) lub zawierającym go wektorem ekspresyjnym (Journal of Experimental Medicine 1999, 190: 1669). [0045] Wyżej opisane peptydy, wektory ekspresyjne, komórki, komórki prezentujące antygen i CTL, ujawniane w kontekście niniejszego wynalazku, można stosować jako

27 28 składnik czynny substancji indukującej CTL, to znaczy szczepionki nowotworowej, przez wytworzenie z nich odpowiedniej postaci, zależnie od odpowiednich substancji, jak opisano bardziej szczegółowo poniżej. (1) Szczepionka nowotworowa zawierająca jako składnik czynny peptyd według niniejszego wynalazku [0046] Peptyd ujawniany w kontekście niniejszego wynalazku ma zdolność indukowania CTL, a tak indukowane CTL mogą wywierać działanie przeciwnowotworowe poprzez aktywność cytotoksyczną lub wytwarzanie limfokin. Peptyd ujawniany w kontekście niniejszego wynalazku można zatem stosować jako składnik czynny szczepionki nowotworowej do leczenia lub zapobiegania rakowi.a zatem niniejszy wynalazek dostarcza szczepionki nowotworowej (kompozycji farmaceutycznej jako szczepionki nowotworowej), zawierającej jako składnik czynny zastrzegany peptyd. Gdy szczepionkę nowotworową według niniejszego wynalazku podaje się pacjentowi posiadającemu HLA-A26 i WT1, peptyd (to znaczy nowotworowy peptyd antygenowy składający się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID nr 2, 8 lub 9) jest prezentowany antygenowi HLA-A26 komórek prezentujących antygen. Następnie CTL swoiście rozpoznające prezentowany kompleks antygenu HLA-A26 mogą proliferować i niszczyć komórki nowotworowe, przez co możliwe staje się leczenie lub profilaktyka choroby nowotworowej. Szczepionkę nowotworową według niniejszego wynalazku można stosować w zapobieganiu lub leczeniu raka, któremu towarzyszy podwyższenie poziomu ekspresji genu WT1, takiego jak na przykład nowotwory krwi, takie jak białaczka, zespół mielodysplastyczny, szpiczak mnogi i

28 29 chłoniak złośliwy, oraz lite guzy nowotworowe, takie jak rak żołądka, rak jelita grubego, rak płuca, rak sutka, rak zarodkowy, rak wątroby, rak skóry, rak pęcherza moczowego, rak prostaty, rak macicy, rak szyjki macicy i rak jajnika. A zatem w innym wykonaniu niniejszy wynalazek dostarcza kompozycji farmaceutycznej, zawierającej skuteczną ilość szczepionki nowotworowej według niniejszego wynalazku do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu u pacjentów posiadających HLA-A26-dodatnich i WT1- dodatnich. [0047] Szczepionka nowotworowa zawierająca jako składnik czynny peptyd według niniejszego wynalazku może zawierać jako składnik czynny jeden epitopowy dla CTL (to znaczy nowotworowy peptyd antygenowy składający się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID nr 2, 8 lub 9) lub peptyd epitopowy, w którym peptyd jest powłączony z innym peptydem lub peptydami (takimi jak epitop dla CTL, epitop pomocniczy itd.). Niedawno wykazano, że peptyd epitopowy, w którym połączonych jest wiele epitopów dla CTL (peptydów antygenowych), wykazuje aktywność skutecznego indukowania CTL in vivo. Opisano na przykład, że około 30-merowy peptyd epitopowy, w którym znajdowały się połączone epitopy dla CTL (peptydy antygenowe) ograniczone do HLA-A2-, - A3, -A11 lub B53 pochodzące z nowotworowego białka antygenowego PSA, indukuje in vivo CTL swoiste dla odpowiednich epitopów dla CTL (Journal of Immunology 1998, 161: ). Opisuje się również, że peptyd epitopowy, w którym połączone są epitop lub epitopy dla CTL i epitop lub epitopy pomocnicze może skutecznie

29 30 indukować CTL. Przy podawaniu peptydu epitopowego w tych postaciach peptyd włącza się do komórek prezentujących antygen; odpowiednie peptydy antygenowe, powstałe na drodze rozpadu wewnątrzkomórkowego, wiążą się z antygenami HLA, tworząc kompleksy; kompleksy są prezentowane z dużą gęstością na powierzchni komórek prezentujących antygeny i dochodzi do skutecznej proliferacji w organizmie CTL swoistych dla kompleksów i do niszczenia komórek nowotworowych. W ten sposób osiąga się leczenie lub zapobieganie rakowi. [0048] Szczepionkę nowotworową, zawierającą jako składnik czynny peptyd według niniejszego wynalazku, można podawać wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, na przykład z odpowiednim adiuwantem, lub w postaci cząstek, tak że może dojść do skutecznego wytworzenia odporności komórkowej. Jako adiuwant można zastosować jeden z adiuwantów opisanych w piśmiennictwie (Clin. Microbiol. Rev., 7: , 1994) i tym podobne. Do konkretnych przykładów należą składniki pochodzące z drobnoustrojów, cytokiny, składniki pochodzące z roślin, składniki pochodzące z organizmów morskich, żele mineralne, takie jak wodorotlenek glinu, środki powierzchniowo czynne, takie jak lizolecytyna i poliole Pluronic, polianiony, peptydy, emulsje olejowe (preparaty emulsji) i tym podobne. Bierze się również pod uwagę preparaty liposomowe, preparaty upostaciowane, w których składnik jest związany z kulkami o średnicy kilku μm, preparaty, w których składnik jest połączony z lipidami i tym podobne. [0049] Podawanie można przeprowadzić na przykład śródskórnie, podskórnie, domięśniowo lub dożylnie.

30 31 Jakkolwiek dawkowanie peptydu według niniejszego wynalazku w preparacie można odpowiednio dostosowywać w zależności od choroby podlegającej leczeniu wieku i masy ciała pacjenta, zwykle mieści się ono w zakresie 0,0001mg mg, korzystnie 0,001mg mg, korzystniej 0,1mg - 10mg; dawkę tę można korzystnie podawać z częstością od jednego razu na kilka dni do jednego razu co kilka miesięcy. (2) Szczepionka DNA, której składnikiem czynnym jest wektor ekspresyjny, zawierający polinukleotyd kodujący peptyd według niniejszego wynalazku [0050] Składnikiem czynnym szczepionki DNA do leczenia lub zapobiegania rakowi może być nie tylko wyżej wymieniony peptyd według niniejszego wynalazku, lecz również wektor ekspresyjny, zawierający polinukleotyd kodujący peptyd według niniejszego wynalazku. A zatem ujawniona jest szczepionka nowotworowa (kompozycja farmaceutyczna stosowana jako szczepionka nowotworowa), której składnikiem czynnym jest wektor ekspresyjny, zawierający polinukleotyd kodujący peptyd według niniejszego wynalazku. [0051] Niedawno wykazano, że polinukleotyd kodujący peptyd epitopowy, w którym połączone są ze sobą liczne epitopy dla CTL (peptydy antygenowe) lub w którym połączone są ze sobą epitop (epitopy) dla CTL i epitop (epitopy) pomocnicze, wykazuje aktywność skutecznego indukowania CTL in vivo. Doniesiono na przykład, że DNA (minigen) kodujący peptyd epitopowy, w którym połączone są ze sobą pochodzące z HBV, ograniczone do HLA-A2 peptydy antygenowe (6 peptydów), ograniczone do HLA-A11

31 32 peptydy antygenowe (3 peptydy) i epitop pomocniczy, skutecznie indukuje in vivo CTL ukierunkowane na odpowiednie epitopy (Journal of Immunology 1999, 162: ). [0052] Zgodnie z tym, składnik czynny szczepionki nowotworowej można wytwarzać przez włączanie polinukleotydu kodującego zastrzegany peptyd epitopowy do odpowiedniego wektora ekspresyjnego. [0053] Przy podawaniu wektora ekspresyjnego, zawierającego polinukleotyd ujawniany w kontekście niniejszego wynalazku jako składnik czynny szczepionki nowotworowej (szczepionki DNA), można stosować następujące sposoby. Sposobem wprowadzania polinukleotydu ujawnianego w kontekście niniejszego wynalazku do komórek może być dowolny sposób, w tym sposoby z wykorzystaniem wektorów wirusowych lub inne sposoby (Nikkei-Science, kwiecień 1994, 20-45; Gekkan-Yakuji, 36(1), (1994); Jikken-Igaku-Zokan, 12(15), 1994, i cytowane tam pozycje piśmiennictwa). [0054] Do przykładów sposobu z wykorzystaniem wektora wirusowego należą sposoby, w których DNA według niniejszego wynalazku włącza się do wirusa DNA lub RNA, takiego jak retrowirus, adenowirus, wirus adenosatelitarny, wirus opryszczki, wirus krowianki, wirus ospy, wirus polio lub wirus Sindbis, po czym wprowadza się go do komórek. Szczególnie korzystne są sposoby z wykorzystaniem retrowirusów, adenowirusów, wirusów adenosatelitarnych lub wirusem krowianki lub tym podobne.

32 33 Do przykładów innych sposobów należy sposób, w którym plazmid ekspresyjny wstrzykuje się bezpośrednio domięśniowo (szczepienie DNA), metoda liposomowa, metoda z Lipofectin, mikroiniekcja, metoda z fosforanem wapnia i elektroporacja. Korzystne jest szczepienie DNA i metoda liposomowa. [0055] Jeżeli chodzi o sposób umożliwienia w praktyce polinukleotydowi ujawnianemu w kontekście niniejszego wynalazku działania jako lek, istnieje sposób in vivo, w którym polinukleotyd wprowadza się bezpośrednio do organizmu, i sposób ex vivo, w którym DNA wprowadza się pozaustrojowo do pewnych komórek pobranych od człowieka, po czym komórki te z powrotem wprowadza się do organizmu (Nikkei-Science, kwiecień 1994, 20-45; Gekkan-Yakuji, 36(1), (1994); Jikkenn-Igaku-Zokan, 12(15), 1994; i cytowane tam pozycje piśmiennictwa). Bardziej korzystny jest sposób in vivo. [0056] W przypadku sposobu in vivo podawanie można przeprowadzić dowolnymi odpowiednimi drogami, w zależności od choroby i objawów podlegajacych leczeniu. Środki można podawać na przykład drogą dożylną, dotętniczą, podskórną, śródskórną, domięśniową itd. Przy podawaniu metodą in vivo kompozycję można podawać w różnych postaciach, takich jak roztwór, typowo jednak wytwarza się ją na przykład jako zastrzyk, którego składnikiem czynnym jest wektor ekspresyjny, zawierający polinukleotyd według niniejszego wynalazku. Jeżeli jest to konieczne, zastrzyk może zawierać konwencjonalne nośniki. W przypadku liposomów lub liposomów w fuzji z błoną (takich jak liposomy wirusa Sendai (HVJ)), których składnikiem czynnym jest wektor

33 34 ekspresyjny, zawierający polinukleotyd ujawniany w kontekście niniejszego wynalazku, mogą one mieć postać preparatu liposomowego, takiego jak zawiesina, lek zamrożony, lek zamrożony zatężony przez odwirowanie lub tym podobne. Jakkolwiek zawartość w preparacie wektora ekspresyjnego, zawierającego polinukleotyd, można odpowiednio dostosowywać, na przykład w zależności od choroby podlegającej leczeniu, wieku i masy ciała pacjenta, zwykle można podawać 0,0001mg - 100mg, korzystnie 0,001mg - 10mg wektora ekspresyjnego, zawierającego polinukleotyd ujawniany w kontekście niniejszego wynalazku z częstością od jednego razu co kilka dni do jednego razu co kilka miesięcy. [0057] Gdy wyżej wymieniony wektor ekspresyjny, zawierający polinukleotyd ujawniany w kontekście niniejszego wynalazku, podaje się pacjentowi z rakiem, w komórkach prezentujących antygen dochodzi do ekspresji na wysokim poziomie polipeptydu odpowiadającemu temu polinukleotydowi. Następnie nowotworowe peptydy antygenowe, powstałe wskutek rozpadu wewnątrzkomórkowego, tworzą kompleksy z antygenami HLA; kompleksy są następnie prezentowane z dużą gęstością na powierzchni komórek prezentujących antygen; wtedy CTL swoiście rozpoznające te kompleksy ulegają skutecznej proliferacji w organizmie i niszczą komórki nowotworowe. W ten sposób osiąga się leczenie lub zapobieganie rakowi. Szczepionkę nowotworową, której składnikiem czynnym jest wektor ekspresyjny, zawierający polinukleotyd ujawniany w kontekście niniejszego wynalazku, można stosować w zapobieganiu lub leczeniu raka