PL 225283 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 225283 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 408981 (22) Data zgłoszenia: 24.07.2014 (51) Int.Cl. C07F 9/22 (2006.01) C07F 9/6561 (2006.01) C07H 19/10 (2006.01) A61K 31/7072 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) (54) Pochodne 2,3'-anhydro-2'-deoksy-5-fluorourydyny o działaniu cytotoksycznym, sposób wytwarzania i zastosowanie (73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET IM. ADAMA MICKIEWICZA W POZNANIU, Poznań, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: 22.06.2015 BUP 13/15 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.03.2017 WUP 03/17 (72) Twórca(y) wynalazku: LECH CELEWICZ, Poznań, PL KAROL KACPRZAK, Pecna, PL MARTA LEWANDOWSKA, Śrem, PL PIOTR RUSZKOWSKI, Suchy Las, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Wojciech Lisiecki
2 PL 225 283 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne 2,3 -anhydro-2 -deoksy-5-fluorourydyny, 5 sposób ich wytwarzania oraz zastosowanie jako środków cytotoksycznych. Choroby nowotworowe stanowią jeden z głównych problemów zdrowotnych ludzi, charakteryzując się najwyższym współczynnikiem umieralności oraz postępującą liczbą zachorowań, związaną głównie ze wzrostem długości oraz stylem życia. Terapia chorób nowotworowych jest trudna, kosztowna i w wielu przypadkach mało efektywna. Z tego powodu pilnie poszukiwane są nowe substancje o działaniu cytostatycznym. Ich źródłem mogą być produkty naturalne i ich pochodne oraz związki syntetyczne. Bardzo ważną grupą syntetycznych cytostatyków są pochodne oraz analogi zasad pirymidynowych czy purynowych oraz modyfikowane nukleozydy. Do nich należą m. in. 5-fluorouracyl oraz jego pochodne np. 5-fluoro-2 -deoksyurydyna (floksurydyna). Zarówno 5-fluorouracyl jak i 5-fluoro-2 - -deoksyurydyna wykazują zbliżoną aktywność cytostatyczną i są od wielu lat zarówno samodzielnie jak i w kombinacjach z innymi lekami stosowane w terapii nowotworów m.in. piersi, żołądka, jelita grubego, jajników i innych, 5-fluoro-2 -deoksyurydyna jest także dzięki lepszemu niż 5-fluorouracyl metabolizmowi wątrobowemu stosowana w terapii raka wątroby. Problemy terapii z wykorzystaniem 5-fiuorouracylu oraz 5-fluoro-2'-deoksyurydyny związane są z pojawiającą się opornością komórek rakowych wobec tych leków w wyniku ich długotrwałego stosowania. Istotnym ograniczeniem w stosowaniu 5-fluorouracylu jest jego stosunkowo wysoka toksyczność skutkująca m.in., działaniem neurotoksycznym oraz kardiotoksycznym, 5-fluorouracyl oraz 5-fluoro-2 -deoksyurydyna nie wykazują selektywności w stosunku do komórek rakowych i zdrowych, co stanowi istotne utrudnienie w stosowaniu tych związków w terapii. Jak wykazały badania Srivastav'a 2,3 -anhydro-2 -deoksy-5-fluorourydyna wykazuje słabe działanie przeciwwirusowe wobec wirusa HBV i znikomą aktywność cytotoksyczną wobec linii Huh-7 (IC 50 >200 µg/ml) (Srivastav, M. Mak, B. Agrawal, D. L. J. Tyrrell, R. Kumar Bioorg. Med. Chem. Lett., 2010,20, 6790 6793). Celem wynalazku było opracowanie nowych związków cytotoksycznych pochodnych 2,3'- -anhydro-2 -deoksy-5-fluorourydyny o wysokiej selektywności w stosunku do komórek rakowych oraz ich zastosowanie w terapii nowotworów. Przedmiotem wynalazku są pochodne 2,3 -anhydro-2 -deoksy-5-fluorourydyny o ogólnym wzorze 1. gdzie: Ar oznacza grupę fenylową. 4-chlorofenylową, 1-naftylową, 2-naftylową lub grupę fenylową podstawioną w pozycji para, meta lub orto: jednym atomem F, Cl, Br lub I, podstawnikiem alkilowym zawierającym od 1 do 12 atomów węgla, R oznacza grupę trifluorometylową, 2,2,2-trifluoroetylową dinuorometylową, pertluoroetylową, 1-fluoroetylową, 2-fluoroefylową, 1,1-difluoroetylową, 1,2-difluoroetylową, 2,2-difluoroetylową, 1,1,2- -trifluoroetylową, 1,2,2-trifluoroetylową, 1,2,2,2-tetrafluoroetylową. W drugim aspekcie przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania pochodnych 2,3 -anhydro- -2 -deoksy-5-fluorourydyny o ogólnym wzorze 1
PL 225 283 B1 3 gdzie Ar i R mają podane wyżej znaczenie, polegający na reakcji triazolidu o ogólnym wzorze 2, w którym Ar oznacza grupę fenylową, 4-chlorofenylową, 1-naftylową, 2-naftylową lub grupą fenylową podstawioną w pozycji para, meta lub orto: jednym atomem F, Cl, Br lub I, podstawnikiem alkilowym zawierającym od 1 do 12 atomów węgla; z fluorowanymi aminami o ogólnym wzorze 3 w którym R-NH 2 (3) R oznacza grupę trifluorometylową, 2,2,2-trifluoroetylową difluorometylową. perfluoroetylową, 1- -fluoroetylową, 2-fluoroetylową, 1,1-difluoroetylową, 1,2-difluoroetylową, 2,2-difluoroetylową, trifluoroetylową, 1,2,2-trifluoroetyIową, 1,1,2,2-tetrafluoroetylową, 1,2,2,2-tetrafluoroetylową lub solami amin o ogólnym wzorze 4, R-NH 3 + X - (4) w którym R ma wyżej podane znaczenie, a X - oznacza anion nieorganiczny z grupy Cl -, Br -, HSO 4 -, SO 4 2- NO 3 - w obecności amin alifatycznych, korzystnie trietyloaminy. Reakcja przebiega po dodaniu do roztworu zawierającego triazolid o ogólnym wzorze 2, fluorowanej aminy o wzorze ogólnym 3 w ilości od 0,1 do 5 równoważników w stosunku do triazolidu, a najkorzystniej 3 równoważniki. Alternatywnie reakcje triazolidu o wzorze ogólnym 2 można prowadzić z solami fluorowanych amin o wzorze ogólnym 4, najkorzystniej chlorowodorkami. W takim przypadku do roztworu zawierającego triazolid dodaje się sól fluorowanej aminy alifatycznej o wzorze ogólnym 4, w ilości od 0,1 do 5 równoważników w stosunku do triazolidu, najkorzystniej 3 równoważniki oraz trzeciorzędowej aminy alifatycznej lub pirydyny, najkorzystniej trietyloaminy, w ilości od 0,1 do 5 równoważników w stosunku do triazolidu, najkorzystniej 3 równoważniki. Dalszy sposób prowadzenia reakcji jest identyczny, niezależnie czy stosuje się aminę o wzorze ogólnym 3 bądź jej sól o wzorze ogólnym 4. Reakcję prowadzi się w czasie od 10 minut do 10 godzin, najkorzystniej 2 godziny. Środowiskiem reakcji są rozpuszczalniki z grupy niższych nitryli alifatycznych, bezwodny DMF lub DMSO. Najkorzystniej stosuje się acetonitryl. Reakcja przebiega w temperaturze od 0 C do 70 C, jednak najkorzystniejsze ze względów praktycznych jest prowadzenie reakcji w temperaturze pokojowej. Otrzymany produkt izoluje się z mieszaniny poreakcyjnej poprzez usunięcie z mieszaniny rozpuszczalników i oczyszcza za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, korzystnie stosując jak fazę ruchomą mieszaninę chloroform-metanol zawierającą od 0,5% do 50% objętościowych metanolu, najkorzystniej 1%. Korzystnym ze względu na oszczędność czasu oraz dostępność handlowych reagentów wariantem syntezy pochodnych 2,3 -anhydro-2'-deoksy-5-fluorourydyny o ogólnym wzorze 1 jest prowadzenie wszystkich reakcji w jednym naczyniu reakcyjnym. W takim przypadku synteza składa się
4 PL 225 283 B1 z trzech kroków realizowanych jeden po drugim bez konieczności izolacji produktów pośrednich, według schematu 1. W kroku 1, poddaje się reakcji arylodichlorofosforan o wzorze ogólnym 5. w którym Ar oznacza grupę fenylową, 4-chlorofenylową, 1-naftylową, 2-naftylową lub grupę fenylową podstawioną w pozycji para, meta lub orto: jednym atomem F, Cl, Br lub I, podstawnikiem alkilowym zawierającym od 1 do 12 atomów węgla, grupą alkoksylową zawierającą od 1 do 12 atomów węgla, grupą nitrową lub trifluorometylową; lub grupę fenylową podstawioną w dowolnej pozycji dwoma takimi samymi lub różnymi podstawnikami z grupy F, Cl, Br lub I, podstawnik alkilowy zawierający od 1 do 12 atomów węgla, grupa alkoksylowa zawierająca od 1 do 12 atomów węgla, grupa nitrowa lub trifluorometylowa, z 1,2,4-triazolem w ilości od 2 do 4 równoważników, najkorzystniej z trzema równoważnikami w obecności trietyloaminy w ilości od 2 do 4 równoważników, najkorzystniej 2,5 równoważników w rozpuszczalniku z grupy niższych nitryli alifatycznych, bezwodnym DMF lub DMSO, najkorzystniej w acetonitrylu, np. stosując procedurę opisaną w Lewandowska, M., Ruszkowski, P., Baraniak, D., Czarnecka, A., Kleczewska, N., Celewicz, L. (2013) Eur. J. Med. Chem., 2013, 67, 188 195. W jej wyniku tworzy się bis-triazolid o wzorze ogólnym 6. w którym Ar ma podane wyżej znaczenie.
PL 225 283 B1 5 W kroku 2, otrzymany bistriazolid o wzorze ogólnym 6 reaguje z 2,3 -anhydro-2 -deoksy-5- -fluorourydyną (AdFU) prowadząc do wytworzenia triazolidu o ogólnym wzorze 2, w którym Ar ma podane wyżej znaczenie. Ten krok prowadzi się wprowadzając do mieszaniny reakcyjnej 2,3 -anhydro-2 -deoksy-5-fluorourydynę (AdFU) w ilości od 0,1 do 1 równoważnika, a najkorzystniej 0,66 równoważnika stosunku do użytego w kroku pierwszym arylodichlorofosforanu o wzorze ogólnym 5. Koniecznym dodatkiem stosowanym w tym kroku, poprawiającym rozpuszczalność AdFU jest amina, najkorzystniej pirydyna, stosowana w ilości od 1 do 3 równoważników w stosunku do AdFU, najkorzystniej w ilości 2 równoważników. Ten etap procesu prowadzi się w czasie od 10 minut do 10 godzin, korzystnie 3 godziny a najkorzystniej godzinę. W kroku trzecim, wytworzony w etapie drugim triazolid o wzorze ogólnym 2 reaguje z fluorowanymi aminami o wzorze ogólnym 3 bądź ich solami o wzorze ogólnym 4, najkorzystniej chlorowodorkami, w obecności trietyloaminy dając docelowy produkt o wzorze ogólnym 1. Ten krok prowadzi się wprowadzając do mieszaniny reakcyjnej zawierającej wytworzony związek o wzorze ogólnym 2 fluorowaną aminę o wzorze ogólnym 3 w ilości od 0,1 do 5 równoważników w stosunku do ilości użytej w kroku drugim 2,3 -anhydro-2 -deoksy-5-fluorourydyny (AdFU), a najkorzystniej 3 równoważniki. Alternatywnie w trzecim kroku, reakcję triazolidu o wzorze ogólnym 2 można prowadzić z solami fluorowanych amin o wzorze ogólnym 4, najkorzystniej chlorowodorkami. W takim przypadku do roztworu zawierającego triazolid o wzorze ogólnym 2 dodaje się sól fluorowanej aminy alifatycznej o wzorze ogólnym 4, w ilości od 0,1 do 5 równoważników w stosunku do w stosunku do ilości użytej w kroku drugim 2,3 -anhydro-2 -deoksy-5-fluorourydyny (AdFU), najkorzystniej 3 równoważniki oraz trzeciorzędowej aminy alifatycznej lub pirydyny, najkorzystniej trietyloaminy, w ilości od 0,1 do 5 równoważników w stosunku do 2,3 -anhydro-2 -deoksy-5-fluorourydyny (AdFU), najkorzystniej 3 równoważniki. Dalszy sposób prowadzenia reakcji jest identyczny niezależnie czy stosuje się aminę o wzorze ogólnym 3 czy jej sól o wzorze ogólnym 4. Reakcję prowadzi się w czasie od 10 minut do 10 godzin, najkorzystniej 2 godziny, w temperaturze od 0 C do 70 C, jednak najkorzystniejsze ze względów praktycznych jest prowadzenie reakcji w temperaturze pokojowej. Otrzymany produkt izoluje się z mieszaniny poreakcyjnej poprzez usunięcie z mieszaniny rozpuszczalników i oczyszcza za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, korzystnie stosując jak fazę ruchomą mieszaninę chloroformmetanol zawierającą od 0,5% do 50% objętościowych metanolu, najkorzystniej 1%. W trzecim aspekcie przedmiotem wynalazku jest zastosowanie pochodnych 2,3 -anhydro-2 - -deoksy-5-fluorourydyny o ogólnym wzorze 1, w którym Ar oznacza para-chlorofenyl lub fenyl zaś R oznacza -CF 3 lub -CF 2 -CF 3 ), w szczególności 5 -[N'-(2,2,2-trifluoroetylo)-O-(4-chlorofenylo)]fosforanu 2,3 -anhydro-2'-deoksy-5-fluorourydyny FEAdFU, według wynalazku w terapii przeciwnowotworowej raka piersi, raka szyjki macicy, raka płuca oraz raka nosogardzieli. Badania przeprowadzone in vitro wobec linii komórek nowotworowych raka piersi, raka szyjki macicy, raka płuca oraz raka nosogardzieli potwierdziły silne działanie cytotoksyczne przewyższające swą aktywnością stosowane w terapii 2 - -deoksy-5-fluorourydynę (SFdU) oraz 5-fluorouracyl, badane w tych samych warunkach. Dodatkowo związek FEAdFU charakteryzuje korzystny, wysoki współczynnik selektywności (SI), który wskazuje na jego selektywną wysoką cytotoksyczność wobec komórek rakowych przy niewielkiej toksyczności wobec komórek zdrowych. Badania aktywności cytotoksycznej przeprowadzono na liniach komórek nowotworowych: MCF-7 (rak piersi), HeLa (rak szyjki macicy), A549 (rak płuca) i KB (rak nosogardzieli) oraz komórkach prawidłowych - fibroblastach skóry ludzkiej (HDF) pochodzących z kolekcji ECACC European Collection of Cell Cultures. Testy cytotoksyczności prowadzono za pomocą standardowego oznaczenia z wykorzystaniem sulforodaminy B. Polegały na 72 godzinnej inkubacji linii komórek nowotworowych znajdujących się w fazie wzrostu logarytmicznego z badanym związkiem a następnie oznaczeniu stopnia zahamowania wzrostu komórek z wykorzystaniem adsorpcji barwnika sulforodaminy B wiążącego się z białkami komórkowymi za pomocą pomiaru spektrofotometrycznego. Oznaczenia prowadzono według procedury opisanej w pracy: Vichai, V., Kirtikara, K, Nature Protocols, 2006, 1, 1112. Oznaczanie cytotoksyczności Przygotowanie komórek do badania: Komórki badanej linii komórkowej w fazie logarytmicznego wzrostu wysiano na 24-studzienkowe płytki w ilości 20 tys. komórek/2 ml pożywki na studzienkę, a następnie inkubowano w cieplarce w temperaturze 37 C, w atmosferze 5% CO 2 przez 24 godziny.
6 PL 225 283 B1 Roztwory badanych związków przygotowano w DMSO w stężeniach: 0,05; 0,1; 0,5; 1; 5; 10; 50; 100; 500 µm. W komorze laminarnej, zapewniającej sterylne warunki pracy, komórki testowanych linii traktowano roztworami badanego związku w ten sposób, że: trzy pierwsze studzienki stanowiły kontrolę zawierały tylko 20 µl DMSO, do następnych studzienek dodano kolejne roztwory badanego związku (20 µl) począwszy od najniższego stężenia po trzy studzienki na każde stężenie. Następnie płytkę umieszczono w inkubatorze o temperaturze 37 C na 72 godziny. Po zakończonej inkubacji przyklejone komórki utrwalono przez dodatek 500 µl zimnego (4 C) 50% kwasu trichlorodowego (TCA) i inkubowano w 4 C przez 1 godzinę. Następnie każdą studzienkę płukano sterylną wodą i suszono. Operację płukania powtarza się pięciokrotnie. Utrwalone komórki wybawiono się przez 30 minut poprzez dodatek 500 µl 0,4% roztworu barwnika sulforodaniny B rozpuszczonej w 1% kwasie octowym. Niezwiązany barwnik usuwa się zlewając go z płytki a komórki płucze się 4 razy 1% kwasem octowym. Następnie płytkę suszono na powietrzu przez ok. 5 minut. Związany barwnik rozpuszczono poprzez dodanie do każdej studzienki 1500 µl 10 mm buforu Tris-base (trishydroksymetyloam i nometan) i mieszano przy użyciu wytrząsarki orbitalnej przez 5 minut. Następnie przeniesiono po 200 µl roztworu z każdej studzienki do dwóch studzienek na nowej płytce 96-studzienkowej oraz oznaczano absorpcję roztworów spektrofotometrycznie przy długości fali 490 530 nm za pomocą czytnika płytek. Stopień zahamowania wzrostu komórek w % wobec badanego związku obliczono przyjmując absorpcję roztworu kontrolnego za 100%. Testy cytotoksyczności dla pozostałych związków i linii komórkowych zostały wykonane w identyczny sposób. W zależności od rodzaju linii komórkowej stosowano następujące media hodowlane: Linia MCF-7 była namnażana w medium Dulbecco'sModifiedEagle's Medium (DME) firmy Sigma (nr kat. D5796) natomiast linie HeLa, A549 oraz KB były namnażane w medium RPMI-1640 firmy Sigma (nr kat. R8758). Dla wszystkich badanych pochodnych wyznaczono wskaźnik IC 50, który oznacza stężenie związku potrzebne do zahamowania wzrostu komórek o 50%. Pochodne wykazujące IC 50 < 4 µg/ml są powszechnie uznawane za aktywne (w skrócie: A, ang. active), pochodne mieszczące się W przedziale IC 50 = 4 30 µg/ml za związki o średniej aktywności (w skrócie: MA, ang. medium active), natomiast pochodne, dla których IC 50 > 30 µg/ml za związki nieaktywne (w skrócie: NA, ang. non-active). Dla porównania analogiczne badania przeprowadzono z użyciem znanych środków cytotoksycznych a mianowicie: 5-fluoro-2 -deoksyurydyny i 5-fluorouracylu. Dodatkowo dla związku FEAdFU obliczono współczynniki selektywności (SJ), zdefiniowane jako: SI = IC 50 linii komórek zdrowych (fibroblasty HDF)/IC 50 linii komórek rakowych. Korzystny, wysoki współczynnik selektywności (SI) wskazuje, że efektywność działania związku wobec komórek rakowych jest wyższa niż jego toksyczność wobec komórek zdrowych. Wyniki badań aktywności cytotoksycznej związków o wzorze ogólnym 1 przedstawione są w tabeli 1. Podane wartości uśredniono z trzech niezależnych oznaczeń T a b e l a 1. Aktywność cytotoksyczna IC«linia MCF-7 (rak piersi) HeLa (rak szyjki macicy) A549 (rak płuca) KB (rak nosogardzieli) Fibroblasty (HDF) związek [µg/ml] [µm] SI [µg/ml] [µm] SI [µg/ml] [µm] SI [µg/ml] [µm] SI [µg/m M] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 FEAdFU 0,12 0,24 50 0,18 0,36 33,3 0,2 0,4 30 0,2 [µm] 0,4 30 6,0 12,0 MFEAdFU 11,8 (MA) 25,4 3,7 16,0 (MA) 34,5 2,7 - - - 12,2 (MA) 26,3 3,5 43,1 92,9 2,3'-anhydro- 2 -deoksy-5- -fluorourydyna (AdFU) 3,7 16,2 2-11,0 (MA) 48,21 - - - - 11,0 (MA) 48,2 1 - - -
PL 225 283 B1 7 ciąg dalszy tabeli 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 5-fluoro-2 - deoksyurydyna 5-fluorouracyl 2,81 2,37 11,4-18,2-3,20 2,73 13,0-21,0-3,30 2,78 13,4-21,4-3,37 2,86 13,7 - - - 22,0 - - - Cytotoksyczność 5'-[N-(2,2,2-trifluoroetylo)-O-(4-chlorofenylo)]fosforanu 2,3 -anhydro-2 -deoksy- -5-fluorourydyny (FEAdFU) będącego przedmiotem zgłoszenia mieści się w zakresie wysokiej aktywności. Związek ten charakteryzuje wysoki współczynnik selektywności SI (zdefiniowany wyżej) wskazujący na wysoce selektywne działanie wobec komórek nowotworowych i niewielkie działanie wobec komórek zdrowych (fibroblastów). Cytotoksyczność i współczynnik selektywności pochodnej MFEAdFU w której Ar oznacza para- -chlorofenyl a R oznacza CH 2 CH 2 F, są znacząco niższe w stosunku do związku FEAdFU. Przedmiotem wynalazku jest w szczególności zastosowanie związku FEAdFU do sporządzania leków stosowanych w chemioterapii raka piersi. Badania potwierdziły, że związek FEAdFU jest bardzo aktywny wobec komórek raka piersi (linii MCF-7), IC 50 = 0,24 µm, przewyższając o ponad 47 razy aktywność 5 FdU oraz o ponad 75 razy aktywność 5 FU. Wykazuje także ponad 67 razy wyższą aktywność niż wyjściowa 2,3 -anhydro-2 -deoksy-5-fluorourydyna (AdFU). Związek ten wykazuje także bardzo wysoki współczynnik selektywności SI = 50 wskazujący na efektywne działanie wobec komórek raka tej linii. W kolejnym aspekcie przedmiotem wynalazku jest w szczególności zastosowanie związku FE- AdFU zastosowanie do sporządzania leków stosowanych w chemioterapii raka szyjki macicy. Badania potwierdziły, że związek FEAdFU jest bardzo aktywny wobec komórek raka szyjki macicy (linii HeLa), IC 50-0,36 µm, przewyższając cytotoksyczności 5 FdU o ponad 36 razy, 5 FU o ponad 58 razy oraz AdFU o ponad 133 razy. Związek ten wykazuje także bardzo wysoki współczynnik selektywności SI - 33 wskazujący na efektywne działanie wobec komórek raka tej linii. W kolejnym aspekcie przedmiotem wynalazku jest w szczególności zastosowanie związku FE- AdFU do sporządzania leków stosowanych w chemioterapii raka płuca. Badania potwierdziły, że związek FEAdFU jest bardzo aktywny wobec komórek raka płuc (linii A549), IC 50 = 0,4 µm, przewyższając cytotoksyczność 5 FdU o ponad 33 razy i 5 FU o ponad 53 razy. Związek ten wykazuje także bardzo wysoki współczynnik selektywności SI = 30 wskazujący na efektywne działanie wobec komórek raka tej linii. W kolejnym aspekcie przedmiotem wynalazku jest w szczególności zastosowanie związku FE- AdFU do sporządzania leków stosowanych w chemioterapii raka nosogardzieli. Badania potwierdziły, że związek FEAdFU jest bardzo aktywny wobec komórek raka nosogardzieli (linii KB), IC 50 = 0,4 µm, przewyższając cytotoksyczności 5 FdU o ponad 34 razy, 5 FU o 55 razy oraz AdFU o 120 razy. Związek ten wykazuje także bardzo wysoki współczynnik selektywności SI - 30 Wskazujący na efektywne działanie wobec komórek raka tej linii. Przedmiot wynalazku jest objaśniony przykładami wykonania, które ilustrują ale nie ograniczają wynalazku. Rozpuszczalniki oraz pozostałe odczynniki chemiczne pochodziły z firm Aldrich, Merck i POCh i były stosowane bez dodatkowych operacji. Chromatografię kolumnową wykonywano stosując jako fazę stacjonarną żel krzemionkowy 60 H (0,045 0,075 mm/200 300 mesh) firmy Merck. Widma 1 H NMR, 13 C NMR, 19 F NMR związków zarejestrowano na spektrometrze Varian-Gemini (300 MHz) oraz Bruker Avance (600 MHz) w zastosowaniem jako wzorców wewnętrznych; tetrametylosilanu (TMS) przy rejestracji widm 1 H NMR i 13 C NMR oraz trichlorofluorometanu (CFCl 3 ) w widmach 19 F NMR.
8 PL 225 283 B1 P r z y k ł a d 1 Synteza FEAdFU Do roztworu 4-chlorofenylodi(1,2,4-triazolo)fosforanu (1,07 mmol, 0,332 g) w acetonitrylu (4 ml) dodano 2,3 -anhydro-2 -dideoksy-5-fluorourydynę (1,07 mmol, 0,244 g) i pirydynę (4 ml). Całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę po czym do mieszaniny reakcyjnej dodano 270 chlorowodorek 2,2,2-trifluoroetyloaminy (5,35 mmol, 0,725 g) oraz trietyloaminę (2,0 ml) i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Postęp reakcji kontrolowano przy pomocy chromatografii cienkowarstwowej TLC, stosując jako eluent CHCI 3 /MeOH w stosunku 10:1. Po całkowitym przereagowaniu substratów do mieszaniny reakcyjnej dodano nasycony roztwór NaHCO 3 (10 ml), a następnie przeprowadzono ekstrakcję chloroformem. Fazę organiczną suszono nad bezwodnym MgSO 4, a następnie odparowano dwukrotnie z toluenem w celu usunięcia resztek pirydyny. Otrzymany produkt oczyszczono na kolumnie chromatograficznej na żelu krzemionkowym stosując jako eluent mieszaninę chloroform/metanol w stosunku 100:1 (v/v). Wydajność 40%. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): 2,33 2,40 (m, 2H, N-CH 2 ); 2,49 2,53 (m, 2H, H-2', H-2''); 3,03 (m, 1H, H-4'); 3,46 (m, 2H, H-5',H-5''); 4,22 4,35 (m, 1H, 11-3'); 5,93 (pseudo t, 1H, J = 5,8 Hz, H-1'); 6,45 (m, 1H, NH-C-C); 7,23, 7,27 (d, 2H, J = 8,7 Hz. 4-CIPh); 7,43, 7,48 (d, 2H, J = 8,7 Hz. 4-CIPh); 8,14, 8,17 (d, 1H, J = 5,2 Hz, H-6). 13 C NMR (DMSO-d 6 ): 31,26, 43,42, 59,38, 77,52, 85,42, 87,34, 122,12, 122,58, 125,59, 129,72, 139,18, 144,27, 149,12, 151,70, 162,93. 19 F NMR (DMSO-d 6 ): -158,26 (d. 1F, J = 5,0 Hz); -71,40. -71,36 (t, 3F, J = 10,0 Hz, N-C-CF 3 ). 31 P NMR (DMSO-d 6 ) 5,05; 5,20. MS-ESI m/z: 500, 502 (M + H]; 522, 524 [M + Na] + ;538, 540 [M + K] + ; 498,500 (M - H] -, 534, 536, 538 [M + CI] -. P r z y k ł a d 2 Synteza FEAdFU procedura one pot Do roztworu 4-chlorofenylodichlorofosforanu (1,84 mmol, 0,452 g) w acetonitrylu (4,5 ml) dodano 1,2,4-triazoI (5,53 mmol, 0,382g) oraz trietyloaminę (0,62 ml.). Całość mieszano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu pierwszego etapu do mieszaniny reakcyjnej dodano 2,3'- -anhydro-2'-dideoksy-5-fluorourydynę (0,88 mmol, 0,200 g) i pirydynę (4,5 ml). Całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po wskazanym czasie do mieszaniny reakcyjnej dodano chlorowodorek 2,2,2-trifluoroetyloaminy (2,64mmol, 0,120 g) oraz trietyloaminę (1,5 ml.) i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Postęp reakcji kontrolowano przy pomocy chromatografii cienkowarstwowej TLC, stosując jako eluent CHCl 3 /MeOH w stosunku 10:1. Po całkowitym przereagowaniu substratów do mieszaniny reakcyjnej dodano nasycony roztwór NaHCO 3 (10 ml), a następnie przeprowadzono ekstrakcję chloroformem. Fazę organiczną suszono nad bezwodnym MgSO 4, a następnie odparowano dwukrotnie z toluenem w celu usunięcia resztek pirydyny. Otrzymany produkt oczyszczono na kolumnie chromatograficznej na żelu krzemionkowym stosując jako eluent mieszaninę chloroform/metanol w stosunku 100:1 (v/v). Wydajność 42%. Produkt wykazuje identyczną charakterystykę spektralną z produktem opisanym w przykładzie 1.
PL 225 283 B1 9 P r z y k ł a d 3 Synteza MFEAdFU Stosując procedurę identyczną jak w przykładzie 2, przeprowadzono reakcję fosforylowanej 2,3 -anhydro-2 -dideoksy-5-fluorourydyny (0,88 mmol, 0,200 g) oraz chlorowodorku 2-fluoroetyloaminy (263 mg; 2,64 mmol). Po oczyszczeniu chromatograficznym otrzymano produkt MFEAdFU z wydajnością 34%. 1 H NMR (DMSO-d 6 ) : 2,56 2,75 (m, 2H, H-2', H-2''), 3,00 3,23 (m, 2H, N-CH 2 C), 3,87 420 (m, 1H, H-4 ), 4,54 (m, 2H, H-5', H-5''), 4,68 4,79 (m, 2H, N-C-CH 2 ), 5,54 (m, 1H, H-3'), 6,04 (pseudo t, J = 6,2 Hz, 1H, H-U), 6,72 (m, 1H, NH-C-C), 7,24, 7,28 (d, 2H, J = 8,6 Hz, 4-CIPh), 7,44, 7,48 (d, 2H, J = 8,6 Hz, 4-CIPh), 8,15, 8,18 (d, 1H, J = 5,6 Hz, H-6), 11,99 (brs, 1H, 3-NH). 13 C NMR (DMSO-d 6 ) 6: 33,12, 45,51, 63,89, 77,12, 82,48, 83,24, 87,58, 121,74, 125,97 (d, J C-F = 37,3 Hz), 128,12, 131,07, 143,74 (d, J C-F = 232,3 Hz), 149,05, 151,48, 162,99 (d, J C-F = 26,0 Hz). 19 F NMR (DMSO-d 6 ) : -71,17 (m, IF),-158,19 (m, IF). 31 P NMR (DMSO-d 6 ) 5,96; 6,01. MS-ESI m/z: 464, 466 [M + H] + ; 486, 488 [M + Na] + ; 502, 504 [M + K] + ; 462, 464 [M - H] - '; 498, 500, 502 [M + Cl] -. Zastrzeżenia patentowe 1. Pochodne 2,3'-anhydro-2'-deoksy-5-fluorourydyny o ogólnym wzorze 1. gdzie: Ar oznacza grupę fenylową, 4-chlorofenylową, 1-naftyIową, 2-naftylową lub grupę fenylową podstawioną w pozycji para, meta lub orto: jednym atomem F, Cl, Br lub I, podstawnikiem alkilowym zawierającym od 1 do 12 atomów węgla, grupą alkoksylową zawierającą od 1 do 12 atomów węgla. R oznacza grupę trifluorometylową, 2,2,2-trifluoroetylową, difluorometylową, perfluoroetylową, 1-fluoroetylową, 2-fluoroetylową, 1,1-difluoroctyIową, 1,2-difluoroetylową, 2,2-difluoroetylową, 1,1,2- -trifluoroetylową, 1,2,2-trifluoroetylową, tetrafluoroetylową, 1,2,2,2-tetrafluoroetylową. 2. Sposób wytwarzania pochodnych 2,3'-anhydro-2'-deoksy-5-fluorourydyny o ogólnym wzorze 1
10 PL 225 283 B1 gdzie Ar i R mają znaczenie; podane w zastrzeżeniu 1, znamienny tym, że polegający na reakcji triazolidu o ogólnym wzorze 2, w którym Ar oznacza grupę fenylową, 4-chlorofenylową, 1-naftyIową, 2-naftylową lub grupę fenylową podstawioną w pozycji para, meta lub orto: jednym atomem F, Cl, Br lub I, podstawnikiem alkilowym zawierającym od 1 do 12 atomów węgla, grupą alkoksylową zawierającą od 1 do 12 atomów węgla; z fluorowanymi aminami o ogólnym wzorze 3 w którym R-NH 2 (3) R oznacza grupę trifluorometyiową, 2,2,2-trifluoroctylową difluorometylową, perfluoroetylową, 1-fluoroety Iową, 2-fluoroetylową, 1,1-difluoroetylową, 1,2-difluoroetylową, 2,2-difluoroetyIową, 1,1,2 --trifluoroetylową, 1,2,2-trifIuoroetyIową, tetrafluoroetylową, 1,2,2,2-tetrafluoroetylową, lub solami amin o ogólnym wzorze 4, R-NH 3 + X - (4) w którym R ma wyżej podane znaczenie, a X - oznacza anion nieorganiczny z grupy Cl -, Br -, HSO 4 -, SO 4 2-, NO 3 - w obecności amin alifatycznych, korzystnie trietyloaminy. (1) 3. Zastosowanie pochodnych 2,3'-anhydro-2'-deoksy-5-fluorourydyny o ogólnym wzorze 1, w którym Ar oznacza para-chlorofenyl lub fenyl zaś R oznacza CF 3 lub CF 2 -CF 3, do przygotowania preparatów leczniczych stosowanych w terapii przeciwnowotworowej. 4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że do sporządzania leków stosowanych w chemioterapii raka piersi stosuje się 5'-[N-(2,2,2-trifluoroetylo)-O-(4-chlorofenylo)]fosforan 2,3'- -anhydro-2'-deoksy-5-fluorourydyny. 5. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że do sporządzania leków stosowanych w chemioterapii raka szyjki macicy stosuje się 5'-[N(2,2,2-trifluoroetylo)-O-(4-chlorofenylo)]fosforan 2,3'-anhydro-2'-deoksy-5-fluorourydyny. 6. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że do sporządzania leków stosowanych w chemioterapii raka płuca stosuje się 5'-[N-(2,2,2-tnfluoroetylo)-O-(4-chlorofenylo)]fosforan 2,3'- -anhydro-2'-deoksy-5-fluorourydyny. 7. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że do sporządzania leków stosowanych w chemioterapii raka nosogardzieli stosuje się 5'-[N-(2,2,2-trifluoroetylo)-O-(4-chlorofenylo)]fosforan 2,3'-anhydro-2'-deoksy-5-fluorourydyny. Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)