PL B1. Nowe pochodne epirubicyny, ich nowe zastosowanie medyczne oraz farmaceutycznie akceptowalna postać leku

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (13) B1 (51) Int.Cl. C07H 15/252 ( ) A61K 31/704 ( ) A61P 31/12 ( ) (54) Nowe pochodne epirubicyny, ich nowe zastosowanie medyczne oraz farmaceutycznie akceptowalna postać leku (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 08/08 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 09/12 (73) Uprawniony z patentu: INSTYTUT BIOCHEMII I BIOFIZYKI POLSKA AKADEMIA NAUK, Warszawa, PL Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, INSERM, Paris, FR INSTYTUT MEDYCYNY DOŚWIADCZALNEJ I KLINICZNEJ IM. M. MOSSAKOWSKIEGO POLSKIEJ AKADEMII NAUK, Warszawa, PL (72) Twórca(y) wynalazku: TADEUSZ KULIKOWSKI, Warszawa, PL MARIA BRETNER, Wołomin, PL ANDŻELIKA NAJDA, Lubartów, PL LUCYNA COVA, Lyon, FR CHRISTIAN TREPO, Bron, FR RAMAMURTHY NARAYAN, Headington, GB ANDRZEJ PIASEK, Warszawa, PL ANDRZEJ LIPNIACKI, Warszawa, PL WŁODZIMIERZ ZAGÓRSKI-OSTOJA, Warszawa, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Iwona Brodowska

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne 7-O-(3 -amino-2,3,6 -trideoksy-α,β-l-arabinohekso-piranozylo)-adriamycynonu (epirubicyna, 4 -epidoksorubicyna) o wzorze 1, w którym co najwyżej dwa z czterech podstawników R 1, R 2, R 3 i R 4 są takie same lub różne i oznaczają atom wodoru, a co najmniej dwa z tych czterech podstawników oznaczają grupę alkilową, grupę alkenową lub alkinową, o 1 do 5 atomach węgla, grupę alkilokarbonylową o łańcuchu alkilowym od 1 do 3 atomów węgla, zwłaszcza acetylową przy czym jeśli R 1 i R 4 oznaczają jednocześnie atom wodoru, to R 2 i R 3 razem z atomem azotu, do którego są przyłączone, oznaczają grupę, dimetyloformamidylową. Przedmiotem wynalazku jest także nowe zastosowanie medyczne tych pochodnych do wytwarzania leków aktywnie hamujących replikację wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) oraz farmaceutycznie akceptowalna forma leku. Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) posiada szczególne znaczenie: jest to wysoce patogenny wirus należący do rodziny Flaviviridae (genus hepaciwirus), bardzo szeroko rozpowszechnionej w świecie (według danych WHO, c.a. 300 milionów zakażonych ludzi). Chroniczne aktywne zapalenie wątroby występuje/rozwija się u ok. 85% silnie zakażonych nosicieli i prowadzi do marskości wątroby, oraz do nowotworu wątrobiaka (hepatocellular carcinoma) (Hagedorn i Rice, red. The Hepatitis C Viruses, Springer, Heidelberg 2000). Nieoczekiwanie zgłaszający stwierdził, że chlorowodorek epirubicyny znany lek przeciwnowotworowy, jest nadzwyczaj silnym środkiem działającym przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV). Chlorowodorek epirubicyny jest toksyczny w stosunku do hemopoetycznych komórek ssaków i komórek tkanki sercowej, jednak powoduje mniejszą hematologiczną i sercową toksyczność niż odpowiednie dawki innego szeroko stosowanego leku przeciwnowotworowego - doksorubicyny (adriamycyny). W dodatku prawdopodobieństwo wystąpienia zatoru serca u człowieka przy całkowitej skumulowanej dawce nie przekraczającej 150 mg na m 2 powierzchni ciała człowieka wg wykresu Kaplana-Meiera (Launchbury and Habooubit, Cancer Treatment Reviews 1993, 19, ) jest znikome. W dniu 7 lipca 2005 zgłaszający złożył wniosek patentowy do polskiego i europejskiego Urzędu Patentowego (odpowiednio PL i EP ). Obecnie, nieoczekiwanie stwierdzono, że pochodne epirubicyny o wzorze 1, jak to poniżej opisano, wykazują silną aktywność hamującą replikację wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) przy znacznie niższej niż epirubicyna cytotoksyczności w stosunku do komórek Huh7 oraz PBMC, lepszym in vitro indeksie terapeutycznym (TI) (Tabela 1) oraz niższej in vivo toksyczności u myszy. W związku z powyższym nowe pochodne epirubicyny mogą być korzystnie stosowane do leczenia zakażeń wirusem HCV. Niniejszy wynalazek dotyczy również farmaceutycznie akceptowalnych form leku zawierających wymienione pochodne o wzorze 1. Nowe pochodne 7-O-(3 -amino-2,3,6 -trideoksy-α,β-l-arabinoheksopiranozylo)-adriamycynonu (epirubicyny) przedstawione są wzorem 1, w którym co najwyżej dwa z czterech podstawników R 1, R 2, R 3 i R 4 są takie same lub różne i oznaczają atom wodoru, a co najmniej dwa z tych czterech podstawników oznaczają grupę alkilową, grupę alkenową lub alkinową, o 1 do 5 atomach węgla, grupę alkilokarbonylową o łańcuchu alkilowym od 1 do 3 atomów węgla, zwłaszcza grupę acetylową, przy czym jeśli R 1 i R 4 oznaczają jednocześnie atom wodoru, to R 2 i R 3 razem z atomem azotu, do którego są przyłaczone, oznaczają grupę dimetyloformamidylową. Zastosowanie medyczne nowych pochodnych epirubicyny, przedstawionych wzorem 1, do wytwarzania leków aktywnie hamujących replikację wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Zastosowanie medyczne nowych pochodnych epirubicyny według wynalazku do wytwarzania leków aktywnie hamujących replikację wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) i zapewniających niską toksyczność w stosunku do komórek Huh7 i PBMC, oraz indeks terapeutyczny (TI) wyższy niż samej epirubicyny oraz mniejszą niż dla epirubicyny toksyczność in vivo. Inaczej, nowe pochodne epirubicyny mogą być stosowane do leczenia zakażeń wirusem HCV. Farmaceutycznie akceptowalna postać leku przeciwko zakażeniom HCV, zawierająca znane nośniki i dodatki, według wynalazku, charakteryzuje się tym, że jako substancję aktywną zawiera pochodne epirubicyny przedstawione wzorem 1, w którym R 1, R 2, R 3 i R 4 mają wyżej podane znaczenie. W przedstawionych poniżej badaniach wykazano po raz pierwszy, że nowe pochodne epirubicyny przedstawione wzorem 1 wywierają silny efekt hamujący replikację HCV przy nanomolowych stężeniach i mogą być stosowane jako efektywne leki przeciwko zakażeniom HCV.

3 PL B1 3 Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku nie ograniczające w żadnym stopniu zakresu wynalazku. P r z y k ł a d I N 3 -acetylo-4 -epidoksyrubicyna (1, BNE01) Chlorowodorek 4 -epidoksyrubicyny (58 mg, 0.1 mmola) rozpuszczono w acetonie (6.8 ml) i dodano 18 μl, diizopropyloetyloaminy. Roztwór oziębiono do 0 C na łaźni lodowej i dodano przy stałym mieszaniu 10 μl (0.11 mmola) bezwodnika octowego. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej i mieszano jeszcze przez 2 godz. Roztwór zatężono pod próżnią do sucha, pozostałość rozpuszczono w ca 13 ml CHCI 3 a roztwór przemyto trzy razy 0.1 M buforem fosforanowym ph 7.0 i dwa razy wodą. Warstwę organiczną suszono nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowano pod próżnią do sucha. Pozostałość chromatografowano na kolumnie z żelem krzemowym (CHCI 3 do CHCl 3 :MeOH 1:1). Otrzymano związek o wzorze 1, (R 1 : H, R 2 : CH 3 CO,R 3 : H, R 4 : H) Temp. topn. 180 C. MS (ES+) ; NMR (CDCl 3 ) δ 1.36 (d, 3, 5 -CH 3 ), 2.01 (s, 3, 3 -N-COCH 3 ), 2.06 (m, 2, 2 -H 2 ), 2.19 (d, 1, 8A-H), 2.41 (d, 1, 8B-H), (m, 3, 3 -H i 4 -H/4 -OH), 3.28 (d, 1, 10A-H), 3.32 (d, 1, 10B-H), (m, 1, 5 -H), 4.09 (s, 3, 4-OCH 3 ), 4.80 (dd, 3, 14-H 2 / 14-OH), 5.30 (br s, 1, 9-OH), 5.43 (d, 1, 1 -H), 5.51 (d, 1, 7-H), 7.41 (d, 1, 3-H), 7.80 (t, 1, 2-H), 8.05 (d, 1, 1-H), (s, 1, 11-OH), (s, 1, 6-OH). P r z y k ł a d II N 3', O 4, O 14 -triacetylo-4 -epidoksyrubicyna (2, BNE02) Chlorowodorek 4 -epidoksyrubicyny (100 mg, 0.17 mmola) rozpuszczono w 10 ml suchego chloroformu i dodano 20 mg dimetyloaminopirydyny. Roztwór oziębiono do 0 C na łaźni lodowej i dodano, stale mieszając 400 μl (4.24 mmola) bezwodnika octowego. Mieszaninę pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej i dalej mieszano. Postęp reakcji badano przy użyciu TLC (CHCl 3 : MeOH 9:1). Otrzymany roztwór przemyto 3 razy 0.1 M buforem fosforanowym o ph 7.0 oraz 2 razy wodą. Warstwę organiczną wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowano pod próżnią. Pozostałość chromatografowano na kolumnie z żelem krzemionkowym (CHCl 3 do CHCl 3 :MeOH 1:1). Otrzymano związek o wzorze 1, (R 1 : CH 3 CO, R 2 : CH 3 CO, R 3 : H, R 4 : CH 3 CO) Temp. topn. 178 C. MS (ES+) NMR (DMSO-d 6 ) δ 1.09 (d, 3, 5 -CH 3 ), 1.69 (s, 3, 14-O-COCH 3 ), 1.97 (s, 3, 4 -O-COCH 3 ), (m, 5, 3 -N-COCH 3, 8H 2 ), 2.94/3.08(d/d, 1/1, 2 -H 2 ), 4.05 (s, 3, 4-OCH 3 ), (m, 1, 5 -H), 4.43 (t, 1, 1 -H), (m, 1, 7-H), 5.22 (d, 2, 14-H 2 ), 5.79 (s, 1, 9-OH), 7.66 (t, 1, 2-H), 7.72 (d, 1, 3-H), 7.92 (d, 1, 1-H), (s, 1, 11-OH), (s, 1, 6-OH). P r z y k ł a d III 3 -N,N-dimetylo-4 -epidoksyrubicyna (3, BNE06) Do roztworu chlorowodorku 4 -epidoksyrubicyny (100 mg, 0.17 mmola) w 630 μl H 2 O dodano mieszając 1.3 ml acetonitrylu i mieszaninę ogrzano do 30 C. Dodano 130 μl (1.31 mmola) 37% wodnego roztworu formaldehydu i roztwór mieszano przez 20 minut w Następnie dodano kroplami w ciągu 15 minut 23 mg (0.37 mmola) NaCNBH 3 w 1.3 ml acetonitrylu i mieszano w 24 C przez 20 minut. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono wodą (4 ml) i ekstrahowano 2 razy 4 ml chloroformu. Ekstrakty chloroformowe połączono, suszono nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowano pod próżnią. Pozostałość chromatografowano na preparatywnych płytkach z żelem (Merck No ) PLC plates stosując CHCl 3 :MeOH:H 2 O 40:10:1. Otrzymano związek o wzorze 1, (R 1 : H, R 2 : CH 3, R 3 : CH 3, R 4 : H) Temp. topn. 220 C. MS (ES+) , (ES-) NMR (DMSO-d 6 ) δ 1.20 (d, 3, 5 - CH 3 ), 1.56 (dt, 1, 2 -H), 1,72 (dd, 1, 2 -H), 2.17 (br s, 8, 3 -N(CH 3 ) 3, 8-H 2 ) (m, 4, 10-H, 4 -OH, 4 -H, 3 -H), (m, 1, 5 -H), 3.99 (s, 3, 4-OCH 3 ), 4.55 (br s, 2, 14-H 2 ), 4.85 (br s, 1, 14-OH), 4.97 (t, 1, 1 -H), 5.32 (d, 1, 7-H), 5.45 (s, 1, 9-OH), 7.62 (d, 1, 3-H), 7.89 (t, 1, 2-H), 7.94 (d, 1, 1-H), (br s, 1, 11-OH), (br s, 1, 6-OH). P r z y k ł a d IV 3 -N-(N,N -dimetyloformamidynylo)-4 -epidoksyrubicyna (4, BNE06) Do roztworu chlorowodorku 4 -epidoksyrubicyny (150 mg, 0.26 mmola) w 7.5 ml suchego metanolu dodano kroplami, w atmosferze argonu N,N-dimetyloformamidodimetyloacetal (182 μl, 1.30 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 4 godz., a następnie rozpuszczalnik odparowano pod próżnią. Pozostałość chromatografowano na kolumnie z żelem krzemionkowym (CHCl 3 do CHCl 3 :MeOH 9:1). Otrzymano związek o wzorze 1, (R 1 : H, R 2 : =CH-N(CH 3 ) 2, R 4 : H) Temp. topn. 206 C. MS (ES+) , (ES-) ; NMR (DMSO-d 6 ) δ 1.24 (d, 3, 5 -CH 3 ), 1.99 (d, 2, 8H 2 ), 2.19 (m, 2, 2 -H 2 ), (m i m, 11, 10-H 2, 4 -OH, 4 -H, 3 -H, N -Me 2 ), 3.93 (m, 1, 5-H), 4.00 (s, 3, 4-

4 4 PL B1 OCH 3 ), 4.57 (d, 2, 14-H 2 ), 4.87 (t, 1, 14-OH), 4.99 (t, 1, 1-H), 5.29 (t, 1, 7-H), 5.48 (s, 1, 9-OH), 7.68 (t, 1, 2-H), 7.94 (d, 2, 1-H i 3-H), 8.08 (s, 1, 3 -NC -H), (s, 1, 11-OH), (s, 1, 6-OH). Badanie aktywności przeciwwirusowej i cytotoksyczności Potencjalną aktywność przeciwwirusową (anty-hcv) pochodnych epirubicyny przedstawionych wzorem 1 zbadano in vitro w hodowli komórkowej przy użyciu układu zawierającego subgenomowy replikon HCV stabilnie transfekowany do komórek Huh7 (klon BM 4.5) (Ju-Tao Gao et al., J Virol. 2001). Komórki Huh7 zawierające replikon HCV hodowano w medium hodowlanym przy różnych stężeniach pochodnej epirubicyny. Media i lek zmieniano każdego dnia przez 5 dni. Po 5-ciu dniach traktowania lekiem komórki zostały poddane lizie i całkowitej ekstrakcji RNA. Następnie wyizolowany RNA zbadano na obecność replikacji HCV drogą analizy Northern Blot, stosując próbkę HCV noszącą region NS5B HCV. Ponadto, hybrydyzacja znakowaną próbką β-aktyny pozwoliła na znormalizowanie tych wyników, tj. na przypisanie wpływu leku na wewnątrzkomórkową ekspresję genu (housekeeping). Linie komórkowe traktowano codziennie odpowiednią pochodną epirubicyny w zakresie stężeń nm przez 5 dni i pod koniec traktowania izolowano RNA z traktowanych komórek. Całkowity RNA zbadano przy użyciu próbki specyficznego HCV, stosując do oznaczenia HCV RNA analizę Northern blot. Uzyskany chromatogram poddano następnie densytometrii stosując Phosfor Imager i oznaczono ilościowo wirusową replikację. Wyniki analizy prowadzonej w zależności od czasu traktowania wykazały, że pochodne epirubicyny w stężeniach μμ efektywnie inhibują in vitro replikację HCV w układzie subgenomowego replikonu (Tabela 1). W Tabeli 1 wykazano również, że 50% stężenia (IC 50 ) pochodnych epirubicyny z uwzględnieniem aktywności przeciwko HCV mierzonej w układzie replikonu HCV są niskie i leżą w zakresie μμ, podczas gdy ich stężenia powodujące 50% inhibicję (CC 50 ) komórek Huh7 wynoszą μμ, korzystnie w przypadku N 3,O 4, O 14 -triacetyloepirubicyny (BNE02), gdzie indeks terapeutyczny wynosił 10. Inhibicję replikacji HCV przez epirubicynę (BNE00), N3 -acetyloepirubicynę (BNE01) oraz N 3,O 4,O 14 -triacetyloepirubicynę (BNE02) (fig. 1, Tabela 2) oznaczano jak następuje. Limfocyty hodowano w medium wzbogaconym znanymi stężeniami BNE00, BNE01 i BNE02. Piątego i czternastego dnia hodowli komórki zebrano i po ekstrakcji oznaczono jakościowo HCV RNA stosując pomiar rzeczywistego czasu reakcji polimeryzacji łańcuchowej (Real Time Polymerase Chain Reaction, RT PCR). Ilościowe oznaczanie HCV RNA również przeprowadzono przy użyciu RT PCR (fig. 2). RNA wyizolowano przy użyciu Total RNA extraction kit (A&A Biotechnology, Gdynia, Poland, Amplifikację HCV RNA przeprowadzono jak następuje: RT-PCR przeprowadzono w jednym etapie przez 60 minut w 42 C i przez 15 min w 75 C. Do pierwszego PCR, które obejmowało 30 cyklów amplifikacji (10 s w 65 C i 20 s w 72 C) użyto 3 μl cdna. 2 μl produktu z pierwszego procesu użyto do drugiej amplifikacji (35 cyklów, każdy cykl 10 s w 94 C, 10 s w 65 C i 20 s w 72 C a następnie przedłużono o 7 min w 72 C. W pierwszym procesie użyto 10 pmoli primerów NTR 1 LOW (GGTGCACGGTCTACGAGACCT) oraz NTR 1 UP (CGACACTCCACCATAGAT) a do drugiego procesu użyto NTR 2 LOW (CACTCGCAAGCACCCTAT CAGGCAGT) oraz NTR 2 UP (CCACCATA- GATCACTCCCCTGT). Produkty uzyskane z PCR analizowano przy pomocy elektroforezy stosując 1% Nusieve agarose gel (FMC) wybarwiając bromkiem etydyny. Cytotoksyczność (CC 50 ) pochodnych epirubicyny w komórkach PBMC była bardzo mała i wynosiła μμ (fig. 3). Oznaczenie toksyczności ostrej u myszy (LD 50 ) wykonano wg. Wskazówek OECD dla testowania chemikaliów (wskazówka No 401). (OECD Guidelines for Testing of Chemicals, Guideline No 401). Związek 2 (BNE02) korzystnie wykazuje bardzo niską toksyczność ostrą in vivo (LD 50 = 1300 mg/kg wagi ciała myszy), podczas gdy wartość ta dla chlorowodorku epirubicyny (BNE00) wynosi 37 mg/kg. W niniejszych badaniach wykazano po raz pierwszy, że pochodne epirubicyny wywierają efekt hamujący replikację HCV przy nanomolowych stężeniach i mogą być stosowane jako efektywne leki przeciwko zakażeniom HCV przy znikomej toksyczności in vitro i in vivo.

5 PL B1 5 T a b e l a 1 Aktywność anty-hcv w układzie replikonu HCV 1 oraz cytotoksyczność epirubicyny i jej pochodnych wobec komórek Huh-7 i PBMC. Związek Chlorowodorek epirubicyny (BNE00) 1. N 3 -acetyloepirubicyna (BNE01) 2. N 3,O 4,O 14 -triacetyloepirubi cyna (BNE02) N,N-Dimetylo-4 -epidoxorubicyna (BNE06) N-(N,N -Dimetyloformamidinylo)-4-epidoxorubicyna (BNE04) Cytotoksyczność wobec komórek PBMC CC 50 (μμ) Cytotoksyczność wobec komórek Huh7 CC 50 (μμ) 2 Aktywność anty-hcv IC 50 (μμ) 3 Indeks terapeutyczny CC 50 / IC >0.9 > >0.05 >0.05 >1 1 subgenomowy replikon HCV stabilnie transfekowany do komórek Huh7 (klon BM4.5) (Ju-Tao Gao et al., J. Virol. 2001, ) 2 cytotoksyczność (CC 50 ) - 50% stężenie cytotoksyczne 3 aktywność przeciwwirusowa (IC 50 ) - stężenie wymagane do zahamowania replikacji wirusa w 50% W tabeli nr 2 zamieszczono dane dotyczące cytotoksyczności (CC 50 i CC 90 ), aktywności anty-hcv (IC 50 i IC 90 ) oraz indeksu terapeutycznego (TI 50 i TI 90 ) epirubicyny i jej pochodnych w hodowli limfocytowej. T a b e l a 2 Związek CC 50 CC 90 IC 50 IC 90 Tl 50 Tl 90 BNE BNE BNE > > Zastrzeżenia patentowe 1. Nowe pochodne epirubicyny czyli 7-O-(3 -amino-2,3,6 -trideoksy-α,β-l-arabinohekso-piranozylo)-adriamycynonu przedstawione wzorem 1, w którym co najwyżej dwa z czterech podstawników R 1, R 2, R 3 i R 4 są takie same lub różne i oznaczają atom wodoru, a co najmniej dwa z tych czterech podstawników oznaczają grupę alkilową, grupę alkenową lub alkinową, o 1 do 5 atomach węgla, grupę alkilokarbonylową o łańcuchu alkilowym od 1 do 3 atomów węgla, zwłaszcza grupę acetylową, przy czym jeśli R 1 i R 4 oznaczają jednocześnie atom wodoru, to R 2 i R 3 razem z atomem azotu, do którego są przyłączone, oznaczają grupę dimetyloformamidylową. 2. Zastosowanie medyczne nowych pochodnych epirubicyny, określonych w zastrzeżeniu 1, do wytwarzania leków aktywnie hamujących replikację wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). 3. Zastosowanie pochodnych, według zastrz. 2, do wytwarzania leków aktywnie hamujących replikację wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV), zapewniających niską toksyczność w stosunku do komórek Huh7 i PBMC, wyższy indeks terapeutyczny (TI) niż sama epirubicyna oraz mniejszą niż epirubicyna toksyczność in vivo. 4. Farmaceutycznie akceptowalna forma leku przeciwko zakażeniom HCV, zawierająca znane nośniki i dodatki, znamienna tym, że jako substancję aktywną zawiera pochodne epirubicyny przedstawione wzorem 1, w którym co najwyżej dwa z czterech podstawników R 1, R 2, R 3 i R 4 są takie same lub różne i oznaczają atom wodoru, a co najmniej dwa z tych czterech podstawników oznaczają grupę alkilową, grupę alkenową lub alkinową, o 1 do 5 atomach węgla, grupę alkilokarbonylową o łańcuchu alkilowym od 1 do 3 atomów węgla, zwłaszcza acetylową, przy czym jeśli R 1 i R 4 oznaczają jednocześnie atom wodoru, to R 2 i R 3 razem z atomem azotu, do którego są przyłączone, oznaczają grupę dimetyloformamidylową.

6 6 PL B1 Rysunki

7 PL B1 7

8 8 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)