PL B1. UNIWERSYTET IM. ADAMA MICKIEWICZA W POZNANIU, Poznań, PL BUP 03/15

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: (51) Int.Cl. A61K 31/49 ( ) A61P 35/00 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (54) Zastosowanie pochodnych alkaloidów chinowca jako związków cytotoksycznych (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 03/15 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 03/16 (73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET IM. ADAMA MICKIEWICZA W POZNANIU, Poznań, PL (72) Twórca(y) wynalazku: LECH CELEWICZ, Poznań, PL KAROL KACPRZAK, Pecna, PL PIOTR RUSZKOWSKI, Suchy Las, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Wojciech Lisiecki

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie 9-O-propargilocynchoniny i 9-O-propargiloepicynchoniny do sporządzania leków stosowanych w terapii przeciwnowotworowej. Choroby nowotworowe stanowią jeden z głównych problemów zdrowotnych ludzi, charakteryzując się najwyższym współczynnikiem umieralności oraz postępującą liczbą zachorowań, związaną głównie ze wzrostem długości oraz stylem życia. Terapia chorób nowotworowych jest trudna, kosztowna i w wielu przypadkach mało efektywna. Z tego powodu pilnie poszukiwane są nowe substancje o działaniu cytostatycznym. Ich źródłem często są produkty naturalne a zwłaszcza alkaloidy i ich pochodne takie jak taksol, kamptotecyna czy alkaloidy barwinka (Vinca) (publikacja przeglądowa Taglialatela-Scafati, O. Modern Alkaloids, Fattorusso E. (red.), Wiley-VCH, 2007, str. 25). Alkaloidy kory chinowej, do których należą m.in. chinina, chinidyna oraz cynchonidyna i cynchonina nie wykazują swoistych właściwości przeciwrakowych. W eksperymentalnej farmakoterapii chorób nowotworowych z występującą opornością wielolekową (MDR) stosuje się kombinację leków przeciwnowotworowych np. cyklofosfamidu, doxorubicyny, metyloprednizolonu lub winblastyny oraz niedziałających przeciwrakowo alkaloidów chinowca chininy lub cynchoniny. Alkaloidy te znajdują zastosowanie w kombinowanej terapii w przypadku wytworzenia w komórce nowotworowej oporności wielolekowej, gdyż hamują one usuwanie z tych komórek leków przeciwrakowych co skutkuje spotęgowaniem ich działania (Lee, S.Y. et al. Environ. Tox., 2011, 26, 424 i Solary, E. et al., Leukemia, 2000, 14, 2085). W zgłoszeniu patentowym WO ujawniono zastosowanie, do leczenia m.in. białaczki szpikowej, raka jajników, niedrobnokomórkowego raka płuc, znanych leków m.in. etopozydu lub doksorubicyny w połączeniu z alkaloidami chinowca takimi jak cynchonina, dihydrocynchonina oraz hydrochinidyna. Alkaloidy chinowca hamują efekt MDR na skutek czego leki przeciwrakowe wykazują efektywniejsze działanie. Z kolei opis WO ujawnia zastosowanie dichlorowodorku cynchoniny jako środka hamującego efekt MDR, przy czym związek ten charakteryzuje się wyższą rozpuszczalnością w wodzie niż związki ujawnione w zgłoszeniu WO , dzięki czemu jest bardziej biodostępnym lekiem a tym samym korzystniejszym dla wspomagania w terapii nowotworów. Ujawnione w zgłoszeniach WO i WO zastosowanie znanych pochodnych chinowca ogranicza się do wspomagającego działania w chemioterapii nowotworowej w terapiach w których występuje zjawisko MDR. Ujawnione w tych zgłoszeniach związki nie wykazują efektywnego samodzielnego działania przeciwnowotworowego, tzn. ich zastosowanie w terapiach przeciwnowotworowych polega na neutralizowaniu mechanizmów uniemożliwiających działanie właściwych leków przeciwnowotworowych a nie bezpośrednim działaniu na komórkę rakową jak to ma miejsce w przypadku właściwych leków przeciwnowotworowych. Z danych ujawnionych przez Martirosyan a (Martirosyan, A.R. et al. Biochem. Pharmacol., 2004, 68, 1729) wynika że, dla wysokich stężeń chininy i chinidyny, obserwuje się słabe działanie przeciwrakowe. W eksperymentalnej różnicowej terapii nowotworów (differentiation therapy) stosowano związki zawierające pierścień chinolinowy, w tym chininę i chinidynę. Zaobserwowano ich wpływ na ekspresję genów wpływających na rozwój raka. Jednak słabe zahamowanie wzrostu i różnicowania się komórek raka piersi (MCF-7) obserwowane in vitro dla chininy i chinidyny (IC 50 odpowiednio 40 i 113 μm), według standardów chemioterapeutycznych nie kwalifikuje tych substancji jako efektywnych leków przeciwrakowych. Celem wynalazku było opracowanie nowych zastosowań pochodnych alkaloidów chinowca posiadających działanie cytotoksyczne w terapii przeciwnowotworowej. Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie eterów 9-O-propargilowych o ogólnej strukturze wyrażonej wzorem 1

3 PL B1 3 gdzie poszczególne etery posiadają konfigurację absolutną atomów C-8 i C-9: (8R,9S) konfiguracja cynchoniny lub (8R,9R) konfiguracja 9-epicynchoniny do sporządzania leków stosowanych w chemioterapii nowotworów. Do oznaczenia konfiguracji przyjęto zwyczajową numerację stosowaną w chemii alkaloidów chinowca. Badania aktywności cytotoksycznej przeprowadzono na liniach komórek nowotworowych: MCF-7 (rak piersi), HeLa (rak szyjki macicy) A549 (rak płuca) oraz KB (rak nosogardzieli) pochodzących z kolekcji ECACC European Collection of Cell Cultures. Testy cytotoksyczności prowadzono za pomocą standardowego oznaczenia z wykorzystaniem sulforodaminy B. Polegały na 72 godzinnej inkubacji linii komórek nowotworowych znajdujących się w fazie wzrostu logarytmicznego z badanym związkiem a następnie oznaczeniu stopnia zahamowania wzrostu komórek z wykorzystaniem adsorpcji barwnika sulforodaminy B wiążącego się z białkami komórkowymi za pomocą pomiaru spektrofotometrycznego. Oznaczenia prowadzono według procedury opisanej w pracy: Vichai, V., Kirtikara, K. Nature Protocols, 2006, 1, Przygotowanie komórek do badań: Komórki nowotworowe badanej linii w fazie logarytmicznego wzrostu wysiewa się na 24-studzienkowe płytki w ilości 20 tys. komórek/2 ml pożywki na studzienkę, a następnie inkubuje w cieplarce w temperaturze 37 C, w atmosferze 5% CO 2 przez 24 godziny. Przygotowanie roztworów badanego związku: Roztwory badanych związków przygotowuje się w DMSO w zakresie stężeń: 0,05; 0,1; 0,5; 1; 5; 10; 50; 100 μm. W komorze laminarnej, zapewniającej sterylne warunki pracy, komórki testowanych linii traktuje się roztworami badanego związku w ten sposób, że: trzy pierwsze studzienki stanowią kontrolę zawierają tylko 20 μl DMSO, do następnych studzienek dodaje się kolejne roztwory badanego związku (20 μl) począwszy od najniższego stężenia (trzy studzienki na każde stężenie). Następnie płytkę umieszcza się w inkubatorze na 72 godziny. Po zakończonej inkubacji przyklejone komórki utrwala się przez dodatek 500 μl zimnego (4 C) 50% kwasu trichloroctowego (TCA) i inkubuje w 4 C przez 1 godzinę. Następnie każdą studzienkę płucze się sterylną wodą i suszy. Tę operację powtarza się pięciokrotnie. Utrwalone komórki wybarwia się przez 30 minut poprzez dodatek 500 μl 0,4% roztworu barwnika (sulforodaniny B) rozpuszczonego w 1% kwasie octowym. Niezwiązany barwnik usuwa się zlewając go z płytki a komórki płucze się 4 razy 1% kwasem octowym. Następnie płytkę suszy się na powietrzu przez ok. 5 minut. Związany barwnik rozpuszcza się poprzez dodanie do każdej studzienki 1500 μl 10 mm buforu Tris-base (trishydroksymetyloaminometan) i miesza się przy użyciu wytrząsarki orbitalnej przez 5 minut. Następnie przenosi się po 200 μl roztworu z każdej studzienki do dwóch studzienek na nowej płytce 96-studzienkowej oraz oznacza się absorpcję roztworów spektrofotometrycznie przy długości fali nm za pomocą czytnika płytek. % zahamowania wzrostu komórek wobec badanego związku oblicza się przyjmując absorpcję roztworu kontrolnego za 100%. W zależności od rodzaju linii komórkowej stosowano następujące media hodowlane: linia MCF-7 była namnażana w medium Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DME) firmy Sigma (nr kat. D5796), linie HeLa, A549 oraz KB były namnażane w medium RPMI-1640 firmy Sigma (nr kat. R8758). Dla wszystkich badanych pochodnych wyznaczono wskaźnik IC 50, który oznacza stężenie związku potrzebne do zahamowania wzrostu komórek o 50%. Pochodne wykazujące IC 50 <4 μg/ml są powszechnie uznawane za aktywne (w skrócie: A, ang. active), pochodne mieszczące się w przedziale IC 50 = 4 30 μg/ml za związki o średniej aktywności (w skrócie: MA, ang. medium active), natomiast pochodne, dla których IC 50 >30 μg/ml za związki nieaktywne (w skrócie: NA, ang. non-active) (National Cancer Institute, Division of Cancer Treatment, Drug Research and Development. Program Procedure. Instruction and technical documentation change notice, instruction 14. Screening data summary interpretation and outline of current screening. Edition NCI, NIH, Bethesda Rev., 1980, 6, 31 62). Dla porównania analogiczne badania przeprowadzono z użyciem znanych leków cytotoksycznych, a mianowicie 5-fluoro-2 -deoksyurydyny i 5-fluorourcylu oraz cynchoniną. Wyniki badań aktywności cytotoksycznej związków o wzorze ogólnym 1 przedstawione są w tabeli 1. Podane wartości uśredniono z trzech niezależnych oznaczeń.

4 4 PL B1 Związek 9-O-propargilocynchonina (PCN) Linia MCF-7 (rak piersi) T a b e l a 1 Aktywność cytotoksyczna IC 50 HeLa (rak szyjki macicy) A549 (rak płuca) KB (rak nosogardzieli) [μg/ml] [μm] [μg/ml] [μm] [μg/ml] [μm] [μg/ml] [μm] 3,0 (A) 9,02 3,5 (A) 10,53 3,9 (A) 11,73 3,2 (A) 9,63 cynchonina 38,1 (NA) 129,6 45,7 (NA) 155,4 >50 (NA) >50 (NA) 5-fluoro-2 -deoksyurdyna 2,81 (A) 11,4 3,20 (A) 13,0 3,30 (A) 13,4 3,37 (A) 13,7 5-fluorouracyl 2,37 (A) 18,2 2,73 (A) 21,0 2,78 (A) 21,4 2,86 (A) 22,0 Cytotoksyczność in vitro wobec linii komórek nowotworowych raka piersi, raka szyjki macicy, raka płuca oraz raka nosogardzieli związku PCN mieści się w zakresie wysokiej aktywności (IC 50 9,0 11,7 μm) i jest wyższa od porównywanych znanych i stosowanych związków przeciwrakowych 5-fluoro-2 -deoksyurydyny i 5-fluorouracylu. Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie 9-O-propargilocynchoniny (PCN) do sporządzania leków stosowanych w chemioterapii raka piersi. Badania potwierdziły, że najbardziej aktywnym związkiem wobec linii MCF-7 jest PCN, dla którego wartość IC 50 wynosi 9.02 μm. Jest on ponad 2 razy bardziej cytotoksyczny niż stosowane w terapiach przeciwnowotworowych porównawcze 5FU oraz 1,3 razy bardziej aktywny niż 5FdU. Kolejnym aspektem wynalazku jest zastosowanie 9-O-propargilocynchoniny (PCN) do sporządzania leków stosowanych w chemioterapii raka szyjki macicy. Badania potwierdziły, że najbardziej aktywnym związkiem jest PCN, dla którego wartość IC 50 wynosi 10,53 μm. PCN jest niemal 2 razy bardziej cytotoksyczny niż porównawczy 5FU oraz 1,2 razy bardziej cytotoksyczny niż 5FdU. Kolejnym aspektem wynalazku jest zastosowanie 9-O-propargilocynchoniny (PCN) do sporządzania leków stosowanych w chemioterapii raka płuca. Badania potwierdziły, że najaktywniejszym związkiem jest PCN, dla którego wartość IC 50 wynosi 11,73 μm. PCN jest 1,8 razy bardziej cytotoksyczny niż porównawczy 5FU oraz nieco bardziej cytotoksyczny niż 5FdU. Kolejnym aspektem wynalazku jest zastosowanie 9-O-propargilocynchoniny (PCN) do sporządzania leków stosowanych w chemioterapii raka nosogardzieli. Badania potwierdziły, że najaktywniejszym związkiem jest PCN, dla którego wartość IC 50 wynosi 9,63 μm. PCN w porównaniu z 5FU oraz 5FdU wykazuje odpowiednio 2,3 oraz 1,4 razy wyższą cytotoksyczność. Cytotoksyczność związków o wzorze ogólnym 1 jest związana z konfiguracją absolutną na atomach C-8 i C-9, najaktywniejszy związek PCN jest pochodną cynchoniny o konfiguracji (8R,9S). Zmiana konfiguracji na przeciwną czyli (8S,9R) występującą w pochodnej otrzymanej z cynchonidyny, powoduje średnio trzykrotne obniżenie aktywności cytotoksycznej. Przedmiot wynalazku jest objaśniony przykładem wykonania, który ilustruje syntezę związku PCN. Eter 9-O-propargilowy cynchoniny otrzymano z naturalnego alkaloidu izolowanego z kory chinowca procedurą opisaną w patencie EP P r z y k ł a d 1 Cynchoninę (883 mg; 3 mmol) rozpuszczano w bezwodnym DMF (12 ml) po czym roztwór umieszczono na łaźni lodowej. Po ochłodzeniu mieszaniny do ok. 5 C dodawano porcjami wodorek sodu (50% NaH w oleju mineralnym, 300 mg, 2 równoważniki) w przeciągu 0,5 godz. Mieszany roztwór pozostawiano na 2 godziny po czym dodano strzykawką porcjami bromek propargilu w postaci 80% roztworu w toluenie (0,42 ml; 3,75 mmol, 1,25 równoważnika). Mieszaninę reakcyjną pozostawiano przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano dichlorometan (50 ml) i roztwór organiczny przemyto kolejno nasyconym roztworem NaCl (30 ml), a następnie wodą destylowaną (30 ml). Warstwę organiczną suszono bezwodnym siarczanem magnezu, po czym środek suszący odsączono, a rozpuszczalniki odparowano na wyparce próżniowej utrzymując temperaturę łaźni wodnej w zakresie C. Surowy produkt 9-O-propargilocynchoninę (PCN) oczysz-

5 PL B1 5 czano na kolumnie chromatograficznej wypełnionej silikażelem (60H, 0,045 0,075 mm/ mesh firmy Merck) w gradiencie: CH 2 Cl 2 /n-heksan, CH 2 Cl 2, 1% MeOH/CH 2 Cl 2, 5% MeOH/CH 2 Cl 2. Związek PCN w formie oleju 165 o czystości >99% otrzymano z wydajnością ok. 80%. 1 H NMR (300/400 MHz, CDCl 3 ): 1,24 (m, 1H), 1,52 (m, 2H), 2,11 (m, 1H), 2,28 (q, 1H, J = 8,0 Hz), 2,46 (t, 1H, J = 2,3 Hz), 2,72-2,97 (m, 3H), 3,11 (m, 1H), 3,49 (s, 1H), 3,92 (d, 1H, J = 1,8 Hz), 3,95 (d, 1H, J = 1,8 Hz), 4,21 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 4,25 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 5,01 (d, 1H, J = 3,7 Hz), 5,14 (d, 1H, J = 11,1 Hz), 6,10 (ddd, 1H, J = 17,3, 10,1, 7,6 Hz), 7,26 (s, 1H ), 7,48 (d, 1H, J = 4,3 Hz), 7,59 (m, 1H), 7,73 (m, 1H), 8,15 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 8,18 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 8,91 (d, 1H, J = 4,3 Hz). 13 C NMR (CDCI 3 ): 20,35, 28,10, 40,00, 49,22, 49,98, 56,48, 60,30, 75,13, 114,74, 123,24, 126,81, 129,18, 130,46, 148,51, 150,08. MS ES (m/z): (-) 331 (M-H) -, 367/369 (M+Cl) - ; (+) 333 (M+H) +, 355 (M+Na) +. Zastrzeżenia patentowe 1. Zastosowanie eterów 9-O-propargilowych o ogólnej strukturze wyrażonej wzorem 1 gdzie poszczególne etery posiadają konfigurację absolutną atomów C-8 i C-9: (8R,9S) konfiguracja cynchoniny lub (8R,9R) konfiguracja 9-epicynchoniny lub do sporządzania leków stosowanych w chemioterapii nowotworów. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że do sporządzania leków stosowanych w chemioterapii raka piersi stosuje się 9-O-propargilocynchoninę. 3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że do sporządzania leków stosowanych w chemioterapii raka szyjki macicy stosuje się 9-O-propargilocynchoninę. 4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że do sporządzania leków stosowanych w chemioterapii raka płuca stosuje się 9-O-propargilocynchoninę. 5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że do sporządzania leków stosowanych w chemioterapii raka nosogardzieli stosuje się 9-O-propargilocynchoninę.

6 6 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)