Ćwiczenie 14 i 15. zjazd 2 ćwiczenie nr 2 dla e-rolnictwa

Ćwiczenie 14 i 15. zjazd 2 ćwiczenie nr 2 dla e-rolnictwa Badanie wpływu róŝnych czynników na szybkość reakcji enzymatycznej. Wyznaczanie wartości stałej Michaelisa-Menten w reakcji katalizowanej przez fosfatazę kwaśną. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest poznanie wpływu podstawowych czynników, takich jak temperatura, stęŝenie jonów wodorowych oraz ilości enzymu na szybkość reakcji enzymatycznej. Ćwiczenie umoŝliwia takŝe wyznaczenie wybranych stałych kinetycznych dla reakcji enzymatycznej katalizowanej przez fosfatazę kwaśną, czyli wartości stałej K m. Wprowadzenie Czynniki określające aktywność enzymów. Poza stęŝeniem substratu szybkość reakcji enzymatycznej zaleŝy od wielu innych czynników, przede wszystkim od temperatury i stęŝenia jonów wodorowych w środowisku reakcji (mieszanina inkubacyjna). Wpływ temperatury na aktywność enzymu charakteryzuje krzywa przedstawiona na rysunku 1. Jak widać z przebiegu krzywej, w miarę wzrostu temperatury reakcja enzymatyczna, podobnie jak kaŝda reakcja chemiczna, początkowo ulega przyspieszeniu w związku z dostarczaniem energii cieplnej do układu. PodwyŜszenie temperatury przyspiesza szybkość reakcji zgodnie z regułą van't offa, która głosi, Ŝe podwyŝszenie temperatury o 10 C powoduje około dwukrotny wzrost szybkości reakcji enzymatycznych. W określonej temperaturze zostaje osiągnięte optimum działania enzymu, a przy dalszym jej wzroście następuje gwałtowny spadek szybkości reakcji, co jest związane z denaturacją cieplną białka enzymu. RYS. 1. Wpływ temperatury na szybkość reakcji enzymatycznej Optymalna temperatura działania większości enzymów, tzn. najwyŝsza temperatura, przy której nie ujawnia się jeszcze wpływ denaturujący, waha się w granicach 30 50 C. Zakres temperatury optymalnej moŝe się jednak zmieniać w zaleŝności od czasu trwania reakcji, zmian stęŝenia jonów wodorowych oraz róŝnego stopnia zanieczyszczenia innymi białkami. Termostabilność (termolabilność) charakteryzuje enzymy jako odporne lub podatne na przedłuŝone działanie określonej temperatury. Preinkubacja enzymów w temperaturze 100 C powoduje najczęściej całkowitą ich inaktywację. Odbywa się to wskutek denaturacji cieplnej, wyjątek stanowią enzymy uzyskiwane z organizmów Ŝyjących w warunkach ekstremalnych pod względem temperatury (np. gorące źródła) lub teŝ uzyskiwane metodami biologii

molekularnej do celów przemysłowych. Po denaturacji cieplnej enzymów, ich inkubacja w temperaturze optymalnej, najczęściej nie powoduje renaturacji i zajścia katalizy enzymatycznej. Zazwyczaj obecność substratu i optymalne dla danego enzymu p zmniejszają jego podatność na denaturację cieplną. Obecność substratu sprzyja bowiem utrzymaniu właściwej konformacji cząsteczki białka enzymu. Optymalne stęŝenie jonów wodorowych, wpływając na stan zdysocjowania reszt aminokwasowych enzymu zapewnia zachowanie jego struktury przestrzennej. Odpowiednie stęŝenie jonów wodorowych jest waŝnym czynnikiem warunkującym aktywność enzymu. Na rysunku 2 przedstawiono wpływ p na aktywność wybranych enzymów proteolitycznych. RYS. 2. Wpływ p na szybkość reakcji enzymatycznej na przykładzie wybranych enzymów proteolitycznych Krzywe przedstawiające zaleŝność aktywności enzymatycznej od p nie zawsze mają typowy kształt dzwonu. Najodpowiedniejsze stęŝenie jonów wodorowych, tzn. takie, przy którym szybkość działania enzymu jest największa, nazywamy optimum p. Dla większości enzymów znajduje się ono w zakresie 5 7. Wpływ p na aktywność danego enzymu zaleŝy od wartości stałej dysocjacji: a) grup jonizujących w centrum aktywnym enzymu uczestniczących w wiązaniu substratu, b) grup funkcyjnych w cząsteczce substratu, którymi wiąŝe się on z enzymem, c) grup funkcyjnych w cząsteczce enzymu, od których zaleŝy kataliza, d) innych grup w cząsteczce enzymu, których stan zjonizowania moŝe warunkować jego katalitycznie aktywną konformację. Optimum p moŝe ulegać pewnym zmianom zaleŝnie od stopnia czystości preparatu enzymu i temperatury środowiska. Zmiany wartości p w układzie pokarmowym zwierząt stanowią waŝny element w regulacji aktywności enzymów trawiennych. Szybkość reakcji enzymatycznej, poza omówionymi juŝ czynnikami, zaleŝy od obecności inhibitorów enzymów. Aktywność wielu enzymów moŝe ulec zahamowaniu w sposób bardziej lub mniej specyficzny pod wpływem określonych substancji wywołujących zmiany w obrębie centrum aktywnego, nazywanych inhibitorami. Proces hamowania przez nie reakcji enzymatycznej nazwano inhibicją. W zaleŝności od sposobu działania inhibitora na enzym rozróŝnia się inhibicję odwracalną i nieodwracalną. Kinetyka reakcji enzymatycznych. Ilościowe badanie i interpretacja wyników szybkości reakcji enzymatycznych wchodzi w zakres kinetyki procesów. Obejmuje ona badanie wpływu stęŝenia substratu, stęŝenia enzymu, temperatury, p oraz mechanizmu reakcji katalizowanych przez enzymy. Enzymy katalizują reakcje metaboliczne w organizmach Ŝywych (in vivo), lecz mogą równieŝ działać poza komórką (in vitro), co ma podstawowe znaczenie w badaniu ilościowym oraz

właściwości enzymów jak równieŝ z w zastosowaniach przemysłowych preparatów enzymatycznych. Charakterystyczną cechą reakcji enzymatycznych jest zjawisko wysycania enzymu substratem (rys. 3). Obserwacje tego zjawiska doprowadziły Michaelisa i Menten do sformułowania teorii działania enzymów i ich kinetyki. Teoria ta jest pewnym uproszczeniem procesu katalizy enzymatycznej i nie dotyczy wszystkich poznanych do tej pory enzymów np. jednym z wyjątków są licznie występujące w organizmach Ŝywych enzymy allosteryczne. Zgodnie teorią Michaelisa i Menten enzym (E) tworzy z substratem (S) kompleks enzymsubstrat (ES), który następnie rozpada się na: produkt (P) i enzym według równania: k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 gdzie: k 1, k 1, k 2 stałe szybkości odpowiednich przemian. RYS. 3. Wykres Miechaelisa-Menten zaleŝności szybkości reakcji enzymatycznej (V) od stęŝenia substratu (S): V max szybkość maksymalna reakcji, K m stała Michaelisa-Menten Energia kompleksu ES określa poziom, do którego w danych warunkach musi wzrosnąć energia układu reagującego, aby reakcja mogła przebiegać. Poziom energetyczny kompleksu ES jest wyŝszy od poziomu energetycznego substratu o wartość energii potrzebnej do zaktywowania substratu, czyli tzw. energii aktywacji. Tworzenie kompleksu ES obniŝa wartość energii aktywacji niezbędnej do zapoczątkowania reakcji i tym samym przyspiesza przebieg reakcji termodynamicznie moŝliwych (Rys. 4.). RYS. 4. Zmiany energii swobodnej - G zachodzące podczas reakcji katalizowanej przez enzym. StęŜenie kompleksu jest tym większe przy stałym stęŝeniu enzymu, im wyŝsze jest stęŝenie substratu. Przy odpowiednio wysokim stęŝeniu substratu praktycznie wszystkie

cząsteczki enzymu znajdują się w kompleksie ES, wówczas reakcja osiąga szybkość maksymalną V i staje się proporcjonalna do aktualnego stęŝenia enzymu: V = k 2 [E] = V max Przy stałym stęŝeniu enzymu szybkość reakcji zmienia się zaleŝnie od aktualnego stęŝenia substratu. ZaleŜność szybkości reakcji enzymatycznej od stęŝenia substratu ujmuje równanie: V gdzie: V szybkość reakcji, K m stała Michaelisa- Menten, V max szybkość maksymalna reakcji, [S] stęŝenie substratu. Przedstawiony wzór nosi nazwę równania Michaelisa-Menten, a graficznie obrazuje go hiperbola (rys. 3). Z rysunku tego wynika, Ŝe przy niskim stęŝeniu substratu (pierwszy odcinek krzywej) tylko niektóre cząsteczki enzymu połączone są z substratem szybkość początkowa reakcji jest proporcjonalna do wzrastającego stęŝenia substratu i reakcja przebiega zgodnie z kinetyką reakcji pierwszego rzędu. W miarę zwiększania stęŝenia substratu przyrost szybkości reakcji staje się nieproporcjonalny, jest to tzw. strefa kinetyki mieszanej, tj. pierwszego i zerowego rzędu (środkowy odcinek krzywej). Przy wyŝszych stęŝeniach substratu reakcja osiąga szybkość maksymalną i przebiega zgodnie z kinetyką zerowego rzędu, tj. niezaleŝną od stęŝenia substratu, a zaleŝną od aktualnego stęŝenia enzymu. WaŜna zaleŝność wynika z równania Michaelisa-Menten wtedy, gdy szybkość reakcji odpowiada połowie szybkości maksymalnej V = 1/2 V max. Wówczas po przekształceniu równania otrzymuje się wartość: K m = [S], co pozwala zdefiniować stałą K m jako takie stęŝenie substratu (w molach na 1 litr lub w milimolach na 1 litr), przy którym szybkość reakcji enzymatycznej osiąga połowę szybkości maksymalnej. Wartości stałej K m wahają się w granicach od 10 1 do 10 8 M i zaleŝą od rodzaju enzymu, substratu, temperatury i p. JeŜeli enzym wchodzi w reakcję z więcej niŝ jednym substratem, to w stosunku do kaŝdego z nich wykazuje charakterystyczną wartość K m. W określonych warunkach prowadzenia reakcji ma ona wartość stałą i jest wskaźnikiem powinowactwa enzymu do substratu. Niska wartość K m wskazuje na duŝe powinowactwo enzymu do substratu oraz duŝą szybkość procesu katalitycznego i odwrotnie. Podobnie jak wartość K m, wartość szybkości maksymalnej V max wykazuje duŝe zróŝnicowanie zaleŝnie od p, temperatury i rodzaju substratu. Wartość V max i stałą K m wyznacza się doświadczalnie z wykresu zaleŝności szybkości reakcji V od stęŝenia substratu [S]. PoniewaŜ wykres tej zaleŝności daje krzywą asymptotyczną, więc utrudnia to dokładne wyznaczenie V max i K m (rys. 1). W celu dokładniejszego wyznaczenia szybkości maksymalnej danej reakcji moŝna jednak oprzeć się na równaniu Michaelisa-Menten przekształconym w jego odwrotność: V = max K m + [ S] [ S] 1 V 1 = V max K + V m 1 max [ S] Jest to równanie Lineweavera-Burka, w którym zaleŝność 1/V od 1/[S] jest funkcją liniową, a wykresem takiej funkcji jest linia prosta. Nachylenie tej prostej określa stosunek K m /V max ; przecina ona oś rzędnych w punkcie wyznaczającym 1/V, a oś odciętych w punkcie 1/K m (rys. 5).

Wyznaczanie wartości stałej Km dla substratu w sposób doświadczalny polega na wykonaniu szeregu pomiarów aktywności enzymów dla róŝnych stęŝeń substratu. StęŜenia substratu oraz czas trwania reakcji enzymatycznej (przebiegającej w optymalnej dla działania enzymu temperaturze oraz w p buforu) muszą być tak dobrane aby uzyskać róŝne ilości produktów, czyli zastosowane stęŝenia substratów nie mogą być wysycające w pełni wszystkie centra aktywne obecnych w środowisku reakcji cząsteczek enzymów. Dobór stęŝenia substratu musi być odpowiedni, a reakcja enzymatyczna powinna przebiegać zgodnie z kinetyką pierwszego rzędu. RYS. 5. Wykres Lineweavera-Burka zaleŝności odwrotności szybkości reakcji enzymatycznej (1/V) od odwrotności stęŝenia substratu (1/[S]): 1/V max odwrotność szybkości maksymalnej, -1/K m odwrotność stałej Michaelisa-Menten. Oznaczanie aktywności enzymów. Wskaźnikiem obecności czynnego enzymu jest stwierdzenie określonej przemiany chemicznej, którą on katalizuje. Natomiast o ilości enzymu wnioskuje się na podstawie szybkości reakcji w określonych warunkach stęŝenia substratu, p mieszaniny reakcyjnej, temperatury itp. W odpowiednich warunkach szybkość reakcji mierzona najczęściej ilością wytworzonego produktu lub ubytkiem substratu w jednostce czasu jest proporcjonalna do ilości czynnego enzymu, czyli jego aktywności. Aktywność enzymu bowiem jest zmienna i zaleŝy od wielu czynników, takich jak: stęŝenie substratu, czas trwania reakcji, temperatura, p, hamowanie przez produkty itp. Dlatego pomiaru aktywności enzymów dokonuje się w tzw. warunkach optymalnych i w takim czasie, kiedy pozostaje ona stała, tj. przemiana przebiega według kinetyki reakcji zerowego rzędu. Jednostki aktywności enzymów. Szybkość przemiany, mierzona ilością substratu przekształconego w jednostce czasu i przeliczona na ilość badanego materiału, jest miarą aktywności enzymu, którą zwykle wyraŝa się w tzw. jednostkach aktywności. Aby umoŝliwić porównywanie aktywności enzymów, oznaczanych w róŝnych badaniach, najwłaściwsze jest wyraŝanie ich aktywności w jednostce standardowej (uniwersalnej). Za taką jednostkę przyjęto tę ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 µmola substratu w ciągu 1 minuty, w optymalnej temperaturze (zwykle 30 C) i w optymalnych warunkach p oraz stęŝenia substratu. Jednostką zalecaną przez Komisję Międzynarodowej Unii Biochemicznej jest katal. Jest to taka ilość enzymu, która w ciągu 1 sekundy w optymalnej temperaturze warunkach p oraz stęŝenia substratu powoduje przemianę 1 mola substratu. PoniewaŜ jest to bardzo duŝa jednostka, więc zwykle uŝywa się jej podwielokrotności, np. mikro- lub nanokatala. Innym jeszcze sposobem wyraŝania aktywności enzymu jest tzw. aktywność molekularna. Jest to ilość mmoli substratu przekształcona w ciągu 1 minuty w standardowych warunkach przez 1 µmol enzymu (w odniesieniu do jednego centrum aktywnego, jeŝeli enzym zawiera ich więcej). Ten sposób wyraŝania aktywności moŝna jednak stosować tylko wtedy, gdy znana jest masa cząsteczkowa enzymu i liczba centrów aktywnych.

Często równieŝ oznacza się ilość białka w badanym materiale i aktywność enzymu wyraŝa jako aktywność właściwą, która określa liczbę jednostek enzymu na 1 mg białka. Jest to bardzo przydatny sposób wyraŝania aktywności podczas wydzielania i oczyszczania enzymów, poniewaŝ w kolejnych etapach oczyszczania aktywność całkowita zazwyczaj maleje, a aktywność właściwa wzrasta i jest miarą stopnia oczyszczenia enzymu. Oznaczanie aktywności fosfatazy kwaśnej. Fosfatazy (fosfomonoesterazy) naleŝą do enzymów z klasy hydrolaz, podklasy esteraz i katalizują hydrolizę róŝnych estrów fosforanowych. ZaleŜnie od typu substratu wyróŝnia się szereg typów fosfataz. Najbardziej rozpowszechnione są wśród nich hydrolazy monoestrów fosforanowych. Naturalnymi substratami dla hydrolaz monoestrów fosforanowych są: estry fosforanowe cukrów (glukozo-6-fosforan, fruktozo-1,6- bisfosforan), fosfoseryna itp (rys. 6). 4 O Glucose-6-phosphatase Enzym: glukozo-6-fosfataza 6 2 C 2 OPO 3 C 2 O 5 O O 3 2 O O glucose-6-phosphate glukozo-6-fosforan 1 2 O O O glucose glukoza O O O + P i fosfoseryna RYS. 6. Reakcja hydrolizy glukozo-6-fosforanu, katalizowana przez glukozo-6-fosfatazę. fruktozo-1,6- bisfosforan Fosfatazy wykazują niską specyficzność substratową i w związku z tym zaleŝnie od optimum p dla ich działania klasyfikowane są na: fosfatazy kwaśne o optimum p ok. 5 i fosfatazy alkaliczne o optimum p ok. 9. Fosfataza kwaśna (EC 3.1.3.2) występuje w duŝych stęŝeniach w nasionach roślin i gruczole krokowym człowieka. Aktywność jej bardzo silnie wzrasta w chorobie nowotworowej tego gruczołu, co wykorzystuje się w diagnostyce do wczesnego rozpoznawania tej postaci raka. W nasionach roślin aktywność fosfatazy kwaśnej silnie wzrasta podczas kiełkowania, a następnie maleje w miarę wzrostu siewek. Prawdopodobnie wzrost jej aktywności związany jest z uwalnianiem fosforanu nieorganicznego z organicznych form zapasowych fosforanu, np. z kwasu fitynowego. Aktywność fosfataz oznacza się zazwyczaj uŝywając sztucznych substratów, takich jak: 2-glicerofosforan, fenylofosforan, fosforan fenoloftaleiny, p-nitrofenylofosforan. Aktywność enzymu mierzy się ilością uwolnionego fosforanu lub części organicznej estru po inkubacji enzymu z substratem w ściśle określonych warunkach. Szczególnie dogodny jako substrat jest p-nitrofenylofosforan, gdyŝ jeden z produktów reakcji przechodzi w formę barwną juŝ po zalkalizowaniu środowiska. W ćwiczeniu będzie wykorzystany wodny wyciąg enzymu z kiełków pszenicy. Jako substrat będzie uŝyty p-nitrofenylofosforan. Reakcję hydrolizy tego związku z udziałem fosfatazy i tworzenie barwnego produktu pokazano na rysunku 7. Powstający produkt reakcji p-nitrofenol przyjmuje w środowisku zasadowym barwę Ŝółtozieloną i jest miarą aktywności fosfatazy.

RYS. 7. Reakcja hydrolizy p-nitrofenylofosforanu z udziałem fosfatazy kwaśnej. Odczynniki 1. Wyciąg enzymu: do 150 mg kiełków pszenicy dodać 100 ml wody i homogenizować przez 5 min (przy wydawaniu prób do kolbek miarowych odpowiednio zwiększyć ilość kiełków). omogenat przesączyć przez sączek z waty i przechowywać w chłodziarce. 2. 0,0075-molowy p-nitrofenylofosforan disodowy. 3. 0,1-molowy bufor cytrynianowy o p 5,2. 4. 10-proc. węglan sodowy. Wykonanie 1. Przygotowanie enzymu. Otrzymany wyciąg enzymatyczny z siewek zbóŝ w kolbce na 25 ml uzupełnić wodą do kreski, dokładnie wymieszać i uŝywać w dalszych punktach jako enzym. W celu pobrania pipetą automatyczną podanej w dalszym opisie objętości enzymu, część rozcieńczonego wodą enzymu przelać do czystej probówki. 2. Wpływ temperatury. Do czterech probówek (próby pełne) odmierzyć po 0,5 ml roztworu enzymu (1), po 0,75 ml buforu cytrynianowego o p = 5,2 (3) oraz po 0,75 ml wody destylowanej. Do jednej probówki (próba kontrolna) odmierzyć po 0,75 ml buforu cytrynianowego o p = 5,2 (3) oraz 1,25 ml wody destylowanej. Preinkubacja: pierwszą probówkę pełną umieścić w temp. 4 C (woda z lodem), drugą w temp. 30 C razem z próba kontrolną, trzecią probówkę pełną w temp. 100 C (wrząca woda), czwartą w łaźni o temperaturze 60 C. Po doprowadzeniu zawartości probówki do temp. 100 C lub 60 C (przez ok. 5 min) wyjąć probówki, schłodzić ich zawartości, a następnie wstawić do łaźni o temp. 30 C. Pozostałe probówki pozostają ciągle w łaźni z lodem lub w temp. 30 C. Inkubacja: Do tak przygotowanych 5 probówek (4 pełne i 1 kontrolna) odmierzyć po 0,5 ml roztworu p-nitrofenylofosforanu, wymieszać zawartość probówek i inkubować przez dokładnie 15 min. Następnie przerwać reakcję enzymatyczną, dodając po 2,5 ml węglanu sodowego (4). Oznaczyć absorbancję prób pełnych w fotometrze przy 420 nm, ustawionym na zero wobec próby kontrolnej. 3. Wpływ stęŝenia jonów wodorowych. Do czterech probówek odmierzyć po 0,5 ml roztworu enzymu (1), po 0,75 ml wody destylowanej i po 0,75 ml buforów: do pierwszej p 3,0, do drugiej p 4,4 i do trzeciej p 5,2, a do czwartej p 6,6. Do jednej probówki (próba kontrolna) odmierzyć po 0,75 ml buforu cytrynianowego o p = 5,2 (3) oraz 1,25 ml wody destylowanej. Umieścić wszystkie probówki w łaźni wodnej o temp. 30 C na 5 minut do preinkubacji, dodać po 0,5 ml roztworu p-nitrofenylofosforanu, wymieszać zawartość probówek i inkubować przez dokładnie 15 min. Następnie przerwać reakcję enzymatyczną, dodając po 2,5 ml węglanu sodowego (4). Oznaczyć absorbancję prób pełnych w fotometrze przy 420 nm, ustawionym na zero wobec próby kontrolnej.

4. Wpływ stęŝenia enzymu. Do czterech probówek (próby pełne) odmierzyć kolejno po 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 ml roztworu enzymu (1), po 0,75 ml buforu cytrynianowego o p = 5,2 (3) oraz uzupełnić mieszaniny wodą destylowaną do objętości 2,0 ml. Do jednej probówki (próba kontrolna) odmierzyć po 0,75 ml buforu cytrynianowego o p = 5,2 (3) oraz 1,25 ml wody destylowanej. Umieścić wszystkie probówki w łaźni wodnej o temp. 30 C na 5 minut do preinkubacji, po tym czasie dodać po 0,5 ml roztworu p-nitrofenylofosforanu, wymieszać zawartość probówek i inkubować przez dokładnie 15 min. Następnie przerwać reakcję enzymatyczną, dodając po 2,5 ml węglanu sodowego (4). Oznaczyć absorbancję prób pełnych w fotometrze przy 420 nm, ustawionym na zero wobec próby kontrolnej. 5. Wyznaczanie wartości stałej Michaelisa-Menten (K m ). W 2 powtórzeniach do sześciu ponumerowanych probówek odmierzyć kolejno 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 i 1,0 ml p- nitrofenylofosforanu (2), dodać po 0,75 ml buforu cytrynianowego (3), uzupełnić mieszaniny wodą destylowaną do objętości 2,0 ml. Do jednej probówki (próba kontrolna) odmierzyć po 0,75 ml buforu cytrynianowego o p = 5,2 (3) oraz 1,25 ml wody destylowanej. Umieścić wszystkie probówki w łaźni wodnej o temp. 30 C na 5 minut do preinkubacji, dodać po 0,5 ml roztworu enzymu, wymieszać zawartość probówek i inkubować przez dokładnie 15 min. Następnie przerwać reakcję enzymatyczną, dodając po 2,5 ml węglanu sodowego (4). Oznaczyć absorbancję prób pełnych w fotometrze przy 420 nm, ustawionym na zero wobec próby kontrolnej. Opracowanie wyników 1. Obliczyć ilość µg uwolnionego w reakcji p-nitrofenolu, dzieląc absorbancję przez współczynnik absorbancji dla 1µg p-nitrofenolu równy 0,002. Sporządzić wykresy zaleŝności szybkości reakcji od stęŝenia enzymu, p oraz temperatury preinkubacji odkładając na osi rzędnych µmole p-nitrofenolu, a na osi odciętych odpowiednie wartości badanych parametrów. Wpływ stęŝenia enzymu ilość enzymu A 420 ilość µg pnp 1) 0,25 ml enzymu 2) 0,5 ml enzymu 3) 0,75 ml enzymu 4) 1,0 ml enzymu 1) p 3,0 2) p 4,4 3) p 5,2 4) p 6,6 Wpływ p p buforu A 420 ilość µg pnp

1) 0 C Wpływ temperatury temperatura A 420 ilość µg pnp 2) 30 C 3) 60 C 4) 100 C 2. Ilość utworzonego p-nitrofenolu obliczyć w µg, jak podano w punkcie 1. Dla poszczególnych stęŝeń substratu obliczyć 1/[S], pamiętając, Ŝe substrat wyjściowy o stęŝeniu 0,0075 M został rozcieńczony pięciokrotnie w mieszaninie inkubacyjnej do 2,5 ml, oraz odwrotność szybkości 1/V (w µmolach produktu). Sporządzić wykres zaleŝności szybkości reakcji od stęŝenia substratu, odkładając na osi rzędnych 1/V (µmole p-nitrofenolu), a na osi odciętych 1/[S] (mole p-nitrofenylofosforanu). PrzedłuŜyć linię do przecięcia się z ujemną częścią osi odciętych, z otrzymanej wartości 1/K m obliczyć wartość stałą K m w molach na 1 litr i podać ją w sprawozdaniu. ilość dodanego S A 420 µg pnp V = µmole pnp / 1 min stęŝenie S (pnpp) w mieszaninie wyraŝone w M 1/S 1/V 0,1ml 0,2ml 0,4ml 0,6ml 0,8ml 1,0ml 3. Dla średniej wartości absorbancji dla 1 ml (punkt 5 wykonania) obliczyć ilość p- nitrofenolu w µg, jak podano w punkcie 1 (opracowanie wyników). Podać wynik prowadzącemu ćwiczenia i uwzględniając rozcieńczenie oraz masę cząsteczkową p- nitrofenolu obliczyć aktywność fosfatazy kwaśnej w µmolach p-nitrofenolu na 1 g siewek pszenicy na 1 minutę. Pytania 1. Jakie czynniki wpływają na szybkość reakcji enzymatycznej i co moŝe być jej miarą? Dla wybranego czynnika przedstaw odpowiedni wykres. 2. Co to jest stała K m, od czego zaleŝy jej wartość? W jaki sposób doświadczalnie moŝna wyznaczyć wartość stałej K m dla określonego substratu?

3. Podać definicję jednostki uniwersalnej i aktywności molekularnej enzymu. 4. Podać przykłady naturalnych substratów fosfatazy kwaśnej. Napisać wzór substratu wykorzystywanego na ćwiczeniach. Co moŝe być miarą aktywności fosfataz? 5. Napisać reakcję zachodzącą podczas oznaczania aktywności fosfatazy kwaśnej na ćwiczeniach. Dlaczego do mieszaniny inkubacyjnej dodaje się roztwór węglanu sodowego? 6. Podczas oznaczania aktywności fosfatazy kwaśnej w mieszaninie inkubacyjnej wykryto 180 µmoli p-nitrofenolu. Ile µg substratu uległo rozłoŝeniu? 7. Napisać równanie Lineweavera-Burka. W jaki sposób wyznacza się na ćwiczeniach stałą K m dla fosfatazy kwaśnej według tego równania? 8. Jaki jest zakres optymalnego p dla większości enzymów? Jakie jest optimum p działania fosfatazy kwaśnej? Czy zmiany aktywności enzymu zaleŝne od p związane są z inaktywacją enzymu, czy teŝ są odwracalne? 9. PodwyŜszona temperatura moŝe przyspieszać lub hamować aktywność enzymów - uzasadnij dlaczego. Reakcja katalizowana przez fosfatazę kwaśną przebiega z nieznaczną szybkością w temp. 4 C i 100 C. Czy wywołane jest to tymi samymi zmianami fizykochemicznymi enzymu? 10. Przedstaw wykres opisujący zmiany energii swobodnej w reakcji katalizowanej oraz nie katalizowanej przez enzym. Co to jest energia aktywacji? 11. Napisz równanie Michealisa Menten, objaśnij znaczenie poszczególnych symboli. Czy to równanie moŝna stosować do opisu zjawisk kinetycznych dla wszystkich enzymów? Odpowiedź uzasadnij.