Fluorescencja
Plan wykładu 1) Absorpcja, emisja wymuszona i emisja spontaniczna 2) Przesunięcie Stokesa 3) Prawo lustrzanego odbicia 4) Znaczniki fluorescencyjne 5) Fotowybielanie
Emisja spontaniczna i wymuszona w absorpcja emisja spontaniczna emisja wymuszona hν hν hν hν E = hν n
Przesunięcie Stokesa
Przesunięcie Stokesa - relaksacja chromoforu Widmo fluorescencji cząsteczek w roztworze zazwyczaj wykazuje maksimum dla fal dłuŝszych niŝ widmo absorpcji ze względu na jądrową relaksację wzbudzonych cząsteczek, których część energii zostaje przeniesiona do otoczenia przez cząsteczki rozpuszczalnika zanim dojdzie do fluorescencji wzbudzonej cząsteczki => przesunięcie Stokesa
Przesunięcie Stokesa relaksacja otoczenia Dodatkowo, przesunięcie Stokesa moŝe być spowodowane relaksacją (=reorganizacją) otaczających cząsteczek rozpuszczalnika (do której dochodzi równieŝ pomiędzy aktem absorpcji i emisji).
Przesunięcie Stokesa - relaksacja chromoforu c.d. Relaksują (słabną) drgania wewnątrzcząsteczkowe Energia b g, b e średnia długość wiązania w stanie podstawowym i wzbudzonym zmiana długości wiązania podczas oscylacji = b e - b g Λ wibracyjna energia reorganizacji (energia potrzebna do rozciągnięcia lub ściśnięcia wiązania o (b e - b g ) Przesunięcie Stokesa: hν abs - hν fl =2Λ Współrzędne koordynacyjne chromoforu (np. zmiana długości wiązania)
Przesunięcie Stokesa relaksacja otoczenia c.d. Analogiczny rysunek do poprzedniego, ale energia w funkcji współrzędnych cząsteczek rozpuszczalnika! Energia Współrzędne koordynacyjne rozpuszczalnika tu: Λ - energia reorganizacji rozpuszczalnika Całkowita energia reorganizacji jest sumą energii reorganizacji wibracyjnej (chromoforu) i rozpuszczalnika i podobnie: Całkowite przesunięcie Stokesa jest sumą przesunięć wibracyjnego i pochodzącego od rozpuszczalnika
Przesunięcie Stokesa, a polarność rozpuszczalnika Ze wzrostem polarności rozpuszczalnika, przesunięcie Stokesa z reguły rośnie (relaksacja cząsteczek rozpuszczalnika mocno obniŝa energię stanu wzbudzonego), np. tryptofan moŝe być w białku w róŝnym środowisku bardziej lub mniej polarnym - maksima fluorescencji dla róŝnych długości fali.
Prawo lustrzanego odbicia
Prawo lustrzanego odbicia Widmo fluorescencji cząsteczki jest zazwyczaj w przybliŝeniu lustrznym odbiciem widma absorpcji. Względna amplituda ε νd ba F ν 3 D ba absorpcja fluorescencja (Uwzględnienie róŝnych zaleŝności absorpcji i fluorescencji od częstotliwości światła) Liczba falowa (1/λ) [cm -1 ]
Kiedy prawo lustrzanego odbicia jest zachowane? 1) Gdy mody wibracyjne są harmoniczne (krzywe energii potencjalnych modów drgań cząsteczki są opisywane przez parabole; kx 2 ) a ich częstotliwości wibracji ν są jednakowe w stanie podstawowym i wzbudzonym => Wówczas energie moŝliwych przejść wibronowych w widmach absorpcji i emisji są symetrycznie rozłoŝone po przeciwnych stronach energii przejścia 0-0, hν 00 np. hν abs = hν 00 + 3hν Energia hν abs hν 00 hν fl hν fl = hν 00-3hν lub ogólniej: ν abs = ν 00 + δ ν fl = ν 00 -δ Współrzędne koordynacyjne chromoforu
Znaczniki fluorescencyjne (barwniki)
Znaczniki fluorescencyjne (barwniki) - mają powszechne zastosowanie do badania zmian strukturalnych w białkach i innych cząsteczkach znakowania Ŝywych komórek
Znaczniki fluorescencyjne (barwniki) - przykłady
Znaczniki fluorescencyjne kropki kwantowe -nanokryształy (klastry) materiałów półprzewodnikowych (np. CdS, CdSe) o średnicy ~20-100 Å otoczone przezroczystą warstwą izolacyjną; -dodatkowo mogą być pokryte polimerem z przyłączonymi ligandami konkretnych białek lub innych cząsteczek
Kropki kwantowe - właściwości fluorescencyjne są związane z ograniczonymi rozmiarami kropek - kształt gaussowski pasm fluorescencji - wąskie pasma fluorescencji - szerokość spektralna (FWHM) 30-50 nm - szerokie widma absorpcji (łatwo wzbudzić światłem o dowolnej długości fali poniŝej długości fali światła emitowanego) - bardzo odporne na fotozniszczenie
Białko GFP Green Fluoresent Protein (GFP) - GFP silnie świeci w zakresie widzialnym i moŝe być genetycznie przyłączane do innych białek nie trzeba dodatkowo znakować badanych białek The Nobel Prize in Chemistry 2008 "for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP" Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien
GFP Gly-Tyr-Ser emisja fluorescencji Aequorea victoria
Pochodne GFP
Pochodne GFP
Fotowybielanie
Fotowybielanie - fotochemiczny proces nieodwracalnego przejścia cząsteczki w stan niefluoryzujący (i nieabsorbujący), - często związany z obecnością O 2 w elektronowym stanie singletowym (wzbudzony stan O 2 powstający np. na skutek przeniesienia energii ze wzbudzonych stanów tripletowych cząsteczek aromatycznych na O 2 w stanie podstawowym) O 2 w stanie singletowym reaguje z podwójnymi wiazaniami C=C => fotoprodukty - wydajność fotowybielania: rzędu 10-7 10-6 lub większa przy duŝym natęŝeniu światła
FRAP i FLIP - wykorzystanie zjawiska fotowybielenia do badania ruchliwości biomolekuł (np. lipidów lub białek w błonie biologicznej) - FRAP = fluorescence recovery after photobleaching - FLIP = fluorescence loss in photobleaching FRAP FLIP Fluorescencja w róŝnych miejscach próbki obserwowana przez mikroskop