Badanie procesów zwijania i agregacji GFP i jego mutantów. Monika Olasek, Zakład Biofizyki IFD UW

Wielkość: px

Rozpocząć pokaz od strony:

Download "Badanie procesów zwijania i agregacji GFP i jego mutantów. Monika Olasek, Zakład Biofizyki IFD UW"

Alicja Kubiak
8 lat temu
Przeglądów:

1 Badanie procesów zwijania i agregacji GFP i jego mutantów. Monika Olasek, Zakład Biofizyki IFD UW

2 Plan O Green Fluorescent Protein i jego mutantach Absorpcyjne badanie agregacji EGFP Emisyjne badanie agregacji i zwijania EGFP i GFP Co wyszło na żelu? Podsumowanie

3 GFP co to jest? Green Fluorescent Protein to białko wyizolowane z meduzy Aqueorea victoria. Charakteryzuje się naturalną fluorescencją w obszarze widzialnym maksimum emisji chromoforu przypada na 58 51nm; Jest to małe białko 238 aminokwasów, Charakterystyczna struktura 11-kartkowa β-beczka z umieszczoną wewnątrz helisą; 3 aminokwasy wchodzące w skład helisy tworzą chromofor.

przypada na 58 51nm; Jest to małe białko 238 aminokwasów, Charakterystyczna struktura

4 Dlaczego świeci? ma 1 tryptofan (Trp57) i 13 tyrozyn to są aminokwasy aromatyczne, fluoryzujące w obszarze ultrafioletowym jest to fluorescencja charakterystyczna dla białek. trzy aminokwasy: S65, Y66 i G67 cyklizują ulegają dehydrogenacji i dehydratacji tworząc chromofor, czyli strukturę zdolną do absorpcji promieniowania i do fluorescencji Oczywiście za zainteresowanie GFP odpowiada ten drugi rodzaj świecenia w obszarze widzialnym.

jest to fluorescencja charakterystyczna dla białek.

5 Jak wygląda GFP?

6 GFP - odkrycie Meduza ma fluoryzujące białko akweorynę (światło niebieskie). Meduza świeci na zielono. Zaczęto szukać i znaleziono GFP.

7 Mutanty Mutanty dzielimy na : świecące: S65T (laboratoryjny dziki typ z uproszczonym widmem absorpcji), S65T/F64L (tzw. EGFP enhanced GFP wzmocnione GFP fluoryzuje ok. 1 razy silniej od typu dzikiego) nieświecące: S65T/G67A (mutacja na glicynie wchodzącej w skład chromoforu, takie mutanty zawsze są nieświecące) Oczywiście jest o wiele więcej mutantów, świecących różnymi kolorami

1 razy silniej od typu dzikiego) nieświecące: S65T/G67A (mutacja na glicynie wchodzącej w skład

8 Oddziaływanie prom. e-m z materią Jeżeli energia fali jest równa energii przejścia, to promieniowanie może zostać pochłonięte (zaabsorbowane) przez cząsteczkę. Diagram Jabłońskiego

9 Co absorbuje/świeci w białkach? ogólnie układ - elektronowy (elektrony zdelokalizowane) w białkach: aminokwasy aromatyczne: tryptofan i tyrozyna absorpcja ok 28nm, emisja ok 34nm chromofory niebiałkowe (np hem) i białkowe (GFP)* wiązania peptydowe - absorpcja ok 22nm mostki disiarczkowe (np w utlenionym DTT) maksimum absorpcji 283nm (prawie pokrywa się z białkowym pikiem od Trp/Tyr) *chromofor jest generalnie strukturą zdolną do absorpcji promieniowania. Chromofory świecące to fluorofory

ok 28nm, emisja ok 34nm chromofory niebiałkowe (np hem) i białkowe (GFP)* wiązania peptydowe - absorpcja ok 22nm mostki

10 Jak wygląda widmo EGFP? Widmo absorpcji EGFP,16 absorpcja (kuw 1cm),14,12,1,8,6,4,2, λ [nm]

11 Agregacja EGFP Widma absorpcji wykonywane co kilka godzin, odjęte tło buforu (5mM Pi 3mM NaCl, bez DTT) absorbancja [a.u.],3,25,2,15,1,5 h h3.1 h9 h18.9 h28 h37 h49 h55 h72 h72.5 iloraz absorbancji względem h 4, 3,5 3, 2,5 2, 1,5 1,,5, d d3.1 d9 d18.9 d28 d37 d49 d55 d72 d72.5, dł fali [nm] -, dł fali [nm]

12 Agregacja EGFP,35,3 1,2 1, iloraz absorbancji,25 absorbancja [a.u.] 1,4 l55 l49 l39 l36 l28 l275 l26 l25,2,15,1,6,4,5,2,, czas [h] d5528 d4928 d3928 d3628 d27528 d2625 d2528, czas [h]

13 Zmiany emisji a agregacja Ex 29nm Ex 415nm emisja h h24 h48 h67.5 h87 h19 h134.5 h156 h181 h25 emisja h h24 h48 h67.5 h87 h19 h134.5 h156 h181 h dł. fali [nm] dł fali [nm]

5 h156 h181 h25 emisja 45 4 35 3 25 2 h h24 h48 h67.

14 Zmiany emisji w czasie - agregacja Zanik eksponencjalny: y+aexp(-t/ τ) fluorescencja [a.u.] Chi^2 R^2 4 1 = =.9911 rozpraszanie 64nm 42 y = 315 ± 5 A = 122 ± 7 τ = 47 ± rozp64 ch czas [h] czas [h] 75 tt32 tt flu o re sc e n c ja [a.u.] flu o re sc en cja [a.u.] trp 32 5 trp cza s [h ] cza s [h ]

6 8 1 12 14 16 18 2 czas [h] czas [h] 75 tt32 tt34 2 55 65 flu

15 Denaturacja białek Denaturacją nazywamy każdą zmianę struktury natywnej białka powodującą utratę aktywności biologicznej. Denaturację mogą wywołać różne czynniki: środki chaotropowe (mocznik, hydrochlorek guanidyny H2NC(=NH) NH2 HCl), działają w wysokich stężeniach detergenty (SDS sodium dodecyl sulphate) ciepło odczynniki rozcinające mostki disiarczkowe (DTT dithiotreitol, DTE dithioerythritol) kwasy lub zasady ingerujące w mostki solne w białkach Chaotrope = chaos maker ; chaotropes break down the hydrogen-bonded network of water, so allowing macromolecules more structural freedom and encouraging protein extension and denaturation.

sodium dodecyl sulphate) ciepło odczynniki rozcinające mostki disiarczkowe (DTT dithiotreitol, DTE dithioerythritol) kwasy lub zasady ingerujące w mostki solne

16 Zmiany emisji w czasie - zwijanie S65T - GFP S65T/F64L - GFP emisja 58nm [a.u] emisja 58nm [a.u] czas [min] czas [min] Ex 47nm em 58nm

17 Zwijanie EGFP emisja [a.u.] dł fali [nm] M,5M 1M 1,5M 2M 2,5M 3M 4M 5M 6M

18 Zwijanie EGFP emisja w 37nm [a.u.] maksimum emisji Trp (ex 295nm) [nm] stężenie GdnHCl [M] stężenie GdnHCl [M]

[nm] 354 353 352 351 35 349 18 1 2 3 4 5 6

19 Co wyszło na żelu? bez β merkaptoetanolu z β merkaptoetanolem 3 próbki: bez DTT, z DTT, ze świeżym DTT; stały 1 dni, zwirowane, oddzielnie supernatant, oddzielnie pellet

20 Wnioski Nie wiadomo do końca czemu, ale EGFP agreguje ze stanu natywnego po rozcieńczeniu stężona próbka jest stabilna. Agregację można zobrazować zarówno metodmi absorpcyjnymi jak i emisyjnymi Inny jest mechanizm zwijania GFP i EGFP przy tym samym stężeniu białka w próbce i w tych samych warunkach. Elektroforeza widać, że białko agreguje prążki odpowiadające dimerom i trimerom; nie wiadomo co z wyższymi polimerami trzeba zrobić żel z wiekszymi porami. Czeka mnie jeszcze dużo pracy!!!

samym stężeniu białka w próbce i w tych samych warunkach.

21 My Agnieszka Bzowska Beata Kutrowska Monika Olasek Anna Buszko Patricia Clark (University of Notre Dame, USA)

Podobne dokumenty

PRACOWNIA BIOFIZYKI DLA ZAAWANSOWANYCH

PRACOWNIA BIOFIZYKI DLA ZAAWANSOWANYCH Ćwiczenia laboratoryjne dla studentów III roku kierunku Zastosowania fizyki w biologii i medycynie Biofizyka molekularna Absorpcyjne i emisyjne badanie tworzenia