Zakresy promieniowania. Światło o widzialne. długość fali, λ. podczerwień. ultrafiolet. Wektor pola elektrycznego. Wektor pola magnetycznego TV AM/FM

Transkrypt

1 Światło o widzialne Zakresy promieniowania ultrafiolet podczerwień Wektor pola elektrycznego Wektor pola magnetycznego TV AM/FM długość fali, λ

2 Podział fal elektromagnetycznych Promieniowanie X Fale wolnozmiennesieci przesyłowe Fale radiowe i TV okresowe zmiany kierunku i prędkości grup elektronów Ultrafiolet Promieniowanie gamma -powstaje w wyniku przemian jądrowych Podczerwień Widzialne Mikrofale Przejścia elektronów pomiędzy orbitami

3 Zastosowanie metod optycznych do badania układ adów w biologicznych Nie inwazyjne Nie niszczące Badania in situ Spektroskopia optyczna Struktura biomolekuł Oddziaływania międzycząsteczkowe Badanie reakcji biochemicznych Mikroskopia optyczna Obrazowanie tkanek, komórek i organelli komórkowych

4 Zastosowanie spektroskopii optycznej do badania makromolekuł Absorpcja UV i widzialna Fluorescencja Światło spolaryzowane fluorescencja dichroizm liniowy i kołowy Spektroskopia wibracyjna podczerwień Raman

5 Podczas przechodzenia wiązki światła przez roztwory można zaobserwować kilka procesów mających wpływ na pochłanianie światła w próbce. - pochłanianie światła przez roztwór I a - rozproszenie światła (do przodu) w kierunku jego przechodzenia I rp -rozproszenie światła do tyłu I b -rozproszenie światła na boki I r -część światła ulega odbiciu na granicy środowisk powietrze-szkło oraz szkło-woda I n -część światła przechodzi przez roztwór I t I b I r I rp I a I 0 I t I r

6 -di = I 0 ε c dx zmiana natężenia di na grubości dx x I t di = εc I I 0 l 0 dx I t = I 0 exp(-εcl cl) I 0 I I -di I t Po zlogarytmowaniu wyrażenia oraz pomnożeniu przez ( 1) otrzymamy wyrażenie na absorbancję A I dx l ln I I 0 t = εcl A = εcl absorbancja A = - log T T = 10 -A T - transmisja

7 Zjawisku absorpcji powoduje osłabienie natężenia światła monochromatycznego przechodzącego przez badany ośrodek. Dla roztworów o niewielkim stężeniu współczynnik absorpcji k jest proporcjonalny do stężenia c. Jest to prawo Beera, które zapisujemy wzorem k = ε c gdzie ε to współczynnik ekstynkcji, wartość charakterystyczna dla danego roztworu Dla roztworów jednorodnych dla których współczynnik absorpcji k nie zależy od położenia natężenie światła wychodzącego I t z próbki o grubości d wynosi co stanowi treść prawa Lamberta. I t = I 0 exp (-kd) Łącząc obydwie zależności otrzymujemy prawo Lamberta-Beera w postaci wzoru I = I 0 exp (-εcd)

8 Współczynnik ekstynkcji ε A = εcl A 1 ε = cl Mcm max ε λ Wartość współczynnika ekstynkcji w maksimum absorpcji jest wartością charakterystyczną dla każdego związku. Na podstawie widma absorpcji oraz znanego współczynnika ekstynkcji możemy obliczyć stężenie molowe danego związku w roztworze. Dzięki addytywności współczynników ekstynkcji można określić udział poszczególnych składników w roztworze A λ = A λm + A λn = ( ε lm [M] + ε λn [N]) l

9 Schemat Jabłońskiego konwersja wewnętrzna s relaksacja wibracyjna przejście międzysystemowe Fluorescencja Fosforescencja

10 Mechanizmy molekularne widma absorpcji i emisji Diagram Jabłońskiego

11 Spektroskopia absorpcyjna Elektronowe widmo absorpcji W TP wszystkie molekuły znajdują się w wibracyjnym stanie podstawowym podstawowego stanu elektronowego Stan wzbudzony Wzbudzenia zachodzą do poziomów wibracyjnych wzbudzonych stanów elektronowych Przejścia pomiędzy stanami wibracyjnymi Stan podstawowy Stan podstawowy to stan singletowy (spiny sparowane S=1) Dozwolone przejścia do stanów singletowych

12 W woda; D dioksan; C cykloheksan gaz idealny gaz rzeczywisty ciecz Dla molekuł wieloatomowych pojedyncze przejścia wibracyjne nie są obserwowane. W cieczach obserwuje się poszerzenie i nakładanie się poszczególnych pasm Oddziaływania z rozpuszczalnikiem zakłócają poziomy energetyczne Prowadzi to do poszerzenia lub/i przesunięcia widm

13 Chromofory Grupy funkcjonalne posiadające charakterystyczne widmo absorpcji Grupa amidowa Aromatyczne aminokwasy Tryptofan, tyrozyna, alaniana Oddziaływania pomiędzy wieloma chromoforami prowadzi do zmiany widm oraz intensywności pasm Najniższe przejścia energetyczne mogą zmieniać natężenie w zależności od geometrii i konformacji chromofrorów Zmniejszenie natężenia pasma hipochromizm Zasady kwasów nukleinowych Zwiększenie natężenia pasma hiperchromizm

14 Spektroskopia wiązania amidowego Cztery nie-wiążące n elektrony na tlenie Cztery π elektrony Silne pasmo ππ przy 195 nm Słabe pasmo nπ przy 220 nm Widmo absorpcji chromoforu amidowego

15 Oddziaływania pomiędzy chromoforami Białka zawierają wiele grup amidowych Przejściowe momenty dipolowe grup amidowych oddziaływają ze sobą Widma absorpcji amino kwasów FAl Tyr Dwie grupy amidowe w dimerze białka Oddziaływania kulombowskie pomiędzy grupami Siła oddziaływania zależy od wielkości dipoli, Względnej orientacji oraz odległości, zależność R -3 Trp

16 Spektroskopia absorpcyjna chromoforów białek Wiele wiązań peptydowych (amidowych) z różnymi podstawnikami Przeważającym chromoforem jest grupa amidowa Słabe nπ przejście około 220 nm Silne ππ przejście około 195 nm Większość łańcuchów bocznych wykazuje przejścia poniżej 200 nm Zwykle przykrytych przez silną absorpcję grupy amidowej Aminokwasy aromatyczne tyrozyna, tryptofan fenyloalanina Mają pasmo absorpcji około 300 nm

17 Spektroskopia absorpcyjna białek Charakterystyczne pasmo grupy amidowej 200 nm Widmo absorpcji albuminy Drugi pik około 280 nm związany z obecnością podstawnik aromatycznego Widmo charakterystyczne pozwalające odróżnić białka od DNA Wstępna identyfikacja białek w badanym materiale, np. w chromatografii

18 Drugorzędowa struktura białek Widmo UV jest czułe na drugorzędową strukturę białek Struktura helikalna (1), pofałdowana (2) i kłębek statystyczny (3) Posiadają różne własności absorpcyjne Pozwala to na śledzenie zmian w strukturze drugorzędowej podczas zmian warunków wykrywać denaturację Różne widma ze względu na różne oddziaływania pomiędzy chromoforami 3 2 Kłębek statystyczny praktycznie widmo grupy amidowej 1 Helikalna - regularnie ułożone, oddziaływujące grupy amidowe Widmo rozdzielone, natężenie zmniejszone

19 Spektroskopia absorpcyjna kwasów nukleinowych Chromofory Zasady kwasów nukleinowych intensywne przejścia typu ππ Wszystkie mają podobne widma UV

20 Widmo przedstawione jako absorbancja przypadająca na jeden nukleotyd Polinukleotydy i kwasy nukleinowe wykazują mniejszą absorpcję niż wolne kwasy nukleinowe zjawisko hipochromizmu Np. DNA E coli wykazuje absorpcję niższą o 60 % niż tworzące je nukleotydy

21 Hipochromizm w DNA Oddziaływania pomiędzy dipolami zasad Zmiany natężenia do obserwacji zmian drugorzędowej struktury podczas zmian temperaturowych lub w różnych roztworach Pomiary względnego wzrostu absorbancji DNA Przy 260 nm jako funkcja temperatury Podczas podgrzewania DNA następuje zmniejszenie oddziaływań pomiędzy zasadami co prowadzi do wzrostu absorpcji Maksymalnie obserwuje się około 88% wzrost natężenia co odpowiada całkowitemu zniszczenie struktury drugorzędowej a obserwowane interakcje wynikają z oddziaływań typu kłębka statystycznego

22 Pomiary stężeń molekuł biologicznych przy pomocy absorpcji Małe stężenia, mała dokładność ważenia Obecność wody i soli Pomiar względem próbki referencyjnej Współczynnik ekstynkcji Prawo Lambert-Beera A = ε c l

23 Spektroskopia fluorescencyjna Obecnie najczęściej używana technika spektroskopowa w biologii Wiele biomolekuł wykazuje naturalną fluorescencję Chlorofil czerwona Białka fluorescencja w zakresie UV głównie z reszt tryptofanowych Modyfikowane zielono fluoryzujące białka GFP DNA fluorescencja w UV Sondy fluorescencyjne do badania nie fluoryzujących biomolekuł Molecular Probes Inc,

24 Dlaczego fluorescencja jest tak użyteczna? Wysoka czułość Możliwość wykrywania pojedynczych molekuł Duża selektywność Trzy charakterystyczne parametry długość fali wzbudzenia długość fali emisji czas życia fluorescencji Czuła na molekularne otoczenie Czuła na oddziaływania międzycząsteczkowe Transfer energii elektronowej Molekularna linijka

25 Luminescencja Emisja światła przez elektronowo wzbudzoną molekułę Fluorescencja to fotoluminescencja Molekuła wzbudzona w wyniku absorpcji światła optyczne wzbudzenie Fotoluminescencja fluorescencja przejścia z zachowaniem spinu czas trwania od piko do nanosekunds Inne rodzaje luminescencji chemiluminescencja bioluminescencja elektroluminescencja fosforescencja przejścia spinowo zabronione czas trwania mili do sekund tryboluminescencja mechanicznie indukowane rozładowania elektryczne

26 Mechanizm fluorescencji Wzbudzenie (absorpcja) do poziomów wibracyjnych pierwszego singletowego stanu wzbudzonego S1 Relaksacja wibracyjna w cieczach Zderzenia z molekułami rozpuszczalnika Szybka utrata energii wibracyjnej i jej zamiana na ciepło Fluorescencja z najniższego poziomu wibracyjnego wzbudzonego stanu S1 Przejścia do poziomów wibracyjnych stanu podstawowego S0

27 Wzbudzenie do wyższych stanów elektronowych, S2, S3 itp. Szybka konwersja wewnętrzna konwersja energii elektronowej do energii wibracyjnej szybka relaksacja wibracyjna utrata energii wibracyjnej z zderzeniach z rozpuszczalnikiem Fluorescencja zawsze zachodzi z najniższego poziomu wibracyjnego stanu S1 Widmo fluorescencji nie zależy od długości fali wzbudzenia

28 Spektroskopia fluorescencyjna białek Wewnętrzna fluorescencja Wykrywanie obecności białek Monitoruje wypływ frakcji proteinowych w HPLC Wysoka czułość Większa selektywność niż widm absorpcji

29 Spektroskopia fluorescencyjna kwasów nukleinowych Kwasy nukleinowe słabo fluoryzują Zastosowanie sond fluorescecnyjnych wiązane kowalencyjnie interkalacyjne /nie-kowalencyjne/ bromek etydyny wizualizacja fragmentów DNA podczas elektroforezy w żelu Podstawianie fluoryzujących analogów zasad jak 2 aminopuryna

30 Metody polaryzacji światła Dwójłomność Światło spolaryzowane w prostopadłych płaszczyznach wykazuje różne współczynniki załamania. Jest to dwójłomność. Odpowiednia konstrukcja pryzmatu pozwala na eliminację jednego z kierunków dzięki zastosowaniu zjawiska całkowitego wewnętrznego odbicia. Rozpraszanie Molekuły zachowują się jak dipole i rozpraszają energię wzdłuż osi dipola

31 Odbicie pod kątem Brewstera Współczynniki odbicia są różne dla obydwu polaryzacji Gdy światło pada pod kątem Brewstera to światło odbite jest liniowo spolaryzowane gdyż dla tego kąta wspł. odbicia składowej II wynosi zero

32 Molekuły chiralne Symetria zwierciadlana Nie można poprzez obrót otrzymać cząsteczki wyjściowej

33 Widma dichroizmu kołowego, CD Dichroizm kołowy jest to różnica w absorpcji kołowo spolaryzowanego światła lewoi prawoskrętnie przez cząsteczkę asymetryczna lub chirialną. W białkach chromoforem jest grupa amidowa absorbująca w zakresie nm Chirialność białek jest związana z niesymetrycznym Atomem węgla C α Widma CD dostarczają informacji na temat drugorzędowej struktury białek oraz DNA gdyż różne struktury wykazują różniące się widma

34 CD białek Widma dichroizmu kołowego są bardziej specyficzne niż widma absorpcji