Metody spektroskopii molekularnej. Metody eksperymentalne biofizyki

Transkrypt

1 Metody spektroskopii molekularnej - III rok biofizyki molekularnej Metody eksperymentalne biofizyki - I rok II stopnia fizyki medycznej i optometrii Krzysztof Gibasiewicz Zakład Biofizyki Molekularnej tel krzyszgi@amu.edu.pl Biofizyka molekularna Ćwiczenia demonstracje: czwartki lub inny termin po uzgodnieniu z osobami prowadzącymi; pierwsze zajęcia dr A. Wilk 23 luty 2012 (wilk@amu.edu.pl)

2 Literatura Wiliam W. Parson, Modern Optical Spectroscopy, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2007 Zbigniew Kęcki, Podstawy spektroskopii molekularnej, PWN W-wa 1992 lub nowsze wydanie

3 Metody spektroskopii molekularnej plan wykładów 1) Spektroskopia optyczna (12 wykładów) - wprowadzenie do zjawisk optycznych (absorpcja, fluorescencja, rozpraszanie światła) i technik z nimi związanych (3 wykłady), - wprowadzenie do mechaniki kwantowej jako podstawy rozumienia zjawisk optycznych (3 wykłady), -światło - klasyczny i kwantowo-mechaniczny opis promieniowania elektromagnetycznego (2 wykłady), - zjawiska absorpcji i fluorescencji w ujęciu kwantowomechanicznym (4 wykłady). 2) Spektroskopia magnetyczna (3 wykłady) - jądrowy rezonans magnetyczny (NMR, nuclear magnetic resonance), - elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR, electron paramegnetic resonance).

4 Plan wykładu wprowadzającego 1) Zagadnienia do przypomnienia 2) Definicje i podział spektroskopii 3) Informacje wstępne nt. spektroskopii optycznej 4) Wprowadzenie do zjawisk absorpcji i fluorescencji 5) Metody pomiaru absorbancji 6) Wprowadzenie do zjawisk dichroizmu liniowego i kołowego 7) Podstawowe pojęcia i techniki pomiaru fluorescencji 8) Wprowadzenie do spektroskopii podczerwieni i rozpraszania ramanowskiego

5 Zagadnienia do przypomnienia 1) Światło jako fala (elektrodynamika) 2) Kwantowa natura poziomów energetycznych atomów i cząsteczek (fizyka atomu i cząsteczki). 3) Orbitale atomowe i molekularne (chemia organiczna). 4) Formy energii cząsteczek rotacyjna, oscylacyjna i elektronowa (podstawy biofizyki II).

6 Definicje Spektroskopia nauka o badaniu materii za pomocą promieniowania (elektromagnetycznego, neutronowego,...). Spektroskopia molekularna materię stanowią cząsteczki. Skupimy się na cząsteczkach: a) biologicznych, b) w roztworach wodnych lub organicznych.

7 Spektroskopia optyczna Spektroskopia optyczna badanie materii za pomocą światła (włączając bliski nadfiolet i podczerwień) spektroskopia optyczna ~1 µm EPR ~1 cm NMR ~10 m

8 Zalety technik spektroskopii optycznej 1) Czułość - fotopowielacze, fotodiody rejestrują pojedyncze fotony emitowane przez wzbudzone cząsteczki, 2) Szybkość - impulsy światła <10-14 s zachowanie cząsteczek w skali czasu ruchu jąder atomowych. milisekundy, ms 10-3 s mikrosekundy, µs 10-6 s nanosekundy, ns 10-9 s pikosekundy, ps s femtosekundy, fs s

9 Informacje uzyskiwane za pomocą technik spektroskopii optycznej Absorpcja, fluorescencja, liniowy i kołowy dichroizm: identyfikacja cząsteczek, stęŝenie, energie, konformacja, dynamika, wpływ otoczenia na ww., wyznaczanie odległości między cząsteczkami, umiejscowienie i dynamika cząsteczek w Ŝywych komórkach (w powiązaniu z inŝynierią genetyczną i mikroskopią).

10 Jak cząsteczki reagują na światło? Cząsteczki istnieją w dobrze określonych stanach i przechodzą z jednych stanów do innych. Opisu tych stanów i przejść dostarcza mechanika kwantowa. Ale! Cząsteczki biologiczne są zbyt duŝe, Ŝeby mogły być opisane ściśle metodami kwantowo-mechanicznymi. Jednak! Kwantowo-mechaniczne zasady sformułowane na podstawie prostszych układów pomagają zrozumieć duŝe cząsteczki.

11 Stan podstawowy RóŜne stany cząsteczek wynikają z róŝnego obsadzenia orbitali molekularnych przez elektrony. KaŜdy orbital ma ściśle określoną energię. Stan podstawowy 2n-elektronowej cząsteczki: - kaŝdy z n orbitali o najniŝszej energii jest obsadzony przez 2 elektrony o przeciwnych spinach, - orbitale o wyŝszych energiach są puste. W nieobecności zaburzeń zewnętrznych cząsteczka pozostaje w stanie podstawowym nieskończenie długo.

12 Ekspozycja cząsteczki na światło Światło (klasycznie) = oscylujące pole elektromagnetyczne Oscylacja elektronów w cząsteczce Przemieszczenie elektronu z jednego z zajętych orbitali na wolny orbital o wyŝszej energii

13 Dwa warunki przejścia elektronu na wyŝszy orbital 1) Pole elektromagnetyczne musi drgać z odpowiednią częstotliwością: - E róŝnica energii pomiędzy stanami podstawowym i wzbudzonym - h stała Plancka. Kolory cząsteczek! ν = E/h (Nie ma konieczności odwoływania się tutaj do kwantowej natury światła! Wystarczy kwantowa natura stanów energetycznych cząsteczki!)

14 Kolory cząsteczek! Pasmo Soreta w obszarze niebieskim lub uv Pasmo Q y w czerwieni (Chl) Zielony kolor chlorofili

15 Dwa warunki przejścia elektronu na wyŝszy orbital c.d. 2) Orbitale, pomiędzy którymi przechodzi elektron muszą mieć róŝną symetrię geometryczną i muszą być odpowiednio zorientowane względem kierunku oscylacji pola EM pasma absorpcji róŝnych cząsteczek róŝnią się, absorpcja światła przez próbki anizotropowe zaleŝy od kierunku polaryzacji światła względem próbek.

16 Moment przejścia Moment przejścia (transition dipole) wektor określający siłę pasma absorpcji i optymalny kierunek polaryzacji światła dla danej cząsteczki, moŝe być obliczony ze znajomości orbitali molekularnych w stanie podstawowym i wzbudzonym, podniesiony do kwadratu siła dipola (dipole strength) proporcjonalna do siły absorpcji (pole powierzchni pod pasmem absorpcji).

17 Fluorescencja Emisja światła przez wzbudzoną cząsteczkę podczas jej powrotu do stanu podstawowego Podobnie jak przy absorpcji: Ale zazwyczaj 1) v v i E E ν = E /h 2) kierunki polaryzacji światła zaabsorbowanego i wyemitowanego są róŝne

18 Prawo Lamberta-Beera diidx = ε I C di zmiana natęŝenia światła przy przechodzeniu przez cienką warstwę próbki o grubości dx dx grubość warstwy próbki I natęŝenie światła C stęŝenie cząsteczek aborbujących ε stała proporcjonalności zaleŝna od: - długości fali światła, - struktury i orientacji cząsteczek, -środowiska.

19 Prawo Lamberta-Beera c.d. I 0 I diii = ε C dx l I = I 0 exp( ε Cl) = I 0 10 ε C l I A A absorbancja, gęstość optyczna (A=εCl), (bezwymiarowa) ε molowy współczynnik ekstynkcji (absorpcji), ε = ε /ln 10 = ε /2.303, (M -1 cm -1 ) C stęŝenie cząsteczek aborbujących (1 M = 1 mol/litr) l grubość absorbujacej próbki, (cm) I 0, I natęŝenie światła padającego i przechodzącego, (J s -1 cm -2, W cm -2 ) Transmisja, I/I T = I/I 0 = 10 -εcl Grubosc warstwy absorbujacej [j.u.]

20 Przypomnienie Metody spektroskopii molekularnej Spektroskopia optyczna Spektroskopia magnetyczna podstawowe zjawiska optyczne (absorpcja, fluorescencja, rozpraszanie światła) i techniki eksp. z nimi związanych mechanika kwantowa - podstawa rozumienia zjawisk optycznych światło opis klasyczny i kwantowomechaniczny absorpcja i fluorescencja w ujęciu kwantowomechanicznym NMR jądrowy rezonans magnetyczny EPR elektronowy rezonans paramagnetyczny

21 Światło monochromatyczne - światło o jednej długości fali lub (w rzeczywistości) o wąskim przedziale długości fali ν = c/nλ v częstotliwość fali EM c prędkość światła w próŝni n współczynnik załamania światła w danym ośrodku λ długość fali

22 Widmo absorpcji - zaleŝność absorbancji (A=εcl=log(I 0 /I)) lub molowego współczynnika ekstynkcji (ε) od częstotliwości światła (v), długości fali światła (λ) lub liczby falowej (v = 1/λ = v/c; cm -1 ) ν = c/nλ ν = E/h Fotosystem I (Chlamydomonas reinhardtii) A 1.0 A λ [nm] liczba falowa [cm -1 ]

23 Widma absorpcji - rotacyjne, oscylacyjne i elektronowe cząsteczek biologicznych 1) Widma elektronowe 300 do 800 nm 2) Widma oscylacyjne podczerwień 3) Widma rotacyjne daleka podczerwień A zakres widzialny (uv-vis) podczerwień (IR) daleka podczerwień (far IR) λ

24 Elektronowe widma absorpcji aminokwasów i białek W tryptofan Y tyrozyna F fenyloalanina nm aminokwasy aromatyczne (elektrony na orbitalach π w łańcuchu bocznym odpowiadają za aborpcję) (mostki dwusiarczkowe S S pomiędzy dwoma cysteinami) Przejście z orbitalu π (wiąŝącego) na π* (niewiąŝący) nm wiązania peptydowe, C(O) N(H) ε 190nm = 7000 M -1 cm -1

25 Elektronowe widma absorpcji zasad azotowych i kwasów nukleinowych ~260 nm nukleozydy DNA (znów elektrony na orbitalach π odpowiadają za aborpcję) da deoksyadenozyna dg deoksyguanozyna (rys.) du deoksyurydyna dc deoksytymidyna Widma zasad azotowych, nukleozydów (zasada + cukier) i nukleotydów (nukleozyd + gr fosforan.) są podobne! adenina guanina deoksyguanozyna

26 Trawienie enzymatyczne Widmo DNA Poj. nić, 82 st. C Podwójna nić 25 st. C Efekt hipochromowy 30-40% spadek absorbancji po utworzeniu podwójnej nici DNA przez nukleotydy - oddziaływanie elektronów naleŝących do róŝnych nukleotydów

27 Maksima absorpcji i współczynniki ekstynkcji aminokwasów i zasad azotowych w wodzie aminokwasy zasady azotowe silne barwniki > 100,000 M -1 cm -1 (np. chlorofil)

28 Widma absorpcji mieszanin Absorbancja mieszaniny nieoddziałujących ze sobą cząstek jest sumą absorbancji poszczególnych składników k Prawo Lamberta Beera dla mieszaniny kilku typów cząsteczek o stęŝeniach C i : Z ww. układu równań moŝna wyliczyć stęŝenia C i (liczba róŝnych długości fal liczba składników).

29 Punkt izozbestyczny - długość fali, λ i, przy której dwie róŝne cząsteczki mają jednakowe współczynniki ekstynkcji - zmiana proporcji stęŝeń tych dwóch typów cząsteczek brak zmian absorbancji w λ i - obserwacja punktu izozbestycznego sugeruje Ŝe mieszanina składa się tylko z dwóch składników Składniki A i B Mieszanina A i B o róŝnych proporcjach A B

30 Wyznaczanie stęŝenia białka - z prawa Lamberta-Beera na podstawie pomiaru A przy 280 nm: C = A 280 /(ε 280 l) i wyliczonego współczynnika ekstynkcji dla białka przy 280 nm: ε 280 = (5500 x W x Y x CC) M -1 cm -1 W, Y, CC ilość tryptofanów, tyrozyn i mostków dwusiarczkowych w badanym białku

31 Metody pomiaru absorbancji A = log(i 0 /I) Pomiar absorbancji sprowadza się do pomiaru natęŝenia światła

32 Pomiar natęŝenia światła 1) Fotopowielacze efekt fotoelektryczny 2) Fotodiody zjawisko fotoelektryczne wewnętrzne

33 Efekt fotoelektryczny (Einstein, 1905) - podstawa działania fotopowielacza - wybicie elektronu przez światło padające na stałą powierzchnię 1) Światło musi mieć częstotliwość większą od progowej, v > v 0 2) Energia kinetyczna wybitego elektronu jest proporcjonalna do (v-v 0 ) 3) Wybicie następuje natychmiast nawet przy bardzo słabym natęŝeniuświatła => światło ma naturę korposkularną => kaŝda cząstka światła (nazwana fotonem w 1926 r.) ma określoną ilość energii proporcjonalną do v => natęŝenie światła jest miarą ilości fotonów przechodzących przez 1 cm 2 w czasie 1 s (a nie miarą energii fotonów) 1, 2 dwa róŝne materiały

34 Fotopowielacz - 6 do 14 elektrod przyspieszających elektrony - fotokatoda, dynody, anoda, napięcie przyłoŝone między tymi elektrodami - wzmocnienie prądu za anodą sygnał wzmacniany na wzmacniaczu i rejestrowany jako ciągły sygnał lub pojedynczy impuls rejestrowany cyfrowo (praca w trybie zliczania pojedynczych fotonów) - wysoka czułość wydajność kwantowa 25% - rozdzielczość czasowa s <= rozrzut czasów przelotu elektronów

35 Fotopowielacz

36 Fotopowielacz mikrokanalikowy (MCP) - zasada działania jw. - mniejsze rozmiary kapilary, na ściankach których następuje wzmacnianie prądu => impuls na anodzie (rozdzielczość czasowa) ~2 x s (20 ps)

37 Fotodiody - światło generuje pary elektron-dziura w półprzewodnikach => powstaje impuls prądu - wydajność kwantowa do 80% - typowa rozdzielczość czasowa s - fotodiody o małych powierzchniach czynnych - rozdzielczość czasowa s rozmiary < 1 mm

38 Spektrofotometr absorpcyjny I 0 I r I 0 I s wirujące lustro - lampa światło białe, ciągłe A = log (I 0 / I s ) log(i 0 / I r ) = log(i r / I s ) - monochromator zamiana światła białego na monochromatyczne - rozszczepienieświatła białego (na siatce dyfrakcyjnej) - selekcja wąskiego pasma długości fali (przez obrót siatki dyfrakcyjnej) - dobieranie rozdzielczości spektralnej (przez regulację szerokości szczelin) - wirujące lustro obszary odbijające i przepuszczające światło dwie wiązki - fotodetektor (PD) fotopowielacz lub fotodioda

39 Siatka dyfrakcyjna

40 Spektrofotometr absorpcyjny - ograniczenia I 0 I r I 0 I s wirujące lustro - długi czas pomiaru skanowanie długości fali przez obrót siatki dyfrakcyjnej (rozwiązanie linijka diodowa w niektórych instrumentach) - zwiększanie rozdzielczości spektralnej (zmniejszanie szczeliny) => zwiększenie szumu (mniej światła)

41 Spektrofotometr FTIR półprzepuszczalne lustro interferogram I L, t transformacja Fouriera I I natęŝenie światła na detektorze L połoŝenie ruchomego lustra t czas FTIR = Fourier Transform Infra Red do pomiarów w podczerwieni - dwie wiązki monochromatycznego spójnego światła interferują za półprzepuszcalnym lustrem pozytywnie lub negatywnie zaleŝnie od połoŝenia ruchomego lustra => powstaje interferogram (wykres zaleŝności rejestrowanego natęŝenia światła od połoŝenia L ruchomego lustra) w postaci sinusoidy (okres = długość fali), jej transformata delta Diraca v

42 Spektrofotometr FTIR półprzepuszczalne lustro interferogram transformacja Fouriera v FTIR = Fourier Transform Infra Red - dwie wiązki monochromatycznego spójnego światła interferują za półprzepuszcalnym lustrem pozytywnie lub negatywnie zaleŝnie od połoŝenia ruchomego lustra => powstaje interferogram (wykres zaleŝności rejestrowanego natęŝenia światła od połoŝenia L ruchomego lustra) w postaci sinusoidy (okres = długość fali), jej transformata delta Diraca

43 Spektrofotometr FTIR półprzepuszczalne lustro interferogram L transformacja Fouriera v FTIR = Fourier Transform Infra Red - dwie wiązki monochromatycznego spójnego światła interferują za półprzepuszcalnym lustrem pozytywnie lub negatywnie zaleŝnie od połoŝenia ruchomego lustra => powstaje interferogram (wykres zaleŝności rejestrowanego natęŝenia światła od połoŝenia L ruchomego lustra) w postaci sinusoidy (okres = długość fali), jej transformata delta Diraca - wiązki niemonochromatyczne => interferogram - złoŝeniem oscylacji o wielu okresach; jego transformata widmo promieniawania ze źródła IR

44 Spektrofotometr FTIR półprzepuszczalne lustro interferogram L transformacja Fouriera v FTIR = Fourier Transform Infra Red - dwie wiązki monochromatycznego spójnego światła interferują za półprzepuszcalnym lustrem pozytywnie lub negatywnie zaleŝnie od połoŝenia ruchomego lustra => powstaje interferogram (wykres zaleŝności rejestrowanego natęŝenia światła od połoŝenia L ruchomego lustra) w postaci sinusoidy (okres = długość fali), jej transformata delta Diraca - wiązki niemonochromatyczne => interferogram - złoŝeniem oscylacji o wielu okresach; jego transformata widmo promieniawania ze źródła IR

45 Spektrofotometr FTIR półprzepuszczalne lustro interferogram L transformacja Fouriera v po włoŝeniu próbki FTIR = Fourier Transform Infra Red - dwie wiązki monochromatycznego spójnego światła interferują za półprzepuszcalnym lustrem pozytywnie lub negatywnie zaleŝnie od połoŝenia ruchomego lustra => powstaje interferogram (wykres zaleŝności rejestrowanego natęŝenia światła od połoŝenia L ruchomego lustra) w postaci sinusoidy (okres = długość fali), jej transformata delta Diraca - wiązki niemonochromatyczne => interferogram - złoŝeniem oscylacji o wielu okresach; jego transformata widmo promieniawania ze źródła IR - po włoŝeniu próbki - interferogram zawiera obniŝony udział absorbowanych oscylacji

46 Spektrofotometr FTIR widmo absorpcji A(ν) = log [S r (ν)/s s (ν)] S r (v), S s (v) transformaty Fouriera interferogramów otrzymanych bez próbki i z próbką

47 Spektrofotometr FTIR zalety 1) Lepszy, w stosunku do klasycznych spektrofotometrów, stosunek sygnału do szumu (mniejszy szum) 2) Szybszy pomiar 3) Precyzyjna kalibracja długości fali 4) Wysoka czułość (światło zewnętrzne, które nie przechodzi przez interferometr nie wprowadza błędu, bo nie jest skorelowane z L)

48 Czasowo-rozdzielcze pomiary zmian absorpcji Układ typu pompa-sonda (demonstracja) wzbudzenie przez krótki impuls pompujący inicjuje zmiany absorpcji próbki, które ewoluują w czasie, aŝ do zaniku stanu wzudzonego i powrotu cząsteczek do stanu podstawowego. Chwilowe róŝnicowe widma absorpcji pomiar impulsami sondującymi dla róŝnych chwil czasu (linia opóźniająca). pompa (światło wzbudzające; monochromatyczne) I 0 I, I exc sonda (światło próbkujące; białe lub monochromatyczne) ruchoma linia opóźniająca pomiary zmian absorpcji w funkcji czasu A = A exc A = log(i 0 /I exc ) log(i 0 /I) = log (I/I exc )

49 Czasowo-rozdzielcze pomiary (zmian) absorpcji E Stan podst. Wybielanie spadek A Stan wzbudz. Stopniowa odbudowa pasma absorpcji w czasie A A A Absorbancja A λ λ A λ λ A λ λ Zmiana absorbancji Czas [j.u.] Czas [j.u.]

50 Czasowo-rozdzielcze pomiary zmian absorpcji c.d. Układ pompa-sonda - rozdzielczość czasowa do s (10 fs) - c = s/t, c = 3 x 10 8 m/s, s = 1 cm => t = 0,33 x s (3,3 ps) - okno czasowe do t = 5 x 10-9 s (5 ns) => l = 1,5 m - detektor linijka diodowa lub kamera CCD całe widmo róŝnicowe jednocześnie - konieczność wielokrotnego uśredniania Pomiary zmian absorpcji w wolniejszej skali czasu w czasie rzeczywistym (demonstracja).

51 Polaryzacja liniowa

52 Dichroizm liniowy - zjawisko zaleŝności siły absorpcji wiązki światła spolaryzowanego liniowo od kierunku polaryzacji - zaleŝność między kątem θ a absorbancją kierunek polaryzacji θ dipolowy moment przejścia A ~ cos 2 θ

53 Dichroizm liniowy c.d. Próbka anizotropowa (nieuporządkowana) brak dichroizmu liniowego Próbka izotropowa uporządkowanie cząsteczek wymuszone przez - przepływ, -ściskanie lub rozciąganie Ŝelu, w którym są cząsteczki, - pole magnetyczne (porządkuje błony) - pomiar za pomocą klasycznego spektrometru absorpcyjnego wyposaŝonego dodatkowo w polaryzator

54 Dichroizm liniowy indukowany liniowo spolaryzowane światło próbkujące impuls światła wzbudzającego (liniowo spolaryzowanego) -dichroizm liniowy jest spowodowany uprzednim wzbudzeniem wybranych cząsteczek światłem spolaryzowanym liniowo

55 Dichroizm liniowy indukowany

56 Dichroizm liniowy indukowany - zanik indukowanego dichroizmu w czasie niesie informację o dynamice obrotu cząsteczki, szybkości zaniku wzbudzenia lub jest efektem obu procesów

57 Dichrozim kołowy - zajwisko róŝnej absorbancjiświatła spolaryzowanego kołowo prawo- i lewoskrętnie - polaryzacja kołowa składowe x i y wektora pola elektrycznego fali EM mają jednakowe amplitudy i są przesunięte w fazie względem siebie o 90 stopni

58 Polaryzacja kołowa - częstotliwość rotacji wektora pola elektrycznego jest taka sama częstotliowść drgań wektora elektrycznego fali spolaryzowanej liniowo Polaryzacja lewostronna

59 Dichrozim kołowy (circular dichroizm, CD) c.d. - zazwyczaj bardzo mały 10-4, ale mierzalny dzięki szybkiemu naprzemiennemu włączaniu światła spolaryzowanego prawo- i lewostronnie => mała oscylująca składowa światła przechodzącego - wyraŝony w róŝnicy molowych współczynników absorpcji światła spolaryzowanego prawo- i lewostronnie ( ε = ε p ε l, M -1 cm -1 ) lub, częściej (z powodów historycznych) jednostkach eliptyczności (w stopniach x M -1 cm -1 ) Przed próbką światło próbkujące spolaryzowane liniowo Za próbką światło próbkujące spolaryzowane eliptycznie

60 Dichrozim kołowy białek i kwasów nukleinowych - warunek: cząsteczka musi być odróŝnialna od swojego obrazu lustrzanego, np. prawo- i lewoskrętne helisy α; - CD zaleŝy od oddziaływania zarówno pola magnetycznego jak i elektrycznego z cząsteczkami i od geometrii układu molekularnego - CD dobra metoda do określania struktury drugorzędowej białek, kwasów nukleinowych i wielocząsteczkowych kompleksów - np. α-helisa: dodatnie 195 nm, ujemne 210 i 220 nm, -β-kartka: dodatnie <200 nm, ujemne 215 nm.

61 Zniekształcanie absorbancji przez rozpraszanie I 0 I I 0 I A = log (I 0 / I) A log (I 0 / I) - rozpraszanie jest tym większe im - rozmiary cząsteczek zbliŝają się lub przekraczają długość fali światła - im krótsza jest długość fali światła

62 Wpływ rozpraszania na widmo absorpcji A) B) małe obiekty słabo rozpraszają duŝe obiekty silnie rozpraszają Centra reakcji bakterii purpurowych A) wyizolowanych z błony, B) w błonach lipidowych

63 Pomiar absorpcji w próbkach rozpraszających 1) Fragmentacja próbek (np. ultradźwiękami) 2) Sfera całkująca ścianki białe (lub wyłoŝone fotodiodami) światło rozproszone nie ucieka, teŝ jest mierzone 3) Spektroskopia fotoakustyczna do próbek bardzo mętnych lub nawet prawie nieprzepuszczalnych dla światła - pomiar ciepła dysypowanego przez próbkę podczas jej powrotu ze stanu wzbudzonego do podstawowego (ciepło powoduje rozszerzenie płynu lub gazu otaczającego próbkę to rozszerzenie jest rejestrowane przez mikrofon) (Politechnika Poznańska)

64 Widma fluorescencji aminokwasów Absorpcja Fluorescencja w r-rze wodnym (w białkach świeci głównie tryptofan) Pole pod krzywymi proporcjonalne do wydajności kwantowej: W 0,12; Y 0,13; F 0,022

65 Green Fluorescent Protein (GFP) - GFP silnie świeci w zakresie widzialnym i moŝe być genetycznie przyłączane do innych białek The Nobel Prize in Chemistry 2008 "for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP" Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien

66 GFP

67 Widma fluorescencji GFP i podobnych białek

68 Spektrofluorymetr Wybór koloru światła wzbudzającego Wybór koloru światła emitowanego 2 typy widm: - widma emisji: wzbudzenie dla jednej długości fali, pomiar fluorescencji kolejno dla całego zakresu fal; przesunięte w stronę fal dłuŝszych względem widm A i (1-T)

69 Widma absorpcji i fluorescencji przesunięcie Stokesa

70 Spektrofluorymetr Wybór koloru światła wzbudzającego Wybór koloru światła emitowanego 2 typy widm: - widma emisji: wzbudzenie dla jednej długości fali, pomiar fluorescencji kolejno dla całego zakresu fal; przesunięte w stronę fal dłuŝszych względem widm A i (1-T) -widma wzbudzenia: pomiar dla jednej długości fali, wzbudzanie kolejno dla całego zakresu fal; dla cząsteczek z jednym chromoforem widmo wzbudzenia przypomina kształtem widmo (1-T), T = I/I 0, 1-T = 1 - I/I 0 = (I 0 I)/I 0 Pomiar widm fluorescencji wymaga korekty ze względu na widmo lampy i zaleŝność czułości miernika od długości fali światła

71 Widma emisji i wzbudzenia A, Fl A, Fl A Fl A Fl λ λ

72 Wydajność fluorescencji - odsetek wzbudzonych cząsteczek powracających do stanu podstawowego na drodze emisji fluorescencji Procesy konkurujące z emisją fluorescencji - wygaszanie przez inne cząsteczki (podczas zderzeń) - przejście interkombinacyjne ze stanu singletowego do tripletowego - konwersja wewnętrzna abs fl

73 Czasowo-rozdzielcze pomiary fluorescencji [M*(t)] stęŝenie cząsteczek wzbudzonych fluorescencja F(t) ~ [M *(t)] dm*/dt = -km (dm*/m)/dt = -k k prawdopodobieństwo, zaniku wzbudzenia w jednostce czasu M*(t) = M*(0) exp( kt/) M*(t) = M*(0) exp( t/τ), τ = 1/k - wzbudzenie krótkim impulsem światła - natęŝnie fluorescencji, F(t), zanika w czasie (jedno- lub wielowykładniczo): F(t) = F(0) exp( t/τ) F(t) =ΣFi(0) exp( t/τi) τ czas Ŝycia fluorescencji (średni czas jaki cząsteczka pozostaje w stanie wzbudzonym) k k k k k

74 Techniki czasowo-rozdzielczych pomiarów fluorescencji Cel: wyznaczenie czasu (czasów) Ŝycia fluorescencji 1) Zliczanie pojedynczych fotonów (demonstracja) 2) Metoda modulacyjna 3) Up-konwersja fluorescencji

75 Zliczanie pojedynczych fotonów 1) wzbudzenie b. słabymi impulsami światła kaŝdy impuls światła powoduje rejestrację tylko jednego fotonu; 2) mierzone są czasy od wzbudzenia do zarejstrowania fotonu fluorescencji, a następnie liczone fotony, które wpadają do odpowiednich kanałów czasowych 3) budowany jest histogram: liczba zliczeń w funkcji nru kanału czasowego 4) 10 5 zarejestrowanych fotonów gładki histogram Liczba fotonów 5) Rozdzielczość czasowa ~10 ps Kanał czasowy F

76 Metoda modulacyjna 1) Wzbudzenie próbki światłem ciągłym o modulowanym sinusoidalnie natęŝeniu światła z częstotliwością ω 2) Fluorescencja oscyluje sinusoidalnie z tą samą częstotliwością ω, ale amplituda i faza (φ) tych oscylacji względem oscylacji światła wzbudzającego zaleŝy od iloczynu ω i τ (czas Ŝycia fluorescencji) 3) Im dłuŝszy czas Ŝycia fluorescencji tym większe przesunięcie fazowe, najlepiej gdy ω = 1/τ. τ wyznacza się ze znajomości ω i φ 4) Zaniki wieloeksponencjalne kilka częstotliwości ω i wzbudzanie emisja fluorescencji przesunięcie fazowe amplituda sygnału fluorescencji

77 Metoda modulacyjna 1) Wzbudzenie próbki światłem ciągłym o modulowanym sinusoidalnie natęŝeniu światła z częstotliwością ω 2) Fluorescencja oscyluje sinusoidalnie z tą samą częstotliwością ω, ale amplituda i faza (φ) tych oscylacji względem oscylacji światła wzbudzającego zaleŝy od iloczynu ω i τ (czas Ŝycia fluorescencji) 3) Im dłuŝszy czas Ŝycia fluorescencji tym większe przesunięcie fazowe, najlepiej gdy ω = 1/τ. τ wyznacza się ze znajomości ω i φ 4) Zaniki wieloeksponencjalne kilka częstotliwości ω i wzbudzanie emisja fluorescencji 5)Rozdzielczość czasowa ~100 ps przesunięcie fazowe amplituda sygnału fluorescencji

78 Up-konwersja fluorescencji 1) Zasada uzyskiwania rozdzielczości czasowej (10-14 s) i układ eksperymentalny podobne jak w czasowo-rozdzielczych pomiarach typu pompa-sonda. 2) Światło fluorescencji jest ogniskowane na nieliniowym krysztale wraz krótkim impulsem swiatła próbkujacego 3) W momencie gdy światło fluorescencji dotrze do kryształu w tym samym czasie co impuls światła próbkujacego, kryształ emituje światło o nowej częstotliwości będącej sumą częstotliwości światła fluorescencji i światła próbkującego. 4) ZaleŜność natęŝenia fluorescencji od czasu zmiana opóźnienia impulsu próbkującego względem impuslu pompującego impuls próbkujący Laser femtosekundowy fluor. kryształ impuls pompujący próbka 5) Rozdzielczość czasowa ~0.1 ps

79 Anizotropia fluorescencji P1, P2 polaryzatory S - próbka - jeśli fluorescencja następuje z tego samego stanu, który został wzbudzony (momenty przejścia absorpcji i fluorescencji są wzajemnie równoległe) i cząsteczka nie obraca się pomiędzy tymi dwoma zdarzeniami wówczas fluorescencja spolaryzowana równolegle do wzbudzenia jest ok. 3 razy większa niŝ fluorescencja spolaryzowana prostopadle - informacje o ruchach cząsteczek i przekazywaniu wzbudzenia innym cząsteczkom

80 Spektroskopia podczerwieni 1) Klasycznie, częstotliwość (ν) drgań dwuatomowej cząsteczki rośnie ze wzrostem stałej siłowej (k ) a maleje ze wzrostem masy zredukowanej (m r, wstęp do biofizyki II): 2) Kwantowo-mechanicznie, dwuatomowa cząsteczka ma serię jądrowych funkcji falowych, których energie są skwantowane (nie maja dowlnych wartości) oddzielone między sobą o stałą (w przybliŝeniu) wartość. RóŜnice te odpowiadają kwantom promieniowania z zakresu podczerwieni. ν ~ (k /m r ) 1/2 m r = m 1 m 2 /(m 1 + m 2 ) E = ½ k x 2 + ½ m r v 2 E ~ k m r A 2 E-energia (o dowolnych wartościach) A-amplituda max. x wychylenie v - predkość m r = <0.5m, m) m masa lŝejszego składnika

81 Cząsteczki wieloatomowe Mają wiele modów drgań; kaŝdy z nich ma dyskretne poziomy energetyczne związane z drganiami => widmo absorpcji w IR moŝe być bardzo skomplikowane! Symmetrical stretching Antisymmetrical stretching Scissoring Rocking Wagging Twisting Ale! - drgania nie dotyczą pojedynczych wiązań, lecz angaŝują całą cząsteczkę! Jednak! - często specyficzne drganie moŝe być głównie związane z pewną grupą atomów.

82 Widmo absorpcji IR - przykład 5.5 µm długość fali 7.7 µm

83 Widma IR (infrared) białek Widma IR białek 3 charakterysytyczne pasma absorpcji od grupy peptydowej 1) rozciąganie wiązania N-H, ( cm 1 ) 2) rozciąganie wiązania C=O (I pasmo amidowe, cm 1 ) 3 ) wahania noŝycowe kąta C-N-H (II pasmo amidowe, cm 1 ), Częstotliwości ww. pasm są róŝne dla α-helis i β-kartek pomiary konformacji białek. Pomiary stacjonarne (FTIR) i czasowo-rozdzielcze.

84 Spektroskopia Ramana - podobnie jak spektroskopia IR pozwala obserwować przejścia pomiędzy róŝnymi stanami jądrowymi (oscylacyjnymi) cząsteczki podstawowy stan elektronowy!

85 Spektrometry Ramana - podobne do spektrofluorymetrów Ale! - waŝna jest wysoka rozdzielczość spektralna Dlatego - wzbudzanie laserem o bardzo wąskim spektralnie pasmie wzbudzenia - dwa monochromatory w torze detekcji

86 Rezonansowa spektroskopia Ramana - bardzo uŝyteczna w biofizyce molekularnej - wzbudzenie światłem o długości fali pasującej do pasm absorpcji elektronowej - korzyści: 1) zwiększenie siły rozpraszania ramanowskiego 2) duŝa selektywność: rozpraszanie tylko od chromoforów o przejściu elektronowym pasującym do długości fali światła

87 Rezonansowa spektroskopia Ramana wzbudzony stan elektronowy! podstawowy stan elektronowy!