Genomic Midi AX Uniwersalny zestaw o zwiększonej wydajności do izolacji genomowego DNA z różnych materiałów. Procedura z precypitacją DNA. wersja 0517 20 izolacji Nr kat. 895-20 Pojemność kolumny do oczyszczania DNA wynosi 100 µg. Produkt przeznaczony wyłącznie do badań naukowych 1
Skład zestawu Składnik Ilość Temp. Przechowywania Kolumny Spin 100AX 20 szt. +4 do +8 C Probówki o poj. 15 ml typu Falcon 40 szt. Temp. Pok. Kolumna równoważąca 1 szt. Temp. Pok. L1.4 roztwór lizujący 45 ml Temp. Pok. K2 roztwór płuczący 110 ml Temp. Pok. K3 roztwór elucyjny 25 ml Temp. Pok. Bufor TE 60 ml Temp. Pok. Izopropanol 25 ml Temp. Pok. Proteinaza K 2 x 1,1 ml +4 do +8 C Wyposażenie i materiały niezbędne do izolacji DNA, które nie wchodzą w skład zestawu 1. Materiał do izolacji DNA 2. Enzymy (opcjonalnie w zależności od rodzaju materiału): Lizozym - 10 mg/ml, 400 U/µl (nr kat. 1005-10, 1005-50) Lizostafyna - 0,4 U/µl (nr kat. 1007-400, 1007-2000) Mutanolizyna - 10 U/µl (nr kat. 1017-5, 1017-10, 1017-50) 3. RNAza - 10 mg/ml (nr kat. 1006-10, 1006-50) (opcjonalnie) 4. Woda jałowa (wolna od nukleaz, traktowana DEPC) (nr kat. 003-075, 003-25) (opcjonalnie) 5. 70% etanol 6. Probówki o poj. 2 ml typu Eppendorf 7. Probówki o poj. 15 ml typu Falcon 8. Vortex 9. Wirówka z rotorem do wirowania probówek o poj. 15 ml typu Falcon UWAGA: Przed przystąpieniem do pracy zalecamy oczyszczenie powierzchni roboczej używając produktu LabZAP (nr kat. 040-500) Ilustracje zamieszczone w niniejszym protokole mają jedynie charakter poglądowy. Ich rzeczywisty wygląd, w tym kolor, może odbiegać od prezentowanych w grafice. Firma A&A Biotechnology udziela rocznej gwarancji na niniejszy zestaw. Firma nie gwarantuje poprawnego działania zestawu do izolacji DNA w przypadku: odstępstwa od dostarczonego wraz z zestawem protokołu braku zalecanego w niniejszym protokole wyposażenia i materiałów użycia innych odczynników niż zalecane lub które nie wchodzą w skład zestawu użycia przeterminowanych lub niewłaściwie przechowywanych odczynników oraz kolumn 2
Przygotowanie materiału Krew świeża lub mrożona 1. Przenieść 2 ml krwi do probówki o poj. 15 ml typu Falcon. Uwaga: w przypadku mniejszej ilości krwi niż 2 ml należy dodać buforu TE do całkowitej objętości 2 ml. 2. Dodać po 2 ml buforu lizującego L 1.4 oraz 100 µl Proteinazy K. 3. Całość wymieszać. Inkubować 20 min w temp. 50 C. Uwaga: Nie przedłużać inkubacji. 4. Po inkubacji intensywnie worteksować próbkę przez 20 s. 5. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA. Bakterie 1. Przenieść 1-5 ml hodowli bakteryjnej do probówki o poj. 15 ml typu Falcon. 2. Odwirować. Usunąć supernatant. 3. Osad zawiesić w 2 ml buforu TE. Dodać po 20 µl lizozymu (10 mg/ml) (nie ma w zestawie, nr kat. 1005-10, 1005-50). Inkubować 15 min w temp. 37 C. Uwaga: dla S.aureus zalecamy traktowanie lizostafyną (nie ma w zestawie, nr kat. 1007-400, 1007-2000); dla Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Listeria zalecamy traktowanie mutanolizyną (nie ma w zestawie, nr kat. 1017-5, 1017-10, 1017-50) lub lizozymeme i mutanolizyną. 4. Dodać po 2 ml buforu lizującego L1.4 oraz 100 µl Proteinazy K. 5. Całość wymieszać przez odwracanie probówki. Inkubować w temp. 50 C do osiągnięcia całkowitej klarowności mieszaniny (zwykle 60 min). Opcjonalne usuwanie RNA: do próbki należy dodać 10 µl RNAzy (10 mg/ml) (nie ma w zestawie, nr kat. 1006-10, 1006-50). Następnie całość wymieszać i pozostawić próbkę na 5 min w temp. pokojowej. 6. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA. Hodowli komórkowe 1. Przenieść 1 x 10 7 hodowli komórkowych do probówki o poj. 15 ml typu Falcon. Odwirować. Usunąć supernatant. 2. Osad zawiesić w 2 ml buforu TE. Dodać po 2 ml buforu lizującego L 1.4 oraz 100 µl Proteinazy K. 3. Całość wymieszać przez odwracanie probówki. Inkubować w przez 30 min w temp. 50 C. Opcjonalne usuwanie RNA: do próbki należy dodać 10 µl RNAzy (10 mg/ml) (nie ma w zestawie, nr kat. 1006-10, 1006-50). Następnie całość wymieszać i pozostawić próbkę na 5 min w temp. pokojowej. 4. Całość wirować 10 min przy 4000-5000 x g. Przenieść supernatant do nowej probówki o poj. 15 ml typu Falcon. 5. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA. 3
Tkanki 1. Pociąć ok. 50-100 mg tkanki na małe fragmenty lub rozetrzeć w ciekłym azocie i przenieść do probówki o poj. 15 ml typu Falcon. 2. Dodać po 2 ml buforu TE, 2 ml buforu lizującego L 1.4 oraz 100 µl Proteinazy K. 3. Całość wymieszać przez odwracanie probówki. Inkubować w temp. 50 C do całkowitego strawienia tkanki (zwykle 120-240 min). Próbkę należy mieszać od czasu do czasu. Opcjonalne usuwanie RNA: do próbki należy dodać 10 µl RNAzy (10 mg/ml) (nie ma w zestawie, nr kat. 1006-10, 1006-50). Następnie całość wymieszać i pozostawić próbkę na 5 min w temp. pokojowej. 4. Całość wirować 10 min przy 4000-5000 x g. Przenieść supernatant do nowej probówki o poj. 15 ml typu Falcon. 5. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA. Protokół izolacji 1. Przygotowane próby nanieść na kolumny Spin 100AX umieszczone w probówkach o poj. 15 ml typu Falcon. W przypadku nieparzystej ilości próbek należy użyć do zrównoważenia kolumny równoważącej, dodając do niej odpowiednie ilości wody lub dowolnego roztworu równoważącego. 2. Wirować w rotorze uchylnym 2 min przy 3000 RPM. 3. Kolumny Spin 100AX przenieść do nowych probówek 15 ml typu Falcon (w zestawie). Nanieść na kolumny po 2,5 ml roztworu płuczącego K2. 4. Wirować w rotorze uchylnym 2 min przy 3000 RPM. A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, 81-451 Gdynia NIP 584-025-44-03 4
5. Następnie nanieść na kolumny Spin 100AX po 2,5 ml roztworu płuczącego K2. 6. Wirować w rotorze uchylnym 2 min przy 3000 RPM. 7. Przenieść kolumny Spin 100AX do nowych probówek 15 ml typu Falcon (w zestawie). Wymywać oczyszczone DNA przez dodanie po 550 µl roztworu elucyjnego K3. 8. Inkubować 2 min w temp. pokojowej. 9. Wirować 1 min przy 3000 RPM. 10. Dodać po 550 µl roztworu elucyjnego K3. 11. Wirować 1 min przy 3000 RPM. 12. Usunąć kolumny Spin 100AX. Średnia objętość eluatu powinna wynieść około 1,1 ml. Eluaty DNA przenieść do 2 ml probówek typu Eppendorf (nie ma w zestawie). Dodać po 880 µl izopropanolu. Zamknąć wieczka probówek i wymieszać przez kilkakrotne odwracanie probówek. Jeśli jest widoczny biały precypitat, należy przejść do punktu A. Jeśli biały precypitat nie jest widoczny, należy przejść do punktu B. A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, 81-451 Gdynia NIP 584-025-44-03 5
A. Biały precypitat jest widoczny 1. Wirować 2 min przy 4000 RPM. 2. Ostrożnie usunąć supernatanty, a osady płukać przez dodanie 500 µl 70% etanolu (nie ma w zestawie). 3. Wirować 2 min przy 4000 RPM. 4. Ostrożnie usunąć supernatanty, a osady suszyć 10 min w temp. pokojowej przez odwrócenie probówek. 5. Osady DNA zawiesić w odpowiedniej ilości buforu TE (w zestawie) lub wody jałowej wolnej od nukleaz (nie ma w zestawie). DNA przechowywać w temp. +4 ºC lub -20 ºC do czasu dalszych analiz. W celu przyspieszenia rozpuszczania DNA można inkubować próbkę w temp. 50 C od czasu do czasu delikatnie wytrząsając. B. Biały precypitat nie jest widoczny 1. Przenieść próbki do nowej probówki wirówkowej dostosowanej do wysokich prędkości wirowania. Wirować 15 min przy 12 000-14 000 RPM. 2. Ostrożnie usunąć supernatanty, a osady płukać przez dodanie 500 µl 70% etanolu (nie ma w zestawie). 3. Wirować 5 min przy 12 000-14 000 RPM. 4. Ostrożnie usunąć supernatanty, a osady suszyć 10 min w temp. pokojowej przez odwrócenie probówek. 5. Osady DNA zawiesić w odpowiedniej ilości buforu TE (w zestawie) lub wody jałowej wolnej od nukleaz (nie ma w zestawie). DNA przechowywać w temp. +4 ºC lub -20 ºC do czasu dalszych analiz. W celu przyspieszenia rozpuszczania DNA można inkubować próbkę w temp. 50 C od czasu do czasu delikatnie wytrząsając. A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, 81-451 Gdynia NIP 584-025-44-03 6
Elementy do zamówień dodatkowych Produkt Ilość Nr kat. Proteinaza K roztwór (20 mg/ml) 1,1 ml 1019-20 25 mg 1019-25L Proteinaza K liofilizat 100 mg 1019-100L 250 mg 1019-250L 1000 mg 1019-1L Bufor TE 100 ml 297-100 Lizozym roztwór (10 mg/ml, 400 U/µl) Lizostafyna roztwór (0,4 U/µl) Mutanolizyna roztwór (10 U/µl) RNAza roztwór (10 mg/ml) 1 ml 1005-10 5 ml 1005-50 400 U 1007-400 2000 U 1007-2000 5 000 U 1017-5 10 000 U 1017-10 50 000 U 1017-50 1 ml 1006-10 5 ml 1006-50 7
Informacje bezpieczeństwa NIEBEZPIECZEŃSTWO Proteinaza K H315 Działa drażniąco na skórę. H334 Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. P261 Unikać wdychania pyłu. P342+P311 W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu oddechowego skontaktować się z Ośrodkiem Zatruć lub lekarzem. UWAGA L1.4 roztwór lizujący H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. NIEBEZPIECZEŃSTWO K2 roztwór płuczący H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Palenia wzbronione. P261 Unikać wdychania par. NIEBEZPIECZEŃSTWO K3 roztwór elucyjny H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Palenia wzbronione. P261 Unikać wdychania par. NIEBEZPIECZEŃSTWO Izopropanol H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Palenia wzbronione. P261 Unikać wdychania par. 8