znaczanie aktywności właściwej PLE W reakcjach biotransformacji najczęściej wykorzystuje się preparaty enzymatyczne będące mieszaninami różnych białek i substancji balastowych. Izolacja enzymu w postaci homogenicznej z materiału biologicznego wiąże się z dużym nakładem pracy i wysokimi kosztami. Dlatego też ilość enzymu w preparacie określa się na podstawie szybkości reakcji, którą on katalizuje a nie poprzez jego masę. W określonych warunkach szybkość ta jest proporcjonalna do stężenia enzymu i można przedstawić ją w jednostkach definiowanych jako taką ilość enzymu, która wywołuje określoną szybkość reakcji (zwykle określoną przez ubytek substratu lub pojawienie się produktu). Złożoność procesów enzymatycznych powoduje często, że szybkość reakcji nie zawsze jest proporcjonalna do ilości enzymu w preparacie. Dlatego też najczęściej ocenia się bezpośrednio nie stężenie enzymu, ale jego aktywność w badanych warunkach. Uzyskane wyniki można interpretować ilościowo tylko z pewnymi zastrzeżeniami. Szybkość reakcji enzymatycznej jest funkcją wielu czynników fizycznych i chemicznych, które mogą powodować przyspieszenie lub zahamowanie reakcji (np. stopniowa inaktywacja enzymu czy inhibicja). Dodatkowo musimy brać pod uwagę fakt, że rozważamy procesy odwracalne, w których wraz ze wzrostem stężenia produktów rośnie prędkość reakcji w kierunku przeciwnym powodując zahamowanie właściwej przemiany. Najbezpieczniej jest więc mierzyć początkową szybkość reakcji lub pomiary prowadzić w warunkach, kiedy szybkość reakcji jest stała i niezależna od stężenia substratu, czyli przebiega wg kinetyki zerowego rzędu. Rys 1. Zależność szybkości reakcji od stężenia substratu wg Michaelisa-Menten 1/7
Realizację tego założenia osiąga się stosując odpowiednio wysokie stężenie substratu, które powoduje całkowite wysycenie enzymu. Niezbędną do tego celu ilość substratu można oszacować na podstawie wartości stałej Michaelisa-Menten (K m ). Jeżeli stężenie substratu jest bliskie wartości K m lub mniejsze, to reakcje enzymatyczne są reakcjami I rzędu. Szybkość reakcji nie jest wtedy proporcjonalna do ilości enzymu, ponieważ zależy też od stężenia substratu (Rys 1). Z definicji tej stałej wynika, że szybkość reakcji przy stężeniu substratu bliskiemu K m stanowi 50% szybkości maksymalnej, przy stężeniu równym 10*K m 90%, natomiast stężenie 100*K m zapewnia reakcję wg kinetyki zerowego rzędu, w której szybkość jest w dość szerokim zakresie proporcjonalna do ilości enzymu (Rys 1). Enzymy wykazują największą aktywność w optymalnych dla każdego z nich warunkach temperatury i ph, a odchylenia od tych wartości mogą znacznie zmieniać przebieg reakcji. Związane jest to ze zmianami energii aktywacji cząsteczek substratów oraz zmianami konformacyjnymi wynikającymi z wpływu ph na stopień dysocjacji reszt aminokwasów, z których zbudowane jest białko. ptymalne ph utrzymuje się za pomocą buforów, należy jednak pamiętać, że skład roztworu może mieć wpływ na aktywność enzymu. Porównywanie wyników reakcji prowadzonych w różnych buforach nie zawsze jest wiarygodne. znaczając aktywność danego enzymu konieczne jest zatem równoczesne uściślenie stężenia substratu, temperatury pomiaru, rodzaju buforu i jego ph. Ważnym punktem w określaniu aktywności enzymów jest wybór odpowiedniej metody analitycznej. Do większości katalizowanych enzymatycznie reakcji można zastosować bezpośredni pomiar zmian stężeń produktów lub substratów stosując klasyczne metody chemii analitycznej, czyli analizę miareczkową, kolorymetrię, spektrofotometrię, chromatografię, ale także metody fizyczne, np. pomiary lepkości, zmętnienia, polarymetrię. Jednak niektóre enzymy wymagają pośredniej metody oznaczenia aktywności, najczęściej przez dodanie reagentów, które nie są substratami dla enzymu, a są niezbędne do wizualizacji efektu reakcji. Jedną z najbardziej popularnych metod bezpośrednich jest metoda spektrofotometryczna oparta na pomiarach absorbancji przy długości fali 340 nm charakterystycznej dla zredukowanego koenzymu NAD(P)H biorącego udział w wielu reakcjach enzymatycznych. Forma utleniona NAD(P) przy tej długości fali nie pochłania promieniowania. Jako przykład może posłużyć oznaczenie Rys 2. Redukcja pirogronianu katalizowana przez dehydrogenazę mleczanową 2/7
aktywności dehydrogenazy mleczanowej (LDH), enzymu którego poziom jest wskaźnikiem przy diagnozowaniu np. zawału serca (Rys 2.). Bardzo popularnym podejściem jest zastosowanie jednego lub kilku dodatkowych enzymów katalizujących reakcję jednego z produktów do związku, który może być oznaczony. Także w tym przypadku często stosuje się koenzymy nikotynoadeninowe. Na przykład aktywność heksokinazy może zostać oznaczona dzięki sprzężeniu reakcji fosforylacji glukozy z reakcją utlenienia 6-fosforanu glukozy katalizowanej przez dehydrogenazę 6-fosforanu glukozy (Rys 3). Rys 3. Metoda oznaczenia aktywności heksokinazy Szybkość reakcji mierzona ilością przereagowanego związku (ubytek substratu lub pojawienie się produktu) w jednostce czasu w przeliczeniu na określoną ilość preparatu enzymatycznego lub badanego materiału jest miarą aktywności enzymu. Natomiast jednostki, w których wyraża się tę aktywność często są umowne i porównywanie wyników uzyskanych różnymi metodami bywa problematyczne. Konieczne było więc wprowadzenie bezwzględnej międzynarodowej jednostki standardowej (U) aktywności enzymów i dokładne określenie warunków standardowego oznaczenia. Jednostką (U) każdego enzymu jest taka jego ilość, która katalizuje przemianę 1 µmola substratu (lub 1 µmola odpowiednich grup chemicznych) w ciągu 1 min, w temp. 30 o C i w optymalnych warunkach (ph i stężenia substratu). Tak zdefiniowane wartości aktywności różnych (ale podobnych) enzymów można ze sobą porównywać. Podstawową wielkością charakteryzującą aktywność enzymatyczną bezpośrednio związaną z czystością preparatu enzymatycznego jest aktywność właściwa. Definiuje się ją jako liczbę jednostek enzymu na 1 mg białka. Zwykle stężenie enzymu podaje się w jednostkach na 1ml roztworu lub 1mg preparatu, chociaż można też stosować jednostki większe (1000ml lub g). Przy porównywaniu aktywności oprócz stałości warunków ważne jest, aby porównywane aktywności obliczane były dla reakcji tego samego substratu, tzn. np. aktywność właściwa PLE będzie inna dla maślanu p-nitrofenylu i inna dla laurynianu p-nitrofenylu. W użyciu znajduje się także jednostka katal (kat), oznaczająca taką ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 mola substratu w ciągu 1 sekundy, w optymalnych warunkach. Relacja między jednostką aktywności a katalem jest następująca: 1U = 16,7 nkat. Aktywność molekularna (liczba obrotów) jest to liczba jednostek na 1 µmol enzymu i może zostać wyznaczona tylko w przypadku, kiedy znana jest masa cząsteczkowa enzymu. 3/7
Metody oznaczania aktywności PLE Aktywność preparatów PLE określa się na podstawie bezpośredniego pomiaru szybkości reakcji hydrolizy estrów. Najczęściej wykorzystuje się następujące metody: a) hydroliza octanu n-butylu + H 2 PLE bufor ph 7,20 H + aceton W wyniku hydrolizy octanu n-butylu powstają równomolowe ilości butanolu i kwasu octowego, który powoduje obniżenie ph środowiska reakcji. Zmiany te można obserwować na ph-metrze. dmiareczkowując powstały kwas 0,1 M roztworem wodorotlenku sodu, można sporządzić wykres zależności ilości (µmol) dodanego NaH od czasu reakcji [min]. Wartość aktywności właściwej wyznacza się z nachylenia prostoliniowego fragmentu wykresu (tgα). b) hydroliza maślanu p-nitrofenylu N + H 2 PLE bufor ph 7,20 acetonitryl Aktywność hydrolityczną wyznacza się spektrofotometrycznie. Maślan p-nitrofenylu hydrolizuje pod wpływem enzymu do kwasu masłowego i p-nitrofenolu, którego stężenie wyznacza się przy długości fali 410 nm na podstawie krzywej wzorcowej. Wartość aktywności właściwej określa się z nachylenia prostoliniowego fragmentu wykresu funkcji ilości p-nitrofenolu [µmol] w zależności od czasu [min]. N H + H H Współczynnik oczyszczania enzymów Często w oczyszczaniu enzymów nie wystarcza zastosowanie jednej metody i zachodzi potrzeba zaangażowania różnych chemicznych i fizycznych procesów frakcjonujących. Każdy etap ma za zadanie usunięcie możliwie najwięcej innych zanieczyszczeń białkowych. Wydajność każdego etapu jest wyrażona liczbą określającą, jaki procent ogólnej wyjściowej aktywności enzymatycznej został odzyskany na danym etapie oczyszczania, a stopień oczyszczenia enzymu wyraża się przez współczynnik oczyszczania, czyli stosunek aktywności w aktualnym roztworze do aktywności w materiale wyjściowym. ba te czynniki należy brać pod uwagę podczas procedury, ponieważ często można uzyskać bardzo wysoki stopień oczyszczenia, niestety przy niskiej wydajności, albo odwrotnie. Przykładowe obliczenia: socze zawierało 80 mg białka/ml. W optymalnych warunkach 0,1 ml osocza wytwarzało 0,25 µmola produktu/min. Po przeprowadzeniu adsorpcji białek z 2 l osocza na 4/7
DEAE-Sephadex, wyeluowano je i otrzymano 240 ml roztworu o stężeniu 55 mg/ml, którego 0,05 ml wytwarzało 1 µmol produktu/min. Po dodaniu 240 ml nasyconego roztworu siarczanu amonu wytrącony osad odwirowano i rozpuszczono w 150 ml buforu, uzyskując roztwór białka o stężeniu 15 mg/ml. 0,05 ml tego roztworu wytwarzało 1,5 µmola produktu/min. bliczyć procent odzysku enzymu i współczynnik oczyszczenia enzymu na poszczególnych etapach. socze zawierało: a) U/ml = (0,25 µmol/min)/0,1 ml = 2,5 µmol/ml/min = 2,5 U/ml b) gólna ilość białka w 2 l osocza = 2000 ml*80mg/ml = 160000 mg c) gólna liczba jednostek w 2l osocza = (2,5 U/ml)*2000 ml = 5000 U d) Aktywność właściwa = (2,5 U/ml)/(80 mg/ml) albo 5000U/160000 mg= 0,03125 U/mg Roztwór po adsorpcji białek i ich wyeluowaniu zawierał: a) U/ml = (1 µmol/min)/0,05 ml = 20 U/ml b) gólna ilość białka w 240 ml roztworu = 240 ml*55 mg/ml = 13200 mg c) gólna liczba jednostek w 240 ml = (20 U/ml)*240 ml = 4800 U d) Aktywność właściwa = (20 U/ml)/(55 mg/ml) albo 4800 U/13200 mg= 0,3636 U/mg Procent odzysku enzymu: gólna liczba U w 240 ml roztworu enzymu 4800 100% = 100% = 96% gólna liczba U w 2l osocza 5000 Współczynnik oczyszczenia enzymu: Wspólczynn ik oczyszczenia enzymu = aktywnsc wlasciwa roztworu enzymu aktywnosc wlasciwa osocza = 0,3636 0,03125 = 11,6 Roztwór po wysoleniu siarczanem amonu zawierał: a) U/ml = (1,5 µmol/min)/0,05 ml = 30 µmol/ml/min = 30 U/ml b) gólna ilość białka w 150 ml roztworu = 150 ml*15mg/ml = 2250 mg c) gólna liczba jednostek w 150 ml = (30 U/ml)*150 ml = 4500 U d) Aktywność właściwa = (30 U/ml)/(15 mg/ml) albo 4500 U/2250 mg = 2 U/mg Procent odzysku enzymu: gólna liczba U w 150 ml roztworu enzymu 100% = gólna liczba U w 2l osocza 4500 100% = 90% 5000 Współczynnik oczyszczenia enzymu: Wspólczynn ik oczyszczenia enzymu = aktywnosc wlasciwa roztworu enzymu aktywosc wlasciwa osocza = 2 0,03125 = 64 5/7
Część doświadczalna Każda grupa ma za zadanie wyznaczyć aktywność właściwą dwóch preparatów: surowego oraz wysolonego. znaczenie aktywności właściwej preparatów PLE dczynniki: wzorcowe roztwory p-nitrofenolu; 20% roztwór acetonitrylu w buforze fosforanowym; bufor fosforanowy ph 7,20; preparat PLE; 12mM roztwór maślanu p-nitrofenylu w acetonitrylu Sprzęt: zlewka 150 ml; mieszadło magnetyczne; spektrofotometr; próbówki wirówkowe; cylinder miarowy, pipety. Wykonanie: a) wyznaczenie krzywej wzorcowej dla p-nitrofenolu (pnp) Do 10 próbówek odpipetować kolejno od 100 do 1000µl wzorcowego roztworu p-nitrofenolu i DPEŁNIĆ do 5 ml 20% roztworem acetonitrylu w buforze fosforanowym ph 7.2. Dokładnie wymieszać i zmierzyć absorbancję względem 20% roztworu acetonitrylu w buforze fosforanowym przy λ=410nm. bliczyć stężenie p-nitrofenolu we wzorcowych roztworach (µmol/ml). b) oznaczenie aktywności właściwej PLE surowego Do próbówki typu Falcone o poj. 15ml odważyć 300 mg surowego PLE i dokładnie wymieszać z 4 ml buforu ph 7.2. dwirowywać przez 10 min (12000 obr/min). Zlać supernatant do zlewki, zmierzyć jego objętość. 1 ml supernatantu odpipetować do kolbki miarowej na 10 ml i uzupełnić do kreski buforem fosforanowym. Zlewkę o poj. 150 ml zawierającą 50 ml buforu fosforanowego i 12,5 ml 12mM roztworu maślanu p-nitrofenylu umieścić na mieszadle magnetycznym. Pobrać 3 ml mieszaniny i wyzerować spektrofotometr. Szybko dodać 500µl roztworu PLE i jednocześnie uruchomić stoper. Po ok. minucie pobrać 3 ml mieszaniny, zmierzyć absorbancję i nie wyjmując kuwety z spektrofotometru, odczytywać co 20 sekund wartość absorbancji. Reakcję prowadzić ok. 7 min (max. absorbancja wynika z krzywej wzorcowej pnp). c) oznaczenie aktywności właściwej PLE wysolonego Na podstawie oznaczonej na poprzednich ćwiczeniach zawartości białka w preparatach PLE obliczyć ilość preparatu wysolonego potrzebną do oznaczenia aktywności, tak aby ilość białka w obu preparatach była taka sama (może się okazać, że trzeba będzie przygotować roztwór). Preparat dodać do zlewki zawierającej 50 ml buforu Tris i 12,5 ml 12mM roztworu próbnika w acetonitrylu i dalej postępować tak samo jak w przypadku PLE surowego. pracowanie wyników: a) Sporządzić krzywą wzorcową dla p-nitrofenolu (A=f(stężenie[µmol/ml])). b) Sporządzić wykresy funkcji ilości uwolnionego p-nitrofenolu [µmol] w zależności od czasu reakcji [min] (stężenie = f(czas)), pamiętając o uwzględnieniu objętości mieszaniny reakcyjnej. 6/7
c) bliczyć aktywności (A) korzystając z współczynników nachylenia prostoliniowych fragmentów wykresów (tgα), pamiętając o rozcieńczeniach w [U/1mg preparatu] d) Korzystając z wyznaczonych wcześniej zawartości białka obliczyć aktywności właściwe PLE surowego i wysolonego [U/mg białka] 7/7