(12) OPIS PATENTOWY (19)PL

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19)PL Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia 304017 (2) Data zgłoszenia 16.12.1992 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego. 16.12.1992, PCT/DK92/00379 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 08.07.1993, W093/12812, PCT Gazette nr 16/93 (5 1) IntCl6 A61K 38/27 C07K 14/61 Sposób wytwarzania kryształów hormonu wzrostu lub pochodnych hormonu wzrostu i histydyny lub pochodnej histydyny (30) Pierwszeństwo: 20.12.1991.DK,2046 (73) Uprawniony z patentu: Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, DK (43) Zgłoszenie ogłoszono: (72) Twórcy wynalazku: Hans H. Sorensen, Virum, DK 05.09.1994 BUP 18/94 Lars Skriver, Vedbaek, DK Annie R. Hoelgaard, Holte, DK (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.04.1997 WUP 04/97 (74) Pełnomocnik: Ponikiewski Andrzej, PHZ POLSERVICE (57)1. Sposób wytwarzania kryształów hormonu wzrostu lub pochodnych hormonu wzrostu i histydyny lub pochodnej histydyny, znamienny tym, że wytwarza się roztwór hormonu wzrostu lub pochodnej hormonu wzrostu w rozpuszczalniku, dodaje się histydynę lub pochodną histydyny w stężeniu od 5 mm do 25 mm, doprowadza się odczyn roztworu do wartości ph od 5 do 7,5, korzystnie kwasem solnym, dodaje się kationy organiczne lub nieorganiczne, krystalizuje się roztwór w temperaturze od około 0 C do około 30 C i wyodrębnia się powstałe kryształy w znany sposób. PL 171356 B1

Sposób wytwarzania kryształów hormonu wzrostu lub pochodnych hormonu wzrostu i histydyny lub pochodnej histydyny Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania kryształów hormonu wzrostu lub pochodnych hormonu wzrostu i histydyny lub pochodnej histydyny, znamienny tym, że wytwarza się roztwór hormonu wzrostu lub pochodnej hormonu wzrostu w rozpuszczalniku, dodaje się histydynę lub pochodną histydyny w stężeniu od 5 mm do 25 mm, doprowadza się odczyn roztworu do wartości ph od 5 do 7,5, korzystnie kwasem solnym, dodaje się kationy organiczne lub nieorganiczne, krystalizuje się roztwór w temperaturze od około 0 C do około 30 C i wyodrębnia się powstałe kryształy w znany sposób. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik tworzący roztwór stosuje się krótkołańcuchowe alifatyczne, alicykliczne i aromatyczne alkohole i ketony. 3. Sposób według zastrz. 1, albo 2, znamienny tym, że jako hormon wzrostu stosuje się hgh. * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kryształów hormonu wzrostu lub pochodnych hormonu wzrostu i histydyny lub pochodnej histydyny. Ludzki hormon wzrostu oraz hormony wzrostu pospolitych zwierząt domowych stanowią białka, zbudowane z około 191 aminokwasów, syntetyzowane i wydzielane przez przedni płat przysadki. Ludzki hormon wzrostu składa się ze 191 aminokwasów. Hormon wzrostu jest kluczowym hormonem biorącym udział nie tylko w regulacji wzrostu somatycznego, ale również w regulacji metabolizmu białek, węglowodanów i lipidów. Główne działanie hormonu wzrostu polega na pobudzaniu wzrostu. Narządy i układy podatne na działanie hormonu wzrostu to kościec, tkanka łączna, mięśnie, oraz trzewia, takie jak wątroba, jelito i nerki. Przed opracowaniem technologii rekombinacji oraz klonowania genu hormonu wzrostu, które obecnie umożliwiają produkcję na przykład ludzkiego hormonu wzrostu (hgh) i Met-hGH na skalę przemysłową, ludzki hormon wzrostu otrzymywany mógł być wyłącznie poprzez ekstrakcję z przysadek pochodzących ze zwłok ludzkich. Jako że możliwości uzyskiwania hormonu wzrostu były bardzo ograniczone, zastosowanie go rezerwowano dla pobudzania wzrostu ciała na długość w okresie dzieciństwa i pokwitania w leczeniu karłowatości, mimo że proponowano leczenie hormonem wzrostu m.in. niskorosłości (spowodowanej niedoborem hormonu wzrostu, niskorosłości zwykłej i zespołu Turnera), niedoboru hormonu wzrostu u dorosłych, niepłodności, oparzeń, dla przyspieszenia gojenia ran, w dystrofii, w leczeniu zrostu fragmentów kości, osteoporozy, rozsianego krwawienia z żołądka i stawów rzekomych. Proponowano również zastosowanie hormonu wzrostu w celu zwiększenia tempa wzrostu zwierząt domowych lub w celu zmniejszenia procentowej zawartości tkanki tłuszczowej u zwierząt rzeźnych. Preparaty farmaceutyczne hormonu wzrostu bywają niestabilne. Powstają, szczególnie w roztworach hormonu wzrostu, produkty degradacji, na przykład produkty deamidowane lub sulfoksydowane, oraz formy dimerowe i polimerowe. Głównymi reakcjami degradacji hgh są: 1) deamidacja, przez hydrolizę, bezpośrednią lub z powstaniem cyklicznego imidu kwasu bursztynowego jako produktu pośredniego; w wyniku deamidacji powstają zmienne ilości L-asp-hGH, L-iso-asp-hGH, D-asp-hGH i D-iso-asp-hGH

171 356 3 (por. wykaz literatury, poz. 1-3), 2) utlenienie reszt metioninowych w położeniu 14 i 125 (poz. 4-9) i 3) rozszczepienie wiązań peptydowych. Deamidacja ma miejsce szczególnie przy Asn w położeniu 149. hgh jest dość łatwo utleniany w położeniu 14 i 125, szczególnie w roztworze (poz. 4-8). Utlenienie hgh w roztworze z następczym utworzeniem sulfotlenków jest normalnie spowodowane obecnością w preparacie rozpuszczonego tlenu. Rozpuszczalność tlenu w wodzie destylowanej wynosi około 200 µm (poz. 9). Ponieważ stężenie hgh w preparacie, zawierającym 4 1U/ml, wynosi 1,3 mg/ml, co odpowiada 60 mm hgh, w normalnych warunkach przechowywania, będzie obecny w nadmiarze 3000 razy przewyższającym stechiometryczną ilość dla utlenienia hgh. Problem nie jest możliwy do rozwiązania poprzez odgazowanie buforów przed rozlaniem preparatu do opakowań. Obecnie uważa się, że te produkty degradacji nie powinny mieć toksycznej czy zmienionej aktywności biologicznej ani zdolności łączenia się z receptorem, są jednak pewne dane wskazujące, że stabilność struktury przestrzennej sulfotlenków jest obniżona w porównaniu z natywnym hgh. Dla wytworzenia stabilnego rozpuszczonego preparatu zawierającego hgh ważna jest znajomość szybkości powstawania sulfotlenków, jak również środków służących regulacji utleniania. Kinetyka degradacji zależy od temperatury, ph oraz różnych dodatków i adiuwantów obecnych w preparacie farmaceutycznym hgh. Z powodu swej niestabilności hormon wzrostu jest obecnie liofilizowany i przechowywany w postaci liofilizowanej w 4 C aż do momentu użycia, kiedy przywracany jest do pierwotnej postaci, w celu zmniejszenia do minimum jego degradacji. Liofilizowane preparaty farmaceutyczne leków zawierających hgh są obecnie przywracane do pierwotnej postaci przez pacjenta i następnie przechowywane w niskiej temperaturze, przeważnie około 4 C, w lodówce, w postaci roztworu, przez okres ich używania, który wynosi do 14 dni, w czasie którego degradacja w pewnym stopniu zachodzi. Przywracanie liofilizowanego hormonu wzrostu do pierwotnej postaci stwarza również trudności pacjentowi. Niespodziewanie odkryto, że preparat ludzkiego hormonu wzrostu, zawierający jako dodatek lub substancję buforującą tylko histydynę lub jej pochodną, w ilości od 0,1 do 12 mg histydyny lub jej pochodnej na mg hormonu wzrostu wykazuje bardzo dużą stabilność, czyli oporność na deamidację, utlenianie i rozszczepianie wiązań peptydowych. Preparat można produkować w postaci liofilizowanego proszku, do późniejszego przywrócenia do pierwotnej postaci z zastosowaniem konwencjonalnych rozczynników, takich jak woda destylowana lub woda do wstrzyknięć, lub w postaci roztworu lub zawiesiny kryształów, zawierającej hormon wzrostu. Rozczynniki mogą zawierać konwencjonalne środki konserwujące, takie jak m-krezol i alkohol benzylowy. Preparat farmaceutyczny ludzkiego hormonu wzrostu, zawierający histydynę lub jej pochodną w postaci wodnej zawiesiny kryształów hormonu wzrostu zbuforowanej buforem histydynowym jest bardzo stabilny i utrzymuje hormon wzrostu w postaci krystalicznej w czasie przechowywania i transportu w postaci gotowej do użycia, wykazując jeszcze mniejszą skłonność do degradacji. Po wstrzyknięciu taki preparat działa jak preparat rozpuszczony, to znaczy, nie dochodzi do przedłużonego uwalniania ludzkiego hormonu wzrostu. Z uwagi na stabilność, ph preparatu w postaci roztworu lub zawiesiny jest, korzystnie, wyrównywane do wartości zawartej w przedziale między 2 a 9. Korzystniejsze są preparaty, których ph wynosi 5 do 8, a szczególnie takie, których ph wynosi 6 do 7,5. Stężenie histydyny wynosi, korzystnie, od 1 mm do 100 mm, w celu osiągnięcia efektu stabilizacji. Stężenie dodanej histydyny wynosi, korzystniej, od 2 do 20 mm, a najkorzystniej od 5 do 15 mm. Dodanie 10% etanolu lub 5% metanolu daje w rezultacie 20% zmniejszenie deamidacji. Jak dotąd nie donoszono o skutecznych próbach krystalizacji GH, mimo że GH jest dostępny w postaci gotowej i ilościach dostatecznych dla krystalizacji. Liczne źródła donoszą o uzyskaniu mikrokryształów lub materiału bezpostaciowego (Jones i in., Bio-Technology (1987) 5, 499-500;

4 171 356 Wilhelmi i in., J. Biol. Chem. (1984) 176, 735-745; Clarkson i in., J. Mol. Biol. (1989) 208, 719-721; oraz Bell i in., J. Biol. Chem. (1985) 260, 8520-8525). Najpopularniejszą metodą stosowaną w próbach krystalizacji GH jest metoda wiszącej kropli. Najwyraźniej, z powodu heterogeniczności preparatów hormonu wzrostu, wielkość i kształt uzyskiwanych kryształów różniły się między sobą w znaczący sposób, według doniesień literaturowych. Największy uzyskany kryształ został opisany przez Jones i in. (1987). W swych udanych doświadczeniach zastosowali oni mieszaninę glikolu polietylenowego 3500 i betaoktylglikozydu w ph obojętnym. Clarkson i in. (1989) donoszą, że zastosowanie alkoholi niższych i acetonu umożliwiło wytworzenie kryształów o wielkości od 0,001 do 0,005 mm sześciennych, o różnych kształtach. Jednakże żadna ze znanych metod nie nadaje się do wykorzystania w przemysłowej produkcji kryształów GH i innych z tej przyczyny, że niezbędny okres ich hodowli wynosi od kilku tygodni do jednego roku. Wyprodukowano bydlęcy hormon wzrostu do użytku weterynaryjnego w postaci mieszaniny jonów dwuwartościowych i oleju (EP 343 696). Dodając ZnCl2 do bydlęcego lub świńskiego hormonu wzrostu w obecności lipidów, uzyskiwano różne cząsteczki, stanowiące preparat o przedłużonym uwalnianiu się w ustroju. Hormon wzrostu rozpraszano w nośniku w taki sposób, aby na każdą cząsteczkę hormonu wzrostu przypadało 1 do 4 cząsteczek Zn. Roztwory przygotowywano w obecności denaturujących substancji rozpuszczonych w różnych stężeniach (1 do 4 M mocznika) w wysokim ph (9,5). Analogiczne postępowanie z zastosowaniem hgh wykazało, że niemożliwa jest produkcja kryształów w ten sposób. W europejskim opisie patentowym nr EP 374 120 ujawniono stabilizowane preparaty zawierające ludzki hormon wzrostu (hgh) i alkohol wielowodorotlenowy o trzech grupach wodorotlenowych. Wymieniono glicerynę i trój(hydroksymetylo)aminometan. Ponadto, ujawniono obecność chlorowodorku histydyny jako buforu, łącznie z alkoholem wielowodorotlenowym. Chlorowodorek histydyny stosuje się wyłącznie jako bufor, podczas gdy działanie stabilizujące osiągane jest dzięki alkoholowi wielowodorotlenowemu. Działanie stabilizujące, z którym mamy do czynienia w tym opisie patentowym polega na zmniejszaniu się tworzenia substancji nierozpuszczalnych w ciągu długiego przechowywania i zachowaniu bioaktywności hormonu wzrostu w kompozycji w postaci roztworu, a nie na zmniejszeniu tworzenia się deamidowanego hormonu wzrostu. W opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 917 685 i nr 4 816 568 ujawniono różne związki wykazujące działanie stabilizujące na preparat hormonu wzrostu. Wśród "pewnych aminokwasów" wymieniano jako wykazujące to działanie stabilizujące kwas asparaginowy i kwas glutaminowy. Działanie stabilizujące według tych patentów polega na zmniejszeniu tworzenia się substancji nierozpuszczalnych i zachowaniu bioaktywności hormonu wzrostu w kompozycji w postaci roztworu. Jak dobrze wiadomo z literatury, obecność kationów dwuwartościowych w czasie procesu krystalizacji insuliny pozwala nie tylko na doskonałą orientację w czasie analizy, ale również poprawia fizyczne warunki krystalizacji (por. np. US pat. nr 2174862). Jednakże hormon wzrostu jest ponad trzykrotnie większy niż insulina i ma całkowicie różną strukturę przestrzenną. Niespodziewanie wykazano, że dodatnie kationów do roztworów zawierających hgh i histydynę lub pochodną histydyny umożliwia wytwarzanie z dużą wydajnością stabilnych, jednolitych kryształów hormonu wzrostu. Okres czasu niezbędny do wytworzenia wysokiej jakości kryształów hgh jest również stosunkowo krótki. Sposób wytwarzania kryształów hormonu wzrostu lub pochodnych hormonu wzrostu i histydyny lub pochodnej histydyny polega na tym, że wytwarza się roztwór hormonu wzrostu lub pochodnej hormonu wzrostu w rozpuszczalniku, dodaje się histydynę lub pochodną histydyny w stężeniu od 5 mm do 25 mm, doprowadza się odczyn roztworu do wartości ph od 5 do 7,5, korzystnie kwasem solnym, dodaje się kationy organiczne lub nieorganiczne, krystalizuje się roztwór w temperaturze od około 0 C do około 30 C i wyodrębnia się powstałe kryształy w znany sposób. Jako rozpuszczalnik tworzący roztwór korzystnie stosuje się krótkołańcuchowe alifatyczne, alicykliczne i arom atyczne alkohole i ketony, a jako hormon w zrostu korzystnie stosuje się hgh.

171 356 5 Odkryto, że krystalizacja hgh w obecności histydyny lub pochodnej histydyny pozwala na uzyskanie większej wydajności wytwarzania krystalicznego hgh w postaci większych i bardziej czystych i jednolitych kryształów, niż krystalizacja w obecności buforu fosforanowego, który jest zwykle używany w preparatach hgh. Wyodrębnianie i oczyszczanie kryształów jest zatem ułatwione. Przy przeprowadzaniu krystalizacji w obecności histydyny wydajności uzyskiwania kryształów jest wyższa o około 20% w stosunku do krystalizacji według poprzednich sposobów. Materiał początkowy, czyli hormon wzrostu, może być koncentratem, otrzymanym bezpośrednio z pożywki fermentacyjnej, lub preparatem liofilizowanym, rozpuszczonym w rozpuszczalniku i o stężeniu wyrównanym do, korzystnie, stężenia większego niż 0,1 mg/ml, korzystniej, stężenia wynoszącego od 4 do 7 mg/ml, a najkorzystniej, stężenia wynoszącego 6 mg/ml. Odpowiednim rozpuszczalnikiem do zastosowania w etapie wytwarzania roztworu jest bufor wodny jak na przykład bufor fosforanowy lub bufor histydynowy. Krystalizację prowadzi się przez okres od 1 do 120 godzin, korzystnie od 5 do 72 godzin, a najkorzystniej od 20 do 48 godzin w określonej temperaturze. Temperatura ta wynosi, korzystnie, od 4 do 25 C. Wartość ph w etapie wytwarzania roztworu wynosi normalnie od 5,0 do 7,5, korzystnie od 5,0 do 6,8, korzystniej od 5,8 do 6,5, a najkorzystniej od 6,0 do 6,3. Stężenie histydyny lub pochodnej histydyny w etapie wytwarzania roztworu, korzystnie wynosi od 5 do 15 mm, w celu uzyskania kryształów o odpowiedniej wielkości i jakości, jak to stwierdzono powyżej. Korzystne jest zastosowanie kationów dwuwartościowych; odkryto, że kationy nieorganiczne, jak na przykład Zn++, są odpowiednie dla uzyskania szybkiego tworzenia się stabilnych kryształów GH. Można również stosować mieszaniny kationów. Ilość dodanego kationu musi być taka, aby zapewniała szybkie i efektywne tworzenie się dokładnie zdefiniowanych kryształów. Górną granicą ilości dodanego kationu jest taka ilość, która spowodowałaby nieswoistą precypitację znacznych ilości materiału bezpostaciowego. Odpowiednie stężenia dla Zn++ typowo wynoszą od około 0,2 do 10 moli Zn++ na mol GH. Jednakże jeżeli mieszanina krystalizacyjna zawiera bufor, lub inny składnik zdolny do związania kationu, na przykład w postaci kompleksu, dla procesu krystalizacji niezbędne jest zastosowanie wyższego stężenia dodawanego kationu, a to w celu skompensowania tego wiązania. Zn++ jest, korzystnie, stosowany w ilości powodującej wytworzenie się kryształów GH o stosunku molowym między Zn++ a GH wynoszącym od około 0,2 do około 10, korzystniej od około 0,5 do około 5 i, najkorzystniej, od około 0,5 do około 2. Jeżeli stosuje się inne kationy nieorganiczne, ich stężenie może wahać się pomiędzy 0,5 a 10 moli kationu na mol GH. W korzystnym wykonaniu wynalazku w etapie wytwarzania roztworu dodaje się rozpuszczalnik organiczny lub mieszaninę rozpuszczalników organicznych. Odpowiedni rozpuszczalnik organiczny, który ma być dodany do krystalizacji, można dobrać spomiędzy: alkoholi lub ketonów alifatycznych, alicyklicznych i aromatycznych, takich jak metanol, etanol, 1- i 2-propanol, cykloheksanol, aceton, oraz fenol lub m-krezol. Korzystne jest zastosowanie etanolu i acetonu jako rozpuszczalników organicznych, przy czym najkorzystniejsze jest zastosowanie etanolu. Można dokonać zaszczepienia krystalizacji w roztworze poprzez dodanie małych i dokładnie określonych kryształów hgh o kształcie heksagonalnym lub iglastym, ale korzystnie nie stosuje się zaszczepienia. Stężenie rozpuszczalnika organicznego może wynosić od 0,1 do 50% obj., korzystnie od 0,1 do 30%, korzystniej od 0,1 do 20%, jeszcze korzystniej od 5 do 15%, a najkorzystniej od 6 do 12% objętościowych. Jako że kryształy tworzą się w dużych objętościach roztworów, niniejszy sposób może być stosowany jako szybki i efektywny proces obróbki współprądowej omawianego hormonu wzrostu. Gdy jako rozpuszczalnik organiczny stosuje się etanol, odpowiednie stężenie wynosi między 0,1 a 20%, korzystniej 5 a 15% i korzystnie od 6 do 12% (objętościowych).

6 171 356 Wytworzone kryształy mogą być wyodrębniane konwencjonalnymi metodami, takimi jak odwirowywanie lub filtracja, płukanie i ewentualnie liofilizacja w celu usunięcia śladów rozpuszczalników organicznych. Wielkość kryształów zależeć będzie od stosunku Zn++ do GH oraz doboru i składu rozpuszczalnika zastosowanego w procesie. Wykazano, że kryształy hgh otrzymane sposobem według niniejszego wynalazku mają aktywność biologiczną podobną do aktywności biologicznej rozpuszczonego wzorcowego hgh w testach in vitro. Kryształy GH wytworzone tą nową metodą mogą zatem być stosowane z tych samych wskazań, co dostępny na rynku preparat hgh. Farmaceutyczne preparaty zawierają, korzystnie, jednostkowe dawki leku zawarte pomiędzy 4 IU a 100 IU hormonu wzrostu na dawkę. "Hormon wzrostu", w rozumieniu niniejszego opisu, może stanowić hormon wzrostu dowolnego pochodzenia, może to być hormon wzrostu pochodzący na przykład od ptaków, bydła, konia, człowieka, owcy, świni, łososia, pstrąga lub tuńczyka, korzystnie jest to bydlęcy, ludzki lub świński hormon wzrostu, a najkorzystniej ludzki hormon wzrostu. Hormon wzrostu, otrzymany według niniejszego wynalazku, może być natywnym horm o- nem wzrostu, wyizolowanym ze źródła naturalnego, na przykład poprzez ekstrakcję z przysadek w znany sposób, lub hormonem wzrostu produkowanym przy użyciu technik rekombinacyjnych, jak to na przykład opisano w Biotech and Bioeng. 36, 1-11 (1990), autorzy: E.B. Jensen i S. Carlsen. "Pochodna hormonu wzrostu" może być okrojoną formą hormonu wzrostu, pozbawioną jednej lub więcej reszt aminokwasowych; jego analogiem, w którym jedna lub więcej reszt aminokwasowych cząsteczki natywnej została zastąpiona innymi resztami aminokwasowymi, korzystnie resztą naturalnie występującego am inokw a- su, o ile takie podstawienie nie wywołuje żadnych niekorzystnych skutków, takich jak antygenowość lub osłabienie działania; lub jego pochodną, na przykład jedną z deamidowanych lub sulfoksydowanych form hormonu wzrostu, lub form mających przedłużenie N- lub C-końcowe, takie jak np. Met-hGH, M et-glu-ala-glu-hgh, lub Ala-Glu-hGH. K orzystnym hormonem wzrostu jest hgh. Pojęcie "pochodnej histydyny" używane jest, w związku z omawianym tematem, dla oznaczenia amidów i estrów histydyny, takich jak ester metylowy lub etylowy, dwu-peptydów takich jak His-Gly, His-Ala, His-Leu, His-Lys, His-Ser i His-Phe, oraz analogów lub pochodnych His, takich jak imidazol, dezamino-his lub poli-his. Dla uproszczenia zawartość histydyny lub jej pochodnej w preparatach otrzymanych sposobem według wynalazku obliczono uwzględniając ciężar molowy samej histydyny. Pojęcie "sole", używane dla oznaczenia dodatkowych czynników ułatwiających obróbkę lub przywracanie do pierwotnej postaci preparatów farmaceutycznych, obejmuje konwencjonalne dodatki, takie jak metal alkaliczny, metal ziem alkalicznych lub sole amonowe kwasów organicznych, na przykład cytrynowego, winowego lub octowego, takie jak cytrynian sodowy, winian sodowy lub octan sodowy, bądź kwasów nieorganicznych, takich jak kwas solny, na przykład chlorek sodowy. Dla potrzeb niniejszego opisu przyjmuje się, że "duża stabilność" osiągana jest wtedy, gdy preparat jest bardziej stabilny, niż konwencjonalne preparaty zawierające bufor fosforanowy. "Alkoholem cukrowym" może być m.in. mannit, ksylit, erytryt, treit, sorbit lub glicerol. W niniejszym opisie pojęcie "dwucukier" używane jest dla oznaczenia naturalnie występujących dwucukrów, takich jak sacharoza, trehaloza, maltoza, laktoza, sefaroza, turanoza, laminarybioza, izomaltoza, gentiobioza lub melibioza. Rozpuszczalnikiem stosowanym w preparacie może być woda, alkohole takie jak alkohol etylowy, n-propylowy, izopropylowy lub butylowy, lub ich mieszanina. Rozpuszczalnik zawierać może środek konserwujący, taki jak m-krezol lub alkohol benzylowy. Wynalazek opisany jest bardziej szczegółowo z odniesieniem do rysunków, na których: fig. 1 przedstawia fotografię kryształów wytworzonych bez dodatku histydyny, a fig. 2 przedstawia fotografię kryształów hgh otrzymanych sposobem według wynalazku.

171 356 7 Wynalazek jest objaśniony bardziej szczegółowo w poniższych przykładach, które ilustrują wynalazek, nie mając na celu ograniczenia zakresu niniejszego wynalazku, który jest określony w załączonych zastrzeżeniach. CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA Przykład I. Zmniejszenie deamidacji. Badano szybkość deamidacji preparatów hgh, zawierających 4 IU i 12 IU w ph 6,5 w 37 C w buforze His w porównaniu z buforem fosforanowym w tym samym ph. Preparat hgh, zawierający 4 IU, o składzie chemicznym A, przygotowano rozpuszczając 13.3 mg hgh w 10 ml 10 mm buforu histydynowego, przygotowanego przez rozpuszczenie 15,5 mg histydyny w 10 ml dejonizowanej wody, zawierającej 0,9% alkoholu benzylowego i dodając 0,1 N kwas solny do ph 6,5. Preparat zawierający 12 IU przygotowano, rozpuszczając 40 mg hgh w tych samych składnikach, jak to opisano powyżej. Preparat hgh, zawierający 4 IU, o składzie chemicznym B, przygotowano rozpuszczając 13,3 mg hgh w 10 mm fosforanu dwusodowego, przygotowanego przez rozpuszczenie 17,8 mg wodorofosforanu dwusodowego w 10 ml wody dejonizowanej, zawierającej 0,9% (objętościowych) alkoholu benzylowego, i dodając 0,1 N kwas fosforowy do ph 6,5. Preparat zawierający 12 IU przygotowano rozpuszczając 40 mg hgh w tych samych składnikach, jak to opisano powyżej. Skład chemiczny A: 10 mm His alkohol benzylowy 0,9% HCl do ph 6,5 Skład chemiczny B: 10 mm fosforanu dwusodowego alkohol benzylowy 0,9% kwas fosforowy do ph 6,5 Preparat zbadano na zawartość dezamido-hgh przy użyciu immunoelektroforetycznej chromatografii cieczowej wysokosprawnej, bezpośrednio po przywróceniu do pierwotnej postaci i po 7 dniach w 37 C. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 1. Tabela 1 Deamidacja Preparat Dezamidopochodne % Bufor A 4 IU/ml 1,7 Początek 12 IU/ml 2,1 Bufor A 4 IU/ml 10,1 7 dni w 37 C 12 IU/ml 10,4 Bufor B 4 Ul/ml 1,8 Początek 12 IU/ml 2,3 Bufor B 4 Ul/ml 16,9 7 dni w 37 C 12 IU/ml 14,9 Z powyższych liczb wynika, że deamidacja hgh jest znacząco zmniejszona w 37 C w buforze histydynowym w porównaniu z buforem fosforanowym. Przykład II. Zmniejszenie deamidacji w obecności histydyny lub pochodnych histydyny. Badano tempo deamidacji w 25 C preparatów hgh, zawierających 6 IU hgh w ph 6,5 i w ph 7,3 w 5 mm, 10 mm i 100 mm buforze His w porównaniu z 8 mm buforu fosforanowym w tym samym ph. Następnie przetestowano pochodne histydyny His-Gly, His-Ala, His-Leu,

8 171 356 His-Lys, His-Phe, His-Ser, ester metylowy histydyny, histydynol, imidazol, kwas imidazoloczterooctowy i histaminę. Preparaty hgh przygotowywano rozpuszczając 20 mg hgh w 10 ml buforu histydynowego o pożądanym stężeniu, przygotowanego przez rozpuszczenie odpowiednio 7,8 mg, 15,5 mg i 155,2 mg histydyny w 10 ml dejonizowanej wody, zawierającej 0,9% (obj.) alkoholu benzylowego i dodając 0,1 N kwas solny aż do uzyskania wyżej wymienionego ph. Preparaty hgh, przedstawione w poniższej tabeli 2, przechowywano w 25 C i poddano analizie na obecność składników dezamidowanych po 14 i 30 dniach przy użyciu immunoelektroforetycznej chromatografii cieczowej wysokosprawnej. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 2. Tabela 2 Zawartość hgh, oznaczona przy użyciu immunoelektroforetycznej chromatografu cieczowej wysokosprawnej, jako funkcja postaci leku i czasu w roztworze w 25 C: Preparat (*) Tworzenie się składników dezamidowanych w 25 C 14 dni (') 30 dni 5 mm His ph 6,5 6,5 9,1 5 mm His ph 7,3 11,0 17,4 10 mm His ph 6,5 6,8 9,7 10 mm His ph 7,3 11,3 16,6 100 mm His ph 6,5 9,8 15,2 100 mm His ph 7,3 19,3 28,8 8 mm dwu-na-fosforan ph 6,5 7,8 10,8 8 mm dwu-na-fosforan ph 7,3 15,2 20,3 8 mm dwu-na-fosforan ph 6,5 9,4 13,2 0,3% m-krezol 10 mm Asp, ph 6,5 21,7 niewykryw 10 mm Glu, ph 6,5 14,8 niewykryw. 10 mm His-Gly, ph 6,2 5,6 8,1 10 mm His-Ala ph 6,5 6,2 8,5 10 mm His-Leu ph 6,5 8,8 12,3 10 mm His-Lys ph 6,5 8,6 12,0 10 mm His-Phe ph 6,5 7,5 11,3 10 mm His-Ser ph 6,3 22,0 niewykryw. 10 mm His-metyloester ph 6,5 4,6 5,2 10 mm histydynol ph 6,5 27,4 niewykryw. 10 mm imidazol ph 6,5 9,2 12,2 10 mm kwas imidazoloczterooctowy ph 6,5 10,3 14,2 10 mm histamina ph 6,5 9,8 12,2 *. zawiera alkohol benzylowy 0,9%, z wyjątkiem preparatu nr 9. Zawartość dezamido-hgh w materiale początkowym wynosiła: 2,1%. Z powyższej tabeli 2 wynika, że deamidacja hgh jest zmniejszona o około 20% przy dodaniu histydyny, w porównaniu z buforem fosforanowym, w ph 6,5 i 7,3. Ponadto zmniejszenie ph z wartości 7,3, która jest konwencjonalną wartością ph dla handlowych preparatów hgh, do 6,5, powoduje samo w sobie zmniejszenie tempa deamidacji o 50%. Wydaje się, że histydynol w warunkach testu nie stabilizuje preparatu, a dodatek histydyny w większych ilościach nie poprawia, lecz raczej pogarsza pożądany efekt. Porównywalne rezultaty osiągnięto przy zastosowaniu analogów histydyny, takich jak imidazol, histamina i kwas imidazoloczterooctowy, jak również estru metylowego histydyny,

171 356 9 który powodował tworzenie zaledwie 3,1% dezamido-hgh po 30 dniach w 25 C, co pozwalało na przechowywanie preparatu przez okres 3 do 4 miesięcy. Dodanie Asp lub Glu zwiększa tempo deamidacji w porównaniu z fosforanem przy ph 6,5. Dodanie dwupeptydów o typie His-X daje pozytywne rezultaty w przypadku His-Gly i His-Ala, podczas gdy His-Ser, zmniejsza stabilność, czyli oporność na deamidację. Powyższe rezultaty dowodzą, że tempo deam idacji zm niejszyć można obniżając ph i dodając histydynę w niskim stężeniu, korzystnie, około 5 mm do 10 mm. Obniżając ph i zastępując bufor fosforanow y histydyną, można zm niejszyć tempo deam idacji o ponad 50%. Wydaje się, że zastosowanie m-krezolu lub alkoholu benzylowego jako środków konserwujących nie wywiera żadnego wpływu na tempo deamidacji. Rozszczepianie (hydroliza wiązań peptydowych) jest przy ph 6,5 zmniejszane przez histydynę w porównaniu z fosforanem. Przykład III. Zmniejszenie powstawania sulfotlenku. Badano zależność od ph i rodzaju buforu. Zależność od ph: Preparat: Przy użyciu 0,1 N kwasu solnego wyrównano ph handlowego preparatu hgh (Norditropin ), 12 IU/ml, zawierającego dwuwęglan, glicynę i mannit, plus alkohol benzylowy 0,9%, do ph 8,3, 8,0,7,5,7,0, 6,5 i 6,0 1 próbki pozostawiono w 37 C. Po 0,7 i 14 dniach przeprowadzono analizę z zastosowaniem metody chromatografii cieczowej wysokosprawnej RP. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 3. Tabela 3 Powstawanie sulfotlenku Próbka Temp C Dni Sulfotlenków % ph 8,37-0 1,0 ph 8,37 37 7 9,0 ph 8,04 37 7 8,7 ph 7,52 37 7 8,3 ph 7,01 37 7 7,7 ph 6,52 37 7 6,5 ph 6,02 37 7 4,8 ph 8,37 37 14 14,9 ph 8,04 37 14 14,5 ph 7,52 37 14 14,0 ph 7,01 37 14 12,9 ph 6,52 37 14 11,1 ph 6,02 37 14 7,7 Jak można stwierdzić, przy obniżaniu ph od 8,4 do 6,0 zmniejsza się powstawanie sulfotlenków. Rodzaj buforu, ph: Preparat B-hGH, zawierający 12 mg/ml wody destylowanej, rozcieńczono w stosunku 1+10 w różnych buforach o stężeniu 15 mm, dodając ewentualnie inny dodatek (dodatki). Próbki pozostawiono w 25 C, i po 10 i 34 dniach przeprowadzono analizę z zastosowaniem metody chromatografii cieczowej wysokosprawnej RP. Wyniki uzyskane przy zastosowaniu metody chromatografii cieczowej wysokosprawnej RP i ewentualne dodatki przedstawiono w tabeli 4.

10 171 356 Tabela 4 Powstawanie sulfotlenku Bufor ph Dodatek Sulfotlenków 10 dni 34 dni Fosforan 7,3-1,9 5,5 Histydyna 7,3-0,9 2,4 Histydyna 6,9-0,9 2,0 Histydyna 6,5-0,8 1,9 Histydyna 7,3 18 mm Met 0,8 2,0 Histydyna 7,3 18 mm Cys 2,4 2,9 Histydyna 7,3 0,42 mm tok 1,1 3,0 Histydyna 7,3 9% etanol 1,3 4,2 Histydyna 7,3 18 mm ask. 41 niewykryw Histydyna 7,3 0,8% NaCl 1,3 3,5 tok.- tokoferol; ask kwas askorbinowy. W porównaniu z buforem fosforanowym, w buforze histydynowym (ph 7,3) obserwowano wyraźnie zmniejszone powstawanie sulfoksydowanego B-hGH. Wraz ze zmniejszaniem się ph w His-buforze obserwowano redukcję powstawania sulfotlenków. Dodawanie przeciwutleniaczy i innych dodatków nie dało dodatkowych efektów. Przykład IV. Krystalizacja hgh w obecności buforu fosforanowego lub histydynowego. Próbki roztworu hgh o jednakowej objętości, przygotowane według Biotechnology, autor Dalboege i in. (1987) 5, 161-164, w stężeniu 6 mg/ml, inkubowano w 10 mm buforze fosforanowym lub 10 mm buforze histydynowym, w ph 6,2. Do każdej z próbek dodano etanolu, tak aby jego końcowe stężenie wyniosło 7,5% (obj.), dodając następnie roztworu octanu cynkowego, tak aby końcowe stężenie cynku wyniosło 1,34 mola Zn na mol hgh w przypadku buforu fosforanowego i 5,5 mola Zn na mol hgh w przypadku buforu histydynowego. Kryształy hodowano w zawiesinie przez 16 godzin, monitorując krystalizację w mikroskopie z kontrastem fazowym. Kryształy powstałe w buforze histydynowym mają dobrze określony heksagonalny wygląd i jednakową wielkość oraz zawierają niewiele lub żadnych bezpostaciowych substancji zanieczyszczających (fig. 1). Kryształy hgh powstałe w buforze fosforanowym w ściśle identycznych warunkach, wykazują, przeciwnie, dużo silniej wyrażoną heterogenność i zawierają znaczącą ilość materiału bezpostaciowego (fig. 2). Prowadzono hodowlę kryształów przez dalsze 5 dni. Po odwirowaniu zebrano kryształy wytworzone zarówno w buforze histydynowym jak i w buforze fosforanowym, kryształy te rozpuszczono w 7 M moczniku i przeprowadzono analizę hgh. Bufor % kryształów % wolnego hgh Histydyna 65 35 Fosforan 55 45 Tak więc bufor histydynowy zapewnia lepsze warunki dla krystalizacji hgh ze względu zarówno na wydajność powstawania kryształów, jak i ich jakość. Przykład V. Preparat farmaceutyczny zawierający kryształy hgh. Kryształy hodowano według opisu z przykładu IV i przechowywano w 4 C. Następnie wyodrębniano kryształy przez odwirowywanie i następcze usunięcie z cieczy macierzystej. Następnie kryształy pozostawiono na noc do liofilizacji w celu uzyskania suchych kryształów bez pozostałości rozpuszczalników organicznych. Następnie przygotowano farmaceutyczną zawiesinę wysuszonych kryształów o następującym składzie: Kryształy hgh 1,3 mg/ml Histydyna 1,6 mg/ml %

Zn(Ac)2, H2 O 0,1 mg/ml Alkohol benzylowy 0,9% (obj.) ph wyrównano do 6,5 z użyciem HCl. 171 356 11 Przykład VI. Powtórzono przykład V z tą różnicą, że nie zastosowano Zn(Ac)2, H2O, co dało zawiesinę o następującym składzie: Kryształy hgh 1,3 mg/ml Histydyna 1,6 mg/ml Alkohol benzylowy 0,9% (obj.) ph wyrównano do 6,2. Przykład VII. Kryształy potraktowano w ten sam sposób, jak w przykładzie V, sporządzając zawiesinę o następującym składzie: Kryształy hgh 1,3 mg/ml Histydyna 1,33 mg/ml NaCl 5,7 mg/ml alkohol benzylowy 0,9% (obj.) ph wyrównano do 6,2. Przykład VIII. Kryształy potraktowano w ten sam sposób, jak w przykładzie V, sporządzając następujący roztwór: Kryształy hgh 1,3 mg/ml Histydyna 1,14 mg/ml NaCl 9,0 mg/ml ph wyrównano do 6,1. Przykład IX. W analogiczny sposób, jak opisany w przykładzie I, sporządzono preparat biosyntetycznego ludzkiego hormonu wzrostu o stężeniu 6 IU/ml w alkoholu benzylowym 0,9% o ph 6,5 przy różnych stężeniach histydyny, 0, 1,2, 5, 10, 20, 30, 50 lub 100 mm. Próbki przechowywano 7 dni w temperaturze 37 C, po czym przeprowadzono analizy na obecność form dezamidowanych i utlenionych oraz dimerów i polimerów, w ten sam sposób, jak to opisano powyżej. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 5, przy czym zawartość dezamido-hgh, dimerów i polimerów oraz form utlenionych określono przy zastosowaniu metod: immunoelektroforetycznej chromatografii cieczowej wysokosprawnej, chromatografii cieczowej wysokosprawnej żelowo-permeacyjnej oraz chromatografii cieczowej wysokosprawnej RP, a zawartość rozszczepionych form hgh zmierzono przy zastosowaniu immunoelektroforetycznej chromatografii cieczowej wysokosprawnej. Przy stężeniu histydyny 1 mm lub mniej, zawartość dimeru jest niska; stężenie histydyny większe niż 30 mm daje wyniki możliwe do przyjęcia co do powstawania składowych dezamidowanych, a co do powstawania form utlenionych korzystne są stężenia histydyny poniżej 20 mm. Sumarycznie optymalne stężenie histydyny wynosiłoby więc 5 mm. Stężenie histydyny (milimoli) Proc zaw. dezamidopochodnych Proc zaw dimeru Tabela 5 Proc. zaw. polimeru Proc. zaw pochodnych utlenionych Proc. zaw. form rozszczep. 1 2 3 4 5 6 7 0 7,7 0,7 <0,2 1,5 1,4 6,3 1 7,9 0,4 <0,2 1,5 1,2 6,4 2 8,7 0,3 <0,2 1,6 1,2 6,5 ph

12 171 356 c d tabeli 5 1 2 3 4 5 6 7 5 9,6 0,4 <0,2 1,7 niewykrywalne 6,6 10 10,8 0,4 <0,2 1,7 niewykrywalne 6,6 20 11,6 0,4 < 0,2 2,0 niewykrywalne 6,6 30 12,0 0,3 <0,2 2,1 niewykrywalne 6,6 50 14,4 0,5 < 0,2 3,8 niewykrywalne 6,6 100 17,0 0,3 < 0,2 2,6 niewykrywalne 6,6

171 356 13 W YKAZ LITERATURY 1) Y. -C.J. Wang i M.A. Hanson. Parenteral Formulations of Preteins and Peptides. Stability and Stabilizers. J. Parenteral Science and Technology 42 (suplement), (1988), 53-525. 2) M.C. Manning, K. Patel, R.T. Borchardt. Stability of Protein Pharmaceuticals. Pharmaceutical Research 6 (11) (1989) 903-918. 3) B.A. Johnson, J.M. Shirokawa, W.S. Hancock, M.W. Spellman, L J. Basa i D.W. Asward. J. Biol. Chem. 264, 1462-71 (1989). 4) L.C. Teh i in., J. Biol. Chem., 262, 785-794 (1987). 5) G.W. Becker i in., Biotech. Appl. Biochem, 10, 326-337 (1988). 6) R.A. Roughten i in., Arch. Biochem. Biophys. 178, 350-355 (1977). 7) R.M. Riggin i in., Anal. Biochem., 167, 199-209 (1987). 8) P. Gellerfors i in., Acta Paediatr. Scand. (suplement), 370, 93-100 (1990). 9) M.J. Kaufman, Pharm. Res., 7 (3) 289-292 (1990).

171 356 FIG. 1 FIG. 2 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł