8. CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA opracował: Wojciech Zapała I. WPROWADZENIE Chromatografia cieczowa naleŝy do najwaŝniejszych metod analizy mieszanin róŝnorodnych związków chemicznych. Polega ona na zróŝnicowanej szybkości migracji cząsteczek poszczególnych składników mieszaniny w odpowiednio dobranym i zoptymalizowanym układzie chromatograficznym. KaŜdy układ chromatograficzny składa się z trzech elementów: fazy ruchomej (eluent), fazy stacjonarnej (adsorbent), chromatografowana substancja (analit) zawierająca jedną lub wiele związków chemicznych. Proces chromatografii najkrócej moŝna zdefiniować jako rozdział poprzez zetknięcie dwu faz będących we względnym ruchu, przy maksymalnie rozwiniętej powierzchni kontaktu. Oczywiście jest to definicja bardzo uproszczona, tym nie mniej po jej rozwinięciu moŝna dokonać klasyfikacji rodzajów i technik chromatograficznych. JeŜeli fazą ruchomą jest gaz, to mamy do czynienia z chromatografią gazową (ang. Gas Chromatography, GC), jeŝeli fazą ruchomą jest ciecz mówimy o chromatografii cieczowej (ang. Liquid Chromatography, LC). JeŜeli natomiast faza ruchoma będzie płynem w stanie nadkrytycznym mówimy o chromatografii nadkrytycznej (ang. Supercritical Liquid Chromatography). Proces chromatografii moŝna prowadzić metodą kolumnową lub na płaszczyźnie w tym drugim rodzaju stosowanym tylko w chromatografii cieczowej, mówimy o chromatografii cienkowarstwowej (ang. Thin Layer Chromatography, TLC) lub planarnej (ang. Planar Chromatography, PLC). Dalszego podziału moŝna dokonać z punktu widzenia mechanizmu retencji na: chromatografię adsorpcyjną, podziałową, jonowymienną, Ŝelową, wykluczania itp. Dokładniejszy podział rodzajów i technik chromatograficznych moŝna znaleźć między innymi w monografii Zygfryda Witkiewicza pt. Podstawy Chromatografii [1]. Stosując polarne adsorbenty (np. Ŝel krzemionkowy), jako fazy ruchome wykorzystuje się rozpuszczalniki niepolarne lub słabo polarne takie jak np. heksan, heptan, izooktan, chloroform. W tym przypadku mówimy o chromatografii cieczowej prowadzonej w normalnym układzie faz (ang. Normal Phase High Performance Liquid Chromatography,
NP HPLC). JeŜeli natomiast faza stacjonarna jest niepolarna lub słabo polarna, a stosowane fazy ruchome stanowią rozpuszczalniki polarne (np. tetrahydrofuran, acetonitryl, metanol lub woda), mówimy wtedy o chromatografii cieczowej prowadzonej w odwróconym układzie faz (ang. Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography, RP HPLC). NaleŜy przy tym zauwaŝyć, Ŝe chromatografia cieczowa w odwróconym układzie faz jest obecnie znacznie częściej stosowana niŝ chromatografia w normalnym układzie faz. Fakt ten wynika ze znacznej hydrofilowości polarnych adsorbentów, które silnie adsorbują wodę występującą w śladowych ilościach w rozpuszczalnikach, wskutek czego aktywność adsorbentu bardzo szybko maleje, a tym samym maleje zdolność rozdzielcza kolumny. PowyŜsze zjawisko nie występuje na niepolarnych, hydrofobowych adsorbentach stosowanych w RP HPLC, przez co takie kolumny mogą pracować przez bardzo długi czas. W tabeli 1. przedstawiono przykłady najczęściej stosowanych faz stacjonarnych i ruchomych wraz z ich zastosowaniami [1]. Tabela 1. Przykładowe zastosowania chromatografii cieczowej prowadzonej w normalnym i odwróconym układzie faz. FAZA STACJONARNA FAZA RUCHOMA ROZDZIELANE SUBSTANCJE śel krzemionkowy Związana faza aminowa, cyjanowa lub diolowa Związana faza aminowa, cyjanowa lub diolowa Związana faza dimetylowa RP 2 Związana faza oktylowa RP 8 Związana faza oktadecylowa RP 18 Związana faza triakontylowa RP 30 Normalny układ faz Heksan, heptan, chloroform, izopropanol Woda, metanol, tetrahydrofuran, acetonitryl, izopropanol Etery, estry, nitrozwiązki, porfiryny, mykotoksyny, witaminy rozpuszczalne w oleju, herbicydy, itp Heksan, heptan, chloroform, Cukry, steroidy, nitrozwiązki, aminokwasy izopropanol Odwrócony układ faz Związki koronowe, aminy, fenole, steroidy, witaminy rozpuszczalne w wodzie Aminy, fenole, steroidy, witaminy rozpuszczalne w wodzie, flawonoidy Wielopierścieniowe związki aromatyczne, karotenoidy, tokoferole, izomery witaminy A, fulereny, proteiny Przy właściwie dobranym układzie chromatograficznym, po wprowadzeniu na szczyt kolumny (albo na linię startu na płytce TLC) roztworu zawierającego mieszaninę związków chemicznych, następuje ich rozdział. W zaleŝności od siły oddziaływań pomiędzy składnikami rozdzielanej mieszaniny a fazą stacjonarną (adsorbentem), pojedyncze (rozdzielone) składniki opuszczają kolumnę w róŝnym czasie. Piki odpowiadające poszczególnym substancjom są rejestrowane przez odpowiedni detektor w postaci chromatogramu. Czas przebywania substancji chromatografowanej w kolumnie liczony od
momentu jej wprowadzenia do kolumny do czasu wyjścia maksimum piku nazywamy czasem retencji. Tak zdefiniowany czas nazywamy całkowitym czasem retencji, t r patrz rys. 1. NaleŜy zaznaczyć, Ŝe czas retencji ma sens termodynamiczny, tylko pod warunkiem stałej wartości natęŝenia przepływu eluentu. 2.0 t r2 Sygnał z detektora 1.5 1.0 0.5 t 0 t r1 0.0 pik substancji inertnej pik składnika 1 pik składnika 2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Czas Rys. 1. Wielkości retencyjne mieszaniny dwuskładnikowej rozdzielanej za pomocą chromatografii kolumnowej. Całkowity czas retencji jest sumą dwóch czasów: czasu w którym substancja chromatografowana przed opuszczeniem kolumny oddziałuje z adsorbentem i czasu potrzebnego do opuszczenia kolumny przez substancję nie oddziaływującą z adsorbentem (składnik inertny układu). Ten drugi czas nazywany jest czasem retencji substancji inertnej lub czasem martwym retencji, t 0 patrz rys. 1. Kolejną wielkością charakteryzującą retencję w chromatografii cieczowej jest tak zwany zredukowany czas retencji, t r, opisujący czas przebywania substancji w kolumnie tylko w wyniku jej oddziaływań z adsorbentem (patrz rys. 1.): (1) WyraŜanie retencji za pomocą czasu retencji utrudnia porównanie poszczególnych układów chromatograficznych (róŝne wymiary kolumny, róŝne prędkości przepływu fazy ruchomej powodują uzyskanie róŝnych wartości czasów retencji). DuŜo bardziej obiektywnym parametrem pozwalającym na np. porównanie przebiegu retencji w róŝnych układach chromatograficznych jest bezwymiarowy współczynnik retencji, k, określający ile razy dłuŝej substancja chromatografowana przebywa w kolumnie w wyniku oddziaływań z adsorbentem w stosunku do sytuacji, gdyby takie oddziaływania nie miały miejsca: (2)
gdzie: k i współczynnik retencji i tego składnika, t ri czas retencji i tego składnika, t 0 czas martwy retencji (czas retencji składnika inertnego układu). Im większa jest wartość współczynnika retencji, tym silnie substancja chromatografowana oddziałuje z fazą stacjonarną w kolumnie. Nieco inaczej proces retencji związków chemicznych wygląda w chromatografii planarnej. Chromatografia cienkowarstwowa (planarna) jest metodą bardzo szeroko stosowaną zarówno w laboratoriach analitycznych jak i zakładach przemysłowych. Pozwala ona na szybkie i stosunkowo tanie przeprowadzenie analizy jakościowej i ilościowej badanych próbek. W chromatografii cienkowarstwowej przy właściwie dobranym układzie chromatograficznym, po naniesieniu na płytkę pokrytą warstwą adsorbentu niewielkiej ilości rozdzielanej mieszaniny, a następnie po rozwinięciu chromatogramu w odpowiedniej komorze i jego ewentualnej wizualizacji, otrzymamy szereg plamek odpowiadających poszczególnym, rozdzielonym związkom chemicznym (patrz rys. 2). Rys. 2. Schematyczny chromatogram TLC. Podstawową wielkością, jaką wyznacza się z chromatografu TLC jest współczynnik opóźnienia (ang. retardation factor), R f. Jak to pokazano na rys. II, współczynnik opóźnienia definiowany jest jako stosunek drogi migracji substancji chromatografowanej od linii startu do środka plamki (B), do drogi przebytej przez czoło fazy ruchomej (A): (3) Wartości współczynnika opóźnienia, R f, charakteryzują zachowanie się chromatografowanej substancji w danym układzie chromatograficznym. W zaleŝności od układu chromatograficznego wartość R f substancji moŝe przyjmować wartości z przedziału 0 R f 1. Substancja bardzo silnie adsorbująca się w danym układzie osiąga wartość R f = 0 (zostaje na
linii startu ). Gdy jej adsorpcja jest natomiast minimalna wędruje z czołem fazy ruchomej i wówczas jej R f = 1. Jednym z celów analitycznych, wykorzystujących chromatografie cienkowarstwową, jest rozdział próbki (mieszaniny) na pojedyncze składniki. Prowadząc analizę nieznanej mieszaniny moŝemy na podstawie wartości R f wzorców substancji i wartości R f substancji otrzymanych z rozdzielenia mieszaniny określić jej skład jakościowy. Na wartość R f analizowanej substancji ma wpływ wiele czynników: rodzaj i jakość adsorbentu (rozkład wielkości ziarna, jednorodność warstwy adsorbentu, grubość warstwy adsorbentu), rodzaj i skład eluentu, struktura i własności fizykochemiczne analizowanych substancji, temperatura, kształt i wielkość naniesionej na płytkę plamki (dokładność dozowania, ilość naniesionej substancji), warunki prowadzenia procesu (kształt i wielkość komory chromatograficznej, stopień wysycenia komory parami fazy ruchomej). Wszystkie w/w czynniki mogą powodować odstępstwa kształtów plamek od idealnie symetrycznego. PowyŜsze czynniki wpływają bowiem na liniowość izotermy adsorpcji testowanej substancji. W niektórych układach moŝe występować tzw. ogonowanie substancji. W takim przypadku wartość R f substancji określamy na podstawie maksymalnego stęŝenia w ogonującej próbce, biorąc pod uwagę środek najintensywniej zabarwionego (świecącego) obszaru plamki. Jednocześnie bardzo silne ogonowanie próbki moŝe wskazywać na źle dobrany układ chromatograficzny. PoniewaŜ chromatografia cienkowarstwowa bardzo często wykorzystywana jest do wstępnego doboru układu chromatograficznego dla chromatografii kolumnowej, bardzo często wykorzystuje się związek pomiędzy współczynnikiem opóźnienia, R f, a współczynnikiem retencji, k, dany zaleŝnością: Proces chromatograficzny moŝna ogólnie zdefiniować jako zespół wzajemnych konkurencyjnych oddziaływań cząsteczek związków chemicznych rozdzielanej mieszaniny (w przypadku chromatografii cieczowej dodatkowo składników fazy ruchomej) z fazą stacjonarną. Oddziaływania te wpływają na róŝne zachowanie się związków chemicznych w kolumnie i w efekcie prowadzą do rozdzielenia mieszaniny, której składniki opuszczają (4)
układ w róŝnych czasach retencji. Zjawisko wolniejszej migracji składników rozdzielanej mieszaniny niŝ wynosi prędkość przepływu eluentu nazywamy retencją (opisywaną współczynnikiem retencji (k)). Gdy kaŝdy składnik mieszaniny wprowadzonej do układu chromatograficznego wykazuje zróŝnicowaną retencję, układ chromatograficzny jest selektywny wobec składników rozdzielanej mieszaniny. Dobór odpowiedniego układu chromatograficznego zapewniającego zadowalającą selektywności i sprawności rozdzielania zarówno w analityce, jak i w zastosowaniach preparatywnych polega na właściwym wybraniu odpowiedniej fazy stacjonarnej (wypełnienia kolumny, albo sorbentu w chromatografii cienkowarstwowej), odpowiedniego składu eluentu (w chromatografii prowadzonej w warunkach izokratycznych), albo programu elucji (w chromatografii prowadzonej w warunkach gradientowych) oraz korzystnego dla sprawności rozdzielania stęŝenia i objętości wprowadzanej do kolumny (lub nanoszonej na płytkę TLC) mieszaniny. W chromatografii cienkowarstwowej najprostszym sposobem określenia selektywność rozdziału plamek poszczególnych substancji jest zwykle parametr, definiowany zgodnie z oznaczeniami na rys. 2. jako: (5) gdzie: R fa i R fb są współczynnikami opóźnienia wyznaczonymi odpowiednio dla substancji a i b. Im większe wartości przyjmie R f, tym ujmując problem w uproszczony sposób, w chromatografii kolumnowej uzyskamy lepszą selektywność rozdziału. W chromatografii najczęściej stosuje sie dwuskładnikowe fazy ruchome. Skład fazy ruchomej powinien być tak dobrany, aby zapewnić optymalną zdolność rozdzielczą układu. Rozpuszczalniki wchodzące w skład fazy ruchomej nie powinny: reagować w sposób nieodwracalny z faza nieruchoma, reagować w sposób nieodwracalny z chromatografowana substancją, zawierać nawet śladowych ilości zanieczyszczeń. W chromatografii cieczowej składniki faz ruchomych róŝnią się siłą elucji. Mieszając poszczególne rozpuszczalniki w odpowiednich proporcjach moŝna zatem sterować globalną siłą elucji fazy ruchomej. Pomocnymi w wyborze odpowiedniego składu fazy ruchomej są tzw. szeregi eluotropowe. Są to empiryczne zestawienia rozpuszczalników od najmniej polarnych do silnie polarnych uporządkowane dla danego typu adsorbentu. JeŜeli składniki fazy ruchomej znacznie róŝnią się siłą elucji, to podczas rozwijania chromatogramu moŝe wystąpić zjawisko demiksji. Na skutek selektywnej adsorpcji składników mieszanej fazy
ruchomej na płytce tworzą sie strefy o róŝnym składzie, na granicy których tworzy sie front zwany frontem demiksji. O obecności frontu demiksji moŝemy się przekonać, gdy chromatografowana substancja znajdzie sie na jego czole. Wówczas jej plamka będzie spłaszczona i rozmyta w kierunku prostopadłym do poruszania sie fazy ruchomej. II. CEL ĆWICZENIA 1. Zapoznanie sie z technika chromatografii planarnej, 2. Poznanie zasad doboru optymalnych warunków prowadzenia procesu chromatograficznego, 3. Poznanie warunków jakościowej analizy mieszaniny dwuskładnikowej. III. CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA III.1. Aparatura doświadczalna i odczynniki komory do chromatografii planarnej, kolbki o poj. 25 cm 3 zawierające testowe substancje, płytki chromatograficzne RP 18 F 254s, lampa UV, lampa kwarcowa, pipetki lub strzykawka analityczna do nanoszenia substancji na płytki, metanol o czystości chromatograficznej, woda demineralizowana, kwercetyna o czystości analitycznej, chryzyna o czystości analitycznej. III.2. Metodyka badań Przygotować roztwory metanolu i wody o stęŝeniach objętościowych 50%, 60%, 70% i 80% objętościowych metanolu w wodzie. Roztwory te zostaną uŝyte jako fazy ruchome. Przygotowanymi roztworami napełnić odpowiednie komory do TLC tak, aby poziom zwierciadła cieczy w komorze nie przekraczał wysokości 0,5 cm. Komory następnie szczelnie zamknąć i pozostawić przez co najmniej jedną godzinę w stałej temperaturze wynoszącej 20 o C aŝ do ustalenia się warunków równowagi ciecz para. Przygotować roztwory chryzyny, kwercetyny i mieszaniny obu tych związków w odpowiednich eluentach. StęŜenia poszczególnych roztworów określi prowadzący zajęcia.
Przygotować odpowiednią ilość płytek chromatograficznych o wymiarach 5 x 10 cm. Na płytkach, miękkim ołówkiem zaznaczyć linię startu (około 0,5 cm od dolnej krawędzi) i linię mety (około 0,5 cm od górnej krawędzi płytki). Przy pomocy pipetek nanieść na linię startu poszczególnych płytek przygotowane wcześniej odpowiednie roztwory chryzyny, kwercetyny i mieszaniny. Płytki wysuszyć pod lampą kwarcową. Umieścić płytki w komorach. Poczekać na rozwinięcie się chromatografów za koniec procesu uznajemy osiągnięcie przez czoło fazy ruchomej linii mety. Po rozwinięciu chromatogramów, wyjąć płytki z komór i umieścić pod lampą UV. Wizualizację prowadzić przy długości fali 254 nm. Miękkim ołówkiem obrysować uzyskane plamki. Następnie posługując się odpowiednimi przyborami wyznaczyć wartości R f dla pojedynczych substancji i wartość R f dla mieszaniny dla kaŝdego analizowanego układu chromatograficznego. III.3. Opracowanie i dyskusja wyników pomiarów Wyniki pomiarów zestawić w tabeli: Lp. Układ R fchryz R fkwercet R f 1 50% MeOH 2 60% MeOH 3 70% MeOH 4 80% MeOH Przeprowadzić dyskusję wyników wskazując układ chromatograficzny umoŝliwiający uzyskanie największej selektywność rozdziału mieszaniny. Na podstawie wykonanego wykresu zaleŝności R f =f(φ) (φ jest ułamkiem objętościowym metanolu w wodzie) omówić wpływ składu fazy ruchomej na wartości współczynników opóźnienia pojedynczych substancji. IV. LITERATURA [1] Z. Witkiewicz, Podstawy Chromatografii, WNT Warszawa, 2000