ĆWICZENIE 14 ANALIZA INSTRUMENTALNA CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA W IDENTYFIKACJI SKŁADNIKÓW ROZDZIELANYCH MIESZANIN. DZIAŁ: Chromatografia

Transkrypt

1 ĆWICZENIE 14 ANALIZA INSTRUMENTALNA CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA W IDENTYFIKACJI SKŁADNIKÓW ROZDZIELANYCH MIESZANIN DZIAŁ: Chromatografia ZAGADNIENIA Chromatografia planarna; podział na chromatografię bibułową i chromatografię cienkowarstwową (ang. Thin Layer Chromatography-TLC); rozwijanie chromatografu metoda wstępującą; współczynnik opóźnienia R F ; sposób obliczania R F ; eluent; zastosowanie chromatografii planarnej LITERATURA: 1. Walenty Szczepaniak Metody instrumentalne w analizie chemicznej; PWN, W-wa D. Kealey, P.J. Haines; tłum. Ang. Małgorzata Galus Chemia Analityczna; PWN, W-wa 2005 I. WSTĘP I CEL ĆWICZENIA Chromatografia planarna dzieli się na chromatografię cienkowarstwową i chromatografię bibułową. Chromatografia cienkowarstwowa jest techniką, w której składniki mieszaniny zostają rozdzielone wskutek różnej migracji przez płaskie złoża fazy stacjonarnej, a faza ruchoma porusza się dzięki siłom kapilarnym. Substancje rozpuszczone wykrywane są in situ na powierzchni płytki za pomocą odczynników wizualizacyjnych po zakończeniu rozwijaniu chromatogramu. Rozdzielenie mieszaniny techniką chromatografii cienkowarstwową (ang. Thin Layer Chromatography-TLC); odbywa się między fazę stacjonarną, która jest naniesiona w postaci cienkiej warstwy na powierzchnię płytki szklanej, folii aluminiowej lub z tworzywa sztucznego. ruchomą stanowi mieszanina rozpuszczalników w odpowiednich proporcjach. Rozpuszczalnikami do fazy ruchomej (rozwijającej mogą być: acetonitryl, metanol, octan etylu, heksan. Rozwijanie chromatografu następuje w komorze chromatograficznej, drogą wstępująca. Układ chromatograficzny zawiera trzy elementy: fazę nieruchomą, fazę ruchomą i rozdzielaną mieszaninę. Fazą Ćwiczenia laboratoryjne z chemii analitycznej i instrumentalnej; oprac.; prowadzący: dr Agnieszka Matłoka Strona 1

2 Cienkowarstwowe fazy stacjonarne - to rozmaite sorbenty o drobnych cząsteczkach. Przykłady: żel krzemionkowy, proszek celulozowy, żywice jonowymienne, selektory chiralne, materiały o ograniczonych rozmiarach porów. Faza ruchoma mogą to być pojedyncze rozpuszczalniki lub ich mieszaniny o odpowiedniej polarności, koniecznej do odpowiedniego rozdzielenia składników mieszaniny. Zmieniają się one od niepolarnych węglowodorów do polarnych alkoholi (n-heksan; cykloheksan; tetrachlorometan; metylobenzen; trichlorometan; dichlorometan; tetrahydrofuran; propanon; acetonitryl; alkohol izopropylowy; etanol; metanol), wody oraz rozpuszczalników kwasowych i zasadowych. Komorę chromatograficzną mogą stanowić różne naczynia laboratoryjne (zlewki, cylindry lub komory fabryczne komory klasyczne lub płaskie). Komory chromatograficzne powinny być szczelne aby umożliwić równomierne rozwinięcie chromatogramu.. przykrywka Płytka pokryta warstwą sorbentu (fazą stacjonarną) Komora elucyjna Faza ruchoma Linia startu Plamki naniesionych substancji Ryc. 1. Układ do rozwijania chromatogramu techniką chromatografii cienkowarstwowej Ćwiczenia laboratoryjne z chemii analitycznej i instrumentalnej; oprac.; prowadzący: dr Agnieszka Matłoka Strona 2

3 W3 czoło chromatogramu W2 b W1 a W1 W2 W3 punkt startowy Ryc.2. Płytka chromatograficzna po rozwinięciu chromatogramu i jego wizualizacji: (W1, W2, W3) substancje wzorcowe, Pr-próba (mieszanina). Stosunek wielkości przesunięcia danej substancji do przesunięcia rozpuszczalnika (czoła chromatogramu) nazywa się współczynnikiem podziału (R f ). Na podstawie wartości współczynników podziału R f wyznaczonych dla roztworów wzorcowych i dla poszczególnych składników mieszaniny można określić skład badanej mieszaniny. Współczynnik R f przyjmuje wartość od 0 do 1. Rf odleglosc od startu do centrum plamki odleglosc od startu do czola rozpuszczalnika a b Jeżeli rozdzielane składniki mieszanin są barwne wówczas nie ma problemu z ich identyfikacją na chromatografie. Jeżeli jednak mamy do czynienia z substancjami bezbarwnymi wówczas należy odpowiednio wywołać chromatogram poprzez: 1. Zastosowanie odczynników dających charakterystyczne zabarwienie z substancjami poddanymi rozdziałowi. 2. Zastosowanie odczynników dających połączenia wykazujące fluorescencję w świetle nadfioletowym. Przepływ rozpuszczalnika osiąga się przez: Ćwiczenia laboratoryjne z chemii analitycznej i instrumentalnej; oprac.; prowadzący: dr Agnieszka Matłoka Strona 3

4 1. metoda wstępująca zanurzenie płytki chromatograficznej w rozpuszczalniku znajdującym się na dnie komory (rozpuszczalnik przemieszcza się z dołu do góry). 2. metoda zstępująca zanurzenie bibuły w rozpuszczalniku znajdującym się w korytku ponad bibułą (rozpuszczalnik przesuwa się z góry w dół). 3. metoda pierścieniowa doprowadzenie rozpuszczalnika do punktu na środku arkusza bibuły (rozpuszczalnik przesuwa się odśrodkowo po bibule). Rozpuszczalniki stosowane do rozdziału chromatograficznego muszą być odpowiednio dobrane, tak aby zachowywały się obojętnie w stosunku do bibuły i badanych substancji oraz powinny wykazywać różne współczynniki podziału dla badanych substancji. Zasada chromatografii bibułowej polega na nanoszeniu niewielkich ilości badanych mieszanin w postaci roztworu na bibułę w określonym wcześniej punkcie startowym. Po wyschnięciu bibuły doprowadza się do niej rozpuszczalnik tak aby mógł swobodnie przepływać po bibule. Następuje wówczas rozwijanie chromatogramu polegające na podziale substancji między dwie fazy ciekłe - wodę i rozpuszczalnik. Dany związek zostaje wówczas w mniejszym lub większym stopniu przesunięty względem punktu startowego. Każdy składnik mieszaniny skupia się na bibule w postaci oddzielnej plamki. Celem ćwiczenia jest nabycie umiejętności przeprowadzenia procesu chromatograficznego TLC w rozdzielaniu wybranych mieszanin celem ich identyfikacji na podstawie substancji wzorcowych. A. Ustalenie składu nieznanych próbek wybranych środków farmaceutycznych II. SPRZĘT I ODCZYNNIKI: -Etanol, cz.d.a. z dozownikiem -Tabletki ibuprom jako wzorzec -Tabletki aspiryna jako wzorzec -Tabletki naproxen jako wzorzec -Mieszanina leków o nieznanym składzie LEKI A -Mieszanina leków o nieznanym składzie LEKI B -Moździerz z pistelą 1 szt. -Płytki do TLC pokryte żelem krzemionkowym 60F254 na podłożu aluminiowym o wymiarach 5cm x 10cm 2 szt. -Lampa UV emitująca promieniowanie o długości fali 254nm i 366nm 1 szt. -Okulary ochronne do lampy UV 1 szt. -Komora chromatograficzna z pokrywą 2 szt. -Mikrokapilarki (Blaubrand intra END) 1 opak. -Cylinder miarowy poj. 10ml; 25 ml po 1 szt. Ćwiczenia laboratoryjne z chemii analitycznej i instrumentalnej; oprac.; prowadzący: dr Agnieszka Matłoka Strona 4

5 -Pipety poj. 10ml; 5ml; 2 ml po 1 szt. -Zlewka poj. 25 ml 2 szt. -Szpatułka metalowa 2 szt. -Fiolki z nakrętkami 5 szt. -Kolbki miarowe poj. 10 ml 5 szt. -Szklany lejek mały z cienką szyjką 2 szt. -Tryskawka z wodą destylowaną 1 szt. -Nożyczki 1 szt. -Sączki bibułowe. Kilka sztuk. -Suszarka do suszenia płytek. 1 szt. -Octan etylu, cz.d.a. z dozownikiem -Kwas octowy, cz.d.a. z dozownikiem -Heksan, cz.d.a. z dozownikiem -Gruszka 2 szt. III. METODYKA: Tabletki będące substancjami wzorcowymi (ibuprom, aspiryna, naproxen) rozetrzeć w moździerzu, wsypać do kolbek miarowych poj. 10 ml, które odpowiednio oznakować: WI ibuprom; WA- aspiryna, WN - naproxen i rozpuścić w etanolu uzupełniając kolbki do kreski; podobnie postąpić z próbką badaną LEKI A lub LEKI B (zależnie którą wskaże prowadzący ćwiczenie). Wytrząsać ręcznie. Przyszykować fiolki zakręcane, które należy oznakować: WI, WA, WN, LEKI A (lub LEKI B). Do odpowiednich zakręcanych fiolek przesączyć odpowiednie roztwory substancji wzorcowych i rozdzielanej mieszaniny próbki. Na płytce chromatograficznej pokrytej, żelem krzemionkowym o wymiarach 5cm x 10 cm narysować linię startu cienko ołówkiem w odległości 1 cm od krawędzi płytki i tak samo na końcu płytki linię mety też w odległości 1cm od krawędzi płytki. Na tak przygotowaną płytkę z żelem krzemionkowym nanieść na linię startu przy użyciu kapilary (do każdego roztworu nowa kapilara) przygotowane substancje wzorcowe leków w odpowiedniej odległości tak aby między plamkami było około 0,5 cm przerwy oraz rozdzielanej mieszaniny LEKI A (lub LEKI B). Dokładnie w sposób opisany powyżej przygotować druga płytkę. Płytki wysuszyć suszarką, celem odparowania rozpuszczalnika (etanolu). W zlewce poj.25 ml przygotować eluent A poprzez zmieszanie: 8 ml octanu etylu + 2 ml heksanu + 0,1 ml kwasu octowego) Eluent: A Octan etylu/heksan/kwas octowy (80/20/1) v/v/v Eluent: B Octan etylu/heksan/kwas octowy (50/50/1) v/v/v/ Ćwiczenia laboratoryjne z chemii analitycznej i instrumentalnej; oprac.; prowadzący: dr Agnieszka Matłoka Strona 5

6 Wlać eluent A do komory chromatograficznej na wysokość 0,5 cm 1 cm, zamknąć i pozostawić na 15 min, aby komora równomiernie wysycała się parami rozpuszczalnika. Następnie płytkę z naniesionymi substancjami wstawić do komory chromatograficznej i rozwijać do ¾ wysokości płytki (do linii mety). Po wyjęciu płytki pozostawić płytki do wyschnięcia. W celu wizualizacji chromatogramu lampę UV włączyć na długość fali 254 nm; obserwować plamki w świetle UV obrysowując ich kontury delikatnie ołówkiem. Uwaga: W taki sam sposób jak opisano powyżej wykonujemy ćwiczenie używając Eluent B W zlewce poj.25 ml przygotować eluent B poprzez zmieszanie: 5ml octanu etylu + 5 ml heksanu + 0,1 ml kwasu octowego)uwaga: Pracując z lampą UV pamiętać o użyciu okularów ochronnych przed promieniowaniem UV!!! INTERPRETACJA I OPRACOWANIE WYNIKÓW: Przerysować chromatogramy do protokołu, oznaczając, który chromatogram w eluencie o jakim składzie był rozwijany, obliczyć R F dla poszczególnych substancji, z zaznaczeniem, która substancja w jakiej kolejności nanoszona była na płytkę; wszystkie zmierzone (drogi migracji plamek i eluentu) i wyliczone (R F ) wartości umieścić w tabeli, zidentyfikować skład substancji nieznanej oraz określić R f substancji wzorcowych. Jak wpływa zastosowany eluent na rozdzielenie składników mieszaniny? B. Ustalenie składu mieszanin polietylenoglikoli PEG`ów o różnych masach cząsteczkowych II. SPRZĘT I ODCZYNNIKI: WZORCE PEGów 1). PEG 300 (PCC Rokita) 2). PEG 400 (PCC Rokita) 3). PEG 600 (PCC Rokita) 4). PEG 1500 (Loba Feinchemie) 5). PEG 3000 (Fluka) 6). PEG 4000 (Clariant GmBH) 7). PEG (Fluka) 8). PEG (Aldrich) PRÓBKI BADANE MIESZANIN MPEGA (przygotowane w metanolu) MPEGB (przygotowane w metanolu) Ćwiczenia laboratoryjne z chemii analitycznej i instrumentalnej; oprac.; prowadzący: dr Agnieszka Matłoka Strona 6

7 -Metanol cz.d.a. (Chempur) z dozownikiem -Chloroform cz.d.a. (POCH) z dozownikiem -Jodyna w spryskiwaczu -Mikrokapilarki (Blaubrand intra END) 1 opak. -Płytki do TLC pokryte żelem krzemionkowym 60F254 na podłożu aluminiowym o wymiarach 10cm x 10cm 1 szt. -Komora chromatograficzna z przykrywką 1szt. -Zlewka poj. 50 ml 1 szt. -Pipety wielomiarowe poj. 2ml; 5 ml;10 ml; po 1 szt. -Szpatułka metalowa 2 szt. -Bagietka szklana (cienka) 2 szt. -Pipeta Pasteura, plastikowe 3 szt. -Zlewka poj.25 ml 1 szt. -Gruszka 2 szt. III. METODYKA: Za pomocą szpatułki metalowej to odpowiednio oznakowanych fiolek wsypać substancje wzorcowe PEG`ów polietylenoglikoli (do każdej fiolki osobny wzorzec). Substancje rozpuścić w metanolu. Na płytce chromatograficznej pokrytej, żelem krzemionkowym o wymiarach 10cm x 10 cm narysować linię startu cienko ołówkiem w odległości 1 cm od krawędzi płytki i tak samo na końcu płytki linię mety też w odległości 1cm od krawędzi płytki. Na tak przygotowaną płytkę z żelem krzemionkowym na linię startu nanieść przy użyciu kapilary (do każdego roztworu nowa kapilara) przygotowane substancje wzorcowe PEGów w odpowiedniej odległości tak aby między plamkami było około 0,5 cm przerwy oraz rozdzielanej mieszaniny MPEGA (lub MPEGB). Płytki wysuszyć suszarką, celem odparowania rozpuszczalnika (metanolu). W zlewce poj.25 ml przygotować fazę rozwijającą eluent X poprzez zmieszanie: 1,2 ml chloroformu + 10 ml metanolu + 4,8 ml wody) Eluent: X chloroform : metanol : woda = 6:50:24 (v/v/v) Tak przygotowany Eluent X wlać do komory chromatograficznej i zamknąć; wysycać oparami komorę 10 min. Następnie ostrożnie wstawić płytkę chromatograficzną do komory i zamknąć. Rozwijanie chromatogramu trwa ok. 50 minut. Po rozwinięciu chromatogramu (aż eluent dojdzie do linii mety) wyjąć płytkę. W celu wizualizacji plamek spryskać płytkę Ćwiczenia laboratoryjne z chemii analitycznej i instrumentalnej; oprac.; prowadzący: dr Agnieszka Matłoka Strona 7

8 jodyną, szybko wysuszyć i zaznaczyć kontury plamek oraz płytkę sfotografować w celu dokumentacji. INTERPRETACJA I OPRACOWANIE WYNIKÓW: Przerysować chromatogram do protokołu, obliczyć R F dla poszczególnych substancji, zaznaczając, która plamka jakiej substancji naniesionej na płytce odpowiada; wszystkie zmierzone (drogi migracji plamek i eluentu) i wyliczone (R F ) wartości umieścić w tabeli, zidentyfikować skład substancji nieznanej oraz określić R f substancji wzorcowych. Jaki skład był rozdzielanej mieszaniny MPEGA (lub MPEG B). IV. WNIOSKI Sformułować wnioski na podstawie wyników z przeprowadzonego doświadczenia. Ćwiczenia laboratoryjne z chemii analitycznej i instrumentalnej; oprac.; prowadzący: dr Agnieszka Matłoka Strona 8