Chromatografia cienkowarstwowa

Transkrypt

1 Chromatografia cienkowarstwowa Wstęp Badanie szeregu złoŝonych mieszanin substancji nastręcza niejednokrotnie wielu trudności. Do analizy skomplikowanych mieszanin wykorzystuje się między innymi procesy chromatograficzne odznaczające się wysoką sprawnością stwarzające moŝ1iwości oznaczeń ilościowych. Rozdział substancji w procesach chromatograficznych następuje wskutek róŝnic szybkości migracji składników mieszanin w układach złoŝonych z 2 faz: fazy nieruchomej i ruchomej. Termin chromatografia wprowadził rosyjski botanik Cwiet, twórca tej metody, który rozdzielał mieszaniny barwników roślinnych w kolumnie wypełnionej sproszkowanym węglanem wapnia. ChociaŜ w chwili obecnej stosuje się chromatografię nie tylko do analizy substancji barwnych powyŝsza nazwa utrwaliła się. RozróŜniamy obecnie metody chromatografii gazowej (gdy fazą ruchomą jest gaz) i cieczowej (faza ruchoma jest cieczą). Procesy chromatograficzne moŝna prowadzić w kolumnie (chromatografia kolumnowa) albo na płaszczyźnie (chromatografia planarna - bibułowa lub cienkowarstwowa). W zaleŝności od typu fazy nieruchomej rozróŝniamy chromatografię adsorpcyjną, jonowymienną, podziałową, sitową i in. Cały wachlarz technik chromatograficznych stworzył wielkie moŝliwości analizy skomplikowanych związków zarówno organicznych jak i nieorganicznych. Godny podkreślenia jest znaczny udział tych technik w rozwoju nauk chemicznych i biochemicznych naszego stulecia. Podstawy teoretyczne chromatografii a) zjawisko podziału b) adsorpcja i desorpcja c) wymiana jonowa d) dyfuzja Zjawisko podziału Substancja, która znajdzie się w układzie 2 nie mieszających się ze sobą rozpuszczalników ulega podziałowi między te rozpuszczalniki. Po osiągnięciu stanu równowagi stosunek stęŝeń substancji w obu fazach ciekłych będzie stały w określonej temperaturze. Prawo podziału moŝna zapisać w następującej postaci: K = c 1 /c 2 gdzie: K - współczynnik podziału c - stęŝenia substancji w rozpuszczalnikach 1 i 2 Adsorpcja i desorpcja JeŜeli roztwór lub gaz zawierający pewną substancję graniczyć będzie z silnie rozwiniętą powierzchnią ciała stałego, na granicy faz moŝna stwierdzić podwyŝszone stęŝenie tej substancji w porównaniu z jej stęŝeniem w punktach oddalonych od granicy faz. Zjawisko tego typu nosi nazwę adsorpcji. W zaleŝności od rodzaju sił powierzchniowych oddziałujących na substancję rozróŝniamy adsorpcję fizyczną lub chemiczną (chemisorpcję). Adsorpcja fizyczna spowodowana jest działaniem niewysyconych sił przyciągania międzycząsteczkowego, 1

2 występujących na granicy faz, tzw. sił Van der Waalsa. Jest to proces odwracalny, i równowagowy. W przypadku zmiany warunków (temperatury, ciśnienia) albo zakłócenia równowagi przez zmianę stęŝenia w pobliŝu granicy faz moŝe nastąpić zjawisko odwrotne do adsorpcji - desorpcja. Proces chemisorpcji uzaleŝniony jest od sił natury chemicznej (wiązania chemiczne pomiędzy substancją a powierzchnią ciała stałego). Chemisorpcja jest z reguły procesem selektywnym i praktycznie nieodwracalnym. Adsorpcja zaleŝy od natury substancji i fazy ruchomej (w przypadku fazy gazowej w niewielkim stopniu), od natury i struktury powierzchni adsorbenta, od liczby miejsc aktywnych na tej powierzchni, od temperatury, ph otoczenia wielkości cząsteczek substancji i in. Wymiana jonowa Wymiana jonowa następuje w wyniku zetknięcia się roztworu zawierającego jony zdolne do wymiany z jonami związanymi z powierzchnią ciał stałych, tzw. jonitów. Wymiana jonów jest zjawiskiem odwracalnym. Jonity po odpowiedniej obróbce mogą odzyskać pierwotną formę. ZaleŜnie od rodzaju wymienianych jonów rozróŝniamy kationity i anionity. W chromatografii cieczowej proces wymiany jonów wykorzystuje się w analizach substancji jonogennych np. aminokwasów. Dyfuzja Dyfuzja polega na wzajemnym przenikaniu się substancji. Zjawisko to jest związane z ruchem cząsteczek obojętnych elektrycznie lub zjonizowanych. Dwie substancje stykające się z sobą a zawierające cząsteczki w róŝnych stęŝeniach będą ulegały dyfuzji w kierunku gradientów stęŝeniowych. Zjawiska dyfuzji opisuje prawo Ficka, które mówi, Ŝe szybkość przechodzenia substancji przez jednostkę powierzchni w jednostce czasu w określonym kierunku jest proporcjonalna do gradientu stęŝeniowego w tym kierunku. Współczynnikiem proporcjonalności w tej zaleŝności jest stała dyfuzji charakterystyczna dla danego układu. Proces chromatograficzny W kaŝdym procesie chromatograficznym rozdzielaną mieszaninę wprowadza się w zasięg działania 2 faz: ruchomej (gaz lub ciecz) i nieruchomej (adsorbent, ciecz naniesiona na stały nośnik, jonit itd.). Faza ruchoma stanowi siłę napędową procesu, natomiast faza nieruchoma odgrywa rolę siły hamującej proces migracji składników w kierunku przepływu fazy ruchomej. Rozdział substancji następuje w przypadku róŝnicy współczynników podziału składników mieszaniny pomiędzy obie fazy. Szybkość migracji substancji jest tym większa, im mniejszy jest współczynnik podziału. MoŜna załoŝyć, Ŝe w kaŝdym punkcie wzdłuŝ złoŝa fazy nieruchomej następuje równowaga stęŝeniowa, a równowagę tę zakłóca przepływ fazy ruchomej. Proces chromatograficzny jest więc procesem dynamicznym, w którym mają miejsce jednostkowe akty absorpcji i desorpcji składników w fazie nieruchomej. W wyniku tego procesu twarzą się charakterystyczne pasma poszczególnych substancji poruszające się z właściwą dla siebie prędkością. Szerokość tych pasm zaleŝy od sposobu wprowadzenia analizowanej mieszaniny do układu rozdzielczego oraz od szybkości i rodzaju dyfuzji, jaka zawsze towarzyszy procesom chromatograficznym. O selektywności rozdziału chromatograficznego decyduje rodzaj oddziaływań substancji z obydwoma fazami, a sprawność rozdziału limitują zjawiska dyfuzji. W przypadku chromatografii adsorpcyjnej fazę stacjonarną stanowią róŝnego typu ciała stałe o rozwiniętej powierzchni, zwane adsorbentami, takie jak węgiel aktywny, Ŝel krzemionkowy, 2

3 aktywny tlenek glinu itp. O ich działaniu decyduje przede wszystkim sposób aktywacji powierzchni i obecność zanieczyszczeń trwale związanych z powierzchnią, które mogą blokować centra aktywne adsorbenta. Z powodzeniem stosowana jest zarówno chromatografia adsorpcyjna w układach gaz/ciało stałe, jak i ciecz/ciało stałe. W chromatografii podziałowej (gaz/ciecz lub ciecz/ciecz) ciekłą fazę stacjonarną nanosi się cienkim filmem na powierzchnię specjalnych nośników, którymi najczęściej są odpowiednio oczyszczone ziemie okrzemkowe o niewielkiej powierzchni właściwej rzędu 1 m 2 /g. W przypadku kolumn o małej średnicy (tzw. kolumn kapilarnych) ciekłą fazę stacjonarną pokrywa się wewnętrzną ściankę kolumny. W podziałowej chromatografii gazowej jako fazy stacjonarne stosuje się najczęściej oleje silikonowe, wysokocząsteczkowe węglowodory oraz róŝnego typu niskolotne ciecze typu polieterów, poliestrów i in. W chromatografii ciecz/ciecz fazami stacjonarnymi mogą być zarówno polarne ciecze, takie jak woda, niektóre nitryle, glikole i in., jak i niepolarne, np. węglowodory alifatyczne. W tym drugim przypadku mówimy o tzw. chromatografii z odwróconymi fazami. O wartości współczynników podziału w chromatografii typu ciecz/ciecz decydują specyficzne lub niespecyficzne oddziaływania miedzy cząsteczkami rozdzielanych substancji i cząsteczkami obu faz chromatograficznych. Są to zwykle oddziaływania w sferze elektronowej (siły dyspersji, orientacji, tworzenie słabych kompleksów donorowo akceptorowych, wiązań wodorowych itd.). W cieczowej chromatografii jonowymiennej proces chromatograficzny prowadzi się w kolumnach wypełnionych jonitem (np. sulfonowany kopolimer styrenu z diwinylobenzenem) albo na płytkach pokrytych warstwą jonitu. Powinowactwo jonów do jonitów danego typu zaleŝy od budowy jonu, (wielkość promienia jonowego, ładunek), jak i od struktury i własności jonitu (rodzaj grupy funkcyjnej, struktura powierzchni, wielkość ziarna itd.). Zwykle jony o wyŝszej wartościowości sorbują się lepiej od jonów o mniejszym ładunku. Chromatografia bibułowa Chromatografia bibułowa jest najprostszą ze stosowanych technik chromatograficznych. Oddaje ona nieocenione usługi przy badaniu niewielkich próbek na przykład pochodzenia biologicznego. Cały proces chromatograficzny przeprowadza się na pasku bibuły - czystej albo impregnowanej odpowiednimi substancjami, np. Ŝywicami jonowymiennymi. W zaleŝności od rodzaju analizy naleŝy dobrać odpowiedni gatunek bibuły oraz ewentualnie substancję impregnującą. Substancje badane w roztworze lotnego rozpuszczalnika w ilości 1 50 µg nanosi się punktowo na bibułę za pomocą kapilarki, mikropipetki lub mikrostrzykawki. Rozpuszczalnik powinien odparować przed analizą. Dla celów preparatywnych niekiedy substancje nanosi się na bibułę w postaci wąskiego pasma aby uzyskać większą wydajność rozdzielanych składników. Rozpuszczalniki rozwijające (fazę ruchomą) dobiera się w zaleŝności od własności składników analizowanej mieszaniny. Przepływ fazy ruchomej przez pasek bibuły osiąga się przez zanurzenie krawędzi bibuły w rozpuszczalniku w taki sposób, Ŝeby naniesiona na bibułę próbka znajdowała się tuŝ przed lustrem cieczy spełniającej rolę fazy ruchomej. Technicznie proces rozwijania chromatogramu przeprowadza się w zamykanej szczelnie komorze szklanej, na dnie której umieszcza się rozpuszczalnik. Po zanurzeniu krawędzi bibuły w rozpuszczalniku zaczyna on płynąć z określoną prędkością ku górze dzięki działaniu sił kapilarnych Technika ta nosi nazwę wstępującej. Bywa stosowana takŝe technika zstępująca, polegająca na tym, Ŝe rozpuszczalnik umieszcza się w górnej części komory chromatograficznej w specjalnej rynience. Po zanurzeniu krawędzi bibuły w zawartości rynienki następuje spływanie rozpuszczalnika 3

4 wzdłuŝ paska bibuły. W przypadku, kiedy bibuła nie jest impregnowana dodatkowymi substancjami rolę fazy stacjonarnej w procesie chromatograficznym spełnia woda zawarta w bibule i związana z nią częściowo chemicznie, a częściowo tylko siłami fizycznymi. Proces rozdziału chromatograficznego zachodzi zgodnie z omówionym wcześniej mechanizmem podziału substancji pomiędzy dwie fazy ciekłe. Szybkość migracji analizowanej substancji zaleŝy od jej współczynnika podziału, a ten wynika ze zdolności rozpuszczania się tej substancji w fazie nieruchomej (wodzie) i ruchomej (w rozpuszczalniku organicznym nie mieszającym się z wodą). Po upływie określonego czasu lub teŝ po przebyciu określonej drogi przez rozpuszczalnik bibułę wyciąga się z komory chromatograficznej, suszy się ją dokładnie i przystępuje się do tzw. wywoływania chromatogramu. PołoŜenie plamek rozdzielonych substancji na chromatogramie ustala się metodami fizycznymi (fluorescencja w świetle nadfioletowym, radioaktywność) albo metodami chemicznymi polegającymi na spowodowaniu reakcji barwnej pomiędzy badaną substancją a odpowiednio dobranym odczynnikiem wywołującym. Odczynnik ten wprowadza się na bibułę w postaci aerozolu z małego rozpylacza. Na podstawie połoŝenia plamek na chromatogramie określamy jakościowy skład badanej próbki. Najłatwiej dokonuje się tego na podstawie porównania chromatogramu z rozwijanym równolegle chrornatogramem mieszaniny wzorcowej złoŝonej ze składników, których oczekujemy w analizowanej próbce. Inny sposób polega na korzystaniu z tzw. wielkości retencyjnych charakteryzujących kaŝdą substancję. Podstawową wielkością retencyjną w chromatografii planarnej jest współczynnik R f : R f = l s /l r gdzie: l s - oznacza dystans (w cm) przebyty przez analizowaną substancję, l r - odległość przebytą przez czoło rozpuszcza1nika. Sposób wyznaczania wartości R f z chromatogramu ilustruje rys.1 Rys.1 Wyznaczanie wartości R f z chromatogramu Istnieje zaleŝność pomiędzy wielkością plamki na chromatogramie i ilością wprowadzonej substancji. Po wyznaczeniu krzywej wzorcowej w układzie: powierzchnia plamki - ilość substancji, moŝna określić zawartość danego składnika w analizowanej mieszaninie. Inną metodą ilościowej interpretacji chromatogramów jest pomiar intensywności zabarwienia plamek na całej ich długości lub szerokości. Pomiaru intensywności dokonuje się za pomocą specjalnych przyrządów zwanych fotodensytometrami. Dokładne wyniki ilościowe moŝna takŝe uzyskać przez wycięcie fragmentu bibuły z p1amką i ekstrakcję substancji odpowiednim 4

5 rozpuszczalnikiem. Wyekstrahowaną substancję oznacza się ilościowo kolorymetrycznie lub spektrofotometrycznie (na podstawie sporządzonej krzywej wzorcowej) albo innymi metodami analizy chemicznej. Chromatografia cienkowarstwowa Chromatografia cienkowarstwowa (w skrócie z ang. TLC = Thin Layer Chromatography) ma szereg cech wspólnych z bibułową - posiada wszystkie jej zalety, natomiast pozwala uniknąć wielu jej wad. Fazę nieruchomą (adsorbent, ciecz na nośniku, jonit, porowaty polimer) nanosi się cienką warstwą (ok.0,25 mm) na płytkę szklaną lub metalową w postaci drobnoziarnistego proszku. Aby uzyskać powtarzalne wyniki analiz, zarówno grubość warstwy, jak i równomierność jej rozłoŝenia na wszystkich uŝywanych płytkach musi być taka sama. Dlatego stosuje się zwykle specjalne urządzenia do nanoszenia sorbenta na płytki. Po naniesieniu warstwy sorbenta poddaje się ją suszeniu w temperaturze C. W odmianie adsorpcyjnej chromatografii cienkowarstwowej najczęściej stosuje się jako fazę stacjonarną Ŝele krzemionkowe (ok. 80% zastosowań), niekiedy tlenek glinu, ziemię okrzemkową i in. MoŜliwości doboru rozpuszczalnika w chromatografii cienkowarstwowej są bardzo szerokie. Doboru rozpuszczalnika dokonuje się zwykle na podstawie tzw. szeregu eluotropowego rozpuszczalników ułoŝonego w kolejności rosnącej polarności jego składników. Analizowane mieszaniny wprowadza się na płytkę identycznie jak w przypadku chromatografii bibułowej. Do rozwijania chromatogramów stosuje się najczęściej technikę wstępującą. Wywoływanie chromatogramów przeprowadza się po wysuszeniu płytki. tj. po odparowaniu zawartego w niej rozpuszczalnika rozwijającego podobnie jak w chromatografii bibułowej. RównieŜ metody jakościowej i ilościowej interpretacji chromatogramów są takie same (wizualizacja chromatogramów, porównywanie wartości R f, pomiary ilościowe). W tym miejscu jednak warto wymienić szereg zalet chromatografii cienkowarstwowej w porównaniu z bibułową. Obok wspomnianej juŝ wcześniej moŝliwości stosowania róŝnorodnych faz stacjonarnych w TLC istnieje znacznie większy asortyment substancji rozwijających i wywołujących, poniewaŝ w odróŝnieniu od bibuły, stosowane sorbenty nieorganiczne są odporne na silnie agresywne związki, takie jak stęŝone kwasy, ługi, silne utleniacze itp. Istotną zaletą TLC jest moŝliwość szybkiego rozwijania chromatogramów. Przeciętny czas rozwijania chromatogramu wynosi ok. 1 godz. podczas gdy w chromatografii bibułowej jest to proces często wielogodzinny. Ponadto na ogół sprawność rozdziału techniką TLC jest wyŝsza niŝ w chromatografii bibułowej. Objawia się to w lepszym wykształceniu plamek i mniejszych ich rozmiarach. Dzięki temu osiąga się z reguły lepsze wyniki interpretacji jakościowej i ilościowej analiz. Wykonanie ćwiczenia Ćwiczenie polega na rozdziale i analizie trzech grup barwników w dwóch układach rozwijających. W tym celu naleŝy sporządzić dwa układy rozwijające, odpowiedni zestaw rozpuszczalników tak by sumaryczna ilość mieszaniny wynosiła 100 cm 3. Układ rozwijający I składa się z n-butanolu, kwasu octowego i wody zmieszanych z sobą w porcjach objętościowych odpowiednio 5 : 1 : 2. Układ rozwijający II składa się z octanu etylu, metanolu i 5n wodorotlenku amonu (5% NH 3 ) zmieszanych w proporcji objętościowej 6 : 3 : 1. Tak przygotowanymi układami napełnić odpowiednie komory rozwijające. 5

6 UWAGA: Układów powyŝszych nie naleŝy sporządzać w przypadku gdy komory są juŝ napełnione. Posługując się szablonami nanieść na płytki chromatograficzne za pomocą kapilar kolejno: 1. barwniki A, B, C, D, E oraz mieszaninę M 2. barwniki a, b, c, d, e oraz mieszaninę m 3. barwniki 1, 2, 3, 4 Wszystkie trzy zestawy naleŝy nanosić na płytki w podwójnych egzemplarzach ze względu na konieczność rozwijania ich w dwóch róŝnych układach. Linia startu barwników powinna znajdować się w odległości nie mniejszej niŝ 1 cm od dolnej krawędzi płytki oraz powinna być zaznaczona delikatnie ołówkiem, średnica naniesionych plamek winna wynosić 1-1,5 mm. Nanoszenie barwników kapilarą dokonywać od razu na dwóch płytkach ze względu na oszczędność kapilar kapilary zuŝyte wyrzucamy do kosza. Płytki z naniesionymi barwnikami umieszczamy dolną krawędzią moŝliwie pionowo, w komorach rozwijających. Chromatogramy rozwijać do momentu gdy front rozpuszczalnika osiągnie odległość 1-0,5 cm od górnej krawędzi, zaznaczając ołówkiem linię frontu zaraz po wyjęciu płytki z komory. Zarysować delikatnie kontury plamek dla analizy A - M, a - m, 1 4, następnie ponownie uczynić to w świetle ultrafioletowym lampy kwarcowej znajdującej się w wyposaŝeniu ćwiczenia. Wyznaczyć środki plamek i zmierzyć odległość od linii startu (x) oraz odległość czoła rozpuszczalnika (y). Obliczyć R f, zapisać uwagi co do kształtu, koloru i sposobu uwizualnienia plamek. W przypadku barwników 1-4 wyznaczyć ilość zanieczyszczeń dla kaŝdego z nich zaś dla zestawów A - M i a - m podać rodzaje barwników znajdujących się w mieszaninach. Zaznaczyć w sprawozdaniu przydatność układu do analizy. Wzór sprawozdania Temat: Chromatografia cienkowarstwowa Po porównaniu plamek z układu I i II stwierdzono, Ŝe: W mieszaninie M znajdowały się barwniki:... W mieszaninie m znajdowały się barwniki:... Barwnik 1 zawierał... zanieczyszczenia Barwnik 2 zawierał... zanieczyszczenia Barwnik 3 zawierał... zanieczyszczenia Barwnik 4 zawierał... zanieczyszczenia 6

7 Układ I Barwniki Ilość plamek Kształt i kolor plamek x [mm] y [mm] R f A B C D E M a b c d e m

8 Układ II Barwniki Ilość plamek Kształt i kolor plamek x [mm] y [mm] R f A B C D E M a b c d e m