Genomic Midi AX Direct zestaw do izolacji genomowego DNA (procedura bez precypitacji) wersja 1215 20 izolacji Nr kat. 895-20D Pojemność kolumny do oczyszczania DNA wynosi 100 µg 1
Skład zestawu Składnik Ilość Temperatura Przechowywania Kolumny Spin 100AX 20 szt. +4 do +8 C Probówki o poj. 15 ml typu Falcon 2 x 20 szt. Temp. Pok. L1.4 roztwór lizujący 50 ml Temp. Pok. W1 G pierwszy roztwór płuczący 70 ml Temp. Pok. W2 drugi roztwór płuczący 40 ml Temp. Pok. Bufor TE 50 ml Temp. Pok. Proteinaza K 2 x 1,1 ml +4 do +8 C E bufor elucyjny 2 x 5 ml +4 do +8 C N bufor zobojętniający 1 ml Temp. Pok. Roztwór T 400 µl +4 do +8 C Kolumna równoważąca 1 szt. Temp. Pok. Wyposażenie i materiały niezbędne do izolacji DNA, które nie wchodzą w skład zestawu 1. Materiał do izolacji DNA 2. Enzymy (opcjonalnie w zależności od rodzaju materiału): Lizozym - 10 mg/ml, 400 U/µl (nr kat. 1005-10, 1005-50) Lizostafyna - 1 mg/ml, 0,4 U/µl (nr kat. 1007-400, 1007-2000) Mutanolizyna - 10 U/µl (nr kat. 1017-5, 1017-10, 1017-50) 3. RNAza - 10 mg/ml (nr kat. 1006-10, 1006-50) (opcjonalnie) 4. Probówki o poj. 1,5 ml typu Eppendorf 5. Probówki o poj. 15 ml typu Falcon 6. Termoblok lub inny inkubator (37 C, 50 C) 7. Wirówka z rotorem do wirowania probówek o poj. 15 ml typu Falcon Firma A&A Biotechnology udziela rocznej gwarancji na niniejszy zestaw. Firma nie gwarantuje poprawnego działania zestawu do izolacji DNA w przypadku: odstępstwa od dostarczonego wraz z zestawem protokołu braku zalecanego w niniejszym protokole wyposażenia i materiałów użycia innych odczynników niż zalecane lub które nie wchodzą w skład zestawu użycia przeterminowanych lub niewłaściwie przechowywanych odczynników oraz kolumn 2
Przygotowanie materiału Krew świeża lub mrożona 1. Przenieść 2 ml krwi do probówki o poj. 15 ml typu Falcon. Uwaga: w przypadku mniejszej ilości krwi niż 2 ml należy dodać buforu TE do całkowitej objętości 2 ml. 2. Dodać po 2 ml buforu lizującego L 1.4 oraz 100 µl Proteinazy K. 3. Całość wymieszać. Inkubować 20 min w temp. 50 C. Uwaga: Nie przedłużać inkubacji. 4. Po inkubacji intensywnie worteksować próbkę przez 20 s. 5. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA. Bakterie 1. Przenieść 1-5 ml hodowli bakteryjnej do probówki o poj. 15 ml typu Falcon. 2. Odwirować. Usunąć supernatant. 3. Osad zawiesić w 2 ml buforu TE. Dodać po 20 µl Lizozymu (10 mg/ml) (nie ma w zestawie, nr kat. 1005-10, 1005-50). Inkubować 15 min w temp. 37 C. Uwaga: dla S.aureus zalecamy traktowanie Lizostafyną (nie ma w zestawie, nr kat. 1007-400, 1007-2000); dla Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Listeria zalecamy traktowanie Mutanolizyną (nie ma w zestawie, nr kat. 1017-5, 1017-10, 1017-50). 4. Dodać po 2 ml buforu lizującego L1.4 oraz 100 µl Proteinazy K. 5. Całość wymieszać przez odwracanie probówki. Inkubować w temp. 50 C do osiągnięcia całkowitej klarowności mieszaniny (zwykle 60 min). Opcjonalne usuwanie RNA: do próbki należy dodać 10 µl RNAzy (10 mg/ml) (nie ma w zestawie, nr kat. 1006-10, 1006-50). Następnie całość wymieszać i pozostawić próbkę na 5 min w temp. pokojowej. 6. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA. Hodowli komórkowe 1. Przenieść 1 x 10 7 hodowli komórkowych do probówki o poj. 15 ml typu Falcon. Odwirować. Usunąć supernatant. 2. Osad zawiesić w 2 ml buforu TE. Dodać po 2 ml buforu lizującego L 1.4 oraz 100 µl Proteinazy K. 3. Całość wymieszać przez odwracanie probówki. Inkubować w przez 30 min w temp. 50 C. Opcjonalne usuwanie RNA: do próbki należy dodać 10 µl RNAzy (10 mg/ml) (nie ma w zestawie, nr kat. 1006-10, 1006-50). Następnie całość wymieszać i pozostawić próbkę na 5 min w temp. pokojowej. 4. Całość wirować 10 min przy 4000-5000 x g. Przenieść supernatant do nowej probówki o poj. 15 ml typu Falcon. 5. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA. 3
Tkanki 1. Pociąć ok. 50-100 mg tkanki na małe fragmenty lub rozetrzeć w ciekłym azocie i przenieść do probówki o poj. 15 ml typu Falcon. 2. Dodać po 2 ml buforu TE, 2 ml buforu lizującego L 1.4 oraz 100 µl Proteinazy K. 3. Całość wymieszać przez odwracanie probówki. Inkubować w temp. 50 C do całkowitego strawienia tkanki (zwykle 120-240 min). Próbkę należy mieszać od czasu do czasu. Opcjonalne usuwanie RNA: do próbki należy dodać 10 µl RNAzy (10 mg/ml) (nie ma w zestawie, nr kat. 1006-10, 1006-50). Następnie całość wymieszać i pozostawić próbkę na 5 min w temp. pokojowej. 4. Całość wirować 10 min przy 4000-5000 x g. Przenieść supernatant do nowej probówki o poj. 15 ml typu Falcon. 5. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA. Protokół izolacji 1. Przygotowane próby nanieść na kolumny Spin 100AX umieszczone w probówkach o poj. 15 ml typu Falcon. W przypadku nieparzystej ilości próbek należy użyć do zrównoważenia kolumny równoważącej, dodając do niej odpowiednie ilości wody lub dowolnego roztworu równoważącego. 2. Wirować w rotorze uchylnym 2 min przy 3000 RPM. 3. Kolumny Spin 100AX przenieść do nowych probówek 15 ml typu Falcon (w zestawie). Nanieść na kolumny po 3 ml pierwszego buforu płuczącego W1G. 4. Wirować w rotorze uchylnym 2 min przy 3000 RPM. A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, 81-451 Gdynia NIP 584-025-44-03 4
5. Następnie nanieść na kolumny Spin 100AX po 1,5 ml drugiego roztworu płuczącego W2. 6. Wirować w rotorze uchylnym 2 min przy 3000 RPM. 7. Przygotować probówki elucyjne 15 ml typu Falcon (w zestawie). Dodać na ich dno po 10 µl buforu zobojętniającego N. Zobojętnianie próbek DNA. Patrz Informacje dodatkowe na końcu protokołu. 8. Kolumny Spin 100AX przenieść do przygotowanych w pkt 7. probówek elucyjnych. Nanieść na kolumny po 400 µl buforu elucyjnego E. Po użyciu buforu E należy zawsze szczelnie zakręcać pojemnik. 9. Inkubować 2 min w temp. pokojowej. 10. Wirować 2 min przy 3000 RPM. 11. Usunąć kolumny Spin 100AX. Eluaty DNA przenieść do probówek typu Eppendorf. A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, 81-451 Gdynia NIP 584-025-44-03 5
Informacje dodatkowe Zobojętnianie DNA Bufor elucyjny E jest silnie alkaliczny. Po zamrożeniu eluatu zawieszonego w buforze elucyjnym E może dojść do degradacji DNA, dlatego eluaty DNA należy zobojętnić buforem N. Z naszej praktyki laboratoryjnej wynika, że najwygodniej jest dodać bufor N przed elucją DNA do pustej probówki elucyjnej (pkt 7. protokołu). W trakcie elucji, zawieszone w buforze elucyjnym DNA wymiesza się z buforem N i ulegnie natychmiastowej neutralizacji. Po dodaniu buforu neutralizującego N - DNA będzie zawieszone w roztworze 10 mm Tris ph 8,5. Jeżeli bufor neutralizujący N nie został dodany w pkt 7. protokołu, to można dodać go po zakończonej izolacji - przed zamrożeniem eluatów DNA. Test funkcjonalności buforu elucyjnego E Bufor elucyjny E ma kluczowy wpływ na wydajność elucji DNA. Jego prawidłowe działanie można sprawdzić za pomocą roztworu T wchodzącego w skład zestawu. Kiedy przeprowadzić test funkcjonalności: Bufor elucyjny E nie był używany przez minimum 2 miesiące Bufor elucyjny E był przechowywany w temp. pokojowej przez minimum 2 tygodnie Fiolka zawierająca bufor elucyjny E nie została szczelnie zamknięta po użyciu Protokół 1. Przenieść 20 µl buforu elucyjnego E do nowej probówki PCR. 2. Dodać 2 µl roztworu T. Całość wymieszać. 3. Poczekać 2 min. 4. Porównać kolor mieszaniny ze zdjęciem przedstawiającym kolory referencyjne. Bufor E nie działający poprawnie Buffer E działający poprawnie 6
Elementy do zamówień dodatkowych Składnik Ilość Nr kat. Proteinaza K roztwór (20 mg/ml) 1,1 ml 1019-20 25 mg 1019-25L Proteinaza K liofilizat 100 mg 1019-100L 250 mg 1019-250L 1000 mg 1019-1L Bufor TE 100 ml 297-100 Lizozym roztwór (10 mg/ml, 400 U/µl) Lizostafyna roztwór (1 mg/ml, 0,4 U/µl) Mutanolizyna roztwór (10 U/µl) RNAza roztwór (10 mg/ml) 1 ml 1005-10 5 ml 1005-50 400 U 1007-400 2000 U 1007-2000 5 000 U 1017-5 10 000 U 1017-10 50 000 U 1017-50 1 ml 1006-10 5 ml 1006-50 7
Informacje bezpieczeństwa NIEBEZPIECZEŃSTWO Proteinaza K H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H334 Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. P261 Unikać wdychania pyłu. P305+P351+P338 W przypadku dostania się do oczu: ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. P342+P311 W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu oddechowego skontaktować się z Ośrodkiem Zatruć lub lekarzem. UWAGA L1.4 roztwór lizujący H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. P305+P351+P338 W przypadku dostania się do oczu: ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. UWAGA W1G pierwszy roztwór płuczący H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. P305+P351+P338 W przypadku dostania się do oczu: ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. NIEBEZPIECZEŃSTWO E bufor elucyjny H314 Powoduje poważne oparzenia skóry oraz uszkodzenia oczu. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu/ ochronę twarzy. P305+P351+P338 W przypadku dostania się do oczu: ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. P310 Natychmiast skontaktować się z Ośrodkiem Zatruć lub lekarzem. 8