PL 214847 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 214847 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 391100 (51) Int.Cl. C07D 233/66 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 29.04.2010 (54) Pochodne 1-(1-fenyloimidazolidyno-2-ylideno) 4-podstawione tiosemikarbazydu oraz sposób ich otrzymywania (73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET MEDYCZNY W LUBLINIE, Lublin, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: 07.11.2011 BUP 23/11 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.09.2013 WUP 09/13 (72) Twórca(y) wynalazku: MONIKA ALETAŃSKA-KOZAK, Lublin, PL DARIUSZ MATOSIUK, Lublin, PL URSZULA KOSIKOWSKA, Lublin, PL ANNA MALM, Lublin, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Bełz
2 PL 214 847 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku są pochodne 1-(1-fenyloimidazolidyno-2-ylideno) 4-podstawione tiosemikarbazydu o wzorze ogólnym 1, gdzie R oznacza 2-metylofenyl, 2,3-dimetylofenyl, 4-metoksyfenyl, 4-chlorofenyl, 2,6-dichlorofenyl oraz sposób ich otrzymywania. W znanym stanie techniki, a w szczególności w publikacji Phosphorus Sulfur Silicon Relat. Elem. 2002, 177,195 występuje tiosemikarbazon 3-metylo-1-fenylo-5-(4-acetylobenzenosulfonamido)- -pirazolu. Związek ten wykazuje aktywność przeciwbakteryjną. Będące przedmiotem wynalazku nowe pochodne stanowią związki 1-(1-fenyloimidazolidyno- -2-ylideno)-4-benzylotiosemikarbazydy o wzorze ogólnym 1, gdzie R oznacza 2-metylofenyl, 2,3-dimetylofenyl, 4-metoksyfenyl, 4-chlorofenyl, 2,6-dichlorofenyl, wykazujące aktywność przeciwdrobnoustrojową a zwłaszcza wobec przetrwalnikujących warunkowo chorobotwórczych laseczek tlenowych Bacillus spp. Związki o wzorze ogólnym 1, gdzie R oznacza 2-metylofenyl, 2,3-dimetylofenyl, 4-metoksyfenyl, 4-chlorofenyl, 2,6-dichlorofenyl sposobem według wynalazku otrzymuje się w wyniku reakcji izotiocyjanianu benzylu, o wzorze ogólnym 3 z odpowiednio podstawionymi wolnymi pochodnymi 1-arylo- -2-hydrazonoimidazolidyny o wzorze ogólnym 2, otrzymanymi z odpowiednio podstawionych jodowodorków o wzorze ogólnym 4. Reakcję prowadzi się w środowisku rozpuszczalnika organicznego, korzystnie dichlorometanu w łaźni wodno-lodowej przez okres co najmniej 5 godzin, stosując proporcje molowe 1:1. Po zakończeniu reakcji, rozpuszczalnik usuwa się przez destylację z łaźni wodnej. Wydzielony osad oczyszcza się przez krystalizację z rozpuszczalnika polarnego, korzystnie propan-2-olu. Otrzymane według wynalazku pochodne mogą znaleźć zastosowanie do wytwarzania leków przeznaczonych do leczenia pacjentów z objawami zakażeń wywołanych warunkowo chorobotwórczymi (oportunistycznymi), przetrwalnikującymi laseczkami Gram-dodatnimi (np. Bacillus subtilis lub Bacillus cereus). Wśród tlenowych laseczek przetrwalnikujących, których przedstawicielem są wymienione gatunki, największe znaczenie mają bakterie z gatunku Bacillus anthracis, czynnik etiologiczny wąglika występującego w postaci schorzeń skórnych (czarna krosta), jelitowych i płucnych, o bardzo zróżnicowanym i trudnym do przewidzenia przebiegu. Bacillus cereus jest znanym od dawna czynnikiem etiologicznym zatruć pokarmowych, wytwarzającym entero toksyny o właściwościach wymiotnych. Laseczki tlenowe, występujące powszechnie w glebie, kurzu, wodzie lub pokarmach, które w stanie fizjologicznym są obojętne lub przyjazne dla zdrowego organizmu, mogą być w pewnych warunkach czynnikami etiologicznymi zakażeń, w tym również odzwierzęcych lub silnych toksykoinfekcjach, zwłaszcza u pacjentów z osłabioną odpornością lub z innymi chorobami układowymi. Mogą również powodować zakażenia lub zatrucia w niektórych grupach zawodowych (garbarze, hodowcy, weterynarze). Ponadto, drobnoustroje te, świadomie użyte, mogą służyć jako broń biologiczna. P r z y k ł a d 1 1.59 g (0.005 mola) jodowodorku 1-(2-metylofenylo)-2-hydrazonoimidazolidyny rozpuszczono w 50 cm 3 wody destylowanej i dodano 0.4 g (0.01 mola) NaOH rozpuszczonego w 50 cm 3 wody destylowanej. Całość ekstrahowano trzema porcjami po 50 cm 3 dichlorometanu. Następnie wysuszono bezwodnym K 2 CO 3 i przesączono od środka suszącego. W kolbie stożkowej o pojemności 250 cm na mieszadle magnetycznym, w łaźni wodno-lodowej umieszczono wolną pochodną hydrazonową w dichlorometanie i dodano roztwór 0.75 g (0.005 mola) izotiocyjanianu benzylu w 20 cm 3 dichlorometanu. Całość mieszano 5 godzin. Na noc wstawiono do lodówki. Rozpuszczalnik oddestylowano na wyparce rotacyjnej z łaźni wodnej, a do pozostałości dodano 20 cm 3 propan-2-olu. Całość ogrzano do wrzenia. Po oziębieniu wypadł osad 1-[1-(2-metylofenylo)-imidazolidyno-2-ylideno]-4-benzylotiosemikarbazydu, wzór 1, który odsączono. Otrzymano 1.18 g (69.4%) osadu o t.t. 153-6 C. Analiza elementarna dla wzoru C 18 H 21 N 5 S (m.cz. 339.47) Obliczono: %C = 63.68 %H = 6.23 %N = 20.63 %S = 9.44 Oznaczono: %C = 63.25 %H = 6.21 %N = 20.54 %S = 9.40 Widmo 1 H NMR (D 6 -DMSO, δ, ppm, TMS) 9.36 (s, 1H, NH); 7.11-7.32 (m, 9H, 9CH arom ); 7.04-7.07 (t, 1H, NH); 6.81- (s. 1H, 1NH); 4.62-4.63 (d, 2H, CH 2aIif.); 3.63-3.67 (t, 2H, CH 2imid.); 3.48-3.52 (t, 2H, CH 2imid.); 2.16 (s,3h, CH 3 ) Dane fizykochemiczne pozostałych pochodnych 1-(1-aryloimidazolidyno-2-ylideno)-4-benzylotiosemikarbazydu zamieszczono w Tabeli 1 w pozycjach od 1 do 4.
PL 214 847 B1 3 Wyniki badań aktywności mikrobiologicznej związków według wynalazku przeprowadzono na przykładzie 10 szczepów wzorcowych reprezentujących Gram- dodatnie i Gram- ujemne bakterie tlenowe. Wyniki te zamieszczono w Tabeli Nr 2. W badaniach wykorzystano 6 szczepów wzorcowych bakterii Gram-dodatnich (Sa6538-Staphylococcus aureus ATCC 6538, Sa25923-Staphylococcus aureus ATCC 25923, Se12228-Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Bs6638-Bacillus subtilis ATCC 6638, Bc10876-Bacillus cereus ATCC 10876, Ml10240-Micrococcus luteus ATCC 10240) oraz 4 szczepy wzorcowe bakterii Gram-ujemnych (Ec25922-Escherichia coli ATCC 25922, Kp13883- Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Pm12453-Proteus mirabilis ATCC 12453, Pa9027- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027). Dla każdego szczepu przygotowywano zawiesinę bakteryjną (inokulum) o gęstości wyjściowej 0.5 w skali McFarlanda - 150 x 10 6 CFU (Colony Forming Units)/mL w 0.85% NaCl. Przeciwdrobnoustrojową aktywność badanych związków oznaczano w oparciu o wartość MIC (minimal inhibitory concentration) metodą seryjnych rozcieńczeń w podłożu agarowym Mueller-Hinton II. Roztwory podstawowe badanych związków o stężeniu 50 mg/ml, przygotowane po rozpuszczeniu badanych substancji w DMSO (dimetylu sulfotlenek), dodawano w odpowiednich ilościach do upłynnionego podłoża agarowego, uzyskując podwójnie malejące stężenia końcowe badanych związków w zakresie wymaganym doświadczeniem (od 31,25 do 1000 μg/ml). Tak przygotowane płytki suszono w cieplarce w temperaturze 35 ± 2 C przez około 1 do 1,5 h, następnie dzielono na sektory i na każdy sektor nanoszono po 20 μl zawiesiny drobnoustrojów o gęstości 0,5 w skali McFarlanda. Płytki preinkubowano w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny celem wchłonięcia nadmiaru NaCl z zawiesin bakteryjnych, następnie inkubowano w temperaturze 35 ± 2 C przez 18 godzin. Po inkubacji oznaczano wartość MIC, definiowaną jako najniższe stężenie badanego związku w podłożu, przy którym wzrokowo nie obserwowano wzrostu bakterii w porównaniu z ich wzrostem na podłożu agarowym bez dodatku badanych substancji (płytka kontrolna). Nie wykazano wpływu DMSO dodanego do podłoża agarowego Mueller-Hinton II na namnażanie i wzrost badanych bakterii. Zgodnie z uzyskanymi wynikami, nowo zsyntetyzowane substancje charakteryzowała zróżnicowana aktywność wobec większości bakterii Gram-dodatnich (MIC 125 do >1000 μg/ml). Wykazano potencjalną aktywność przeciwbakteryjną pochodnych 1-[1-(2,6-dichlorofenylo)-imidazolidyno-2-ylideno]-4-benzylotiosemikarbazydu, 1-[1-(2,3-dimetylofenylo)-imidazolidyno-2-ylideno]-4-benzylotiosemikarbazydu i 1-[1-(2-metylofenylo)-imidazolidyno-2-ylideno]-4-benzylotiosemikarbazydu (MIC=62,5-1000 μg/ml wobec Bacillus subtilis ATCC 6638 i Bacillus cereus ATCC 10876, co wskazuje, że badane substancje mogą być związkami wyjściowymi do syntezy pochodnych charakteryzujących się aktywnością wobec mikroorganizmów oportunistycznych. Uzyskane pochodne nie wykazywały aktywności wobec bakterii Gram- ujemnych - wartość MIC = 1000 g/ml uzyskano tylko w przypadku związków 1-{[1-(2,3-dimetylofenyl)-oimidazolidyno-2-ylideno]-4-benzylotiosemikarbazydu i 1-[1-(2-metylofenylo)-imidazolidyno- -2-ylideno]-4-benzylotiosemikarbazydu dla szczepu wzorcowego Escherichia coli ATCC 25922.
4 PL 214 847 B1 T a b e l a 1 Dane fizykochemiczne pochodnych 1-(1-fenyloimidazolidyno-2-ylideno)-4-benzylotiosemikarbazydu Nr zw. R Wzór sumaryczny Masa cząsteczkowa Temp. topn. C Analiza (obl./ozn.) % Wydajność % C H Cl N S 1 HNMR (ppm) 1 2,3-diCH 3C 6H 3 C 19H 23N 5S 353.50 193-5 81.9 64.56 64.72 6.56 6.57-19.81 19.76 9.07 9.11 9.35 (s, 1H, NH); 7.01-7.32 (m, 9H, 8CH arom, 1NH); 6.79 (s, 1H, NH); 4.61-4.63 (d, 2H, CH 2alif.); 3.60-3.63 (dd, 2H, CH 2imid.); 3.48-3.52 (dd, 2H, CH 2imid.); 2.15 (s, 3H, CH 3); 2.02 (s, 3H, CH 3); 2 4-OCH 3C 6H 4 C 18H 21N 5OS 355.47 142-3 76.4 60.82 60.95 5.95 5.92-19.70 19.59 9.02 8.97 9.37 (s, 1H, NH); 7.53-7.55 (t, 1H, NH);7.24-7.50 (m, 7H, 7CH arom); 6.87 (s, 1H, NH); 6.81-6.83 (d, 2H, 2CH arom); 4.73-4.75 (d, 2H, CH 2allf); 3.78-3.82 (t, 2H, CH 2imid); 3.70 (s, 3H, OCH 3); 3.42-3.46 (t, 2H, CH 2imid); 3 4-ClC 6H 4 C 17H 18ClN 5S 359.89 161-4 77.2 56.73 56.58 5.04 5.01 9.85 9.91 19.46 19.52 8.91 8.89 9.35 (s, 1H, NH); 7.61-7.65 (m, 3H, 3CH arom); 7.23-7.33 (m, 7H, 1NH, 6CH arom); 7.01 (s, 1H, NH); 4.76-4.77 (d, 2H, CH 2allf); 3.84-3.88 (t, 2H, CH 2imid.); 3.45-3.48 (t, 2H, CH 2imid.); 4 2,6-diClC 6H 3 C 17H 17Cl 2N 5S 394.34 160-3 60.2 51.78 51.90 4.34 4.32 17.98 18.08 17.76 17.68 8.13 8.09 9.4 (s, 1H, NH); 7.17-7.50 (m, 8H, 8CH arom); 7.00-7.03 (t, 1H, NH); 6.89 (s, 1H, NH); 4.61-4.62 (d, 2H, CH 2allf); 3.65-3,70 (dd, 2H, CH 2imid.); 3.57-3.61 (dd, 2H, CH 2imid.); T a b e l a 2 Aktywność przeciwbakteryjna pochodnych 1-(1-fenyloimidazolidyno-2-ylideno)-4-benzylotiosemikarbazydu oznaczona w oparciu o wartości MIC uzyskane metodą rozcieńczeń w podłożu agarowym Badany związek R MIC g/ml) Sa25923 Sa6538 Se12228 Bs6638 Bc10876 Ml10240 Ec25922 Kp13883 Pm12453 Pa9027 2-CH 3C 6H 4 1000 1000 1000 125 250 1000 1000 >1000 >1000 >1000 2,3-diCH 3C 6H 3 1000 1000 1000 500 1000 1000 1000 >1000 >1000 >1000 4-OCH 3C 6H 4 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 4-ClC 6H 4 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 2,6-diClC 6H 3 1000 1000 1000 1000 62,5 1000 >1000 >1000 >1000 >1000 Skróty: Sa25923 - Staphylococcus aureus ATCC 25923 Sa6538 - Staphylococcus aureus ATCC 6538 Se12228 - Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 Bs6638 - Bacillus subtilis ATCC 6638 Bc10876 - Bacillus cereus ATCC 10876 Ml10240 - Micrococcus luteus ATCC 10240 Ec25922 - Escherichia coli ATCC 25922 Kp13883 - Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Pm12453 - Proteus mirabilis ATCC 12453 Pa9027 - Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
PL 214 847 B1 5 Zastrzeżenia patentowe 1. Pochodne 1-(1-fenyloimidazolidyno-2-ylideno) 4-podstawione tiosemikarbazydu o wzorze ogólnym 1, gdzie R oznacza 2-metylofenyl, 2,3-dimetylofenyl, 4-metoksyfenyl, 4-chlorofenyl, 2,6-dichlorofenyl. 2. Sposób otrzymywania pochodnych 1-(1-fenyloimidazolidyno-2-ylideno) 4-podstawionych tiosemikarbazydu o wzorze ogólnym 1, gdzie R oznacza 2-metylofenyl, 2,3-dimetylofenyl, 4-metoksyfenyl, 4-chlorofenyl, 2,6-dichlorofenyl, znamienny tym, że izotiocyjanian benzylu, o wzorze ogólnym 3, poddaje się reakcji z odpowiednio podstawionymi wolnymi pochodnymi 1-arylo-2-hydrazonoimidazolidyny o wzorze ogólnym 2, gdzie R ma wyżej podane znaczenie, otrzymanymi z odpowiednio podstawionych jodowodorków 1-arylo-2-hydrazonoimidazolidyny o wzorze ogólnym 4, przy czym reakcję prowadzi się w środowisku rozpuszczalnika organicznego, stosując proporcje molowe 1:1 przez okres co najmniej 5 godzin, a po zakończeniu reakcji, rozpuszczalnik usuwa się przez destylację z łaźni wodnej, zaś wydzielony osad oczyszcza się przez krystalizację z rozpuszczalnika polarnego. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w dichlorometanie w łaźni wodno-lodowej. 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że wydzielony osad oczyszcza się przez krystalizację z propan-2-olu.
6 PL 214 847 B1 Rysunki Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)