Nr kat. EM10 Wersja: 1.2018 Zestaw do izolacji genomowego DNA z drożdży EXTRACTME jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy BLIRT S.A.
www.blirt.eu 2
Nr kat. EM10 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA YEAST KIT przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji drożdżowego DNA o wysokiej czystości z hodowli płynnych i powierzchniowych oraz osadów mrożonych. Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia wysokiej wydajności i czystości izolowanego DNA. Produkt przeznaczony jest wyłącznie do użytku w celach badawczych. II. SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU LICZBA IZOLACJI 10 IZOLACJI 50 IZOLACJI 250 IZOLACJI 1 Warunki prze chowywania Nr katalogowy EM10-010 EM10-050 EM10-250 YS Buffer (Spheroplast Buffer) 2 ml 10 ml 50 ml TP Lysis Mix 20 μl 100 μl 500 μl -20 C YL Buffer (Lysis Buffer) 3 ml 15 ml 75 ml TP RNase A * (lyophilized) 1 szt. 1 szt. 5 szt. -20 C 2 RNase Buffer 100 μl 220 μl 1.1 ml TP Proteinase K ** (lyophilized) 1 szt. 1 szt. 5 szt. -20 C 3 Proteinase Buffer 200 μl 560 μl 2.8 ml TP YB Buffer (Binding Buffer) 3.5 ml 18 ml 88 ml TP YW Buffer (Wash Buffer) 10 ml 50 ml 250 ml TP Elution Buffer 2 ml 10 ml 5 x 10 ml TP DNA Purification Columns 10 pcs 50 pcs 5 x 50 pcs TP Collection Tubes (2 ml) 10 pcs 50 pcs 5 x 50 pcs TP 1 TP temperatura pokojowa (+15 C do +25 C) 2 RNase A w roztworze przechowywana w temperaturze +4 C zachowuje całkowitą aktywność przez kilka dni. Jeśli wymagane jest przechowywanie RNase A przez dłuższy okres czasu, zaleca się rozporcjowanie roztworu RNase A i przechowywanie w temperaturze -20 C 3 R o z t w ó r Proteinase K należy przechowywać w temperaturze -20 C. * Przed pierwszym użyciem do próbówki zawierającej liofilizat RNase A należy dodać 220 μl RNase Buffer (w zestawie na 10 izolacji należy dodać 100 μl buforu). ** Przed pierwszym użyciem do próbówki zawierającej liofilizat Proteinase K należy dodać 560 μl Proteinase Buffer (w zestawie na 10 izolacji należy dodać 200 μl buforu). 3
Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Data ważności Data ważności zestawu, przechowywanego w odpowiednich warunkach, podana jest na etykietach produktu. Po otwarciu zestaw zachowuje stabilność przez okres 12 miesięcy. www.blirt.eu 4
Nr kat. EM10 III. SPECYFIKACJA PRODUKTU MATERIAŁ WYJŚCIOWY Płynna lub powierzchniowa hodowla drożdży bądź mrożony osad komórkowy. WYDAJNOŚĆ IZOLACJI Liczba komórek: 1 x 10 8 100% Liczba komórek: 2 x 10 8 9 x 10 8 30 70% POJEMNOŚĆ ZŁOŻA ok. 40 μg DNA CZAS IZOLACJI ok. 75 minut (łacznie z lizą) CZYSTOŚĆ DNA A 260 /A 280 = 1.7 1.9 5
IV. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI Izolacja DNA z hodowli płynnej (0.2 3 ml) Przed pobraniem odpowiedniej objętości hodowli płynnej, zawiesinę komórek należy dokładnie wymieszać. Do probówki typu Eppendorf przenieść żądaną objętość hodowli (maksymalnie 1.5 ml) i wirować przy 3000 4000 x g. Zdekantować supernatant. Jeśli istnieje potrzeba izolacji z większej niż 1.5 ml objętości hodowli, do powstałego osadu dodać kolejne 1.5 ml hodowli i powtórzyć wirowanie. Kontynuować izolację od pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja VI). Izolacja DNA z zamrożonego osadu komórkowego Zamrożony osad należy bezzwłocznie zawiesić w 200 μl YS Buffer. Nie należy doprowadzać do rozmrożenia osadu. Kontynuować izolację od pkt. 3 Protokołu izolacji (sekcja VI). Izolacja DNA z hodowli powierzchniowej Do probówki 1,5 ml typu Eppendorf przenieść 200 μl YS Buffer. Ezą pobrać obfitą ilość komórek drożdżowych z podłoża na płytce Petriego i zawiesić w buforze. Kontynuować izolację od pkt. 3 Protokołu izolacji (sekcja VI). www.blirt.eu 6
Nr kat. EM10 V. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI 1. Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać. 2. Należy pamiętać o rozpuszczeniu liofilizatu Proteinase K w odpowiedniej ilości buforu do proteinazy (Proteinase Buffer) oraz liofilizatu RNase A w odpowiedniej ilości buforu do RNazy (RNase Buffer). 3. W przypadku wytrącenia osadu w buforach, butelkę z roztworem należy ogrzać do temp. 37 C (YW Buffer) lub 50 60 C (pozostałe bufory) i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej. 4. Nagrzać termoblok lub łaźnię wodną do temp. 30 C i 55 C. 5. Należy pamiętać, aby wszystkie etapy izolacji przeprowadzać w temp. pokojowej. 7
VI. PROTOKÓŁ IZOLACJI 1. Zwirować 1.5 ml hodowli drożdżowej przy 3000 4000 x g przez 5 min. c Możliwa jest zmiana objętości hodowli w zakresie 0.2 3 ml. Więcej wskazówek znajduje się w sekcji IV. Przygotowanie próbki. 2. Supernatant zdekantować, a osad komórkowy dokładnie zawiesić w 200 μl YS Buffer. 3. Dodać 2 μl Lysis Mix, 4 μl RNase A oraz 0,2 μl 100% β-me (opcjonalnie, nie zawarty w zestawie), a następnie wymieszać przez worteksowanie. c Można przygotować odpowiednią ilość buforu YS z dodatkiem β-me przed izolacją. cz a mias t β-me można dodać 10 μl 1 M DTT. Można także pominąć dodatek związku redukującego, jednak odczynnik Lysis Mix nie będzie wtedy działał z maksymalną wydajnością. 4. Inkubować 30 min w temp. 30 C, mieszając co 8-10 min przez odwracanie. 5. Po inkubacji wirować próbkę 2 8 min przy 1000 x g. 6. Ostrożnie usunąć supernatant pipetą. Zwrócić szczególną uwagę, aby nie naruszyć osadu sferoplastów. 7. Osad dokładnie zawiesić w 300 μl YL Buffer. 8. Dodać 10 μl Proteinase K i wymieszać przez worteksowanie. 9. Inkubować 10 min w temp. 55 C. 10. Dodać 350 μl YB Buffer i dokładnie wymieszać. 11. Inkubować kolejne 5 min w temp. 55 C. 12. Po inkubacji próbkę intensywnie worteksować przez 15 s. 13. Wirować 120 s przy 11 000 15 000 x g. 14. Nie naruszając osadu delikatnie przenieść supernatant do minikolumny ze złożem (DNA Purification Column), umieszczonej w probówce odbierającej (Collection Tube) i wirować 60 s przy 11 000 15 000 x g. www.blirt.eu 8
Nr kat. EM10 15. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej (2 ml). 16. Dodać do minikolumny 600 μl buforu płuczącego YW Buffer i wirować 30 s przy 11 000 15 000 x g. 17. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej ponownie minikolumnę. 18. Dodać do minikolumny 400 μl YW Buffer i wirować 30 s przy 11 000 15 000 x g. 19. Wyjąć minikolumnę, wylać przesącz i umieścić ponownie minikolumnę w probówce odbierającej. 20. Wirować 60 120 s przy 15 000 21 000 x g. c Bufor płuczący zawiera alkohol, który może powodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji. 21. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej i umieścić ją w jałowej probówce 1.5 ml typu Eppendorf. 22. Nanieść 50-100 μl Elution Buffer centralnie na złoże w minikolumnie. c Możliwa jest zmiana objętości buforu elucyjnego w zakresie 20-200 μl. Więcej wskazówek dotyczących tego etapu znajduje się w sekcji VIII. Szczególne zalecenia i uwagi. 23. Inkubować minikolumnę z buforem przez 120 s. 24. Wirować 60 s przy 15 000 21 000 x g. 25. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane DNA przechowywać w temperaturze +4 C lub -20 C w zależności od dalszych analiz. 9
VII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM Proteinase K Niebezpieczeństwo H315, H319, H334, H335 P261, P271, P304+P340, P342+P311 YB Buffer Niebezpieczeństwo H315, H318, H412 P264, P280, P305+P351+P338 P310 YW Buffer Niebezpieczeństwo H225, H319, H336 P210, P261, P305+P351+P338, P304+P340 P312 H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H315 Działa drażniąco na skórę. H318 Powoduje poważne uszkodzenie oczu. H319 Działa drażniąco na oczy. H334 Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. H412 Działa szkodliwie na organizmy wodne, powodując długotrwałe skutki. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, źródeł iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Nie palić. P261 Unikać wdychania pyłu/dymu/gazu/mgły/par/rozpylonej cieczy. P264 Dokładnie umyć ręce po użyciu. P271 Stosować wyłącznie na zewnątrz lub w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. P280 Stosować rękawice ochronne/odzież ochronną/ochronę oczu/ochronę twarzy. P305+P351+P338 P310 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. Natychmiast skontaktować się z ośrodkiem zatruć lub lekarzem. P342+P311 W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu oddechowego: Skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub z lekarzem. P312 W przypadku złego samopoczucia skontaktować się z ośrodkiem zatruć lub lekarzem. P304+P340 W przypadku dostania się do dróg oddechowych: Wyprowadzić lub wynieść poszkodowanego na świeże powietrze i zapewnić warunki do odpoczynku w pozycji umożliwiającej swobodne oddychanie. www.blirt.eu 10
11 Nr kat. EM10
www.blirt.eu