PL 212748 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 212748 (21) Numer zgłoszenia: 388681 (22) Data zgłoszenia: 30.07.2009 (13) B1 (51) Int.Cl. C12Q 1/68 (2006.01) A61P 35/04 (2006.01) C07H 21/02 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01) Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Sposób określania ryzyka odległego nawrotu niedrobnokomórkowego raka płuca u chorych w stopniu I-IIIA zaawansowania leczonych chirurgicznie (43) Zgłoszenie ogłoszono: 31.01.2011 BUP 03/11 (73) Uprawniony z patentu: GDAŃSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY, Gdańsk, PL SKRZYPSKI MARCIN, Sopot, PL JASSEM JACEK, Gdańsk, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.11.2012 WUP 11/12 (72) Twórca(y) wynalazku: MARCIN SKRZYPSKI, Sopot, PL JACEK JASSEM, Gdańsk, PL
2 PL 212 748 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób określania ryzyka odległego nawrotu niedrobn o- komórkowego raka płuca u chorych w stopniu I-IIIA zaawansowania leczonych chirurgicznie polegający na pomiarze ekspresji mikrorna z listy w wycinkach z guza pierwotnego niedrobnokomórkowego raka płuca. W większości rozwiniętych krajów rak płuca jest najczęstszą przyczyną zgonów z powodu nowotworów. Rocznie w Polsce notuje się około 20 000 zachorowań na raka płuca, przy czym 80% przypadków stanowi rak niedrobnokomórkowy (ndrp). W Polsce najczęstszą postacią ndrp jest rak płaskonabłonkowy, a następnie kolejno rak gruczołowy i wielkokomórkowy. Leczeniem z wyboru ndrp jest radykalny zabieg operacyjny, jednak odległe wyniki są niezadowalające - jedynie 30-40% ogółu operowanych chorych przeżywa 5 lat. Przyczyną niepowodzenia chirurgicznego leczenia jest najczęściej uogólnienie procesu now o- tworowego. W dwóch metaanalizach badań klinicznych z losowym doborem chorych wykazano, że pooperacyjna chemioterapia z udziałem pochodnych platyny pozwala uzyskać około pięcioprocentową poprawę wieloletnich przeżyć. W polskich warunkach oznacza to potencjalnie około 150 dodatkowo uratowanych chorych rocznie. Zastosowanie uzupełniającej chemioterapii u wszystkich chorych poddanych doszczętnej resekcji płucnej oznacza jednak, że około 3000 z nich otrzymałoby to toksyczne i kosztowne leczenie bez żadnej korzyści. Obecnie głównym, jeśli nie jedynym onkologicznym kryterium kwalifikacji do pooperacyjnej chemioterapii jest stopień zaawansowania nowotworu określony na podstawie pooperacyjnego b a- dania usuniętych tkanek. Wyniki badan klinicznych z losowym doborem chorych oraz ich metaanal i- zy wskazują, że korzyść kliniczna związana z chemioterapią dotyczy chorych w stopniu II i IIIA. Zaledwie pięcioprocentowy zysk terapeutyczny wskazuje jednak, że większość leczonych chorych nie uzyskuje takiej korzyści. Równocześnie wśród chorych w I stopniu zaawansowania, którzy obecnie nie są kwalifikowani do pooperacyjnej chemioterapii udział niepowodzeń leczenia sięga 30-40%. W tej sytuacji konieczne jest opracowanie innych wskaźników ryzyka, które pozwolą na bardziej racjonalny dobór chorych do systemowego leczenia w uzupełnieniu zabiegu operacyjnego. Wyniki chirurgicznego leczenia raka płuca w poszczególnych przypadkach są trudne do przewidzenia. U chorych w tym samym stopniu zaawansowania nowotworu ocenionym na podstawie badania histopatologicznego i o tych samych konwencjonalnych" czynnikach rokown i- czych, takich jak postać histologiczna nowotworu i stopień jego zróżnicowania, wiek, płeć, czy stan sprawności, występują duże różnice w odniesieniu do ryzyka miejscowej wznowy i tworzenia odległych przerzutów. Wyniki badań ostatnich lat wskazują, że istnieje możliwość określenia indywi dualnego ryzyka nawrotu na podstawie oceny profilu ekspresji genów (mrna) w wycinkach z nowotworu Bhattacharjee A, Richards WG, Staunton J et al. Classification of human Iung carcinomas by mrna expression profiling reveals distinct adenocarcinoma subclasses. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 13790-13795. Szczególnie przydatnym molekularnym testem rokowniczym jest analiza ekspresji metodą reakcji odwrotnej transkryptazy wraz z metodą ilościowej łańcuchowej reakcji pol i- merazy (RT-PCR). Z publikacji Endoh H, Tomida S, Yatabe Y et al. Prognostic model of pulmonary adenocarcinoma by expression profiling of eight genes as determined by quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction. J Clin Oncol 2004; 22: 811-819 znana jest technika umożliwiające ilościowe badanie ekspresji mrna w komórkach guza. Wyniki znanych badań wykorzystujących te techniki mogą ostatecznie doprowadzić do mod y- fikacji histologicznej klasyfikacji i zaawansowania raka płuca o dodatkowe kryteria molekularne. Z publikacji Skrzypski M, Jassem E. Taron M et al. Three-gene expression signature predicts survival in early-stage squamous cell carcinoma of the lung. Clin Cancer Res 2008; 14: 4794-4799 znany jest rokowniczy profil ekspresji genów dotyczący płaskonabłonkowego raka płuca. Równolegle do prac nad rokowniczym znaczeniem profili ekspresji genów (mrna), w osta t- nich latach prowadzono badania nad ekspresją cząstek mikrorna, które są kluczowymi molekula r- nymi regulatorami wielu procesów, w tym embriogenezy, proliferacji i różnicowania komórek, apoptozy i onkogenezy, co zostało przedstawione w Erson AE, Petty EM: MicroRNAs in development and disease. Clin. Genetics 2008; 74: 296-306.
PL 212 748 B1 3 MikroRNA są krótkimi łańcuchami RNA (19-23 nukleotydów), które pełnią regulacyjną rolę w procesie transkrypcji i translacji. MikroRNA między innymi łączą się z łańcuchami mrna w ich częściach niekodujących i blokują translację w kompleksach rybosomalnych. Z uwagi na niepełną komplementarność pomiędzy odpowiednimi sekwencjami tarczowymi, jedna cząstka mikrorna może kontrolować ekspresję setek, a nawet tysięcy mrna. Obecnie prowadzone są badania nad wykorzystaniem cząstek mikrorna jako podstawy molekularnych testów rokowniczych w wielu nowotworach. W publikacji Yu SL, Chen HY, Chang GC et al. MicroRNA signature predicts survival and relapse in lung cancer. Cancer Cell 2008; 13: 48-57 został ujawniony profil ekspresji 5 mikrorna związany z rokowaniem chorych w stopniu I-IIIA. Z informacji zawartych w publikacjach znane są zatem sposoby określania ryzyka odległego nawrotu niedrobnokomórkowego raka płuca u chorych w stopniu I-IIIA zaawansowania leczonych chirurgicznie polegające na tym, z tkanki guza pobiera się wycinek, z którego izoluje się RNA, które w reakcji odwrotnej transkryptazy przepisuje się na łańcuch komplementarnego DNA. Metodą il o- ściowej łańcuchowej reakcji polimerazy określa się ilość mrna lub mikrorna w badanym wycinku, zaś wynik ekspresji jest odnoszony do wartości referencyjnej w modelu przewidywania ryzyka odległego nawrotu, w którym wartości ekspresji danego genu są skorelowane z wysokim ryzykiem odl e- głego nawrotu. Sposób określania ryzyka odległego nawrotu niedrobnokomórkowego raka płuca u chorych w stopniu I-IIIA zaawansowania leczonych chirurgicznie charakteryzuje się według wynalazku tym, że mierzy się ekspresję przynajmniej jednego z dwudziestu dwóch mikrorna, z listy przedstawionej w poniższej tabeli 1, w wycinkach z guza pierwotnego niedrobnokomórkowego raka płuca.
4 PL 212 748 B1 W odmianie wynalazku ryzyko odległego nawrotu określa się na podstawie wskaźnika ryzyka RS, który stanowi sumę wpływu rokowniczego co najmniej dwóch mikro RNA, według następującego ogólnego wzoru: RS= mikro RNA A + mikro RNA B +... + mikro RNA Z gdzie mikro RNA A... Z oznacza częściowe ryzyko. w którym, wartość wskaźnika ryzyka RS jest obliczana poprzez dodanie wartości częściowego ryzyka na podstawie wyniku ekspresji poszczególnych mikrorna A... Z wchodzących w skład danego indeksu ryzyka. Wynik ekspresji danego mikrorna odnosi się do wartości referencyjnych z modelu przewidywania ryzyka nawrotu, w którym dla wartości wysokiego ryzyka przyjmuje się wartość liczbową, korzystnie 1, a dla wartości niskiego ryzyka przyjmuję się wartość liczbową niższą od wartości wysokiego ryzyka, korzystnie 0. W innej odmianie wynalazku ryzyko odległego nawrotu określa się na podstawie wskaźników ryzyka RS, które stanowią średnią ważoną wpływu rokowniczego co najmniej dwóch mikro RNA, według następującego ogólnego wzoru: RS = [wsp. β dla mikrorna A * {ekspresja mikrorna A}] + [wsp. β dla mikrorna B * {ekspresja mikrorna B}] + + [wsp. β dla mikrorna Z * {ekspresja mikrorna Z}] gdzie wsp. β dla mikrorna A... Z - współczynnik regresji z modelu wieloczynnikowego dla danego mikrorna A. mikrorna A... Z oznacza znormalizowaną wartość ekspresji według transformacji z - score. Korzystnie ryzyko odległego nawrotu określa się stosując pakiet, który zawiera przynajmniej jeden zestaw primerów, z których przynajmniej jeden hybrydyzuje z częścią sekwencji badanego mikro RNA z listy 22 umożliwiających przeprowadzenie reakcji odwrotnej transkryptazy i ilościowej łańcuchowej reakcji polimerazy, a także korzystnie zawiera takie odczynniki jak: bufory, enzymy i ewentualnie inne składniki do prowadzenia reakcji odwrotnej transkryptazy i ilościowej łańcuchowej reakcji polimerazy. Dzięki wykorzystaniu wynalazku określenie indywidualnego ryzyka nawrotu nowotworu metodami molekularnymi jest istotnym elementem w kwalifikacji chorych do uzupełniającej chemioterapii lub uzupełniającego leczenia ukierunkowanego molekularnie. Do takiego leczenia kwalifikowani są wyłącznie chorzy z wysokim ryzykiem odległego nawrotu nowotworu, podczas gdy chorzy z niskim ryzykiem mogą być leczeni wyłącznie chirurgicznie. W efekcie następuje poprawa wyników leczenia
PL 212 748 B1 5 wczesnego niedrobnokomórkowego raka płuca przy jednoczesnym zmniejszeniu jego toksyczności oraz kosztów. Wynalazek objaśniony jest bliżej w przykładach wykonania. P r z y k ł a d 1 Z tkanki guza izolowane jest całkowite RNA zawierające frakcję mikro RNA z listy przestawionej w poniższej tabeli. W poniższym zastosowaniu izolowano RNA zestawem do izolacji firmy mirneasy Mini Kit (50) (Qiagen) nr kat. 217004. Określenie stężenia i jakości RNA w próbkach z jednoczesną oceną jakości RNA przy użyciu RNA Lab Chip (Bianalyzer Agilent 2100)
6 PL 212 748 B1 Następnie mikro RNA w reakcji odwrotnej transkryptazy zostało przepisywane na łańcuch komplementarnego DNA. Przepisanie RNA na DNA (TaqMan MicroRNA RT kit 4366596 - AppliedBiosystems) z zastosowaniem zestawu specyficznych primerów (MegaPlex RT nr Kat 4401091 AppliedBiosystems). Reakcję tą prowadzono zgodnie z zaleceniami producenta. Analiza ilości kopii mikrorna w próbkach z cdna (powstałych w wyniku reakcji RT) metodą ilościowej PCR z wykorzystaniem odpowiednio zaprojektowanych fluorescencyjnych sond TaqMan, primerów oraz polimerazy z aktywnością nukleazy 5. Reakcje prowadzono w systemie kart mikrocieczowych TLDA (TaqMan Low Density Arrays -Part Nuber 4400238 AppliedBiosystems) w cyklerze HT 7900 (Applied Biosystems) zgodnie z warunkami zalecanymi przez producenta - AppliedBiosystems. Analiza surowych wyników ekspresji za pomocą oprogramowania SDS.2.1 (AppliedBiosysytems) zaś wynik ekspresji poszczególnych mikro RNA jest normalizowany względem ekspresji wybranego mikrorna normalizacyjnego. Wynik ekspresji każdego z wymienionych mikro RNA jest odnoszony do wartości referencyjnej w modelu przewidywania ryzyka odległego nawrotu (odległych przerzutów), w którym pewne wartości ekspresji danego genu są skorelowane z wysokim ryzykiem odległego nawrotu (odległych przerzutów). Stwierdzenie, że ekspresja danego mikro RNA odpowiada tym wartościom wskazuje ma wysokie ryzyko nawrotu. Przykładowo do zobrazowania znaczenia dla przewidywania odległego nawrotu wykreślono krzywe przeżycia dla mikro RNA 221 o sekwencji AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUU. Różnica pomiędzy czasem wolnym od odległego nawrotu pomiędzy chorymi z wartościami ekspresji poniżej i powyżej wartości referencyjnej (wartość 40-stego percentyla ekspresji mikro RNA 221 dla całej grupy chorych) była znamienna (p=0,03). Przykładowo do zobrazowania znaczenia dla przewidywania odległego nawrotu wykreślono krzywe przeżycia dla mikro RNA 10b o sekwencji UACCCUGUAGAACCGAAUUUGU
PL 212 748 B1 7 Różnica pomiędzy czasem wolnym od odległego nawrotu pomiędzy chorymi z wartościami ekspresji poniżej i powyżej wartości referencyjnej (wartość 40-stego percentyla ekspresji mikro RNA 10b dla całej grupy chorych) była znamienna (p=0,001). Niska ekspresja RNA 10b jest związana z wysokim ryzykiem nawrotu odległego nowotworu po zabiegu operacyjnych u chorych na ndrp.
8 PL 212 748 B1 Różnica pomiędzy czasem wolnym od odległego nawrotu pomiędzy chorymi z wartościami ekspresji poniżej i powyżej wartości referencyjnej (wartość 40-stego percentyla ekspresji mikro RNA 192* dla całej grupy chorych) była znamienna (p=0,03). Wysoka ekspresja mikro RNA 192* jest związana z wysokim ryzykiem nawrotu odległego nowotworu po zabiegu operacyjnych u chorych na ndrp. Stwierdzenie wysokich wartości ekspresji (np. wyższych niż wartość mediany ekspresji w grupie wszystkich operowanych chorych na ndrp) dla następujących mikro RNA: 92a,192* i 622 jest związana z wysokim ryzykiem odległego nawrotu (odległych przerzutów) oraz że stwierdzenie niskich wartości ekspresji (np. niższych niż wartość mediany ekspresji w grupie wszystkich operowanych chorych na ndrp) mikro RNA: 10b, 10b *, 10a, 23a, 101, 103, 149, 221, 222, 340, 508, 519e, 532_3p, 532_5p, 622, 654, 660, 874 i 885-5p. Wartość referencyjna ustalona na poziomie mediany ekspresji w żadnym stopniu nie ogranicza zastrzeżenia patentowego - wartość referencyjna może być zmieniona na podstawie analizy szerszego materiału tkankowego od chorych na ndrp, w miarę rozwoju wynalazku. P r z y k ł a d 2 Postępuje się jak w przykładzie 1, z tym, że z listy 22 mikro RNA wybrano następujące mikro RNA do utworzenia wskaźnika ryzyka: hsa-mir-532-5p-4380928 hsa-mir-92a-1*-4395248 hsa-mir-192*-4395383 hsa-mir-10b-4395329 Wskaźnik ryzyka ustala się z wzoru: RS= mikro RNA 532-5p + mikro RNA 92a + mikro RNA 192* + mikro RNA 10b Przyjmuje się, że mikro RNA = 1 jeśli ekspresja dla danego mikro RNA zgodnie z modelem wskazuje na wysokie ryzyko oraz, że mikro RNA = 0 jeśli ekspresja dla danego mikro RNA zgodnie z modelem wskazuje na niskie ryzyko. Dla każdego chorego oblicza się wskaźnik ryzyka. Następnie wykreśla się krzywe przeżycia wolnego od odległego nawrotu dla grupy chorych z wartościami wskaźnika ryzyka większego od wartości referencyjnej (powyżej wartości 60-tego percentyla RS w całej grupie) oraz w grupie chorych z wartościami indeksu ryzyka poniżej wartości referencyjnej (poniżej wartości 60-tego percentyla w całej grupie). Prawdopodobieństwo przeżycia wolnego o odległego nawrotu porównuje się pomiędzy tymi dwiema grupami.
PL 212 748 B1 9 P r z y k ł a d 3 Postępuje się jak w przykładzie 1, z tym się wybrano następujące mikro RNA do utworzenia wskaźnika ryzyka: hsa-mir-101*-4395254 hsa-mir-532-5p-4380928 hsa-mir-222-4395387 hsa-mir-192**4395383 hsa-mir-10b-4395329 Dla każdego chorego ustala się wskaźnik ryzyka według zależności: RS = (-2,7*MiR101)+(-0,6*MiR222)+(-1,2*MiR532-3p)+(0,78*MiR192)+ (-2*MiR10b) Następnie wykreśla się krzywe przeżycia wolnego od odległego nawrotu dla grupy chorych z wartościami wskaźnika ryzyka większego od wartości referencyjnej (powyżej wartości 60-tego percentyla RS w całej grupie) oraz w grupie chorych z wartościami indeksu ryzyka poniżej wartości referencyjnej (poniżej wartości 60-tego percentyla w całej grupie). Prawdopodobieństwo przeżycia wolnego o odległego nawrotu porównuje się między tymi dwiema grupami. P r z y k ł a d 4 Postępuje się jak w przykładzie 1, 2 i 3, z tym że do badania wykorzystuje się pakiet, który zawiera zestaw primerów, z których jeden hybrydyzuje z częścią sekwencji badanego mikro RNA umożliwiających przeprowadzenie reakcji odwrotnej transkryptazy i ilościowej łańcuchowej reakcji polimerazy. Zestaw primerów składa się z dwu krótkich kwasów polinukleinowych, z których przynajmniej jeden jest komplementarny w stosunku do sekwencji badanego mikrorna. W skład zestawu wchodzą bufory, enzymy odwrotna transkryptazy oraz polimeraza
10 PL 212 748 B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób określania ryzyka odległego nawrotu niedrobnokomórkowego raka płuca u chorych w stopniu I-IIIA zaawansowania leczonych chirurgicznie, polegający na tym, że z tkanki guza pobiera się wycinek, z którego izoluje się co najmniej jedno mikrorna, które w reakcji odwrotnej transkryptazy przepisuje się na łańcuch komplementarnego DNA, po czym metodą ilościowej łańcuchowej reakcji polimerazy określa się ilość mikrorna w badanym wycinku, zaś wynik ekspresji każdego mikrorna jest odnoszony do wartości referencyjnej w modelu przewidywania ryzyka odległego nawrotu, w którym wartości ekspresji danego genu są skorelowane z wysokim ryzykiem odległego nawrotu, znamienny tym, że mierzy się ekspresję przynajmniej jednego z dwudziestu dwóch mikrorna przedstawionych w tabeli 1, w wycinkach z guza pierwotnego niedrobnokomórkowego raka płuca 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ryzyko odległego nawrotu określa się na podstawie wskaźnika ryzyka (relapse score, RS), który stanowi sumę wpływu rokowniczego co najmniej dwóch mikro RNA, według następującego ogólnego wzoru: RS= mikro RNA A + mikro RNA B +... + mikro RNA Z w którym dla wartości wysokiego ryzyka przyjmuje się stałą wartość liczbową, korzystnie O, a dla wartości niskiego ryzyka przyjmuje się stałą wartość liczbową wyższą od wartości wysokiego ryzyka, korzystnie 1. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ryzyko odległego nawrotu określa się na podstawie wskaźników ryzyka RS, które stanowią średnią ważoną wpływu rokowniczego, co najmniej dwóch mikrorna, według następującego ogólnego wzoru: RS = [wsp. β gena * {ekspresja genu A}] + [wsp. β gen B * {ekspresja genu B}] +...+ [wsp. β gen Z * {ekspresja genu Z}] w którym, wsp. β gen - współczynnik regresji z modelu wieloczynnikowego dla danego genu - znormalizowana wartość ekspresji według transformacji z-score. 4. Sposób według zastrz. 1-4, znamienny tym, że stosuje się pakiet, który zawiera zestaw primerów, z których przynajmniej jeden hybrydyzuje z częścią sekwencji badanego mikrorna, umożliwiając przeprowadzenie reakcji odwrotnej transkryptazy i ilościowej łańcuchowej reakcji polimerazy, a także korzystnie zawiera takie odczynniki jak: bufory, enzymy i ewentualnie inne składniki do prowadzenia reakcji odwrotnej transkryptazy i ilościowej łańcuchowej reakcji polimerazy. Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)