PL B1. Sposób wykrywania i różnicowania chorób należących do grupy hemoglobinopatii, zwłaszcza talasemii

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12Q 1/68 ( ) A61P 7/00 ( ) C12N 15/10 ( ) (54) Sposób wykrywania i różnicowania chorób należących do grupy hemoglobinopatii, zwłaszcza talasemii (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 12/08 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 06/11 (73) Uprawniony z patentu: INSTYTUT BIOCHEMII I BIOFIZYKI POLSKA AKADEMIA NAUK, Warszawa, PL (72) Twórca(y) wynalazku: MONIKA MACIĄG, Warszawa, PL BEATA BURZYŃSKA, Warszawa, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Iwona Brodowska PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania i różnicowania hemoglobinopatii, chorób należących do grupy chorób genetycznych, polegających na zaburzonej syntezie łańcuchów globiny w hemoglobinie. Stan techniki Talasemie są zróżnicowaną grupą chorób genetycznych, charakteryzujących się zredukowaną syntezą jednego bądź więcej łańcuchów białek globinowych, które tworzą wiążącą tlen cząsteczkę hemoglobiny w krwinkach czerwonych. U zdrowych dorosłych osób ekspresja genów globinowych jest zbilansowana. Syndromy talasemii klasyfikowane są według typu globiny, która syntetyzowana jest nieprawidłowo. Główne kategorie talasemii to: - α-talasemie (nieprawidłowa synteza łańcuchów α) - β-talasemie wraz z δβ-talasemiami (nieprawidłowa synteza łańcucha β lub łańcuchów δ plus β). Znane jest ponad 80 mutacji powodujących alpha-talasemie. Większość z nich to delecje, usuwające kilka lub wszystkie geny z clusteru α-globinowego. Znanych jest około 40 mutacji punktowych, głównie w genie α2, natomiast około połowa tych mutacji wpływa na składanie i translację RNA. Znane jest ponad 200 mutacji w genie β-globiny. Są to zwykle mutacje punktowe: pojedyncze substytucje lub delecje i insercje dotyczące kilku nukleotydów. Ze względu na objawy kliniczne Beta- Talasemie dzieli się na: - Talasemie major (transfuzjo-zależne) - Talasemie intermedia (o bardzo zróżnicowanych objawach) - Talasemie minor (często bezobjawowe). Dotychczas panowała opinia, że w populacji polskiej nie występują przypadki beta i alfa talasemii. Nasze badania genetyczne dowiodły, że hemoglobinopatie występują również w naszej szerokości geograficznej. Są to beta- talasemie intermedia i minor oraz łagodniejsze typy alfa-talasemii. Dotychczasowa diagnostyka Diagnostyka talasemii jest niezmiernie trudna, ponieważ charakteryzuje się dużą różnorodnością objawów klinicznych: od przypadków wymagających systematycznych przetoczeń krwi do przypadków bezobjawowych. W patofizjologii talasemii zaburzony jest stosunek poziomów mrna genów globinowych, co w konsekwencji powoduje niezbilansowanie łańcuchów peptydowych. Nadmiar łańcucha alpha występuje w beta-talasemiach a nadmiar łańcucha beta jest charakterystyczny dla alpha-talasemii. Występuje mikrocytoza, hemoliza krwinek czerwonych i zaburzona erytropoeza. W typowych talasemiach podwyższona jest liczba erytrocytów (RBC ), obniżony poziom hemoglobiny (HGB ), zmniejszona wielkość krwinki czerwonej (MCV ). Badania biochemiczne wykazują czasami podwyższony poziom hemoglobiny A 2 (HbA 2 ) i hemoglobiny płodowej (HbF ). Niestety, w wielu przypadkach hemoglobinopatii, na podstawie danych hematologicznych poszczególnych pacjentów, nie można postawić prawidłowego rozpoznania (Tabela 1). Brak jest dotychczas badania, które w sposób jednoznaczny potwierdzałoby, bądź wykluczało talasemie jako przyczynę niedokrwistości hemolitycznej. Diagnoza taka jest szalenie istotna dla chorych i ich prawidłowego leczenia, ponieważ talasemie imitują niedokrwistość z powodu niedoboru żelaza, i często są żelazem leczone. Dla chorych z talasemią jest to wybitnie niewskazane, gdyż na ogół, występuje u nich nadmiar żelaza w organizmie. T a b e l a 1. Dane hematologiczne pacjentów pacjent RBC (x1012/l) HGB (g/l) MVC (fl) β S B bd bd bd B B A2 F

3 PL B1 3 cd. tabeli B B B B B bd bd bd B B S S S S B B Nieoczekiwanie okazało się, że sposobem według wynalazku możliwe jest przeprowadzenie badania, które w sposób jednoznaczny potwierdzałoby, bądź wykluczało talasemie jako przyczynę niedokrwistości hemolitycznej, a także pozwalałoby na diagnostykę, czyli dokładne określenie rodzaju talasemii, na jaką choruje dany pacjent. Istota wynalazku Sposób wykrywania i różnicowania chorób należących do grupy hemoglobinopatii, zwłaszcza talasemii, z wykorzystaniem reakcji Real-time PCR, według wynalazku polega na tym, że izoluje się RNA z krwi pacjenta, następnie przeprowadza syntezę cdna, a następnie reakcje Real-time PCR z zastosowaniem dwóch par primerów o wzorze 1, wzorze 2, wzorze 3 i wzorze 4, bada się poziom ekspresji genów metodą RT-PCR, i analizuje relatywne zmiany w ekspresji poszczególnych genów, porównując poziom mrna danych genów u chorych relatywnie do poziomu mrna tych samych genów u osób zdrowych i normalizując w stosunku do poziomu mrna wybranych genów referencyjnych z uwzględnieniem różnic w wydajności amplifikacji poszczególnych genów. W sposobie według wynalazku, w metodzie RT-PCR, korzystnie stosuje się standardowe geny charakteryzujące się stabilnym poziomem ekspresji, zwłaszcza geny Tubb i HPRT1. W sposobie według wynalazku, w metodzie RT-PCR, korzystnie stosuje się jednakowy skład mieszaniny reakcyjnej dla genów kontrolnych (house-keeping) i dla badanych genów globinowych, a reakcje wykonuje się przy użyciu tych samych odczynników, z wyjątkiem primerów specyficznych dla poszczególnych genów. W sposobie według wynalazku możliwe jest również zastosowanie innych znanych genów charakteryzujących się stabilnym poziomem ekspresji zarówno w grupie zdrowych dawców i w grupie pacjentów, zwłaszcza geny Tubb i HPRT1. W sposobie według wynalazku, izolacje RNA i syntezę cdna przeprowadza się znanymi w biochemii, ogólnie dostępnymi metodami. W sposobie według wynalazku, zgłaszający zaproponował, wykorzystanie wyizolowanego z krwi chorego pacjenta RNA i zsyntetyzowanego na jego podstawie cdna do pomiaru poziomu ekspresji genów, metodą RT-PCR (Reakcja Łańcuchowa Polimerazy w Czasie Rzeczywistym), co nieoczekiwanie pozwoliło na dokładne diagnozowanie i zróżnicowanie chorób należących do grupy hemoglobinopatii, zwłaszcza talasemii. Poniżej przedstawiono przykład zastosowania metody według wynalazku. P r z y k ł a d 1. Izolowanie RNA z krwi pacjentów Krew pobierana jest do probówek PAXgene (PreAnalytiX) w ilości 2.5 ml. Ten sposób pobierania stabilizuje RNA i umożliwia transport w temperaturze pokojowej. Izolowanie materiału genetycznego następuje w przeciągu 48 godzin od pobrania.

4 4 PL B1 Izolowanie RNA przeprowadzane jest przy użyciu PAX gene Blond RNA Kit (PreAnalytiX), według zaleceń producenta. 2. Synteza cdna Do syntezy cdna używane jest 0.8 μg RNA. Synteza cdna przeprowadzona jest odczynnikami firmy Qiagen - QuantiTect Reverse Transcription, według procedury zalecanej przez producenta, z modyfikacją polegającą na wydłużeniu czasu inkubacji w temperaturze 42 C do 30 min. Powoduje to całkowite usunięcie genomowego DNA z próbki. Otrzymane cdna jest rozcieńczenie 5X w ddh 2 O. 3. Poziom ekspresji genów referencyjnych, mierzony metodą RT-PCR. Jako standard zaproponowano użycie genów: Tubb i HPRT1. Geny te charakteryzują się stabilnym poziomem ekspresji zarówno w grupie zdrowych dawców i w grupie pacjentów. Skład mieszaniny reakcyjnej był jednakowy dla genów kontrolnych (housekeeping) i dla badanych genów globinowych. Reakcje wykonywane są przy użyciu odczynników LightCycler FastStart DNA Master SYBR GreenI (Roche) i na aparacie LightCycler 1.5 (Roche). W skład mieszaniny reakcyjnej wchodzą: 1 μl cdna 1 μl Starter Forward 1 μl Starter Reverse 1 μl SybrGreen (dntp-y, enzym, bufor, SybrGreen- barwnik fluorescencyjny) 1.6 μl 25mM MgCI μl H 2 O Z każdego cdna (2 powtórzenia) przeprowadzano właściwe reakcje real-time PCR w 2 powtórzeniach (w sumie 4 powtórzenia dla jednego cdna). W pierwszej kolejności wykonano reakcje real- -time PCR dla grupy kontrolnej (10 zdrowych osobników), a następnie u poszczególnych pacjentów. Sekwencje primerów i warunki reakcji przedstawiono w Tabeli 2. Nazwa genu T a b e l a 2. Sekwencje primerów i warunki reakcji RT-PCR genów referencyjnych Fragment (bp) Tubb cttcaagcgcatctcgg agc3 5 tgcggtggcatcctggt act3 HPRT tgctgacctgctggatt aca3 5 gcttgcgaccttgacca tct3 Warunki reakcji (temperatura/czas) Sekwencja primerów Denaturacja Przyłączanie Wydłużanie Dodatkowy cykl 95 /10s 61 /1s 72 /5s 85 /5s 95 /10s 60 /1s 72 /5s 77 /s 4. Poziom ekspresji genów kodujących białka globinowe, mierzony metodą RT-PCR. Poziom ekspresji genów kodujących alpha i beta globinę, bada się w analogicznej reakcji jak dla genów kontrolnych, stosując startery homologiczne do danych genów i zmieniając warunki reakcji (Tabela 3). T a b e l a 3. Sekwencje primerów i warunki reakcji RT-PCR genów kodujących alfa i beta - globinę Nazwa genu Globina Alfa Globina Beta Fragment (bp) Warunki reakcji (temperatura/czas) Sekwencja primerów Denaturacja Przyłączanie Wydłużanie Dodatkowy cykl tggccgacgccctgaccaa 5 tcagcacggtgctcacaga caagggcacctttgccaca 5 ggcagaatccagtgcataag 95 /10s 63 /1s 72 /5s 88 /5s 95 /10s 63 /1s 72 /8s 86 /5s 5. Szacowanie poziomu transkrypcji genów alfa i beta globiny. Do analizy relatywnych zmian w ekspresji poszczególnych genów zastosowano model Pfaffl, w którym poziom mrna danych genów u chorych jest szacowany relatywnie do poziomu mrna tych

5 PL B1 5 samych genów u osób zdrowych i normalizowany w stosunku do poziomu mrna wybranych genów referencyjnych z uwzględnieniem różnic w wydajności amplifikacji poszczególnych genów. Relatywną ilość mrna genów kodujących białka globinowe, szacuje się przy pomocy następującego wzoru (Pfaffl, 2002): R ΔCPt arg et( MEAN control MEAN sample) ( Et arg et ) ΔC ef ( MEAN control MEAN sample) ( E ) = Pr ref gdzie: R- relatywny poziom ekspresji badanego genu E target - wydajność reakcji dla genu badanego E ref - wydajność rekcji genów kontrolnych CPtarget - różnica wartości crossing point" między próbką kontrolną a próbką pacjenta w badanych genach CPcontrol - różnica wartości crossing point" między próbką kontrolną a próbką badaną w genach kontrolnych. Wydajność reakcji dla badanych genów została oszacowana na podstawie krzywej wydajności (reakcje przeprowadzone przy różnych stężeniach cdna) i wynosi: GenTubb: 1.77 Gen HPRT1: 1.73 Gen alfa-globina: 1.77 Gen beta-globina: 1.85 Podsumowanie uzyskanych wyników Badania przeprowadzono na grupie 10 zdrowych osób i 18 pacjentów z talasemiami, potwierdzonymi badaniami DNA. Poziomy ekspresji w grupie zdrowych osób były wyrównane, zarówno dla genów kontrolnych jak i genów globinowych. W grupie pacjentów poziomy ekspresji genów kontrolnych kształtowały się na tym samym poziomie, co w grupie zdrowych dawców i były bardzo wyrównane. Natomiast poziomy ekspresji genów alfa i beta -globiny były bardzo zróżnicowane, jak pokazano na fig. 1 i fig. 2. Dokładne pomiary poziomów ekspresji genów globinowych w grupie pacjentów wykazały istnienie następujących zależności: 1. W przypadku pacjentów z mutacjami powodującymi zaburzenia transkrypcyjne i/lub wpływającymi na stabilność, składanie czy ilość mrna genu β-globiny, charakterystyczny jest zaburzony stosunek α/β, spowodowany nadprodukcją α-globiny (Tabela 4). T a b e l a 4. Poziomy ekspresji u pacjentów z mutacjami transkrypcyjnymi Pacjent alfa beta alfa-beta Zmiany genetyczne 20β UTR + 33(C>T) + IVS-I-15T>C 45S UTR + 33(C>T) + IVS-II-745C>G 50B UTR + 33(C>T) + IVS-II-745C>G 60B UTR + 33(C>T) 1B IVS-I-1 G>A 58B IVS-I-1 G>A 80B IVS-I-5 G>A 41B IVS-I-6 G>A homozygota 43B IVS-I-6 G>A 64B IVS-I-6 G>A 62B UTR - 2 substitutions 84B UTR - 1 substitution

6 6 PL B1 2. Pacjenci z mutacjami strukturalnymi β-globiny, powodującymi produkcję białka o nieprawidłowej strukturze, wykazują podwyższony poziom ekspresji genów α-globiny i β-globiny przy prawidłowym stosunku ilościowym 1:1 (Tabela 5) T a b e l a 5. Poziomy ekspresji u pacjentów z mutacjami strukturalnymi Pacjent alfa beta Zmiany genetyczne 50S codon 98 GTG>ATG Hb Köln 110S Phe 42 deletion 3. Pacjenci z delecjami obejmującymi geny α-globiny, wykazują zaburzony stosunek α/β, nadprodukcja β-globiny (Tabela 6). T a b e l a 6. Poziomy ekspresji u pacjentów z delecjami w obrębie genu alfa-globiny Pacjent alfa beta alfa/beta Zmiany genetyczna 30S α3.7/-α S α3.7/-α3.7 35B α3.7/αα 46B α4.2/-α4.2 Końcowe wnioski 1. Przeprowadzane badania potwierdzają istnienie korelacji między poziomami ekspresji genów globinowych a podłożem genetycznym hemoglobinopatii. 2. Na podstawie badań poziomów ekspresji, można potwierdzić bądź wykluczyć hemoglobinopatię jako przyczynę niedokrwistości hemolitycznej. 3. Otrzymane wyniki umożliwiają określenie charakteru schorzenia, co może być pomocne w dalszym leczeniu i poradnictwie genetycznym. 4. Żadna z dotychczasowo stosowanych metod nie daje takich możliwości. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wykrywania i różnicowania chorób genetycznych należących do grupy hemoglobinopatii, zwłaszcza talasemii, z wykorzystaniem reakcji Real-time PCR, znamienny tym, że izoluje się RNA z krwi pacjenta, następnie przeprowadza syntezę cdna, a następnie reakcje Real-time PCR z zastosowaniem dwóch par primerów o wzorze 1, wzorze 2, wzorze 3 i wzorze 4, bada się poziom ekspresji genów metodą RT-PCR i analizuje relatywne zmiany w ekspresji poszczególnych genów, porównując poziom mrna danych genów u chorych relatywnie do poziomu mrna tych samych genów u osób zdrowych i normalizując w stosunku do poziomu mrna wybranych genów referencyjnych z uwzględnieniem różnic w wydajności amplifikacji poszczególnych genów. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w metodzie RT-PCR, stosuje się standardowe geny charakteryzujące się stabilnym poziomem ekspresji zarówno w grupie zdrowych dawców i w grupie pacjentów, zwłaszcza geny Tubb i HPRT1. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w metodzie RT-PCR, stosuje się jednakowy skład mieszaniny reakcyjnej dla genów kontrolnych (housekeeping) i dla badanych genów globinowych, a reakcje wykonuje się przy użyciu tych samych odczynników.

7 PL B1 7 tubb F - 5 cttcaagcgcatctcggagc3 tubb R - 5 tgcggtggcatcctggtact3 wzór 1 HP F - 5 tgctgacctgctggattaca3 HP R - 5 gcttgcgaccttgaccatct3 wzór 2 Alfa F - 5 tggccgacgccctgaccaa Alfa R - 5 tcagcacggtgctcacaga wzór 3 Beta F - 5 caagggcacctttgccaca Beta R - 5 ggcagaatccagtgcataag wzór 4

8 8 PL B1 Rysunki Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)