MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: 189-194 Wpływ stymulacji wirusem odry na ekspresję receptorów Toll-like w komórkach PBMC Measles virus stimulation effect on the expression of Toll-like receptors in PBMC Agnieszka Częścik, Agnieszka Trzcińska, Milena Dunal-Szczepaniak, Joanna Siennicka Zakład Wirusologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny w Warszawie W pracy opisano wpływ stymulacji wirusem odry komórek PBMC izolowanych od zdrowych osób szczepionych przeciwko odrze (seropozytywnych i seronegatywnych), na ekspresję receptorów Toll-like. Oceniano ekspresje receptorów TLR2 i TLR4 w odpowiedzi na stymulację ligandami dla tych receptorów (Pam3CSK i LPS) a także w odpowiedzi na stymulację szczepem szczepionkowym (E) i dzikimi (W1 i W2) wirusa odry. Słowa kluczowe: receptory Toll-like, ekspresja, real-time RT-PCR ABSTRACT Introduction: Toll-like receptors (TLRs) are an important component of a innate immune system. Stimulation of TLRs, through action with helper T cells, could change Th1/Th2 balance and thus affect adaptive immune response. Receptors TLR2 and TLR4 play important role in immune response to measles virus. The aim of this work was stimulation of the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and determination of Toll-like gene expression in these cells. Methods: PBMCs from 20 healthy donors were stimulated with measles viruses and ligands for TLR2 and TLR4. For examinations the real time RT-PCR (QuantiFast Assay, Qiagen) was used. The expression of Toll-like receptors was determined on mrna level, using real- -time one step RT-PCR (QuantiFast Assay, Qiagen) with simultaneous detection of TLR2 and TLR4 genes and housekeeping gene (GAPDH). Results: Virus-specific influence of wild measles virus strains activity on PBMC derived from vaccinated seronegative individuals manifested in higher level of expression of TLR2 and TLR4 genes in compare to the expression of these genes in PBMC of seropositive individuals. Conclusions: Toll-like receptors participate in the development of immune response to measles virus.
190 A. Częścik i inni Nr 3-4 Key words: Toll-like receptors, expression, real-time RT-PCR WSTĘP Receptory Toll-like (TLR) zostały odkryte stosunkowo niedawno a po raz pierwszy opisane u muszki owocowej Drosophila, u której warunkują odpowiedź przeciwgrzybiczą. Struktury te są ważnym elementem reakcji odpornościowej, stanowią pomost pomiędzy odpowiedzią wrodzoną (innate response) a nabytą (adoptive response). Przy udziale TLRs rozpoznawane są pewne struktury charakterystyczne dla patogenów (PAMP pathogen associated molecular patterns). W odróżnieniu od odpowiedzi nabytej, związanie receptora nie pociąga za sobą uruchomienia procesów pamięci immunologicznej (5, 6). Pobudzenie receptorów TLR skutkuje między innymi indukcją syntezy cytokin i na tej drodze wpływa na modyfikację odpowiedzi nabytej. Dzieje się tak poprzez oddziaływanie na limfocyty pomocnicze i ukierunkowywanie ich bądź w stronę Th1 (przewagi cytotoksyczności), bądź Th2 (przewagi odpowiedzi humoralnej) (7, 8). Pierwszymi elementami immunologicznej odpowiedzi aktywowanymi w wyniku kontaktu z wirusem odry (MeV) są te związane z odpowiedzią nieswoistą: interferonami (IFN), układem dopełniacza, komórkami NK oraz pobudzeniem receptorów Toll-like. Dostępne dane wskazują, że spośród wszystkich znanych receptorów TLR, na kształtowanie reakcji odpornościowej indukowanej przez MeV największe znaczenie ma aktywacja TLR2 oraz TLR4 (1, 2, 4). W pracy Bieback i wsp. (1) przedstawiono, że dzikie szczepy wirusa odry, ale nie szczepy szczepionkowe, aktywuje limfocyty T zarówno mysie jak i ludzkie poprzez receptor TLR2, a właściwość ta jest związana jest z obecnością hemaglutyniny. Celem pracy było określenie ekspresji receptorów TLR 2 i TLR 4 pod wpływem stymulacji wirusem odry, oraz udziału receptorów w kształtowaniu odpowiedzi poszczepiennej. MATERIAŁ I METODY W badaniu uczestniczyło 20 zdrowych ochotników szczepionych przeciwko odrze o znanym statusie serologicznym: seronegatywnych pomimo szczepienia (NEG, n=8), seropozytywnych w wyniku szczepienia (POS, n=12), od których pobierano 10 ml krwi żylnej, celem izolacji komórek PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells). Komórki PBMC izolowano przy użyciu LSM (Lymphocyte Separation Medium, MP Biomedicals). Zebrane PBMC płukano w PBS, zawieszano w RPMI 1640 (Sigma, R8758) z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej (FBS) i liczono w komorze Bűrkera. Próbki zawierające 10 6 PBMC w 4 ml zawiesiny stymulowano dodając niżej wymienione stymulatory i stosując odpowiedni czas i temperaturę stymulacji: 1. 200 µl LPS (10 µg/ml), czas stymulacji 24h w 37 C 2. 200 µl Pam3CSK (1 µg/ml), czas stymulacji 6h w 37 C 3. 200 µl zawiesiny wirusa odry szczep Edmonston (E), zawierającą 1250 cząstek zakaźnych wirusa, czas stymulacji 24h w 37 C 4. 200 µl zawiesiny wirusa odry izolat 2281/3/2006 (W1) zawierającą 1250 cząstek zakaźnych wirusa, czas stymulacji 24h w 37 C
Nr 3-4 Ekspresja receptorów Toll-like w komórkach PBMC 191 5. 200 µl zawiesiny wirusa odry izolat 2521/3/2007 (W2) zawierającą 1250 cząstek zakaźnych wirusa, czas stymulacji 24h w 37 C 6. 200 µl PBS, czas stymulacji 24h w 37 C Warunki stymulacji określono w doświadczeniu opisanym w pracy opublikowanej uprzednio (3). Po etapie inkubacji próbki wirowano (250g, 10 minut, 20 C), nadsącz odciągano, osad worteksowano, przenoszono do probówek typu eppendorf i przechowywano w temperaturze -70 C do czasu izolacji mrna. Z komórek PBMC mrna izolowano przy użyciu zestawu Oligotex Direct mrna Mini Kit (QIAGEN, 70022). Proces izolacji przeprowadzono zgodnie z procedurą podaną przez producenta testu. Zgodnie z informacją producenta zestawu, odzysk mrna izolowanego wg tej procedury wynosił ponad 90%. Izolat mrna do dalszych analiz przechowywano w temperaturze -70 C. Poziom ekspresji receptorów Toll-like na poziomie mrna oznaczono metodą Real- -time RT-PCR z jednoczesną detekcją poszukiwanego genu (TLR2 lub TLR4) oraz genu referencyjnego (GAPDH) z wykorzystaniem zestawów: - QuantiFast Probe Assays (QIAGEN) zawierającego indywidualnie projektowane startery oraz sondę TaqMan (sonda hydrolizująca) dla genów TLR2 (Hs_TLR2_FAM_1, QF00005712), TLR4 (Hs_TLR4_FAM_1; QF00066633) lub genu referencyjnego dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanu; GAPDH (Hs_GAPDH_MAX_2, QF00531132). - QuantiFast Probe RT-PCR Plus Kit (QIAGEN, 204482) zawierającego zestaw buforów oraz enzymów (odwrotna transkryptaza Omniscript i Sensiscript, HotStarTaq Plus DNA polimeraza) niezbędnych do przeprowadzenia reakcji odwrotnej transkrypcji (mrna cdna) oraz amplifikacji (one-step RT-PCR) jednocześnie dla genu TLR2 lub TLR4 oraz genu referencyjnego GAPDH (format duplex detection) w czasie rzeczywistym (real-time). Zastosowany zestaw zawierał bufor umożliwiający efektywne usunięcie zanieczyszczeń genomowym DNA, które mogłoby generować fałszywie dodatnie odczyty. Reakcję Real-time PCR przeprowadzono zgodnie z procedurą podaną przez producenta zestawów, przy użyciu cyklera Rotor-Gene TM 6000 (Corbett Life Science). Na podstawie wyników wygenerowanych przez program Rotor-Gene 6000Series software v. 1.7.87. wyznaczono względny poziom ekspresji badanych genów Toll-like (TLR2 i TLR4) względem genu referencyjnego (GAPDH) stosując metodę Pfaffla. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE W grupie 20 osób szczepionych przeciwko odrze, wykazujących różny poziom poszczepiennej odpowiedzi humoralnej: seronegatywnych pomimo szczepienia (NEG, n=8) i seropozytywnych w wyniku szczepienia (POS, n=12) oceniano względną ekspresję genów TLR2 i TLR4. Oceny dokonywano przy zastosowaniu metody Pfaffla wobec genu referencyjnego (GAPDH) po inkubacji z zawiesiną zawierającą cząstki wirusa odry szczepu szczepionkowego (E), szczepów dzikich (W1 i W2) oraz ligandów dla TLR2 i TLR4 Pam3CSK i LPS, odpowiednio.
192 A. Częścik i inni Nr 3-4 1 Względna ekspresja genu TLR2/Pam3CSK 0,8 0,6 0,4 0,2 0 NEG POS Anty-MeV IgG Względna ekspresja genu TLR4/LPS 12 10 8 6 4 2 0 NEG POS Anty-MeV IgG Ryc.1. Względna ekspresja genów dla TLR2 (wykres górny) i TLR4 (wykres dolny) po inkubacji z Pam3CSK i LPS w PBMC osób szczepionych przeciwko odrze, seronegatywnych (NEG) i seropozytywnych (POS). Nie obserwowano statystycznie istotnych różnic (p>0,05) w poziomie ekspresji TLR2 i TLR4 w komórkach PBMC pochodzących od osób seropozytywnych i seronegatywnych w stosunku do wirusa odry w odpowiedzi na działanie ligandów, które to poziomy wyniosły w grupie osób seronegatywnych i seropozytywnych, odpowiednio: 6,16±2,90 i 4,44±2,50 dla TLR2 po inkubacji z Pam3CSK, oraz 0,45±0,30 i 0,48±0,27 dla TLR4 po inkubacji z LPS (rycina 1). Poziom ekspresji badanych genów po inkubacji z zawiesinami zawierającymi różne szczepy wirusa odry wykazywał znacznie większe zróżnicowanie osobnicze niż po inkubacji z ligandami tych receptorów. Przeprowadzona analiza ujawniła istnienie wśród badanej grupy 5 osób, których wyniki znacznie odbiegały od średniej (ang. outliers). Wyniki wykraczające poza zakres (interquantile range dla współczynnika k=3) pominięto w dalszej analizie. Po wirusowo-swoistej stymulacji, wyższy poziom ekspresji badanych genów wykazywały komórki PBMC pochodzące od osób seronegatywnych (rycina 2). Dotyczyło to jednak tylko stymulacji szczepami dzikimi: dla TLR2 1,53±0,53 versus 1,16±0,57 po inkubacji ze szczepem W1 i 1,24±0,83 versus 0,59±0,59 po inkubacji ze szczepem W2, oraz dla TLR4 1,09±0,78 versus 1,05±0,66 po inkubacji ze szczepem W1 i 7,10±9,50 versus 3,54±7,09 po inkubacji ze szczepem W2. Po inkubacji ze szczepem szczepionkowym wirusa odry obserwowano sytuację odwrotną poziomy względnej ekspresji genów u osób serone-
Nr 3-4 Ekspresja receptorów Toll-like w komórkach PBMC 193 Ryc.2. Względna ekspresja genów TLR2 (wykres górny) i TLR4 (wykres dolny) przedstawiona jako średnia ± SD wyników uzyskanych w grupie osób szczepionych przeciwko odrze, wykazujących różny poziom odpowiedzi humoralnej: NEG (seronegatywni pomimo szczepienia) i POS (seropozytywni w wyniku szczepienia). PBMC inkubowano z zawiesiną zawierającą wirus odry szczepu szczepionkowego (E) i dwóch szczepów dzikich (W1 i W2). gatywnych były niższe od stwierdzonych u osób seropozytywnych: dla TLR2 1,00±0,31 versus 1,07±0,34 oraz dla TLR4 0,93±0,40 versus 1,28±0,49. Obserwowane różnice jedynie w przypadku ekspresji TLR4 po inkubacji ze szczepem W2 były istotne statystycznie (test Kruskal-Wallis, p=0,049). W przedstawionej pracy badano wpływ stymulacji szczepem szczepionkowym wirusa odry i szczepami dzikimi na ekspresję receptorów Toll-like u osób szczepionych przeciwko odrze. Otrzymane wyniki potwierdzają, że szczep dziki wirusa odry aktywuje receptor TLR2. Ponadto wykazano, że wyższy poziom ekspresji genów dla receptorów TLR obserwowano u osób seronegatywnych pomimo szczepienia.
194 A. Częścik i inni Nr 3-4 PODSUMOWANIE Receptory Toll-like wydają się być istotnym elementem wpływającym na kształtowanie odpowiedzi poszczepiennej, w szczególności u osób szczepionych seronegatywnych, które wykazują wyższy poziom ekspresji receptorów TLR. Nie mniej jednak z uwagi na niedużą liczebność grupy badanej konieczne jest przeprowadzenie badań na większą skalę z uwzględnieniem dużej grupy osób szczepionych seronegatywnych. PIŚMIENICTWO 1. Bieback K, Lien E, Klagge IM i inni. Hemagglutinin protein of wild-type measles virus activates toll-like receptor 2 signaling. J Virol 2002; 76: 8729 36. 2. Częścik A, Trzcińska A, Siennicka J. Wirus odry reakcje odpornościowe związane z naturalnym zakażeniem i odpowiedzią poszczepienną. Post Mikrobiol 2011; 50: 235 45. 3. Cześcik A, Trzcińska A, Dunal-Szczepaniak M, Siennicka J. The use of real-time RT-PCR method for the determination of Toll-like genes expression at mrna level. Med Dosw Mikrobiol 2014; 66:17-22. 4. Hahm B, Cho JH, Oldstone MB. Measles virus-dendritic cell interaction via SLAM inhibits innate immunity: selective signaling through TLR4 but not other TLRs mediates suppression of IL-12 synthesis. Virology 2007; 358: 251 7. 5. Janeway CA Jr, Medzhitov R. Innate immune recognition. Annu Rev Immunol 2002; 20: 197 216. 6. Tokarz-Deptuła B, Niedźwiedzka P, Deptuła W. Receptory Toll-podobne nowe znaczniki w immunologii. Alergia Astma Immunologia 2006; 11: 23 8. 7. van Els CA, Nanan R. T cell responses in acute measles. Viral Immunol 2002; 15: 435 50. 8. Xu D, Liu H, Komai-Koma M. Direct and indirect role of Toll-like receptors in T cell mediated immunity. Cell Mol Immunol 2004; 1: 239 46. Otrzymano: 29 X 2015 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Wirusologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny