Antywirulentny potencjał białek fagowych

HTML
DOWNLOAD

Wielkość: px

Rozpocząć pokaz od strony:

Download "Antywirulentny potencjał białek fagowych"

Antoni Kulesza
7 lat temu
Przeglądów:

1 Antywirulentny potencjał białek fagowych Grażyna Majkowska-Skrobek Zakład Biologii Patogenów i Immunologii Instytut Genetyki i Mikrobiologii UWr IMMUNOGENNOŚĆ BAKTERII PATOGENNOŚĆ BAKTERII BAKTERIOFAGI BIAŁKA FAGOWE 1

2 Bakteriofagi fagoterapia Gruzja antybiotykoterapia F. Twort ( ) F. d Herelle ( ) A. Fleming ( ) terapia oparta na fagach i ich białkach Bakteriofag (gr. phagein-jeść) LIZA 2

rząd Caudivirales 96% znanych fagów gospodarze: Eubacteria i Archaea ikozaedralna główka +

rodzajów [25% fagów ogonkowych, opisanych1300] rodzinasiphoviridae 9 rodzajów [61% fagów

Rozpoznanie i adsorbcja faga do komórki 2.

3 rząd Caudivirales 96% znanych fagów gospodarze: Eubacteria i Archaea ikozaedralna główka + ogonek, brak osłonki (płytka podstawna, włókna, haczyki) liniowe dsdna rodzina Myoviridae 8 rodzajów [25% fagów ogonkowych, opisanych1300] rodzinasiphoviridae 9 rodzajów [61% fagów ogonkowych, opisanych ponad 3200] rodzinapodoviridae podrodzina Autographivirinae (3 rodz.) podrodzina Picovirinae (2 rodz.) 6 rodzajów [14% fagów ogonkowych, opisanych 750] DEPOLIMERAZY Cykl lityczny 1. Rozpoznanie i adsorbcja faga do komórki 2. Wprowadzenie DNA fagowego do komórki i degradacja DNA gospodarza 3. Synteza wczesnych białek wirusowych ENDOLIZYNY 4. Replikacja genomu i synteza późnych białek wirusowych 5. Składanie i dojrzewanie 6. Uwalnianie 3

4 Bariery na powierzchni bakterii GRAM + GRAM -- Adsorbcja degradacja polisacharydów otoczkowych liazy alginatowe hialuronidazy endosialidazy depolimerazy alginat hialuronian kwas polisialowy amyloworan polisacharydy Klebsiella (K-antygen) 4

5 Adsorbcja degradacja LPSu endoramnozydazy Adsorbcja degradacja peptydoglikanu VAPGHs virion-associated peptidoglycan hydrolases Exoliziny = lizyny strukturalne 1. lizozym (gp5 fagat4) 2. transglikozylazy (gp16 fagat7; białko P7 faga PRD1) 3. N-acetyl-muramoylamidases 4. Glukozaminidazy 5. endopeptydazy (białko P5 faga phi6 ; Tal2009 fagatuc2009) 5

Klebsiella pneumoniae Jeden z najczęstszych czynników zakażeń w

Zakażenia łożyska krwi (urosepsis, odcewnikowe) Zapalenie płuc

żółciowych Zapalenie opon m-rdz ANTYBIOTYKI penicyliny, wczesne

cudowne leki lat 1980-90 aminoglikozydy rezerwa karbapenemy leki

6 Klebsiella pneumoniae Jeden z najczęstszych czynników zakażeń w szpitalu poza szpitalem Zakażenia dróg moczowych Ropnie wątroby Zakażenia łożyska krwi (urosepsis, odcewnikowe) Zapalenie płuc Zakażenia skory i tkanki podskórnej Zapalenie otrzewnej Zapalenie dróg żółciowych Zapalenie opon m-rdz ANTYBIOTYKI penicyliny, wczesne cefalosporyny, fluorochinolony leki I rzutu cefalosporyny III generacji cudowne leki lat aminoglikozydy rezerwa karbapenemy leki ostatniej szansy szczepy wielooporne, szpitale, ciężkie zakażenia Klebsiella pneumoniae Paczosa et al

7 a) KP15 Myoviridae family b) KP27 Myoviridae family c) KP16 Siphoviridae family d) KP36 Siphoviridae family e) KP32 Podoviridae family f) KP34 Podoviridae family Kęsik-Szeloch et al. Virology Journal 2013 łysinka halo murawa Plaque morphology of KP36 on K. pneumoniae 486 7

8 PCR Produkcja rekombinowanych depolimeraz Dodanie Adeniny (wektor zakończony Tyminą) Polimeraza Dream Taq Produkt PCR Oczyszczanie produktów PCR LIGACJA 8

SEKWENCJA DEPOLIMERAZY atggcactatacagagaaggcaaagcggctatggccgcagacggaaccgttaccgggactggcacaaaatggcaatcttcgctttcgctgattcgcccaggcgcgacgattatgtttttgtcgtc accaattcaaatggccgtcgtaaacaaggtg

ggatgcagtcgagttcttcaagaactttgatttcgattccctgcaagatcttgctaaccaaattaatgcagactctgaatctgcacaatcaagcgctgcggctgctgctgcgtctgaaaatgcggccaaaacttcagagaataacgccaagtcttcaga

9 SEKWENCJA DEPOLIMERAZY atggcactatacagagaaggcaaagcggctatggccgcagacggaaccgttaccgggactggcacaaaatggcaatcttcgctttcgctgattcgcccaggcgcgacgattatgtttttgtcgtc accaattcaaatggccgtcgtaaacaaggtg gttagcgatactgaaattaaagccatcaccacaaacggcgctgtcgtagcgtctagcgattacgcgatcctgttaagtgactcacttaccgttgacggtctggcgcaagatgttgctgaaactctgcgctactatcagtcacaggaaaccgtgatcgc ggatgcagtcgagttcttcaagaactttgatttcgattccctgcaagatcttgctaaccaaattaatgcagactctgaatctgcacaatcaagcgctgcggctgctgctgcgtctgaaaatgcggccaaaacttcagagaataacgccaagtcttcaga ggtggctgcggagaatgcaagagaccaagttcagcagatcattaatgacgctggagacgcatcaacactggttgtgctggcgaatcctgatggatttaggcacatagggcgttgcaaagatattgccactctgaggacaattgagccagtagaa agccggcaggttattgaggttctaagctactacaacggcttggcacaaggaggcggaacattctggtacgatcctaacgattcagtaactgaggacaatggcgggagttgtattgtcacaaatggcggaaagcgctggaagcgaatcattgacg gagcggtagatgttttgagctttggagccaagccagacgatataagttttgatagcgcccctcacattcaagccgcacttgacaaccatgacgcagtatcattgtacggacgcagctattatatcggaagcccgatctatatgccgtcaaggactgtgt tcgatggtatgggaggaaagctaacctccatagctccaagcacggctggcttcatggctgggtcaatcttcgcgcctggaaactaccacccagacttttgggaagaggttccgaaggtagcggcc accacgacgcttgggagtgccaacatcac gctggcagatccgaatatagtgaacgttggagacatcatccggctttcgtcaaccactggtgtcctgagcgccgggttcttcgtttccgagtatctacagatggcccgcgtcttgagtaagacaggcaatgtcatcacgattgatggcccggttgaatc gcagcttacgttggtggcagctaatgccaaccagccagggtatcttgcgcgcttcaataaaccgttgttctgctgtgtcgattcaataattcagaatatcgaaatcgatacctgggattactggactgccgactcagcaacttataacgtaaaattctcga atatatggggttcagcaaaggcagtggcctatggcaacaccttctgccgttcacttttcgaggatatacggattgttttctccgggcgtgtatcggagttggcttttgggtcgcatgacacgaacctagttcgcatcacggctattgccagccctaaaggct tatctgcatcagttgtctttggttgggctgaatctggcaggcgctgcacgattgataccttttctatcatgttgaacgctaatgctaatcccagcacggtaattcgtgtatctggtcatcgggatagcttgatcaagaacggaagcatatatgtccataacaa caccaataatatccttagcgtcgagaactatggcactaccgctgatggtgttagaccagattgcgacaacataacgttcgagaacgtgagcatcttcgtaactggatcatctgctgtagtgtgtgatgtatataaatccgccgacaactcggttattaaa aatgttgcgtttaaaaacataaaatatttcgggcctacaccaagcgtcgcattataccgcgctcgcggaacgttggcgaatttcgtgaagggagttcaggcgaacatatcttccgatactggcggagccattgttctcagcaattcggaaaataacgtt ctgacatttaccggcccggtgagcgttacatcgctcgtctctgctgccgcaaaaaatacgttgtccatcagaaactatgccagatctagcgcgaaggcgaacaatttcacgcaagagtctaccttgaacgtgactgatactacggcaaacgctgtca gcaaagaatttacatatcctgctggctctctcagaattaacgataagatcaagctgtcgttgggtggtagtacggctgggactgtcggtaaaaagaccgtacaggtgggtttcattgggtctgac ggtgcgttcaagtacgttgagttggcagctttggc aaccgatcaagtatattggacgatggaggttgaaatatcgttcctcaggacgacgaatagccagacaaatgagcttgagacctcggctattatcacttccttcctttcgaagggtgcggctaccggcgcggcattatctggctcaagggcgctggcg gttgtgtcggatttagcgctctcgaattttgtcgtccaagttcgcgcctggaaggaaaatgcggcagatggattgtcactgtcaagaatgaatcttcagttagaagatttgacggca taa Produkcja rekombinowanych depolimeraz cd. indukcja ekspresji IPTG E.coli zebranie komórek bakteryjnych przez wirowanie 9

10 Produkcja rekombinowanych depolimeraz cd. 1. lizat (przed nałożeniem na kolumnę) oczyszczone białko Majkowska-Skrobek et al. Viruses 2016 Charakterystyka depolimeraz 10

Relative activity [%] Relative activity [%] 2017-01-25

Galleria mellonella PBS 24h po infekcji % survival 100 80 60 40

11 Relative activity [%] Relative activity [%] Charakterystyka depolimeraz ph Tm=65 O C temperature [ C] Majkowska-Skrobek et al. Viruses 2016 Anty-wirulentny potencjał depolimeraz in vivo Galleria mellonella PBS 24h po infekcji % survival * * 10 7 CFU 10 7 CFU + depokp CFU after depokp36 treatment n = 30 p < time post infection (h) Majkowska-Skrobek et al. Viruses

survivial rate (%) 2017-01-25 Anty-wirulentny potencjał

depokp32 (50 μg/ml) depokp32 (100 μg/ml) 150 100 50 0 0 1 2

IDENTYFIKACJA I DETEKCJA BAKTERII DEPOLIMERAZY UWRAŻLIWIENIE

12 survivial rate (%) Anty-wirulentny potencjał depolimeraz in vitro control depokp32 (10 μg/ml) depokp32 (50 μg/ml) depokp32 (100 μg/ml) time (h) ENDOLIZYNY TERAPIA FAGOWA LIZA BAKTERII IDENTYFIKACJA I DETEKCJA BAKTERII DEPOLIMERAZY UWRAŻLIWIENIE BAKTERII NA CZYNNIKI ANTYBAKTERYJNE I MECHANIZMY UKŁADU ODPORNOŚCIOWEGO 12

homologii BIOLOGIA STRUKTURALNA krystalizacja określenie struktury

13 BIOLOGIA MOLEKULARNA klonowanie ekspresja oczyszczanie interakcje BIOINFORMATYKA identyfikacja przewidywanie struktury dokowanie modelowanie homologii BIOLOGIA STRUKTURALNA krystalizacja określenie struktury przestrzennej Kryształy depokp36 Institute of Biostructures and Bioimaging, National Research Council, Naples 13

Podobne dokumenty

Zawartość. Wstęp 1. Historia wirusologii. 2. Klasyfikacja wirusów

Zawartość. Wstęp 1. Historia wirusologii. 2. Klasyfikacja wirusów Zawartość 139585 Wstęp 1. Historia wirusologii 2. Klasyfikacja wirusów 3. Struktura cząstek wirusowych 3.1. Metody określania struktury cząstek wirusowych 3.2. Budowa cząstek wirusowych o strukturze helikalnej