Wpływ warunków przechowywania materiału klinicznego na wynik wirusologicznych oznaczeń metodą RT-PCR

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: Agnieszka Trzcińska, Anna Laskowska, Joanna Siennicka Wpływ warunków przechowywania materiału klinicznego na wynik wirusologicznych oznaczeń metodą RT-PCR Zakład Wirusologii NIZP-PZH w Warszawie Kierownik: dr hab. Bogumiła Litwińska, prof. nadzw. w NIZP-PZH Określeno wpływ temperatury, czasu przechowywania próbek różnych materiałów klinicznych oraz liczby cykli zamrażania i rozmrażania na wyniki oznaczeń przeprowadzonych metodą RT-PCR. Badania przeprowadzono w modelu wirusa wirusa odry (RNA). Swoista diagnostyka laboratoryjna stanowi podstawę rozpoznania etiologicznego czynnika choroby zakaźnej. Metody laboratoryjne obecnie stosowane w wirusologii klinicznej są bardzo różnorodne i polegają na wykryciu w materiale klinicznym pobranym od pacjenta cząstek wirusowych, elementów budowy wirionu (antygenów lub materiału genetycznego) bądź immunologicznej odpowiedzi organizmu (pod postacią swoistych przeciwciał) na zakażenie wirusowe. Postęp jaki dokonał się wraz z wprowadzeniem metod molekularnych sprawił, że różne techniki PCR stanowią obecnie istotną część diagnostycznych badań laboratoryjnych. Niewątpliwą zaletą metod molekularnych jest skrócenie czasu oczekiwania na wynik badania, wysoka czułość oraz niewielka ilość materiału klinicznego potrzebna do przeprowadzenia oznaczeń. W przypadku metod molekularnych za przewagę w stosunku do klasycznej izolacji zarazka należy również uznać wyższą stabilność genetycznego materiału wirusów w porównaniu do zachowania przez wirus zdolności do replikacji. Jednym z podstawowych problemów związanych z badaniem kwasów nukleinowych jest określenie warunków transportu i przechowywania próbek klinicznych w celu zapewnienia wiarygodnych wyników. Informacje dotyczące stabilności wirusowego RNA i DNA w materiale klinicznym mają kluczowe znaczenie dla otrzymania wiarygodnego wyniku badania wykonanego metodą RT-PCR, PCR lub inną metodą molekularną. Nawet 80-90% błędów, które mogą mieć wpływ na wynik badania diagnostycznego dotyczy pierwszego, przedanalitycznego etapu procesu diagnostycznego pobierania, przechowywania i postępowania z próbkami klinicznymi do badań (5, 10, 11). Do niebiologicznych czynników przedanalitycznych, mających istotny wpływ na stabilność próbki, rozumianą jako zdolność do utrzymania początkowej wartości mierzonego parametru, a tym samym na wynik badania, zaliczane są: sposób pobrania, warunki przechowywania oraz transportu próbki przeznaczonej do badania. Z punktu widzenia wiarygodności metod molekularnych nasilenie niekorzystnych zmian, jakie zachodzą w próbkach może być uzależnione również od rodzaju materiału klinicznego oraz rodzaju materiału

2 342 A.Trzcińska, A. Laskowska, J. Siennicka Nr 4 genetycznego, jaki ma być badany. Dzięki strukturze podwójnej helisy dwuniciowe DNA (dsdna) jest uważane za względnie stabilne, natomiast bardzo niestabilną strukturą, obecną u niektórych wirusów, jest jednoniciowe RNA (ssrna), podatne na uszkodzenia i mutacje, a przede wszystkim na działanie RNaz obecnych w próbce (3). Tak więc wydaje się celowe określenie stabilności próbek różnych rodzajów materiału klinicznego pod kątem obecności materiału genetycznego RNA wirusów, w celu optymalizacji procedur związanych z przechowywaniem i transportem próbek przeznaczonych do badań diagnostycznych. Celem pracy było określenie wpływu temperatury, czasu przechowywania próbek oraz liczby cykli zamrażania i rozmrażania na wyniki oznaczeń przeprowadzanych metodą RT- -PCR. MATERIAŁ I METODY W i r u s: Model do badań metodą RT-PCR stanowił wirus odry (MeV), szczep Schwarz, pochodzący ze szczepionki przeciwko odrze Rouvax, firmy Aventis Pasteur. H o d o w l a k o m ó r k o w a i n a m n a ż a n i e w i r u s a: Do namnażania i mianowania wirusa MeV używano hodowli komórkowej VeroSLAM (komórki linii Vero transfekowane plazmidem kodującym cząsteczkę SLAM), otrzymanej z Instytutu Roberta Kocha w Berlinie (RKI). Miano infekcyjne wirusa (TCID 50 ) oznaczano wg metody Spaermana- -Kärbera. Zawiesinę wirusa, stanowiącą materiał do dalszych badań, po rozporcjowaniu przechowywano w temperaturze -70 o C. P r ó b k i m a t e r i a ł u k l i n i c z n e g o: Badania prowadzono dla 3 rodzajów materiału klinicznego: surowicy, płynu mózgowo-rdzeniowego i moczu. Próbki moczu pochodziły od ochotnika, u którego nie stwierdzono obecności przeciwciał klasy IgG i IgM dla MeV. Materiał pobierano w dniu badań. Próbki surowic oraz płynu mózgowo-rdzeniowego do oznaczeń metodą RT-PCR pochodziły od osób badanych w Zakładzie Wirusologii NIZP-PZH w ramach rutynowej diagnostyki laboratoryjnej. Do badania wykorzystano pozostałości materiałów zarchiwizowanych po oznaczeniach wykonanych w latach Do badań na modelu wirusa MeV pulowano surowice uzyskane od osób anty-mev IgG i IgM negatywnych. W celu potwierdzenia, że w danym materiale klinicznym nie ma genetycznego materiału badanego wirusa, z każdego z nich przed kontaminacją pobierano odpowiednią ilość próbki, wykonywano izolację RNA, a następnie oznaczenia metodą RT-PCR. K o n t a m i n a c j a p r ó b e k k l i n i c z n y c h d o o z n a c z e ń m e t o d ą R T P C R: Wartość kontaminacji wirusem MeV dla każdego materiału klinicznego była taka sama. Zastosowano 2 poziomy kontaminacji niski i wysoki. Kontaminacji materiałów klinicznych wirusem MeV dokonywano na poziomie 2,4 cząstek zakaźnych wirusa / 1ml materiału (niski poziom) i 240 cząstek zakaźnych wirusa / 1 ml materiału (wysoki poziom). P o s t ę p o w a n i e z p r ó b k a m i k o n t a m i n o w a n y m i w i r u s e m: a) kontaminowane materiały kliniczne inkubowano w różnych warunkach przez określony czas: w temperaturze pokojowej (21 ± 4 o C) przez 2, 4, 8, 24, 48 h oraz 5 dni; w temperaturze lodówki (5 ± 3 o C) przez 2, 4, 8, 24, 48 h oraz 5 dni; w temperaturze zamrażarki

3 Nr 4 Wpływ przechowywania próbek na wynik RT-PCR 343 (<-18 o C) przez 48 i 72h oraz 7 dni. Następnie przeprowadzano izolację materiału genetycznego wirusa i wykonywano oznaczenia metodą RT-PCR. b) kontaminowane materiały kliniczne porcjowano i poddawano 20 cyklom zamrażania i odmrażania, po każdym cyklu izolowano kwas nukleinowy i wykonywano badanie RT-PCR. c) przed wykonaniem oznaczeń procesowi mrożenia i rozmrażania poddawano wyizolowany wirusowy kwas nukleinowy. Ze świeżo kontaminowanego materiału dokonywano izolacji kwasu nukleinowego, izolat porcjowano i poddawano 20 cyklom zamrażania i odmrażania, po czym wykonywano badanie RT-PCR. I z o l a c j a k w a s u n u k l e i n o w e g o: Do izolacji wirusowego materiału genetycznego (RNA) stosowano zestawy firmy Qiagen odpowiednie dla danego materiału klinicznego. Wirusowe RNA z surowicy i z płynu mózgowo-rdzeniowego izolowano przy użyciu zestawu QIAamp MinElute Virus Spin Kit. Wirusowe RNA z moczu izolowano przy użyciu zestawu QIAamp Viral RNA Mini Kit. A m p l i f i k a c j a k w a s ó w n u k l e i n o w y c h: Obecność RNA MeV oznaczano jakościową metodą nested RT-PCR zgodnie z procedurą opisaną przez Tischer i wsp. (16) oraz Shimizu i wsp. (15), wykorzystując primery dla genu N. Przy wykonywaniu reakcji nested RT-PCR wykorzystano zestaw One-Step RT PCR firmy Qiagen. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Możliwość wykrycia w materiale klinicznym obecności wirusa lub/i jego materiału genetycznego zależy od wielu czynników, spośród których czas i temperatura transportu oraz przechowywania próbek do badań diagnostycznych odgrywają ważną rolę. Znajomość stopnia degradacji wirusowego RNA lub DNA ma znaczenie dla określenia warunków transportu próbek do laboratorium, przechowywania próbek do czasu badania, archiwizacji materiału klinicznego do badań porównawczych mających na celu np. śledzenie skuteczności leczenia, ale również w aspekcie bezpieczeństwa preparatów krwiopochodnych, które po pozyskaniu podlegają kontroli wirusologicznej. Właśnie z tego względu większość publikacji na temat stabilności materiału genetycznego wirusów w materiale klinicznym dotyczy badań wirusów przenoszonych drogą krwi: HIV, HCV czy HBV. W prezentowanej pracy w badaniach posłużono się modelem wirusa RNA (MeV), a oznaczenia przeprowadzono stosując dwa poziomy kontaminacji ( niski i wysoki ) obliczone w oparciu o zakaźne miano wirusa MeV. Tym samym liczba dodawanych do materiału klinicznego cząstek wirusowych odnosiła się wyłącznie (!) do zakaźnych cząstek wirusowych, nie uwzględniając np. cząstek defektywnych. Przeprowadzono badania dotyczące wpływu przechowywania w różnych warunkach temperatury (temp. pokojowa, lodówki, zamrażarki) i przez różny okres czasu (2, 4, 8, 24 i 48 h, 5dni, 7 dni) kontaminowanych wirusem odry próbek materiału klinicznego (surowica, płyn mózgowo-rdzeniowy, mocz) na wyniki oznaczeń metodą RT-PCR. Po izolacji RNA MeV wykryto we wszystkich badanych próbkach, niezależnie od poziomu kontaminacji, czasu i temperatury przechowywania (tabela I). Uzyskane wyniki wskazują, że wirusowe RNA na badanych poziomach kontaminacji jest stabilne w szerokim zakresie zastosowanych temperatur, jak i czasu przechowywania próbek. Obserwacja ta jest zgodna z wynikami uzyskanymi przez innych autorów. Jose

4 344 A.Trzcińska, A. Laskowska, J. Siennicka Nr 4 Tabela I Wyniki badania metodą RT-PCR obecności RNA MeV w kontaminowanych próbkach klinicznych przechowywanych w różnych warunkach temperatury przez różny okres czasu Temperatura Temperatura pokojowa (21± 4 o C) Temperatura lodówki (5 ± 3 o C) Temperatura zamrażarki (<- 18 o C) N niska kontaminacja W wysoka kontaminacja PMR płyn mózgowo-rdzeniowy RNA MeV Czas Surowica PMR Mocz N W N W N W 2 h h h h h dni h h h h h dni h h dni i wsp. (7) wykazali, że RNA HCV jest wykrywalne w plazmie pacjentów po 14 dniach przechowywania w 25 o C, 3 miesiącach w 5 o C i co najmniej po 3,5 roku zamrożenia w -20 o C i -70 o C. Kontynuacja badań w modelu HCV i HIV wykazała, że RNA HCV jest stabilne w -20 o C przez 5 lat, RNA HIV w -20 o C przez co najmniej 3 lata, natomiast w temperaturze 5 o C przez 14 dni, a w 25 o C przez 7 dni (8). Przechowywanie pełnej krwi zawierającej HCV przez okres 5 tygodni w temp. 4 o C nie wpływa na poziom RNA tego wirusa (14). RNA HIV w próbkach pełnej krwi i podłożu do hodowli jest stabilne w temperaturze pokojowej przez 7 dni, a dodatek Tritonu X-100 do próbki krwi zwiększa stabilność RNA do 120 dni (17), natomiast RNA HIV w próbkach surowicy, osocza i pełnej krwi pacjentów przechowywane w -70 o C jest stabilne przez 6 miesięcy oraz przez 14 dni w próbkach surowicy i osoczu przechowywanych w 4 o C (2). Anwar i wsp. (1) wykazali brak znaczącego wpływu zamrażania w -70 o C i rozmrażania w 25 o C aż do 5 cykli w przypadku surowicy kontaminowanej wirusem Dengua (DENV-2) oraz w przypadku dodatniej surowicy pacjenta (DENV-3). Na istotne znaczenie czynników przedanalitycznych i wpływie jaki mają na stabilność wirusowego RNA w różnych materiałach klinicznych zwraca uwagę również Schulze i wsp. (12). Badacze posługujący się różnymi metodami ilościowymi stwierdzili postępujący w czasie spadek poziomu wirusowego RNA, związany z degradacją materiału genetycznego. Spadek ten był znacząco szybszy w wyższych temperaturach, w stanie zamrożenia materiał genetyczny wirusów wykazywał dużą stabilność (6, 8, 13, 18). W prezentowanej pracy przedstawiono również wyniki wpływu wielokrotnego zamrażania i krótkotrwałego rozmrażania wyjściowych próbek materiału klinicznego kontami-

5 Nr 4 Wpływ przechowywania próbek na wynik RT-PCR 345 nowanych wirusem odry na wyniki oznaczeń metodą RT-PCR. Po 20 cyklach zamrażania i krótkotrwałego odmrażania RNA MeV wykryto we wszystkich próbkach kontaminowanych na wysokim poziomie oraz we wszystkich próbkach surowicy i płynu mózgowo-rdzeniowego kontaminowanych na niskim poziomie. W próbkach moczu kontaminowanych na niskim poziomie po pięciu i więcej cyklach mrożeniach i rozmrożenia nie wykryto RNA MeV. Po czterech cyklach mrożeniach i rozmrożenia badanie dało wynik wątpliwy (tabela II). Uzyskane wyniki pokazują, że wirusowe RNA w materiale klinicznym poddane zamrażaniu i rozmrażaniu pozostaje stabilne przez co najmniej 3 cykle. Obserwacja ta jest zgodna z wynikami innych autorów. Gessoni i wsp. (4) wykazali, że RNA HIV i HCV jest obecne w próbkach pełnej krwi poddanych 5 cyklom zamrażania w C i rozmrażania w 37 o C, pomimo znaczącego spadku poziomu wirusa w próbce. Brak wpływu na wynik oznaczeń zaobserwowali Krajden i wsp. (9), którzy poddali 8 cyklom zamrażania (-70 o C przez 2h) i rozmrażania (25 o C przez 1h) próbki surowicy od osób zakażonych wirusem HBV i HCV. Zbadano również wpływ wielokrotnego zamrażania i rozmrażania RNA wyizolowanego z próbek materiału klinicznego (surowica, płyn mózgowo-rdzeniowy, mocz) kontaminowanych wirusem odry na wyniki oznaczeń metodą RT-PCR. Po 20 cyklach zamrażania i krótkotrwałego odmrażania RNA MeV wykryto we wszystkich badanych próbkach izolatów, Tabela II Wyniki badania metodą RT-PCR obecności RNA MeV w kontaminowanych próbkach wyjściowych materiałów klinicznych oraz izolatach poddanych kolejnym cyklom zamrażania i odmrażania. RNA MeV w próbce wyjściowej Liczba rozmrożeń Surowica PMR Mocz materiału N W N W N W 2x x x /- + 5x x x x Izolat RNA (MeV) Liczba rozmrożeń Surowica PMR Mocz izolatu N W N W N W 1x x x x x x x x N niska kontaminacja W wysoka kontaminacja PMR płyn mózgowo-rdzeniowy

6 346 A.Trzcińska, A. Laskowska, J. Siennicka Nr 4 niezależnie od poziomu kontaminacji (tabela II). Podsumowując, można stwierdzić, że o ile izolowane z próbek klinicznych RNA MeV poddane 20 cyklom zamrażania i odmrażania pozostaje wykrywalne niezależnie od poziomu kontaminacji próbki wyjściowej, to zamrażanie i rozmrażanie próbek materiału klinicznego związane jest z pewnymi ograniczeniami. Ważnym elementem diagnostyki laboratoryjnej jest wybór właściwego materiału klinicznego. W prezentowanej pracy badano 3 rodzaje materiałów klinicznych surowicę, płyn mózgowo-rdzeniowy oraz mocz. Uzyskane wyniki wskazują, że wirusowe RNA w zastosowanych poziomach kontaminacji jest stabilne we wszystkich badanych materiałach, chociaż, jak zaznaczono to wcześniej, stabilność materiału genetycznego w przypadku moczu może być ograniczona. Na podstawie przytoczonego piśmiennictwa można zauważyć, że wyniki otrzymane przez różnych badaczy, nawet dla tych samych wirusów różnią się, co zdecydowanie wskazuje na konieczność wykonania walidacji we własnym laboratorium, a faza przedanalityczna powinna być objęta ściślejszą kontrolą, idącą w kierunku standaryzacji procedur pobierania, transportu i przechowywania materiału klinicznego do badań. A.Trzcińska, A.Laskowska, J.Siennicka Effect of storage conditions of clinical materials on virological tests results by RT-PCR SUMMARY Obtaining a reliable laboratory test result depends on many factors, among which preanalitical factors play a significant role. The aim of this study was to determine the effect of temperature, storage time of samples and number of freezing and thawing cycles on the results of tests carried out by RT-PCR. The study was conducted in a model of measles virus (RNA). The results revealed that: 1) Samples of clinical material (serum, cerebrospinal fluid, urine) for testing by RT-PCR can be stored for at least 5 days at room temperature or refrigerated and at least 7 days when frozen, 2) Freezing and thawing three times, samples of clinical material does not affect the outcome of the presence of viral RNA, 3) Isolated viral RNA is stable at freezer temperature and can be subjected to at least 20 freeze-thaw cycles without affecting the results. PIŚMIENNICTWO 1. Anwar A, Wan G, Chua KB i inni. Evaluation of pre-analytical variables in the quantification of dengue virus by real-time polymerase chain reaction. J Mol Diagn 2009; 11: Bruisten SM, Oudshoorn P, van Swieten P i inni. Stability of HIV-1 RNA in blood during specimen handling and storage prior to amplification by NASBA-QT. J Virol Methods 1997; 67: Farkas DH, Kaul KL, Wiedbrauk DL i inni. Specimen collection and storage for diagnostic molecular pathology investigation. Arch Pathol Lab Med : Gessoni G, Barin P, Valverde S i inni. Biological qualification of blood units: considerations about the effects of sample s handling and storage on stability of nucleic acids. Transf Apher Sci 2004; 30: Jaźwińska-Kluzik J. Źródła niepewności przedanalitycznej w badaniach laboratoryjnych cz I. Laboratorium medyczne 2008; 4: 40-2.

7 Nr 4 Wpływ przechowywania próbek na wynik RT-PCR Jerome KR, Huang ML, Wald A i inni. Quantitative stability of DNA after extended storage of clinical specimens as determined by real-time PCR. J Clin Microbiol 2002; 40: José M, Curtu S, Gajardo R i inni. The effect of storage at different temperatures on the stability of Hepatitis C virus RNA in plasma samples. Biologicals 2003; 31: José M, Gajardo R, Jorquera JI. Stability of HCV, HIV-1 and HBV nucleic acids in plasma samples under long-term storage. Biologicals 2005; 33: Krajden M, Minor JM, Rifkin O i inni. Effect of multiple freeze-thaw cycles on hepatitis B virus DNA and hepatitis C virus RNA quantification as measured with branched-dna technology. J Clin Microbiol 1999;37: Lippi G, Guidi GC. Preanalytic indicators of laboratory performances and quality improvement of laboratory testing. Clin Lab 2006; 52: Lippi G, Guidi GC, Mattiuzzi C i inni. Preanalytical variability: the dark side of the moon in laboratory testing. Clin Chem Lab Med 2006; 44: Schulze TJ, Weiss C, Luhm J i inni. Preanalytical stability of HIV-1 and HCV RNA: impact of storage and plasma separation from cells on blood donation testing by NAT. Transfus Med 2011; 21: Sebire K, McGavin K, Land S i inni. Stability of human immunodeficiency virus RNA in blood specimens as measured by a commercial PCR-based assay. J Clin Microbiol 1998; 36: Sener K, Yapar M, Bedir O i inni. Stability of hepatitis C virus RNA in blood samples by TaqMan real-time PCR. J Clin Lab Anal 2010; 24: Shimizu H, McCarthy CA, Smaron MF, i inni. Polymerase chain reaction for detection of measles virus in clinical samples. J Clin Microbiol 1993; 31: Tischer A, Santibanez S, Siedler A i inni. Laboratory investigations are indispensable to monitor the progress of measles elimination--results of the German Measles Sentinel J Clin Virol 2004; 31: Vandamme AM, Van Laethem K, Schmit JC i inni. Long-term stability of human immunodeficiency virus viral load and infectivity in whole blood. Eur J Clin Invest 1999;29: Vaughan H, Chalker VJ, Mee Z i inni. Stability of lyophilised specimens for the molecular detection of viral DNA/RNA. J Clin Virol 2006; 35: Otrzymano: 14 XI 2011r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Wirusologii NIZP-PZH

8