Wpływ warunków przechowywania na wyniki oznaczeń poziomu przeciwciał w próbkach ludzkiej surowicy

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: Wiesław Truszkiewicz Wpływ warunków przechowywania na wyniki oznaczeń poziomu przeciwciał w próbkach ludzkiej surowicy Wojewódzka Stacja Sanitarno-Epidemiologiczna w Lublinie Dyrektor: dr n. med. Janusz Słodziński Przedstawiono wyniki pomiarów poziomu przeciwciał klasy IgG anti-hav, klasy IgG anti-ebv oraz klasy IgM anti-ebv przeprowadzonych w trakcie przechowywania próbek surowicy ludzkiej w warunkach chłodniczych oraz w zamrożeniu. Badanie wykonano dla oceny wpływu warunków przechowywania oraz wielokrotnego rozmrażania na poziom przeciwciał. Stwierdzono wzrost poziomu przeciwciał klasy IgG w próbkach wielokrotnie rozmrażanych w stosunku do poziomu przeciwciał oznaczonego w próbkach przechowywanych w temperaturze 40C. Zanotowano również spadek poziomu przeciwciał klasy IgM w czasie trwania doświadczenia, który był najwyraźniejszy w temperaturze 40C. Oznaczenia poziomu przeciwciał są jednym z najpopularniejszych sposobów diagnostyki zakażeń bakteryjnych, wirusowych oraz autoimmunologicznych. Wpływa na to głównie ich relatywnie niski koszt wobec innych technik, jak coraz popularniejsze, ale wciąż kosztowne oznaczenia przy użyciu techniki PCR przy diagnostyce zakażeń, możliwość uzyskania zadowalającej swoistości i czułości, lub występowanie przeciwciał będących bezpośrednią przyczyną choroby (schorzenia autoimmunologiczne). Duża obecnie dostępność prostych testów ELISA/ELFA umożliwia wykonywanie oznaczeń poziomu przeciwciał nawet małym laboratoriom. Materiałem diagnostycznym z wyboru w oznaczeniach przeciwciał jest surowica (3). Ograniczenie czasu przechowywania surowicy w temp. 4 0 C do kilku dni oraz ograniczenie ilości cykli zamrażania/rozmrażania to uwagi podawane przez większość producentów testów służących do oznaczeń ilościowych i jakościowych przeciwciał. Celem pracy była ocena wpływu warunków przechowywania (temperatury i wielokrotnego rozmrażania ) na stabilność ludzkich przeciwciał klasy IgG i IgM. MATERIAŁ I METODY Jako materiału do pomiarów miana przeciwciał użyto surowic uzyskanych od pacjentów badanych w Pracowni Wirusologii WSSE w Lublinie. Wiek pacjentów zawierał się w granicach lat. Oznaczenie poziomu przeciwciał anty-hav IgG, anty-ebv IgG, anty- -EBV IgM wykonywano z próbek surowicy bezpośrednio po jej uzyskaniu od pacjenta. Do

2 190 W. Truszkiewicz Nr 2 dalszych badań wykorzystano próbki mające miana przeciwciał mieszczące się w zakresie kalibracji użytych metod. Każda próbka była dzielona na 3 części po ul. Kolejno umieszczano je w lodówce i zamrażarce o monitorowanych warunkach : od 2 do 8 0 C (jedna część) i od C do C (pozostałe). Cały proces pobierania krwi zamkniętym systemem respiracyjno-próżniowym, uzyskiwania surowicy i jej porcjowania, przeprowadzano w warunkach jałowych. Próbki przechowywane w warunkach lodówki (2-8 0 C) przechowywane przez cały okres (30 dni ) trwania doświadczenia i wyjmowane wyłącznie na czas pobierania materiału do badań. Część próbek zamrożonych była rozmrażana 2 razy dziennie przez przeniesienie ich do miejsca zacienionego o monitorowanej temperaturze C na okres 1 godziny tak aby każda próbka podlegała takiej samej ilości (38) cykli zamrażania i rozmrażania. Druga część próbek zamrożonych była rozmrażana wyłącznie na czas pobierania materiału do badań (2 razy (anty HAV), lub 3 razy (anty EBV) w czasie trwania doświadczenia). Badanie w kierunku przeciwciał anty-ebv wykonano czterokrotnie w czasie trwania doświadczenia (pojedyncze wyniki są uśrednioną wartością dwóch pomiarów ) a badanie w kierunku anty-hav trzykrotnie, bez powtórzeń. Wszystkie badania zostały wykonane za pomocą metod akredytowanych, testami : (VIDAS Anti-HAV Total (ilościowy), (Bio- Merieux, Holandia) oraz Anty-EBV-CA ELISA (IgG)(ilościowy)(Euroimmun, Niemcy), Anty-EBV-CA ELISA (IgM)(półilościowy) (Euroimmun, Niemcy). Ponadto w próbkach podlegających oznaczeniu anty-hav wykonano jednokrotne oznaczenie anty-hav IgM testem VIDAS anti-hav IgM (BioMerieux, Holandia) bezpośrednio po pobraniu próbek, z wynikiem ujemnym. Kolejne pomiary dla każdej z próbek wykonywano po 10, 21 i 30 dniach od pobrania. Po zakończeniu doświadczenia surowice były posiewane na agarze z krwią przygotowanym w Pracowni Pożywek WSSE w Lublinie, dla sprawdzenia ich jałowości. Wyniki dotyczące próbek niejałowych odrzucono a wyniki badań pozostałych (6 próbek w kierunku anty-hav IgG, 5 w kierunku anty-ebv IgG, 6 w kierunku any-ebv IgM) przedstawiono jako odsetek wartości wyjściowego miana przeciwciał. Wartości procentowe uzyskano na podstawie następujących danych: 1. odczyt z krzywej wzorcowej w jednostkach względnych (RU/ml) dla anty-ebv IgG. Jako wartość odcięcia (cut-off) przyjęto 20 RU/ml, zakres kalibracji metody wynosił: RU/ml, 2. współczynnik Ratio anty-ebv IgM wyliczony zgodnie ze wskazaniami producenta testu jako iloraz ekstynkcji próbki badanej i kalibratora o wartości 20 RU/ml. Jako dodatnie klasyfikowano próbki z wartością Ratio >1,1 i tylko takie były brane pod uwagę przy obliczeniach. Wyniki badania przeciwciał anty-hav były wyliczane przez aparat VIDAS według krzywej kalibracyjnej dostarczanej wraz z testem i wyrażane w miu/ml (standard referencyjny WHO przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu A ma miano 100 miu/ml). Zakres kalibracji metody wynosił miu/ml. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Wyniki pomiarów w kolejnych terminach uśredniono a ich wartości wyrażone w odsetkach w stosunku do wyjściowych wartości przedstawiono na rycinach 1-3.

3 Nr 2 Wpływ przechowywania surowicy na poziom przeciwciał 191 Ryc.1 Wpływ warunków przechowywania na poziom przeciwciał HAV IgG. Ryc.2 Wpływ warunków przechowywania na poziom przeciwciał EBV IgG. Ryc.3 Wpływ warunków przechowywania na poziom przeciwciał EBV IgM.

4 192 W. Truszkiewicz Nr 2 Wykazane na wykresach tendencje (wzrost /spadek oznaczanego miana) w sensie jakościowym obserwowano we wszystkich badanych próbkach. Po uwzględnieniu niepewności, wyniki pozwoliły zaobserwować prawidłowości polegające na wzroście obserwowanego miana przeciwciał w oznaczeniach anty-hav IgG oraz anty-ebv IgG. Miano anty EBV IgM nie zmieniało się istotnie. Tabela I. Maksymalne różnice w obserwowanym mianie przeciwciał w zależności od sposobu przechowywania względem miana wyjściowego (100%). Niepewność rozszerzona Warunki przechowywania (U R ) zastosowanych metod C C C R anty-hav IgG +1,22 % +16,35 % +28,79 % 13,5 % anty EBV IgG -13,62 % +8,97 % +16,89 % 10,7 % anty EBV IgM +2,32 % +3,76 % +7,7 % 14,8 % R próbki podlegające wielokrotnym cyklom zamrażania/rozmrażania. W czasie trwania doświadczenia tylko w przypadku anty EBV IgG przechowywanych w temperaturze C zanotowano znamienny spadek oznaczanego miana. W próbkach tych miano spadało systematycznie: I pomiar : 100%, II pomiar : 98,39%, III pomiar : 97,72%, IV pomiar : 86,38%. Próbki badane w kierunku anty-ebv IgM oraz anty HAV Total nie wykazywały jednak wyraźnego spadku miana w tej temperaturze, zanotowano nawet nieznaczny jego wzrost, odpowiednio o 2,32% oraz o 1,22%. Wzrost ten, sięgający znacznie wyższych wartości pojawił się w próbkach anty HAV i anty EBV IgG przechowywanych w zamrożeniu a jeszcze bardziej znamienne wzrosty oznaczanego miana obserwowano w próbkach wielokrotnie rozmrażanych. Postulowany przez innych autorów (1) brak spadku poziomu przeciwciał po wielokrotnym rozmrażaniu próbek nawet w okresie wielu dni znajduje tutaj potwierdzenie. Dodatkowo, wszystkie badane próbki wykazały tendencję do wzrostu oznaczanego poziomu przeciwciał w czasie. W próbkach przeciwciał anty-hav IgG oraz anty-ebv IgG wzrosty były już na tyle duże, że mogą mieć znaczenie w interpretacji wyniku w przypadku użycia zamrożonych surowic jako materiału kontrolnego. Na podstawie uzyskanych wyników można sugerować, że o ile notowane zmiany nie powinny mieć znaczenia przy rozpatrywaniu serologicznego statusu pacjenta, to przygotowując surowice do użycia jako materiał porównawczy/kontrolny należy wziąć pod uwagę zachodzące zmiany. Jest to tym bardziej istotne, że wrażliwość poszczególnych typów przeciwciał na warunki przechowywania wydaje się być różna. Autorzy badający stabilność przeciwciał w porównywalnym okresie (4 tygodni)(2) notowali wyraźnie mniejszą stabilność przeciwciał IgM niż IgG. Prezentowane tutaj wyniki nie wskazują aby w przypadku badanych przeciwciał taka zależność się pojawiła. Zasadne może być jednak przypuszczenie, że trwałość przeciwciał jest różna w zależności od antygenu przeciw jakiemu zostały wytworzone. Obserwujemy znaczący spadek poziomu przeciwciał anty EBV IgG w temp. 4 0 C i brak takiej wyraźnej tendencji w przypadku przeciwciał - EBV IgM oraz anty - HAV IgG gdzie poziom przeciwciał w surowicach przechowywanych w temp. 4 0 C pozostawał na stałym poziomie. Na trwałość przeciwciał w przechowywanych próbkach ma najwyraźniej wpływ szereg procesów zmiennych w zależności od rodzaju przeciwciał. Duża powtarzalność wyników (co

5 Nr 2 Wpływ przechowywania surowicy na poziom przeciwciał 193 do tendencji zmian) sugeruje, że zmienność składu surowicy (schorzenia, płeć, zmienność osobnicza) między pacjentami ma tu mniejsze znaczenie. W. Truszkiewicz Influence of storage conditions on results of antibody level assay in human serum samples SUMMARY Human serum samples containing immunoglobulin G (IgG) and M (IgM) were stored at 4 0 C, and 20 0 C with and without thaw/freeze cycles by 30 days. Anti-HAV IgG, anti-ebv IgG and anti- EBV IgM were investigated by ELISA and ELFA methods. Freezing have given significant growth of measured antibodies concentration. In the IgM case, significant loose of activity was observed followed its growth in all assay conditions. Anti EBV IgG stored at freezing conditions were much stable than stored at 4 0 C. Greatest changes of antibodies activity was found after multiple thawing and freezing. PIŚMIENNICTWO 1. Siennicka J,Laskowska A, Trzcińska A. Wpływ wielokrotnego rozmrażania próbki na stabilność przeciwciał klasy IgG i IgM. Med DośwMikrobiol 2010; 62: Vai S, Cavallo R, Angeretti A i inni. Stability of specific antibodies in blood collected on filter paper disks. G Batteriol Virol Immunol 1987; 80: World Health Organization. Use of anticoagulants in diagnostic laboratory investigations. WHO Genewa Wydanie w języku polskim, Krajowa Izba Diagnostów Laboratoryjnych, maj 2006 Otrzymano: 10 V 2011 r Adres Autora: Lublin, ul. Pielęgniarek 6, Pracownia Wirusologii WSSE w Lublinie

6