AmpliTest BVDV (Real Time PCR)

Transkrypt

1 AmpliTest BVDV (Real Time PCR) Zestaw do wykrywania sekwencji RNA specyficznych dla wirusa BVD (Bovine Viral Diarrhea Virus) techniką Real Time PCR Nr kat.: RV01-50 Wielkość zestawu: 50 oznaczeń Objętość pojedynczej reakcji: 20 µl Limit detekcji: 12 kopii RNA wirusa Przed użyciem zestawu należy uważnie zapoznać się z niniejszą instrukcją. Amplicon sp. z o. o. ul. Duńska Wrocław Polska, NIP: , KRS: contact@amplicon.pl, tel , fax

2 ZASTOSOWANIE Zestaw AmpliTest BVDV (Real Time PCR) jest przeznaczony do wykrywania sekwencji RNA specyficznych dla wirusa BVD (Bovine Viral Diarrhea Virus) w próbkach RNA uzyskanych od zwierząt. Materiałem wyjściowym do izolacji RNA może być krew lub surowica oraz wymazy z nosa i spojówek. W przypadku padłych zwierząt można pobrać próbki narządów wewnętrznych (śledziona, nerki, grasica). W celu uniknięcia problemów z wydajnością reakcji Real Time PCR próbki RNA powinny być uzyskane przy użyciu metod pozwalających uzyskać wysokiej jakości RNA pozbawiony inhibitorów reakcji PCR. Zalecane są zestawy do izolacji RNA oparte o złoża krzemionkowe (tzw. zestawy kolumienkowe). ZAKRES STOSOWANIA Diagnostyka weterynaryjna in vitro Badania i rozwój (B+R) SKŁADNIKI ZESTAWU Nazwa Opis Ilość Kolor wieczka RM Mieszanina reakcyjna µl Zielony PC Kontrola pozytywna 2 50 µl Czerwony NC Kontrola negatywna 2 50 µl Niebieski RT Odwrotna transkryptaza 1 10 µl Czarny Rin Inhibitor RNAz 1 20 µl Żółty Woda Woda wolna od nukleaz µl Biały TRANSPORT i PRZECHOWYWANIE Transport odbywa się w suchym lodzie. Po otrzymaniu przesyłki należy ją natychmiast rozpakować. Składniki testu przechowywać -20 C; UNIKAĆ EKSPOZYCJI SKŁADNIKA RM NA ŚWIATŁO; Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania składników testu, w szczególności składnika RM. Trzy cykle zamrożenia i rozmrożenia składnika RM nie wpływa znacząco na jakość wyników. WSKAZÓWKA: na etykietach probówek zawierających składnik RM znajdują się pola, w których można zaznaczać ilość rozmrożeń danej porcji. Składniki RM oraz PC zawierają RNA należy je chronić przed działaniem rybonukleaz. Nie używać składników testu po upływie daty przydatności do użycia. 2

3 ZASADA DZIAŁANIA Wirus BVD jest wirusem typu RNA należącym do rodziny Flaviviridae. Do jego detekcji metodą Real Time PCR konieczny jest proces odwrotnej transkrypcji polegający na syntezie cząsteczek cdna na podstawie RNA. Zestaw AmpliTest BVDV (Real Time PCR) jest zestawem typu one-step. Dzięki temu procesy odwrotnej transkrypcji i amplifikacji sekwencji specyficznych dla wirusa BVD zachodzą w jednej probówce. Zestaw AmpliTest BVDV (Real Time PCR) zawiera trzy pary starterów umożliwiających namnożenie sekwencji charakterystycznych dla trzech znanych genotypów wirusa (BVDV1, BVDV2 i BVDV3). Detekcja obecności wirusowych sekwencji następuje dzięki specyficznym sondom typu TaqMan, które przyłączając się do powstającego amplikonu (powielanego fragmentu DNA wirusa) ulegają hydrolizie. Podczas hydrolizy z sond są uwalniane barwniki fluorescencyjne (FAM, Cy5 i Texas Red odpowiednio dla BVDV1, BVDV2 i BVDV3). Uwolnione barwniki są następnie wykrywane przez układ optyczny aparatu do Real Time PCR. Odpowiednio dobrane sekwencje starterów i sond zapewniają wysoką czułość i specyficzność reakcji. W celu zwiększenia wiarygodności wyników Zestaw AmpliTest BVDV (Real Time PCR) zawiera kontrolę wewnętrzną (egzogenny fragment RNA) oraz układ starterów i sondy do jej amplifikacji i detekcji. Detekcja kontroli wewnętrznej odbywa się dzięki uwalnianiu przez sondę barwnika fluorescencyjnego HEX. Obecność kontroli wewnętrznej pozwala na monitorowanie prawidłowego przebiegu odwrotnej transkrypcji i reakcji Real Time PCR. Amplifikacja kontroli wewnętrznej nie wpływa na wydajność wykrywania sekwencji specyficznych dla wirusa BVD. Pozytywny wynik kontroli wewnętrznej stanowi potwierdzenie prawidłowego przebiegu odwrotnej transkrypcji i reakcji Real Time PCR. 3

4 POTRZEBNY SPRZĘT I DODATKOWE MATERIAŁY Aparat do Real Time PCR: LightCycler 480 (Roche) LightCycler 96 (Roche) RotorGene 3000/6000 (Qiagen) Inne urządzenia umożliwiające detekcję barwników fluorescencyjnych FAM, Cy5, Texas Red i HEX. Zestaw AmpliTest BVDV (Real Time PCR) nie zawiera barwnika normalizacyjnego ROX. Dodanie barwnika ROX do mieszaniny reakcyjnej nie jest możliwe, gdyż odpowiadający mu kanał detekcji jest zarezerwowany dla barwnika Texas Red uwalnianego przez sondę wykrywającą sekwencję specyficzną dla genotypu BVDV3. Probówki reakcyjne (próbówki PCR, płytki PCR, kapilary w zależności od posiadanego urządzenia do Real Time PCR) Wirówka do probówek reakcyjnych Wirówka stołowa Pipety automatyczne w zakresie µl Sterylne końcówki z filtrami do pipet automatycznych Zestaw do izolacji RNA W zależności od użytego zestawu do izolacji RNA może być potrzeby dodatkowy sprzęt i materiały. IZOLACJA RNA Z uzyskanego materiału (wymazy, krew, surowica, fragmenty narządów wewnętrznych) należy wyizolować RNA. Ilość potrzebnego materiału biologicznego zależy od użytej metody izolacji RNA. Ze względu na dużą podatność RNA na degradację czas pomiędzy pobraniem materiału biologicznego a izolacją RNA powinien być jak najkrótszy. Do chwili izolacji RNA uzyskany materiał biologiczny powinien być odpowiednio zabezpieczony (przechowywany w -20 C, ewentualnie w +4 C, najlepiej w środowisku hamującym aktywność nukleaz, np. w obecności EDTA). Niewłaściwe przechowywanie pobranego materiału biologicznego skutkować degradacją RNA, co będzie prowadzić do uzyskania wyników fałszywie negatywnych. Do izolacji RNA zaleca się stosowanie zestawów opartych o złoża krzemionkowe (tzw. zestawów kolumienkowych), gdyż zapewniają one uzyskanie próbek RNA o odpowiedniej jakości pozbawionych inhibitorów reakcji PCR. W przypadku 4

5 innych metod izolacji preparat RNA może zawierać związki, które istotnie zmniejszają wydajność reakcji PCR. Prowadzi to do obniżenia czułości testu, a w skrajnych przypadkach do braku amplifikacji DNA. Próbki RNA należy przechowywać w -20 C (krótki okres przechowywania) lub w -80 C (długi okres przechowywania). Należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania próbek RNA i chronić je przed kontaktem z nukleazami. W tym celu należy korzystać z materiałów (woda, probówki, końcówki do pipet itp.) wolnych od nukleaz (potwierdzonych odpowiednimi certyfikatami). REAKCJA REAL TIME PCR 1. Określić liczbę próbek RNA poddawanych analizie (n). 2. Rozmrozić składniki testu, z wyjątkiem składników RT i Rin. Składniki po rozmrożeniu przechowywać w +4 C lub na lodzie. UNIKAĆ EKSPOZYCJI składnika RM NA ŚWIATŁO. UWAGA: Składniki RT (odwrotna transkryptaza) i Rin (inhibitor RNAz) w miarę możliwości utrzymywać przez cały czas w temperaturze poniżej 0 C, gdyż pozostają one w postaci płynnej w tej temperaturze. Składniki te są wrażliwe na temperaturę i ogrzewanie ich do temperatury powyżej 00 C może doprowadzić do ich inaktywacji. 3. Określić ilość RNA dodawanego do reakcji (x µl). Optymalna ilość RNA w reakcji wynosi ng. Ilość RNA dodawanego do reakcji nie powinna przekroczyć 1 µg. Duże ilości RNA dodanego do reakcji PCR mogą negatywnie wypływać na obniżenie wydajności odwrotnej transkrypcji i podwyższyć limit detekcji testu. 4. W probówce wolnej od nukleaz wymieszać następujące składniki: RM (n + 3) 11 µl RT (n + 3) 0,2 µl Rin (n + 3) 0,4 µl Woda (n + 3) (8,4 - x) µl 5. Do n + 2 probówek reakcyjnych (probówek PCR, kapilar, studzienek na płytce PCR) nanieść po (20 x) µl mieszaniny przygotowanej w punkcie Do n probówek reakcyjnych dodać po x µl przygotowanych próbek RNA. Do jednej z pozostałych dwóch próbówek reakcyjnych dodać kontrolę negatywną NC, a do drugiej kontrolę pozytywną PC. UWAGA: Kontrolę pozytywną należy dodać jako ostatnią. 7. Zamknąć probówki reakcyjne, a następnie krótko je zwirować. 5

6 8. Probówki reakcyjne upieścić w aparacie do Real Time PCR i wykonać reakcję według następującego protokołu: Odwrotna transkrypcja 45 C 15 min Denaturacja wstępna Amplifikacja (45 cykli) Schłodzenie aparatu 95 C 5 min 95 C 10 s 60 C 50 s* C 30s (zależnie od typu aparatu) *Na końcu tego etapu ustawić odczyt fluorescencji w kanałach dla FAM, Cy5, Texas Red i HEX. Kanały dla FAM, Cy5 oraz Texas Red służą do wykrywania sekwencji specyficznych dla wirusa BVD (odpowiednio BVDV1, BVDV2 i BVDV3). Kanał dla HEX służy do wykrywania kontroli wewnętrznej. INTERPRETACJA WYNIKÓW L.p. Rodzaj próbki FAM Cy5 Texas Red HEX Wynik 1 Kontrola pozytywna Prawidłowy 2 Kontrola negatywna Prawidłowy 3 Oznaczenie Ujemny 4 Oznaczenie BVDV1 5 Oznaczenie BVDV2 6 Oznaczenie BVDV3 7 Oznaczenie BVDV1/2* 8 Oznaczenie BVDV2/3* 9 Oznaczenie BVDV1/3* 10 Oznaczenie BVDV1/2/3* *Ze względu na podobieństwo pomiędzy niektórymi wariantami wirusa BVD należącymi do różnych genotypów może się zdarzyć, że sygnał stwierdzający obecność wirusa określonego typu zostanie wykryty jednocześnie w dwóch lub trzech kanałach. W takim wypadku za genotyp właściwy danemu oznaczeniu należy przyjąć ten dla którego wartość punktu C t (lub C p ) jest najmniejsza. Na przykład, jeżeli sygnał został wykryty jednocześnie w kanałach FAM i Cy5 i punkty C t (C p ) dla tych kanałów wynosiły odpowiednio 32 i 25 to genotypem wirusa obecnym w badanej próbce jest genotyp BVDV2. 6

7 Brak odczytu w kanale dla HEX # oznacza, że reakcja Real Time PCR nie przebiegła w sposób prawidłowy. Jednoczesny brak pozytywnego odczytu fluorescencji w kanale dla HEX w przypadku kontroli pozytywnej i negatywnej wskazuje na złą jakość Zestawu AmpliTest BVDV (Real Time PCR) (niewłaściwe przechowywanie, transport, wygaśnięcie terminu przydatności do użycia itp.) Pozytywny odczyt fluorescencji w kanale dla HEX w przypadku kontroli pozytywnej i negatywnej i brak pozytywnego odczytu dla badanych próbek RNA oznacza złą jakość próbek RNA (obecność związków hamujących reakcję PCR) lub zbyt dużą ilość RNA użytego w reakcji. W tym przypadku należy do reakcji dodać mniejszą objętość próbki RNA, jednocześnie zwiększając objętość wody tak, aby końcowa objętość reakcji wynosiła 20 µl. # Przy bardzo wysokim mianie wirusa może wystąpić brak odczytu w kanale HEX przy jednoczesnym odczycie w przynajmniej jednym z kanałów FAM/Texas Red/Cy5. Zaleca się wtedy powtórzenie reakcji z zmniejszoną ( krotnie) ilością RNA dodanego do reakcji. UWAGI DODATKOWE Zastosowane sondy TaqMan posiadają wygaszacze (Quenchers) typu BHQ (Black Hole Quencher ), które nie generują dodatkowych sygnałów fluorescencyjnych. W aparatach, które tego wymagają (np. RotorGene 6000), jako typ wygaszacza należy wybrać opcję none. Przygotowany test wykrywa powyżej 12 kopii RNA wirusa obecnych w dodanej próbce RNA. Próbki RNA uzyskane z pojedynczych osobników można ze sobą pulować i wykorzystywać w pojedynczym oznaczeniu. W tym celu równe objętości próbek RNA (np. 10 µl) przeznaczonych do pulowania należy ze sobą dokładnie wymieszać i użyć jako matrycy w reakcji Real Time PCR. Należy jednak pamiętać, że pulowanie próbek RNA zmniejsza możliwość uzyskania pozytywnego wyniku w przypadku próbek zawierających niewielką ilość cząsteczek wirusa. Pulowaniu można poddać również próbki krwi lub surowicy uzyskane od zwierząt, a następnie wyizolować RNA. Nie stosować objętości reakcji mniejszych niż 20 µl. Zmniejszenie objętości reakcji powoduje zmniejszenie czułości testu. Należy zachować szczególną ostrożność podczas izolacji RNA, a materiał biologiczny uzyskany od chorych zwierząt traktować jako potencjalnie zakażony. Izolację RNA oraz detekcję obecności wirusa BVD powinien wykonać odpowiednio przeszkolony personel w laboratorium spełniającym odpowiednie wymogi i dopuszczonym do pracy z zakażonym materiałem biologicznym. Należy zwrócić szczególną uwagę, aby podczas izolacji RNA nie doszło do krzyżowego zanieczyszczenia próbek RNA izolowanych równolegle. 7

8 W celu maksymalnego wyeliminowania fałszywych wyników powinno się przestrzegać następujących zasad: - w miarę możliwości wyznaczyć osobne stanowiska do izolacji RNA, przygotowania reakcji Real Time PCR oraz jej wykonania/analizy. - pomiędzy etapami izolacji RNA, przygotowania reakcji Real Time PCR należy dokonać zmiany odzieży laboratoryjnej (fartucha) oraz zmiany rękawiczek jednorazowych. - powierzchnię stanowisk do izolacji RNA i przygotowania reakcji Real Time PCR należy przemywać środkami usuwającymi/niszczącymi RNA. - do pipet automatycznych należy stosować wyłącznie sterylne końcówki z filtrem. - podczas przygotowywania reakcji Real Time PCR Kontrolę pozytywną PC należy dodać jako ostatnią. Przed jej dodaniem w miarę możliwości należy zamknąć probówki z dodanymi próbkami DNA i kontrolą negatywną NC. RNA jest materiałem bardzo łatwo podatnym na degradację. Z tego względu należy zadbać o odpowiednie zabezpieczenie materiału biologicznego do czasu izolacji RNA (niska temperatura, środki inaktywujące nukleazy). Czas pomiędzy pobraniem materiału biologicznego a izolacją RNA powinien być możliwie jak najkrótszy. Izolację RNA należy wykonać ściśle według wskazówek producenta odpowiedniego zestawu do izolacji RNA. Podczas izolacji RNA szczególnie istotny jest etap homogenizacji materiału biologicznego (w przypadku próbek narządów wewnętrznych). Należy zwrócić szczególną uwagę, aby podczas homogenizacji nie doszło do degradacji RNA. Uzyskaną próbkę RNA chronić przed działaniem nukleaz (stosować odpowiednio certyfikowane materiały wolne od nukleaz). Próbkę RNA należy przechowywać w postać zamrożonej. Należy unikać jej wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. W celu zwiększania stabilności RNA, zarówno po jego wyizolowaniu, jak i na etapie materiału biologicznego można używać preparatów poprawiających stabilność RNA i hamujących działanie nukleaz. TaqMan jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Applied Biosystems, Inc. LightCycler jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Roche Diagnostics GmbH. Black Hole Quencher jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Biosearch Technologies, Inc. Texas Red jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Molecular Probes, Inc. Cy5 jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Amersham Biosciences Corp. 8